KR20140119109A - 알루미늄 옥시하이드록사이드 상에 흡착될 수 있는 2 개 이상의 항원을 함유하는 백신의 제형화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 주제는 적어도 알루미늄 옥시하이드록사이드(AlOOH), 및 적어도 B형 간염 표면 항원 및 b형 헤모필루스 인플루엔자에 항원을 포함하는 백신 조성물의 제조 방법이다. 본 발명에 따라, 상기 B형 간염 표면 항원은 상기 AlOOH 상에 흡착시킨 채로 유지되는 반면, 상기 Hib 항원은 흡착되지 않은 채로 유지된다. 이를 위해서, 상기 B형 간염 표면 항원을, AlOOH/HBsAg 복합체를 수득하기 위해서 AlOOH 상에 흡착시키고, 이어서 상기 AlOOH/HBsAg 복합체를 100 ㎎/㎖ 이상 농도의 양이온성 아미노산 및 35 내지 45 mMol/ℓ 농도의 포스페이트 이온의 존재 하에서 상기 Hib 항원과 혼합시킨다.

Description

알루미늄 옥시하이드록사이드 상에 흡착될 수 있는 2 개 이상의 항원을 함유하는 백신의 제형화 방법{METHOD FOR FORMULATING A VACCINE CONTAINING AT LEAST TWO ANTIGENS CAPABLE OF ADSORBING ONTO ALUMINIUM OXYHYDROXIDE}

본 발명은 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg)으로 이루어지는 B형 간염 결합가(valence), 및 b형 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 결합가(폴리리보실리비톨 포스페이트(PRP)라 칭하는 그의 캡슐 폴리사카라이드로 이루어지며, 2 세 이하의 아동에서 유효하기 위해 담체 단백질, 예를 들어 파상풍 단백질에 접합된다)를 모두 포함하는 백신 조합의 분야에 관한 것이다.

상기와 같은 조합은 어린 아동에 투여가 의도되며, 일반적으로 단일 실행으로 여러 질병에 대한 백신화를 가능하게 하는 다른 항원들, 및 또한 알루미늄 기재 항원보강제를 포함한다.

따라서, 특허 출원 WO 99/13906은 13 페이지에 개시된 바와 같이, 디프테리아, 파상풍, 소아마비, 백일해, B형 간염 및 b형 헤모필루스 인플루엔자에 감염에 대한 항원들을 포함하는 백신 조성물을 개시한다. 이들 항원 중 일부는 면역원성이기 위해서 알루미늄염상에 흡착시킬 필요가 있다. 이는 특히 B형 간염 표면 항원 또는 HBsAg의 경우에 그렇다.

그러나, 출원 WO 99/13906의 12 페이지에서 지적한 바와 같이, 파상풍 단백질에 접합된 캡슐 폴리사카라이드로 이루어지는 Hib 결합가는 상기 Hib가 알루미늄염상에 흡착되면 시간이 지남에 따라 그의 면역원성을 상실하는 성향을 갖는다. 이러한 결점을 피하기 위해서, 종래 기술에서 제시된 해법은 이미 선행 출원 PCT/FR96/00791에서 권장된 바와 같이, 음이온 및 특히 포스페이트, 카보네이트 도는 시트레이트 이온을 가하는 것이다.

그러나, 본 발명의 저자들은 이온, 특히 포스페이트 또는 카보네이트의 첨가가 실제로 알루미늄 옥사이드 하이드록사이드(AlOOH) 상에의 PRP-T의 흡착을 방지하고 따라서 시간에 따른 그의 면역원성의 유지를 가능하게 하지만, 상기 첨가는 또한 상기 이온 자체가 알루미늄 옥사이드 하이드록사이드 상에 흡착되면 상기 B형 간염 표면 항원을 탈착시키는 단점을 가짐을 알았다.

따라서, 상기 B형 간염 표면 항원은 AlOOH 상에 흡착된 채로 유지되는 반면 상기 Hib 항원은 흡착되지 않은 채로 유지되는, 알루미늄 옥사이드 하이드록사이드를 포함하는 백신 조합의 제조 방법을 찾을 필요가 있다.

이를 위해서, 본 발명의 주제는 적어도

-하나의 B형 간염 표면 항원(HBsAg),

-담체 단백질에 접합된 캡슐 폴리사카라이드로 이루어지는 하나의 b형 헤모필루스 인플루엔자에(Hib) 항원,

-알루미늄 옥사이드 하이드록사이드(AlOOH)

를 포함하고, 여기에서 상기 B형 간염 표면 항원이 AlOOH 상에 흡착된 채로 유지되는 반면 상기 Hib 항원은 흡착되지 않은 채로 유지되는 액체 백신 조합의 제조 방법이며, 여기에서

-상기 B형 간염 표면 항원을 AlOOH/HBsAg 복합체를 수득하기 위해서 AlOOH 상에 흡착시키고,

-상기 AlOOH/HBsAg 복합체를 100 ㎎/ℓ 이상 농도의 양이온성 아미노산 및 35 내지 45 mMol/ℓ 농도의 포스페이트 이온의 존재 하에서 상기 Hib 항원과 혼합시킨다.

본 발명에 따른 방법에 의해서, 상기 알루미늄 옥사이드 하이드록사이드 상에의 상기 B형 간염 표면 항원의 흡착의 유지와 상기 Hib 항원의 비흡착의 유지 간의 목적하는 균형을 성취할 수 있다.

도 1은 각 성분의 첨가 후에 혼합을 수행하는 종래 기술 방법의 도식이다.

본 발명의 하나의 특정한 실시태양에 따라, AlOOH의 현탁액을 HBsAg의 현탁액과 4 시간 이상, 바람직하게는 12 시간 이상, 바람직하게는 20 내지 24 시간 동안 교반하면서 혼합시킴으로써 상기 HBsAg 항원을 상기 알루미늄 상에 흡착시킨다.

본 발명의 하나의 특정한 실시태양에 따라, 상기 양이온성 아미노산을 상기 Hib 항원과의 혼합 전에 상기 AlOOH/HBsAg 복합체에 가한다.

본 발명의 또 다른 실시태양에 따라, 상기 양이온성 아미노산을 상기 AlOOH/HBsAg 복합체와의 혼합 전에 상기 Hib 항원에 가한다.

본 발명의 하나의 실시태양에 따라, 상기 포스페이트 이온을 상기 Hib 항원과의 혼합 전에 상기 AlOOH/HBsAg 복합체에 가한다.

본 발명의 하나의 실시태양에 따라, 상기 AlOOH/HBsAg 복합체를 포함하는 제제의 pH를 상기 Hib 항원과의 혼합 전에 7.1 ± 0.1로 조절한다.

본 발명의 주제는 또한, 특허청구된 방법에 따라 수득되고 적어도

-B형 간염 표면 항원,

-디프테리아 독소 D 형태의 디프테리아 항원,

-파상풍 독소 T 형태의 파상풍 항원,

-정제된 독소(PTxd) 및 섬유상 헤마글루티닌(FHA) 형태의 백일해 항원,

-파상풍 단백질에 접합된 폴리리보실리비톨 포스페이트(PRP-T) 형태의 b형 헤모필루스 인플루엔자에 항원,

-비활성화된 1, 2 및 3형 바이러스 형태의 소아마비 항원

을 포함하는 백신 조합이다.

상기와 같은 백신 조성물은 액체 형태이어서, 동결건조물을 용해시킬 작업을 피할 수 있다는 이점을 가지며; 사용일 까지, 심지어 제조일 후 36 개월까지 면역원성인 채로 있기에 충분히 안정성인 것으로 입증되었다.

본 발명에 따라, 상기 백신 조성물은 B형 간염 표면 항원(HBsAg)을 포함한다. 상기 항원은 특히 B형 간염 표면 항원, 예를 들어 리콤비백스(Recombivax) HB(상표) 백신으로, 또는 임의의 다른 B형 간염 백신으로 존재하는 것일 수 있다. 특히 상기는 크루셀(Crucell)에 의해 개발된 기술에 따른, 변형된 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 효모의 발효에 의해 수득된 재조합 항원, 예를 들어 헤파박스-진(Hepavax-Gene)(상표) 백신 중에 존재하는 것일 수 있다. 본 발명을 위해서, 0.5 ㎖ 용량 중에 존재하는 HBsAg의 양은 유리하게는 5 내지 15 ㎍, 및 특히 10 ㎍이다.

본 발명에 따라, 상기 백신 조성물은 b형 헤모필루스 인플루엔자에(Hib) 항원을 포함한다. 상기 항원은 담체 단백질에 접합된 세균 또는 폴리리보실리비톨 포스페이트(PRP)의 캡슐 폴리사카라이드로 이루어진다. 상기 담체 단백질은 백신 분야에서 상기에 관하여 사용되는 임의의 단백질일 수 있다. 상기는 예를 들어 디프테리아 독소 D, 파상풍 독소 T, 헤모필루스 인플루엔자에 지단백질 D, CRM197 또는 엔 메닌지티디스(N. meningitidis) 외막 단백질(OMP)일 수 있다. 바람직하게는 상기 PRP-T 접합체를 수득하기 위해서 상기 파상풍 단백질을 사용한다. 본 발명을 위해서, 상기 PRP-T 접합체는 22 내지 36 ㎍의 파상풍 단백질에, 0.5 ㎖ 용량당 1 내지 30 ㎍의 PRP; 유리하게는 용량당 5 내지 25 ㎍의 PRP; 바람직하게는 용량당 10 내지 15 ㎍의 PRP; 전적으로 바람직하게는 용량당 10 내지 12 ㎍의 PRP, 및 보다 특히 12 ㎍의 PRP의 비율로 접합되어 존재할 수 있다.

본 발명에 따라, 상기 백신 조성물은 알루미늄 옥사이드 하이드록사이드 AlOOH를 포함한다. 상기 알루미늄염은 매우 통상적으로는 부정확하게 알루미늄 옥사이드라 불린다. 본 발명의 목적에 사용될 수 있는 상기 AlOOH는 예를 들어 브렌탁(Brenntag) AG에 의해 판매되는 AlOOH 염, 또는 레하이스 코포레이션(Reheis Corp.)(미국 뉴저지주 버클리 하이츠 소재)으로부터의 레하이드라젤(Rehydragel) HPA일 수 있지만, 상기 두 항원보강제들 각각의 제조 방법은 상이하다. 사용되는 AlOOH의 양은 만족스러운 면역 반응이 성취될 수 있도록 산정되며; 특히 상기 조성물 중에 존재하는 항원들의 수 및 성질, 및 또한 이들 항원 각각의 양에 따라 다르다.

순전히 정보를 목적으로, AlOOH 상에의 HBsAg의 최대 흡착은 알루미늄의 ㎎당 단백질 약 780 ㎍이다(통상적으로, 상기 AlOOH의 양을 알루미늄 Al³⁺의 양으로서 나타낸다). 따라서 10 ㎍의 HBsAg를 포함하는 백신 용량의 경우에, 임의의 다른 추가적인 항원 없이, 13 ㎍의 알루미늄이면 충분할 것이나, 이는 다른 항원이 첨가되는 경우에는 목적하는 효능을 획득하기에 불충분한 양이다. 따라서, 하나 이상의 추가적인 항원의 첨가에 따라, 10 ㎍의 HBsAg를, 유럽 약전이 권장하는 최대량인 0.01 ㎎ 내지 1.25 ㎎의 알루미늄과 접촉시킬 수 있다.

예를 들어, 디프테리아, 파상풍, 백일해 및 B형 간염 항원을 포함하는 0.5 ㎖ 용량의 소아 백신은 통상적으로 0.5 내지 0.7 ㎎의 알루미늄, 바람직하게는 대략 0.6 ㎎의 알루미늄을 함유할 수 있다.

본 발명에 따라, B형 간염 표면 항원을 AlOOH 상에 흡착된 채로 유지시키며, 이는 상기 조성물 중에 존재하는 상기 항원의 총량의 60% 이상, 바람직하게는 65% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상이 흡착된 형태로 존재함을 의미한다.

본 발명에 따라, 상기 Hib 항원을 AlOOH 상에 흡착되지 않은 채로 유지시키며, 이는 상기 조성물 중에 존재하는 상기 항원의 총량의 65% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상이 흡착되지 않은 형태로 존재함을 의미한다.

본 발명에 따라, 상기 B형 간염 표면 항원이 상기 AlOOH 상에 흡착된 채로 유지되고 상기 Hib 항원은 흡착되지 않은 채로 유지되는 동안의 기간은, 보관 온도가 5±3 ℃인 경우, 상기 조성물의 제조일로부터 출발하여 3 개월 이상, 바람직하게는 6 개월 이상, 바람직하게는 12 개월 이상, 바람직하게는 18 개월 이상, 바람직하게는 24 개월 이상, 바람직하게는 36 개월 이상이다. 바람직하게, 흡착된 또는 흡착되지 않은 항원의 양은 시간이 지남에 따라 안정하지만, 상기 량이 허용 가능한 한계 내에서 유지되는 한 또한 상기 량은 변할 수도 있다. 따라서, 상기 조성물 중에 존재하는 HBsAg의 총량의 85% 이상이, 5±3 ℃의 온도에서 보관되는 상기 조성물의 제조일로부터 출발하여 3 개월 동안 상기 AlOOH 상에 흡착될 때, 동일한 보관 조건 하에서 1 년 후 여전히, 상기 조성물 중에 존재하는 HBsAg의 총량의 80%가 흡착된 채로 유지되는 것은 전적으로 가능하다.

상기 흡착된 항원의 양을 평가하기 위해서, 당해 분야의 숙련가들은 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있다.

상기 HBsAg의 흡착 백분율의 측정에 관하여, 유럽 약전 2.7.1에 의해 정의된 규정에 따라 샌드위치 ELISA 방법을 사용할 수 있다. 간단히, 상기 HBsAg을 96-웰 플레이트의 웰에서, IgM 유형의 항-HBsAg 1차 단클론 항체에 의해 포획한다. 상기와 같이 결합된 HBsAg를 IgG 유형의 항-HBsAg 2차 단클론 항체(페록시다제-결합된 항-IgG 다클론 항체에 의해 그 자체가 검출된다)로 코팅한다. 페록시다제에 대한 발색성 기질인 테트라메틸벤지딘(TMB)은 발색제로서 작용한다. 상기 발색제를 첨가하면, 색상이 나타나며, 그의 강도는 상기 웰 중에 포획된 HBsAg의 양에 비례한다. 상기 결과를 유럽 약전 5.3.3에 개시된 평행선 방법에 따라 분석한다. 상기 흡착 백분율을 총 HBsAg 함량 및 흡착되지 않은 HBsAg 함량의 측정으로부터 획득한다.

흡착되지 않은 PRP-T의 양에 관하여, 평가를 HPAEC-PAD(고성능 이온 교환 크로마토그래피 - 펄스화된 전류측정 검출)에 의해 수행할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라, 상기 B형 간염 표면 항원을 AlOOH 상에 흡착시킨다. 이 단계는, AlOOH/HBsAg 복합체를 함유하는 제제를 수득하기 위해서, 상기 B형 간염 표면 항원 및 AlOOH를 임의의 다른 항원의 부재 하에서 접촉되게 하고 상기 B형 간염 표면 항원을 상기 AlOOH 상에 4 시간 이상, 바람직하게는 12 시간 이상, 전적으로 바람직하게는 20 내지 24 시간 동안 흡착되게 함으로써 수행될 수 있다. 상기 흡착을 본 발명에 따라, 포스페이트 이온의 부재 하에서 수행할 수 있다. 상기 B형 간염 표면 항원과 상기 AlOOH 간의 연장된 접촉 시간에 의해 추구되는 목적은 정전기적 상호작용의 극대화 및 안정한 상호작용의 촉진이며, 따라서 이는 리간드 교환에 의한 흡착을 생성시킬 수 있다. 상기 접촉을 유리하게는 교반과 함께 계속한다.

본 발명의 방법에 따라, 상기 AlOOH/HBsAg 복합체를 양이온성 아미노산 및 포스페이트 이온의 존재 하에서 상기 Hib 항원과 혼합한다.

본 발명을 위해서, "양이온성 아미노산"이란 용어는 pHi가 상기 백신 조성물의 pH보다 더 높고 따라서 상기 백신의 pH에서 양이온성 형태로 존재하는 아미노산을 의미하고자 하며; 상기 아미노산은 특히 리신(Lys), 아르기닌(Arg) 또는 히스티딘(His)이고; 이들 아미노산을 각각 단독으로, 쌍으로(Lys + Arg; Lys + His; Arg + His) 또는 3 개를 모두 함께(Lys + Arg + His) 사용할 수 있다. 하나의 특정한 실시태양에 따라, 상기 양이온성 아미노산을 다이펩타이드 형태로 결합시킬 수도 있다. 특히 다이펩타이드 Lys-Lys, Lys-Arg, Lys-His, Arg-Arg, Arg-Lys, Arg-His, His-His, His-Lys 및 His-Arg를 언급할 수 있다. 한편으로, 본 발명에 사용하기 위한 다이펩타이드는 양이온성 아미노산 및 Ala, Val, Leu, Iso, Pro, Met, Phe, Trp, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp 및 Gln 중에서 선택된 하전되지 않은 아미노산으로 구성될 수 있다. 따라서, 실제로는, 유리 및/또는 다이펩타이드 형태로 하나 이상의 양이온성 아미노산(들)을 함유하는 제제를 사용할 수 있다. 다른 아미노산과의 혼합물로서, 목적하는 양의 양이온성 아미노산을 포함하는 아미노산 제제를 사용하는 것도 또한 가능하다. 상기 아미노산의 첨가 동안 pH의 너무 큰 강하가 발생하지 않도록, 상기 아미노산을 AlOOH/HBsAg 복합체에 가하기 전에, 염기, 특히 수산화 나트륨에 의해서 상기 아미노산을 포함하는 제제의 pH를 증가시키는 것도 구상할 수 있다.

본 발명에 따라, 상기 백신 조성물 중에 최종적으로 존재하는 양이온성 아미노산의 양은 100 ㎎/ℓ 이상, 유리하게는 300 ㎎/ℓ 이상, 유리하게는 400 ㎎/ℓ 이상, 전적으로 바람직하게는 500 ㎎/ℓ 이상이어야 한다. 한계 최대 용량은 존재하지 않는다. 그러나, 상기 최대량은 바람직하게는 2 ㎎/㎖ 이하, 보다 바람직하게는 1 ㎎/㎖ 이하, 보다 바람직하게는 800 ㎍/㎖ 이하, 전적으로 바람직하게는 700 ㎍/㎖ 이하이다. 상기 첨가되는 양이온성 아미노산의 양을 계산할 때, HBsAg 및 Hib 항원 이외의 항원이 존재하는 매질에 의해 도입될 수도 있는 양이온성 아미노산을 고려해야 한다.

상기 방법의 하나의 대안에 따라, 상기 Hib 캡슐 폴리사카라이드의 중량에 대한 양이온성 아미노산의 양을 측정하고 1:4 내지 1:100, 유리하게는 1:10 내지 1:80, 바람직하게는 1:15 내지 1:60, 또는 특히 바람직하게는 1:20 내지 1:30 또는 40의 Hib 폴리사카라이드/양이온성 아미노산 중량비를 제공할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라, 상기 AlOOH/HBsAg 복합체를 양이온성 아미노산의 존재 하에서, 또한 포스페이트 이온의 존재 하에서 Hib 항원과 혼합시킨다. 본 발명의 하나의 실시태양에 따라, 상기 포스페이트 이온을 상기 Hib 항원과 접촉시키기 전에 상기 AlOOH/HBsAg 복합체에 가한다. 상기 포스페이트 이온을, 예를 들어 나트륨 수소 포스페이트 또는 칼륨 수소 포스페이트, 또는 달리 이 둘의 혼합물을 가함으로써 도입시킬 수 있다. 상기 Hib 항원의 흡착을 피하면서 상기 B형 간염 표면 항원의 최대량이 상기 AlOOH 상에 흡착된 채로 있게 하는 상기 포스페이트 이온의 양을 계산한다. 상기 량은 상기 존재하는 항원의 성질 및 수에 따라 변하며, 특히 상기 HBsAg 및 Hib 항원 이외의 항원에 따라 변한다.

따라서, 소아 백신에 통상적으로 사용되는 항원, 즉 상기 HBsAg 및 상기 Hib 항원 이외에, 디프테리아, 파상풍 및 백일해 항원을 포함하는 백신 조합에 대해서, 상기 최종적으로 수득되는 백신 조성물 중의 포스페이트 이온 농도가 한계를 포함하여 35 mMol/ℓ 이상, 및 보다 특히 35 내지 45 mMol/ℓ; 바람직하게는 한계를 포함하여 38 내지 44 mMol/ℓ; 전적으로 바람직하게는 한계를 포함하여 38 내지 42 mMol/ℓ가 되도록 포스페이트 이온을 가하는 것이 유리할 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에 따라, 상기 최종적으로 수득되는 백신 조성물 중의 포스페이트 이온 농도는 40 mMol/ℓ이다.

또 다른 실시태양에 따라, 상기 포스페이트 이온을 상기 이온이 상기 백신 조성물 중에, 한계를 포함하여 35 내지 38 mMol/ℓ의 최종 농도로 존재하도록 하는 양으로 가한다. 이는 카보네이트 이온을 제한된 양으로 또한 첨가함으로써 완성되는데, 이는 실제로 과잉량의 카보네이트 이온이 불리한 것으로 보고되었기 때문이다. 유리하게는, 상기 이온을 상기 이온이 상기 백신 조성물 중에 10 mMol/ℓ 이하의 최종 농도로 존재하도록 하는 양으로 첨가할 수 있다.

상기 HBsAg를 탈안정화시키고 그의 탈착을 촉진할 수 있는 과도한 이온성 충격을 피하기 위해서, 상기 포스페이트 이온을 다수(예로서 2)의 별개의 실행들(단계들)로 첨가하는 것이 권장된다. 따라서, 상기 포스페이트 이온을 첫 번째 실행에서, 한계를 포함하여 20 내지 30 mMol/ℓ의 최종 농도가 성취될 수 있게 하는 양으로; 이어서 두 번째 실행에서, 상기 명시된 바와 같은 최종 농도가 성취될 수 있게 하는 양으로 첨가할 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 하나의 바람직한 실시태양에 따라, 상기 수득되는 제제의 pH를 또한 7.1±0.1로 조절한 후에, 상기 Hib 항원을 상기 AlOOH/HBsAg 복합체와 혼합시킨다. 실제로 상기와 같은 pH 값은 상기 Hib 항원을 흡착되지 않은 상태로 유지시키는데 긍정적인 효과를 갖는 것으로 보고되었다.

하나의 특정한 실시태양에 따라, 상기 pH를 또한 상기 혼합 단계 후에 7.1±0.1로 조절한다.

따라서, 본 발명에 따른 방법에 의해,

(i) 백신 조성물 중에 존재하는 B형 간염 표면 항원의 총량의 60% 또는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상이, 5±3 ℃의 온도에서 보관된 상기 조성물의 제조일로부터 출발하여 3 개월 이상 동안 AlOOH 상에 흡착되고;

(ii) 상기 조성물 중에 존재하는 Hib 항원의 총량의 65%, 70% 또는 75% 이상이 AlOOH 상에 흡착되지 않는

상기 백신 조성물을 수득할 수 있다.

"AlOOH/HBsAg 복합체"란 표현은 상기 복합체가 적어도 AlOOH 상에 흡착된 HBsAg 항원을 포함함을 의미하는 것으로서 해석되어야 한다. 상기 복합체는 명시되든지 명시되지 않든지 간에, 다른 항원을 함유할 수도 있다.

하나 이상의 추가적인 항원이 또한 상기 복합체를 형성하게 될 수 있다. 상기 항원은 특히 디프테리아 변성독소(D), 파상풍 변성독소(T), 백일해 무세포 항원, 예를 들어 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 해독된 독소(PTxd), 상기 동일한 세균의 섬유상 헤마글루티닌(FHA), 페르탁틴(69 kDa 항원) 및 아글루티노젠(섬모 항원)일 수 있다. 하나의 특히 유리한 실시태양에 따라, D, T, PTxd 및 FHA 항원을 상기 복합체를 형성시키기 위해 첨가할 수도 있다.

상기 추가적인 항원들을 다양한 방식으로 첨가할 수 있다. 상기 항원들을 (i) 상기 백신 조성물 중에 존재할 필요가 있는 총량의 AlOOH 상에; (ii) 또는 상기 총량에 도달하기 위해 후속으로 첨가되는 부분적인 양의 AlOOH 상에 예비흡착된 B형 간염 표면 항원에 이어서 연속적으로 첨가할 수 있다. 한편으로, 상기 추가적인 항원들을 각각 HBsAg와 똑같이 부분적인 양의 AlOOH 상에 별도로 흡착시킬 수도 있다. 혼합된 흡착 공정이 또한 제공될 수 있다, 즉 일부의 항원은 별도로 흡착되고, 다른 것들은 연속적으로 흡착된다.

본 발명에 따른 방법의 하나의 특정한 실시태양에 따라, 상기 수득되는 조성물을 각 항원의 첨가 후에 교반한다.

하나의 유리한 실시태양에 따라, 단지 예로서, 상기 HBsAg를 최종 조성물 중에 존재하는 AlOOH의 총량의 대략 30%(1/3)에 상응하는 부분적인 양의 AlOOH 상에 별도로 흡착시킨다. 동시에, 상기 D 및 T 항원을 상기 AlOOH의 추가적인 부분 상에 연속적으로 흡착시킨다. 이어서 상기 PTxd 및 FHA 백일해 항원을 상기 AlOOH-D-T 복합체를 함유하는 제제에 가하며, 이들 두 백일해 항원들 자체는 각각 개별적으로 AlOOH 상에 예비 흡착된다. 최종적으로, 상기 두 제제(AlOOH - HBsAg 복합체 및 AlOOH - D-T-PTxd-FHA 복합체)를, 상기 AlOOH - HBsAg-D-T-PTxd-FHA를 포함하는 제제를 형성하도록 결합시키며, 이때 상기 각각의 요소들의 양은 통상적으로:

- 5 내지 15 ㎍의 HBsAg/용량; 바람직하게는 10 ㎍/용량,

- 20 내지 40 Lf의 D/용량; 바람직하게는 25 내지 35 Lf/용량; 전적으로 바람직하게는 30 Lf/용량(Lf = 응집의 한계)(또 다른 방식으로 표현하면, D의 양은 20 IU/용량 이상이다),

- 5 내지 25 Lf의 T/용량; 바람직하게는 10 내지 15 Lf/용량; 전적으로 바람직하게는 10 Lf/용량(또 다른 방식으로 표현하면, T의 양은 40 IU/용량 이상이다),

- 20 내지 30 ㎍의 FHA/용량; 바람직하게는 25 ㎍/용량,

- 20 내지 30 ㎍의 PTxd/용량; 바람직하게는 25 ㎍/용량

을 포함하는 0.5 ㎖의 백신 용량이 획득되도록 선택되었다.

본 발명의 하나의 특정 실시태양에 따라, 소아마비 항원(통상적으로 비활성화 바이러스로 이루어진다)을 또한 가한다. 소아 백신 중에 대체로 존재하는 3 가지 유형, 즉 1, 2 또는 3 유형의 폴리오바이러스를 가하는 것을 구상하거나; 또는 달리 상기 3 가지 유형에 대해 백신화할 필요가 없는 경우에, 단지 보호를 요하는 것에 대한 유형들만을 도입시키는 것을 구상할 수 있다. 용량당 폴리오바이러스의 양은 특히

- 1 유형의 경우, 20 내지 43 DU(D 항원 단위), 특히 40,

- 2 유형의 경우, 5 내지 9 DU, 특히 8,

- 3 유형의 경우, 17 내지 36 DU, 특히 32

일 수 있다.

이들 항원을 상기 백신 제제에 첨가 전에 알루미늄염 상에 반드시 예비흡착시킬 필요는 없다.

하나의 특정한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 방법은

(i)(a) AlOOH/HBsAg 복합체를 함유하는 제제를 수득하기 위해서, 상기 HBsAg 및 상기 AlOOH를 임의의 다른 항원의 부재 하에서 접촉되게 하고, 상기 HBsAg를 상기 AlOOH 상에 4 시간 이상, 바람직하게는 12 시간 이상, 전적으로 바람직하게는 대략 24 시간 동안 흡착되게 하고;

(i)(b) AlOOH 상에 예비 흡착된 상기 D, T, PTxd 및 FHA 항원, 및 임의로 추가적인 보르데텔라 페르투시스 항원, 예를 들어 페르탁틴 및 아글루티노젠을 포함하는 제제를 상기 (i)(a)에서 수득된 제제에 가하고;

(ii) 포스페이트 이온을 40 mMol/ℓ의 백신 중 최종 농도를 획득하기 위해서 상기 (i)(b)에서 수득된 제제에 가하고;

(iii) 소아마비 항원을 상기 (ii)에서 수득된 제제에 임의로 가하고;

(iv) 상기 Hib 항원을 함유하는 제제를 상기 (ii) 또는 (iii)에서 수득된 제제에 가하고;

(v) 상기 pH를 7.1±0.1로 조절하고;

(vi)(a) 상기 Hib 항원의 첨가 전에 상기 (ii) 또는 (iii)에서 수득된 제제를 완성하기 위해서 하나 이상의 양이온성 아미노산을 가하거나, 또는

(b) 하나 이상의 양이온성 아미노산을 상기 Hib 항원에 가하고;

상기 양이온성 아미노산을 100 ㎎/ℓ 이상의 백신 중 최종 농도를 획득하기에 충분한 양으로 첨가하는 방법이다.

하나의 특정한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 백신 조성물은 HBsAg, 디프테리아 독소 D, 파상풍 독소 T, AlOOH 상에 예비흡착된 PTxd 및 FHA 백일해 항원, Hib 항원, 및 임의로 폴리오 결합가를 포함하는 조성물이며, 여기에서

(i) 상기 조성물 중에 존재하는 HBsAg의 총량의 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 5±3 ℃의 온도에서 보관된 상기 조성물의 제조일로부터 출발하여 3 개월 이상 동안 AlOOH 상에 흡착된 채로 유지되고;

(ii) 상기 조성물 중에 존재하는 Hib 항원의 총량의 65%, 70% 또는 바람직하게는 75% 이상이 AlOOH 상에 흡착되지 않으며, 상기 량은 시간이 지남에 따라 비교적 안정하게 남아 있는다.

또한, 본 발명에 따른 방법에 의해, 면역원성이기 위해서 알루미늄 옥사이드 하이드록사이드 상에 흡착되는 것이 유리한 것으로 나타난 HBsAg 이외의 항원들을 또한 흡착된 채로 유지시킨다.

따라서, 예로서, 본 발명에 따른 조성물은

- 10 내지 30 ㎍의 HBsAg/㎖; 바람직하게는 20 ㎍/㎖;

- 40 내지 80 Lf의 D/㎖, 바람직하게는 50 내지 70 Lf/㎖;

- 10 내지 50 Lf의 T/㎖, 바람직하게는 10 내지 30 Lf/㎖;

- 40 내지 60 ㎍의 FHA/㎖; 바람직하게는 50 ㎍/㎖;

- 40 내지 60 ㎍의 PTxd/㎖; 바람직하게는 50 ㎍/㎖;

- 2 내지 60 ㎍의 PRP/㎖; 바람직하게는 20 내지 24 ㎍/㎖;

- 1 내지 2 ㎎의 AlOOH/㎖; 바람직하게는 1.2 ㎎의 AlOOH/㎖;

- 35 내지 45 mMol/ℓ 농도의 포스페이트 이온, 바람직하게는 38 내지 42 mMol/ℓ의 포스페이트 이온;

- 100 내지 1000 ㎍/㎖, 바람직하게는 400 내지 800 ㎍/㎖의 양이온성 아미노산; 및 임의로

- 각각 80, 16 및 64 DU/㎖의 양의, 비활성화된 형태의 1, 2 및 3 유형의 폴리오바이러스

를 포함할 수도 있음이 지시된다.

앞서 지시된 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 추가적인 보르데텔라 페르투시스 항원, 예를 들어 페르탁틴(69 kDa의) 또는 아글루티노젠을 또한 포함할 수 있다.

실시예

HepB-Dt-Tt-페르투시스-폴리오-HiB 6가 백신의 산업적인 규모의 벌크(250 ℓ) 제조

상기 제조를 멸균 조건 하에서 연속적으로 교반하면서 수행한다.

A - AlOOH 상에 흡착된 HBsAg의 제조

브렌탁 AG에 의해 판매되는 알루미늄 옥사이드 하이드록사이드(AlOOH) 젤의 균질한 현탁액을 8 g 알루미늄/ℓ로 50 ℓ 탱크에 무균 하에 도입시킨다.

0.22 ㎛ 필터를 통한 여과 후에, 최종 백신 중의 20 ㎍/㎖의 농도를 획득하는데 필요한 부피의 HBsAg를, 이미 AlOOH를 함유하는 상기 탱크에 연속적으로 가한다.

상기 혼합물을 균질한 현탁액을 수득하기 위해서 주변 온도에서 20 내지 24 시간 동안 교반하면서 방치한다.

B - 알루미늄 젤 상에 흡착된 D + T + PTxd + FHA의 제조

동시에, 알루미늄 젤, 디프테리아 변성독소(D), 파상풍 변성독소(T), 보르데텔라 페르투시스 변성독소(PTxd) 및 보르데텔라 페르투시스 섬유상 헤마글루티닌(FHA)의 혼합물을 하기 방식으로 제조한다:

브렌탁 AG에 의해 판매되는 AlOOH 젤의 균질한 현탁액을 8 g 알루미늄/ℓ로 250 ℓ 탱크에 무균 하에 도입시킨다.

D 및 이어서 균질화 후 T의 용액들을, 60 Lf(응집의 한계)/㎖ 및 20 Lf/㎖의 최종 백신 중의 각각의 D 및 T 농도를 획득하기 위해서, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과 후, 이미 AlOOH를 함유하는 상기 250 ℓ 탱크에 연속적으로 도입시킨다.

일단 상기 균질한 혼합물이 수득되었으면, AlOOH 상에 예비흡착된 PTxd의 현탁액 및 AlOOH 상에 예비흡착된 FHA의 현탁액을, 25 ㎍/㎖의 최종 백신 중 PTxd 및 FHA 농도를 획득하기 위해서, 상기 탱크에 무균 하에 연속적으로 가한다.

최종적으로, 20 내지 30 mMol/ℓ의 포스페이트 이온 농도를 획득하기 위해 필요한 부피의 500 mM의 포스페이트 완충액을 0.22 ㎛ 필터 통과 후에 가한다.

생성되는 D-T-PTxd-FHA-AlOOH 현탁액을 5±3 ℃의 온도에서 14 시간 이상 동안 교반 방치한다.

C - 알루미늄 젤 상에 흡착된 HBsAg + D + T + PTxd + FHA의 혼합물의 제조

상기 A에서 수득된 제제를 상기 B에서 수득된 제제에 무균 하에서 가한다.

상기 혼합물을 균질한 현탁액을 수득하기 위해 교반 방치한다.

이어서 최종 조성물 중의 40 mMol/ℓ의 포스페이트 이온 농도를 획득하기 위해 필요한 부피의 500 mM의 포스페이트 완충액을 0.22 ㎛ 필터 통과 후에 가한다.

D - 알루미늄 젤/HBsAg + D + T + PTxd + FHA 복합체의 정전기적 부위의 아미노산 용액에 의한 포화

하기의 조성을 갖는, 12 개 필수 아미노산을 함유하는 아미노산 용액을 제조한다:

- 아르기닌 하이드로클로라이드 …… 2.1 g/ℓ, 즉 1.73 g/ℓ의 아르기닌

- 시스틴 ………………… 1.2 g/ℓ

- 히스티딘 ………………… 0.8 g/ℓ

- 아이소류신 ………………… 2.6 g/ℓ

- 류신 …………………… 2.6 g/ l

- 리신 하이드로클로라이드 3.65 g/ℓ, 즉 2.91 g/ℓ의 리신

- 메티오닌 …………… 0.75 g/ℓ

- 페닐알라닌 ………… 1.65 g/ℓ

- 쓰레오닌 ……………… 2.4 g/ℓ

- 트립토판 …………… 0.4 g/ℓ

- 타이로신 ………………… 1.8 g/ℓ

- 발린 …………………… 2.35 g/ℓ

즉, 5.44 g/ℓ의 양이온성 아미노산(His - Arg - Lys)을 포함한, 21.2 g/ℓ의 아미노산.

450 ㎖의 2.5N 수산화 나트륨(NaOH)을 가한다(0.5 ℓ/분). 상기 균질화를 10 분간 교반하면서 속행한다.

0.22 ㎛ 필터를 통해 여과된 상기 아미노산 용액을 최종 조성물 중의 572 ㎍/㎖의 양이온성 아미노산 농도를 획득하기 위해서, C에서 수득된 혼합물에 연속적으로 가한다.

E - pH 조절

상기 D에서 수득된 현탁액의 pH를 2.5 N의 수산화 나트륨의 여과된 모액을 사용하여 pH 7.1(7.0 내지 7.2)로 조절한다.

F - 소아마비 항원의 첨가

이어서 0.22 ㎛를 통해 여과된, 비활성화된 형태의 폴리오바이러스 혈청형 1, 2 및 3(각각 마호니(Mahoney), MEF-1 및 사우케트(Saukett) 균주)을 함유하는 제제를, E에서 수득된 현탁액을 함유하는 탱크에 도입시킨다.

G - PRP-T의 첨가

먼저 PRP-T의 중간 용액을 하기 방식으로 제조한다: 앞서 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과된 트리스-슈크로스 완충제를, 중간 혼합물을 조성하기 위해서 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과된 PRP-T의 제제에 가한다.

상기 혼합물을 F에서 수득한 혼합물에 무균 하에 도입시킨다.

H - 최종 조절 단계

G에서 수득된 현탁액의 균질화 후에, 250 ℓ의 표적 부피에 도달하기에 충분한 양의 예비여과된 주사-등급 수를 가한다. 이어서 필요한 경우, 상기 혼합물의 pH를 예비여과된 2.5 N 수산화 나트륨 또는 10% 아세트산 용액의 첨가에 의해 pH 7.1±0.1로 조절한다.

상기 혼합물을 5±3 ℃에서 보관하고, 이어서 주사기 또는 병에 0.5 ㎖/용량의 비율로 분배한다.

따라서 하나의 0.5 ㎖ 용량은 600 ㎍의 Al³⁺, 10 ㎍의 HBsAg, 200 IU 이상의 D, 40 IU 이상의 T, 25 ㎍의 Pt, 25 ㎍의 FHA, 20 내지 43 DU(D 항원 단위)의 1형 소아마비, 5 내지 9 DU의 2형 소아마비, 17 내지 36 DU의 3형 소아마비, 12 ㎍의 PRP(PRP-T의 형태), 40 mMol/ℓ 농도의 포스페이트 이온, 2.5 mMol/ℓ의 트리스 및 2.125%의 슈크로스 농도의 트리스-슈크로스 완충제, 및 또한 286 ㎍의 양이온성 아미노산(His-Arg-Lys)을 함유한다.

임상 시험

상기 실시예에 따라 제조된 백신 조성물을, 인판릭스 헥사(Infanrix Hexa)(상표)(본 발명에 따라 제조된 백신과 동일한 질병(디프테리아, 파상풍, 백일해, 소아마비, Hib 감염 및 B형 간염)에 대해 아동을 백신화할 수 있으나, 특히 그의 일부가 동결건조되고 따라서 투여 과정 전에 상기 동결건조물을 용해시키는 작업이 필요하다는 결점을 갖는다)라 지칭되는, 이미 시중에 존재하는 6가 백신과 비교하여, 임상 시험으로 시험하였다.

상기 임상 시험 동안, 2 가지 유형의 백신 조성물을 아동에게, 2, 4 및 6 개월째에 투여되는 3 회 용량을 포함하는 백신 섭생으로 투여하였다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 액체는 매우 잘 허용되고 시중에 존재하는 백신만큼 면역원성인 것으로 입증되었다.

실험 데이터

HBsAg의 흡착 백분율/흡착되지 않은 PRP-T의 양

3 개 배치의 최종 벌크 생성물(PFV39-41-42) 및 또한 병에 분배된 3 개의 배치(S12-13-14)(이들 배치는 모두 상기 제공된 실시예에 따라 수득되었다)를 +5 ℃에서 보관하고 각각 9 및 22 개월의 기간 동안 다양한 시점들에서 분석하였다. 상기 분석은 HBsAg의 흡착 백분율 및 흡착되지 않은 PRP-T의 양에 관한 것이다.

상기 HBsAg의 흡착 백분율을 앞서 지시된 바와 같이, 총 HBsAg 함량 및 흡착되지 않은 HBsAg 함량으로부터 측정하였으며, 상기 HBsAg 측정을 유럽 약전 2.7.1에 의해 정의된 규정에 따라 샌드위치 ELISA 방법을 사용하여 수행하였다. 간단히, 상기 HBsAg을 96-웰 플레이트의 웰에서, IgM 유형의 항-HBsAg 1차 단클론 항체에 의해 포획하였다. 상기와 같이 결합된 HBsAg를 IgG 유형의 항-HBsAg 2차 단클론 항체(페록시다제-결합된 항-IgG 다클론 항체에 의해 그 자체가 검출된다)로 코팅하였다. 페록시다제에 대한 발색성 기질인 테트라메틸벤지딘(TMB)은 발색제로서 작용하였다. 상기 발색제를 첨가하면, 색상이 나타나며, 그의 강도는 상기 웰 중에 포획된 HBsAg의 양에 비례하였다. 상기 결과를 유럽 약전 5.3.3에 개시된 평행선 방법에 따라 분석하였다.

상기 HBsAg의 흡착 백분율을 측정하기 위해서, 상기 백신을 원심분리시키고(8800 g; 5 분; 20 ℃), 흡착되지 않은 HBsAg를 함유하는 상등액을 회수할 수 있었다. 상기 시험하려는 상등액의 샘플을, 포함된 범위 중에서 2 배 연속 희석으로, 예를 들어 1/400 내지 1/12 800의 희석으로, 탈착 완충제를 포함하는 ELISA 완충제로 희석하였다.

상기 전체-백신 및 표준-범위 백신을, 포함된 범위 중에서 2 배 연속 희석으로, 예를 들어 1/8 내지 1/25 600의 희석으로, 탈착 완충제를 포함하는 ELISA 완충제로 희석하였다.

상기 1차 단클론 항체로 코팅된 96-웰 플레이트를 5 ℃에서 12 시간 동안 배양하고 이어서 PBS-트윈 20 용액으로 세척하였다. 상기 상등액, 상기 전체 백신 및 상기 표준 범위의 희석액들을 상기 웰에 분배하였다. 이어서 2차 항체를 가하고 페록시다제-접합된 항체 및 TMB(테트라메틸벤지딘)로 발색을 수행하였다. 1N HCl을 가하여 상기 반응을 정지시켰다. 각 단계 후에, 상기 플레이트를 25 ℃에서 30 분간 배양하고 이어서 후속으로 상기 PBS-트윈 20 용액으로 세척하였다. 블랭크(희석 완충제)를 이용 가능한 웰에 가하고 동일한 처리를 수행하였다. 상기 플레이트를 OD 450 및 630 ㎚에서 판독하였다.

흡착되지 않은 PRP-T의 양을 하기 식으로 HPAEC-PAD(고성능 음이온 교환 크로마토그래피 - 펄스화된 전류측정 검출)에 의해 평가하였다:

먼저 0.5 내지 12.5 ㎍/㎖의 표준 범위의 비교 PRP-T를 제조하였다.

상기 시험하고자 하는 샘플 및 또한 표준 범위 샘플을 주변 온도에서 5 분간 5000 g에서 원심분리시켰다. 상등액들을 수거하고 이어서 내부 표준으로서 글루코스아민-1-포스페이트를 함유하는 1.5N NaCl 용액으로 가수분해시켰다. 블랭크(0.9% NaCl; 1.5N NaOH + 내부 표준)를 가하였다.

상기 크로마토그래피를, 35 mM NaOH 및 114 mM의 나트륨 아세테이트로 구성되고 상기 컬럼에 1.2 ㎖/분의 속도로 주입되는 이동상으로 수행하였다.

흡착되지 않은 PRP(㎍/㎖)의 농도를 하기 식을 사용하여 계산하였다:

(PRP 피크의 표면적/내부 표준 피크의 표면적) = a x [PRP 농도] + b

여기에서, "a"는 기울기이고, "b"는 y-축상의 절편이고, a 및 b는 회귀선으로부터 측정되었다.

상기 결과들을 하기 표 4에 제공한다:

비교를 위해서, 동일한 항원들로 구성되지만 도 1에 개시된 선형 제형화 방법에 따라 수득된, 따라서 상기 실시예에 개시된 경우와 상이한 액체 제제의, 상기 최종 벌크 생성물의 3 개의 배치(FDN5-6-7) 및 또한 병에 분배된 3 개의 배치(S 44-45-46) 중에 함유된 HBsAg의 시간에 따른 흡착을 또한 시험하였다. 상기 제제는 0.5 ㎖ 중에: 10 ㎍의 HBsAg, 30 Lf의 Dt, 10 Lf의 Tt, 25 ㎍의 Pt, 25 ㎍의 FHA, 40 DU의 1형 폴리오바이러스, 8 DU의 2형 폴리오바이러스, 32 DU의 3형 폴리오바이러스, 12 ㎍의 PRP(PRP-T의 형태), 0.6 ㎎의 Al, 55 mMol/ℓ 농도의 포스페이트 이온, 20 mMol/ℓ 농도의 카보네이트 이온, 2.5 mMol/ℓ의 트리스 및 2.125%의 슈크로스 농도의 트리스-슈크로스 완충제, 및 상기 M199 배지(폴리오 결합가), pH 6.8 - 7.2로부터 기원하는 14 ㎍의 양이온성 아미노산(His-Arg-Lys)을 함유하였다.

획득된 결과는 하기와 같았다:

동일한 기간 동안 측정된 흡착되지 않은 PRP-T의 양은 0 시간과 비교하여 거의 변화가 없었으며 따라서 만족스러운 것으로 나타났다. 그러나, 이러한 결과는, 이 경우에(본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 제형에 상응하지 않는다), B형 간염 표면 항원이 상기 알루미늄 옥사이드 하이드록사이드 상에 흡착된 채로 남아있지 않았다.

양이온성 아미노산에 관한 실험 데이터

상기 제공된 실시예에서 수행된 실험 프로토콜로부터 직접 생성되는 본 발명에 따른 조성물과, 오직 3 개의 양이온성 아미노산(Arg-Lys-His)만을 함유하는 조성물이 12 개의 필수 아미노산의 조성물 대신 사용된 것이 변형된 프로토콜에 의해 수득된 조성물을, 끝에서 PRP-T의 흡착되지 않은 양에 관하여 비교하였다. 흡착되지 않은 PRP-T의 양의 차이는 관찰되지 않았으며, 이에 의해 오직 상기 양이온성 아미노산만이 중요함을 보였다.

Claims (14)

1. 적어도
   -알루미늄 옥사이드 하이드록사이드(AlOOH),
   -하나의 B형 간염 표면 항원(HBsAg),
   -담체 단백질에 접합된 캡슐 폴리사카라이드로 이루어지는 하나의 b형 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)(Hib) 항원
   을 포함하고, 상기 B형 간염 표면 항원이 AlOOH 상에 흡착된 채로 유지되는 반면 상기 Hib 항원은 흡착되지 않은 채로 유지되는 액체 백신 조합의 제조 방법으로,
   -상기 B형 간염 표면 항원을, AlOOH/HBsAg 복합체를 수득하기 위해서 AlOOH 상에 흡착시키고,
   -상기 AlOOH/HBsAg 복합체를 100 ㎎/ℓ 이상 농도의 양이온성 아미노산 및 35 내지 45 mMol/ℓ 농도의 포스페이트 이온의 존재 하에서 상기 Hib 항원과 혼합시키는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   HBsAg 항원을, AlOOH의 현탁액을 HBsAg의 현탁액과 4 시간 이상, 바람직하게는 12 시간 이상, 바람직하게는 20 내지 24 시간 동안 교반하면서 혼합시킴으로써 알루미늄 상에 흡착시키는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   양이온성 아미노산을 Hib 항원과의 혼합 전에 AlOOH/HBsAg 복합체에 가함을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   양이온성 아미노산을 AlOOH/HBsAg 복합체와의 혼합 전에 Hib 항원에 가함을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   포스페이트 이온을 Hib 항원과의 혼합 전에 AlOOH/HBsAg 복합체에 가함을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   AlOOH/HBsAg 복합체를 포함하는 제제의 pH를 Hib 항원과의 혼합 전에 7.1 ± 0.1로 조절함을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서,
   -디프테리아, 파상풍, 소아마비 및 백일해 항원 중에서 선택된 하나 이상의 항원 및 또한 알루미늄 옥사이드 하이드록사이드를 포함하는 조성물을 제조하고,
   -AlOOH/HBsAg 복합체를, Hib 항원과의 혼합을 수행하기 전에 상기 조성물과 혼합시킴
   을 또한 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서,
   각각의 항원들을 알루미늄 옥사이드 하이드록사이드의 현탁액에 연속적으로 가하고 각 항원들의 첨가 사이에서 교반함으로써 조성물을 제조함을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서,
   -AlOOH/HBsAg 복합체를 형성시키기 위해서, HBsAg를 20 내지 24 시간의 기간 동안 최종 조성물 중에 존재하는 총 AlOOH의 1/3을 나타내는 부분적인 양의 AlOOH 상에 흡착시키고,
   -동시에, 하기를 추가적인 양의 AlOOH 상에 연속적으로 흡착시키고: 디프테리아 독소 D, 파상풍 독소 T, 자체가 AlOOH 상에 예비흡착된 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 정제된 독소 PTxd, 및 자체가 AlOOH 상에 예비흡착된 보르데텔라 페르투시스 섬유상 헤마글루티닌 FHA, 이어서 여기에 포스페이트 이온을 가하고, 이어서 여기에 상기 AlOOH/HBsAg 복합체를 가하고,
   -포스페이트 이온을 최종 조성물 중의 40 mMol/ℓ의 농도가 성취될 수 있게 하는 양으로 다시 가하고,
   -하나 이상의 양이온성 아미노산을 최종 조성물 중의 100 ㎎/ℓ 이상의 농도가 성취될 수 있게 하는 양으로 가하고,
   -pH를 7.1±0.1로 조절하고,
   -비활성화된 1형 및/또는 2형 및/또는 3형 바이러스 형태의 소아마비 항원을 가하고,
   -Hib 항원을 가하고,
   -상기 pH를 7.1±0.1로 조절하고,
   -상기 수득된 조성물을 주사기 또는 병에 분배함
   을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    250 ℓ 이상의 백신 조성물을 산업적인 규모로 제조함을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따라 수득되고 적어도 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 및 파상풍 단백질에 접합된 폴리리보실리비톨 포스페이트(PRP-T)로 이루어지는 Hib 항원을 포함하는 백신 조성물.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    디프테리아, 파상풍, 소아마비 및 백일해 항원을 또한 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    적어도
    -B형 간염 표면 항원, HBsAg,
    -디프테리아 독소 D 형태의 디프테리아 항원,
    -파상풍 독소 T 형태의 파상풍 항원,
    -정제된 독소(PTxd) 및 섬유상 헤마글루티닌(FHA) 형태의 백일해 항원,
    -파상풍 단백질에 접합된 폴리리보실리비톨 포스페이트(PRP-T) 형태의 b형 헤모필루스 인플루엔자에 항원,
    -1, 2 및 3형 중에서 선택된 비활성화된 바이러스 형태의 소아마비 항원
    을 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
14. 제 13 항에 있어서,
    적어도
    - 10 내지 30 ㎍의 HBsAg, 바람직하게는 20 ㎍/㎖;
    - 40 내지 80 Lf의 D/㎖, 바람직하게는 50 내지 70 Lf/㎖;
    - 10 내지 50 Lf의 T/㎖, 바람직하게는 10 내지 30 Lf/㎖;
    - 40 내지 60 ㎍의 FHA/㎖, 바람직하게는 50 ㎍/㎖;
    - 40 내지 60 ㎍의 PTxd/㎖, 바람직하게는 50 ㎍/㎖;
    - PRP-T 접합체 형태의, 2 내지 60 ㎍의 PRP/㎖, 바람직하게는 20 내지 24 ㎍/㎖;
    - 1 내지 2 ㎎의 AlOOH/㎖, 바람직하게는 1.2 ㎎의 AlOOH/㎖;
    - 35 내지 45 mMol/ℓ, 바람직하게는 38 내지 42 mMol/ℓ의 포스페이트 이온;
    - 100 내지 1000 ㎍/㎖, 바람직하게는 400 내지 800 ㎍/㎖의 양이온성 아미노산;
    - 각각 80, 16 및 64 DU/㎖의 양의, 비활성화된 형태의 1, 2 및 3형의 폴리오바이러스
    를 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
    

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