JP6356886B2 - 水酸化酸化アルミニウムへ吸着可能な少なくとも２種類の抗原を含有するワクチンの調製方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）からなるＢ型肝炎抗体価（valence）および２歳未満の小児において有効となるようにキャリアータンパク質（例えば破傷風タンパク質）とコンジュゲートしたポリリボシルリビトールリン酸（ＰＲＰ）と称される莢膜多糖類からなるヘモフィルスインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）ｂ型抗体価の両方を含むワクチンの分野に関する。

幼児への投与を対象としているこのような合剤は、一般的に、いくつかの疾患に対する予防接種を可能にする他の抗原、およびアルミニウムベースのアジュバントを含む。

特許文献１には、第１３頁に記載されているように、ジフテリア、破傷風、ポリオ、百日咳、Ｂ型肝炎およびヘモフィルスインフルエンザ菌ｂ型の感染に対する抗原を含むワクチン組成物が開示されている。これらの抗原のいくつかは、それらに免疫原性を持たせるために、アルミニウム塩に吸着させる必要がある。これは、特に、Ｂ型肝炎表面抗原またはＨＢｓＡｇの場合である。

しかしながら、特許文献１の第１２頁に記載されているように、破傷風タンパク質とコンジュゲートした莢膜多糖類からなるＨｉｂ抗体価は、アルミニウム塩に吸着した場合、その免疫原性を経時的に喪失していく傾向がある。この欠点を回避するためにこの先行技術が提案している解決法は、先行出願である特許文献２において既に推奨されていたように、陰イオン、特にリン酸イオン、炭酸イオンまたはクエン酸イオンを加えることである。

しかしながら、本発明の発明者らは、イオンの添加、特にリン酸イオンまたは炭酸イオンの添加によって、実際に、ＰＲＰ−Ｔが水酸化酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）へ吸着するのを防ぐことができ、その結果、その免疫原性を経時的に維持することができるが、この添加は、Ｂ型肝炎表面抗原自体も水酸化酸化アルミニウムに吸着している場合にはＢ型肝炎表面抗原を脱着させるという欠点を有することを見出した。

国際公開第ＷＯ９９／１３９０６号 国際特許出願第ＰＣＴ／ＦＲ９６／００７９１号

したがって、Ｂ型肝炎表面抗原はＡｌＯＯＨに吸着されたままであるが、Ｈｉｂ抗原は吸着されないままである、水酸化酸化アルミニウムを含む混合ワクチンの調製方法を見出すことが必要とされている。

この目的を達成するために、本発明の対象は、少なくとも、
− １つのＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、
− キャリアータンパク質とコンジュゲートした莢膜多糖類からなる、１つのヘモフィルスインフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）抗原、
− 水酸化酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）
を含む液体混合ワクチンであって、該Ｂ型肝炎表面抗原はＡｌＯＯＨに吸着されたままであるが、該Ｈｉｂ抗原は吸着されないままである、液体混合ワクチンの調製方法であって、
− 該Ｂ型肝炎表面抗原をＡｌＯＯＨに吸着させて、ＡｌＯＯＨ／ＨＢｓＡｇ複合体を得ること、
− 少なくとも１００ｍｇ／Ｌの濃度の陽イオンアミノ酸および３５〜４５ｍＭｏｌ／Ｌの濃度のリン酸イオンの存在下で、該ＡｌＯＯＨ／ＨＢｓＡｇ複合体をＨｉｂ抗原と混合すること
を含む、方法である。

本発明の方法によって、Ｂ型肝炎表面抗原の水酸化酸化アルミニウムへの吸着の保持とＨｉｂ抗原の非吸着の保持との所望のバランスを達成することができる。

本発明の特定の一実施態様によると、ＡｌＯＯＨの懸濁液とＨＢｓＡｇの懸濁液を撹拌しながら少なくとも４時間、好ましくは少なくとも１２時間、好ましくは２０〜２４時間混合することによって、ＨＢｓＡｇ抗原を該アルミニウムに吸着させる。

本発明の特定の一実施態様によると、Ｈｉｂ抗原との混合の前にＡｌＯＯＨ／ＨＢｓＡｇ複合体に陽イオンアミノ酸を添加する。

本発明の別の実施態様によると、ＡｌＯＯＨ／ＨＢｓＡｇ複合体との混合の前にＨｉｂ抗原に陽イオンアミノ酸を添加する。

本発明の一実施態様によると、Ｈｉｂ抗原との混合の前にＡｌＯＯＨ／ＨＢｓＡｇ複合体にリン酸イオンを添加する。

本発明の一実施態様によると、Ｈｉｂ抗原との混合の前に、ＡｌＯＯＨ／ＨＢｓＡｇ複合体を含む調製物のｐＨを７.１±０.１に調整する。

本発明の態様は、また、特許請求の範囲に記載の方法に従って得られる、少なくとも、
− Ｂ型肝炎表面抗原、
− ジフテリア毒素Ｄの形態のジフテリア抗原、
− 破傷風毒素Ｔの形態の破傷風抗原、
− 精製毒素（ＰＴｘｄ）の形態の百日咳抗原および糸状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）の形態の百日咳抗原、
− 破傷風タンパク質とコンジュゲートしたポリリボシルリビトールリン酸の形態のヘモフィルスインフルエンザ菌ｂ型抗原（ＰＲＰ−Ｔ）、
− １型、２型および３型の不活化ウイルスの形態のポリオ抗原
を含む混合ワクチンである。

このようなワクチン組成物は、液体の形態であり、それによって、凍結乾燥品を溶解する操作を回避するという利点を有している；使用する日まで、製造日から３６か月後であっても、免疫原性を維持するのに十分なほど安定であることが立証された。

本発明によると、当該ワクチン組成物は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含んでいる。この抗原は、特に、Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ^TMワクチンまたは他の何れかのＢ型肝炎ワクチン中に含まれているようなＢ型肝炎表面抗原であり得る。特に、それは、Ｈｅｐａｖａｘ−Ｇｅｎｅ^TMワクチン中に含まれているような、Crucellによって開発された技術に従って修飾されたハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）酵母の醗酵によって得られる組換え抗原であり得る。本発明の目的のために、０.５ｍＬ用量中に含まれるＨＢｓＡｇの量は、有利には、５〜１５μｇ、特に１０μｇである。

本発明によると、当該ワクチン組成物は、ヘモフィルスインフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）抗原を含む。この抗原は、キャリアータンパク質とコンジュゲートしている、該細菌の莢膜多糖類またはポリリボシルリビトールリン酸（ＰＲＰ）からなる。該キャリアータンパク質は、ワクチンの分野でこの点において使用されているいずれかのタンパク質であり得る。例えば、ジフテリア毒素Ｄ、破傷風毒素Ｔ、インフルエンザ菌リポタンパク質Ｄ、ＣＲＭ１９７または髄膜炎菌（N. meningitidis）外膜タンパク質（ＯＭＰ）であり得る。ＰＲＰ−Ｔコンジュゲートを得るためには好ましくは破傷風タンパク質が使用される。本発明のために、ＰＲＰ−Ｔコンジュゲートは、破傷風タンパク質２２〜３６μｇとコンジュゲートした、用量０.５ｍＬあたりＰＲＰ １〜３０μｇの割合で、有利には、用量あたりＰＲＰ ５〜２５μｇの割合で、好ましくは用量あたりＰＲＰ １０〜１５μｇの割合で、好ましくは用量あたりＰＲＰ １０〜１２μｇの割合で、特にＰＲＰ １２μｇの割合で存在し得る。

本発明によると、当該ワクチン組成物は、水酸化酸化アルミニウムＡｌＯＯＨを含む。このアルミニウム塩は、ごく一般的に、間違って水酸化アルミニウムと称されている。本発明に使用することができるＡｌＯＯＨは、例えばBrenntag AGが販売しているＡｌＯＯＨ塩、またはReheis Corp.（Berkeley Heights、NJ）が提供しているＲｅｈｙｄｒａｇｅｌ ＨＰＡであり得るが、この２種類のアジュバントのそれぞれの製造方法は異なる。使用されるＡｌＯＯＨの量は、満足のいく免疫応答が達成されるように算出される；組成物中に含まれる抗原の数および性質に特に依存し、これらの抗原のそれぞれの量にも依存する。

単なる情報として記載するが、ＨＢｓＡｇのＡｌＯＯＨへの最大吸着量は、アルミニウム１ｍｇ（慣例的には、ＡｌＯＯＨの量は、アルミニウムＡｌ³⁺の量として表される）あたりタンパク質約７８０μｇである。かくして、ＨＢｓＡｇ １０μｇを含有し、さらなる他の抗原を含有しないワクチンについて、アルミニウムは１３μｇで十分であるが、これは、他の抗原が添加される場合に所望の効力を得るのには不十分な量である。かくして、１種以上のさらなる抗原の添加に応じて、ＨＢｓＡｇ １０μｇを、欧州薬局方が推奨する最大量である０.０１ｍｇ〜１.２５ｍｇのアルミニウムと接触させることができる。

例えば、ジフテリア、破傷風、百日咳およびＢ型肝炎抗原を含む０.５ｍＬ用量の小児用ワクチンは、慣例的に、アルミニウム０.５〜０.７ｍｇ、好ましくはアルミニウム約０.６ｍｇを含有することができる。

本発明によると、Ｂ型肝炎表面抗原は、ＡｌＯＯＨに吸着されたままであり、これは、当該組成物中に含まれるこの抗原の総量の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましく少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％が吸着形態で存在することを意味している。

本発明によると、Ｈｉｂ抗原は、ＡｌＯＯＨに吸着されないままであり、これは、当該組成物中に含まれるこの抗原の総量の少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％が非吸着形態で存在することを意味している。

本発明によると、Ｂ型肝炎表面抗原がＡｌＯＯＨに吸着されたままであり、かつ、Ｈｉｂ抗原が吸着されないままである期間は、貯蔵温度が５±３℃である場合、該組成物を製造した日から少なくとも３か月間、好ましくは少なくとも６か月間、好ましくは少なくとも１２か月間、好ましくは少なくとも１８か月間、好ましくは少なくとも２４か月間、より好ましくは少なくとも３６か月間である。好ましくは、吸着された抗原の量または吸着されていない抗原の量は、経時的に安定しているが、許容できる範囲内にとどまるならば、変化してもよい。かくして、組成物中に含まれるＨＢｓＡｇの総量の少なくとも８５％が、５±３℃の温度で貯蔵された組成物の製造日から３か月間、ＡｌＯＯＨに吸着されている場合、同条件下で１年後に、組成物中に含まれるＨＢｓＡｇの総量の８０％が吸着されたままであることは全く可能である。

吸着された抗原の量を評価するためには、当業者であればいずれかの公知方法を使用することができる。

ＨＢｓＡｇの吸着の割合の決定に関して、欧州薬局方２.７.１によって定められた規則に従ってサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用することができる。すなわち、ＨＢｓＡｇを９６ウェルプレート中にてＩｇＭ型の抗ＨＢｓＡｇ一次モノクローナル抗体によって捕捉する。このようにして結合したＨＢｓＡｇに、自身がペルオキシダーゼ結合抗ＩｇＧポリクローナル抗体によって検出されるＩｇＧ型の抗ＨＢｓＡｇ二次モノクローナル抗体を塗布する。ペルオキシダーゼに対する発色基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）は、現像主薬として作用する。それが添加されると、発色し、その強度は、ウェル中で捕捉されたＨＢｓＡｇの量に比例する。結果を、欧州薬局方５.３.３に記載されている平行線法に従って解析する。吸着の割合は、総ＨＢｓＡｇ含有量および非吸着ＨＢｓＡｇ含有量の測定から得られる。

非吸着ＰＲＰ−Ｔの量に関して、評価は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（高速イオン交換クロマトグラフィー−パルスアンペロメトリック検出）によって行うことができる。

本発明の方法によると、Ｂ型肝炎表面抗原は、ＡｌＯＯＨに吸着される。この工程は、ＡｌＯＯＨ／ＨＢｓＡｇ複合体を含有する調製物を得るために、Ｂ型肝炎表面抗原およびＡｌＯＯＨを他の抗原の不在下で接触させ、少なくとも４時間、好ましくは少なくとも１２時間、好ましくは２０〜２４時間、Ｂ型肝炎表面抗原をＡｌＯＯＨに吸着させることによって行うことができる。この吸着は、本発明に従って、リン酸イオンの不在下で行うことができる。Ｂ型肝炎表面抗原とＡｌＯＯＨとの長時間の接触は、静電相互作用の最大化および安定な相互作用の促進を目的としており、かくして、リガンド交換によって吸着をもたらすことができる。この接触は、有利には、撹拌しながら続けられる。

本発明の方法によると、ＡｌＯＯＨ／ＨＢｓＡｇ複合体は、陽イオンアミノ酸およびリン酸イオンの存在下にてＨｉｂ抗原と混合される。

本発明の目的として、「陽イオンアミノ酸」とは、ワクチン組成物のｐＨよりも高いｐＨｉを有しており、したがって、ワクチンのｐＨでは陽イオン形態で存在するであろう、アミノ酸を意味するものである；特に、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）またはヒスチジン（Ｈｉｓ）である；これらのアミノ酸は、各々、単独で、または二つ一組の混合物（Ｌｙｓ＋Ａｒｇ；Ｌｙｓ＋Ｈｉｓ；Ａｒｇ＋Ｈｉｓ）もしくは３つ全部を一緒にした混合物（Ｌｙｓ＋Ａｒｇ＋Ｈｉｓ）として使用することができる。特定の一実施態様によると、陽イオンアミノ酸は、ジペプチド形態で会合され得る。特に、下記のジペプチドが挙げられる：Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ｈｉｓ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ｈｉｓ、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ、Ｈｉｓ−ＬｙｓおよびＨｉｓ−Ａｒｇ。別法として、本発明の目的に用いられるジペプチドは、陽イオンアミノ酸と、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｓｏ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｐおよびＧｌｎから選択される非荷電アミノ酸で構成され得る。かくして、実際には、遊離形態および／またはジペプチド形態の陽イオンアミノ酸を１つ以上含有する調製物を使用することができる。所望の量の陽イオンアミノ酸を他のアミノ酸との混合物として含むアミノ酸調製物を使用することもできる。アミノ酸添加中にｐＨをあまり低下させないために、ＡｌＯＯＨ／ＨＢｓＡｇ複合体に添加する前に、塩基、特に水酸化ナトリウムによって、該アミノ酸を含む調製物のｐＨを上昇させることを考えることができる。

本発明によると、ワクチン組成物に最終的に含まれる陽イオンアミノ酸の量は、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、有利には少なくとも３００ｍｇ／Ｌ、有利には少なくとも４００ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも５００ｍｇ／Ｌである。臨界的な最大投与量はない。しかしながら、最大量は、好ましくは最大で２ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは最大で１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは最大で８００μｇ／ｍＬ、好ましくは最大で７００μｇ／ｍＬである。添加されるべき陽イオンアミノ酸の量を算出する場合、ＨＢｓＡｇおよびＨｉｂ抗原以外の抗原が含まれる媒体によって導入され得る陽イオンアミノ酸を考慮すべきである。

当該方法の一代替法によると、Ｈｉｂ莢膜多糖類の重量に対する陽イオンアミノ酸の量を決定することができ、また、１：４〜１：１００、有利には１：１０〜１：８０、好ましくは１：１５〜１：６０、または特に好ましくは１：２０〜１：３０もしくは４０のＨｉｂ多糖類／陽イオンアミノ酸重量比を提供することができる。

本発明の方法によると、ＡｌＯＯＨ／ＨＢｓＡｇ複合体は、陽イオンアミノ酸の存在下であるがリン酸イオンの存在下でも、Ｈｉｂ抗原と混合される。本発明の一実施態様によると、リン酸イオンは、ＡｌＯＯＨ／ＨＢｓＡｇ複合体をＨｉｂ抗原と接触させる前に該複合体に添加される。リン酸イオンは、例えば、リン酸水素ナトリウムもしくはリン酸水素カリウムまたはこれらの混合物を添加することによって導入され得る。リン酸イオンの量は、Ｂ型肝炎表面抗原の最大量がＡｌＯＯＨに吸着されたままであるが同時にＨｉｂ抗原の吸着を回避するように算出される。この量は、含まれる抗原の性質および数に応じて、また、特にＨＢｓＡｇおよびＨｉｂ抗原以外の抗原に応じて、変わる。

かくして、小児用ワクチンにおいて通常使用される抗原、すなわち、ＨＢｓＡｇおよびＨｉｂ抗原に加えてジフテリア抗原、破傷風抗原および百日咳抗原を含む混合ワクチンについて、最終的に得られるワクチン組成物中のリン酸イオン濃度が少なくとも３５ｍＭｏｌ／Ｌ、より詳しくは３５〜４５ｍＭｏｌ／Ｌ（境界を含む）、好ましくは３８〜４４ｍＭｏｌ／Ｌ（境界を含む）、好ましくは３８〜４２ｍＭｏｌ／Ｌ（境界を含む）となるようにリン酸イオンを添加するのが有利である。好ましい一実施態様によると、最終的に得られるワクチン組成物中のリン酸イオン濃度は、４０ｍＭｏｌ／Ｌである。

別の実施態様によると、リン酸イオンは、３５〜３８ｍＭｏｌ／Ｌ（境界を含む）の最終濃度でワクチン組成物中に含まれるような量で添加される。これは、炭酸イオンの添加によっても達成されるが、実際、過剰量の炭酸イオンが望ましくないことが分かっているので、その量は限定される。別法として、それらは、１０ｍＭｏｌ／Ｌ以下の最終濃度でワクチン組成物中に含まれるような量で添加され得る。

ＨＢｓＡｇの安定性を損ない、その脱着を促進する可能性がある過剰なイオン衝撃を回避するために、いくつか（例えば、２つ）の異なる操作（工程）でリン酸イオンを添加することが推奨される。かくして、リン酸イオンは、第１の操作で２０〜３０ｍＭｏｌ／Ｌ（境界を含む）の最終濃度を達成することができる量を添加し；次いで、第２の操作で、上記で特定したような最終濃度を達成することができる量を添加することができる。

本発明の方法の好ましい一実施態様によると、得られた調製物のｐＨは、Ｈｉｂ抗原をＡｌＯＯＨ／ＨＢｓＡｇ複合体と混合する前に、さらに７.１±０.１に調整される。実際、このようなｐＨ値は、Ｈｉｂ抗原を非吸着状態に保持することに対してプラスの効果を及ぼす。

特定の一実施態様によると、該ｐＨは、混合フェーズの後に、さらに７.１±０.１に調整される。

かくして、本発明の方法によって、
（ｉ）当該組成物中に含まれるＢ型肝炎表面抗原の総量の少なくとも６０％または８０％、好ましくは少なくとも８５％が、５±３℃の温度で貯蔵された当該組成物の製造日から少なくとも３か月間、ＡｌＯＯＨに吸着されており；
（ｉｉ）該組成物中に含まれるＨｉｂ抗原の総量の少なくとも６５％、７０％または７５％が、ＡｌＯＯＨに吸着されていない、
ワクチン組成物を得ることができる。

「ＡｌＯＯＨ／ＨＢｓＡｇ複合体」という表現は、複合体が、少なくとも、ＡｌＯＯＨに吸着されたＨＢｓＡｇ抗原を含むことを意味すると解釈される。該複合体は、特定されているか否かにかかわらず他の抗原を含み得る。

１つ以上のさらなる抗原が、さらに、該複合体を形成するようになり得る。それらは、特に、ジフテリアトキソイド（Ｄ）抗原、破傷風トキソイド（Ｔ）抗原、無菌性百日咳抗原、例えば、百日咳菌（Bordetella pertussis）解毒トキシン（ＰＴｘｄ）、同細菌の糸状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、パータクチン（６９ｋＤａ抗原）および凝集原（線毛）であり得る。特に有利な一実施態様によると、当該複合体を形成するために、Ｄ、Ｔ、ＰＴｘｄおよびＦＨＡ抗原を添加することができる。

これらのさらなる抗原は、種々の方法で添加することができる。それらは、（ｉ）ワクチン組成物に含まれる必要がある総量のＡｌＯＯＨ；または（ｉｉ）総量に達するように続いて添加される部分量のＡｌＯＯＨのいずれかに予め吸着しているＢ型肝炎表面抗原に続いて逐次的に添加され得る。別法として、これらのさらなる抗原は、それぞれ別々に、ＨＢｓＡｇと同様に、部分量のＡｌＯＯＨに吸着され得る。いくつかの抗原が別々に吸着され、残りが逐次的に吸着される混合吸着法も提供され得る。

本発明の方法の特定の一実施態様によると、得られる組成物は、各抗原の添加の後に撹拌される。

有利な一実施態様によると、一例に過ぎないが、ＨＢｓＡｇは、最終組成物中に含まれるＡｌＯＯＨの総量の約３０％（三分の一）に相当する部分量のＡｌＯＯＨに別々に吸着される。並行して、Ｄ抗原およびＴ抗原は、さらなるＡｌＯＯＨに逐次的に吸着される。次いで、ＰＴｘｄ百日咳抗原およびＦＨＡ百日咳抗原は、自体、ＡｌＯＯＨに個別に予備吸着されており、ＡｌＯＯＨ−Ｄ−Ｔ複合体を含有する調製物に添加される。最後に、２つの調製物（ＡｌＯＯＨ−ＨＢｓＡｇ複合体とＡｌＯＯＨ−Ｄ−Ｔ−ＰＴｘｄ−ＦＨＡ複合体）を合わせて、慣例的に、
− １用量あたり５〜１５μｇのＨＢｓＡｇ；好ましくは１用量あたり１０μｇのＨＢｓＡｇ、
− １用量あたり２０〜４０ＬｆのＤ；好ましくは１用量あたり２５〜３５ＬｆのＤ；好ましくは１用量あたり３０ＬｆのＤ（Ｌｆ＝フロキュレーションの限界）（別の方法で表現すると、Ｄの量は、１用量あたり２０ＩＵ以上である）、
− １用量あたり５〜２５ＬｆのＴ；好ましくは１用量あたり１０〜１５ＬｆのＴ；好ましくは１用量あたり１０ＬｆのＴ（別の方法で表現すると、Ｔの量は、１用量あたり４０ＩＵ以上である）、
− １用量あたり２０〜３０μｇのＦＨＡ；好ましくは１用量あたり２５μｇのＦＨＡ、
− １用量あたり２０〜３０μｇのＰＴｘｄ；好ましくは１用量あたり２５μｇのＰＴｘｄ
を含むワクチン用量０.５ｍＬを得るように各成分の量が選択された、ＡｌＯＯＨ−ＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−ＰＴｘｄ−ＦＨＡを含む調製物を形成する。

本発明の特定の一実施態様によると、慣例的には不活化ウイルスからなるポリオ抗原も、添加される。小児用ワクチン中に通常含まれる３種類の、すなわち、１型、２型もしくは３型のポリオウイルスを添加すること、または、これら３種類に対してワクチン接種する必要がない場合には保護を求める種類だけを導入することを考えることができる。１用量あたりのポリオウイルスの量は、特に、
− １型については、２０〜４３ＤＵ（Ｄ抗原単位）、特に４０ＤＵ、
− ２型については、５〜９ＤＵ、特に８ＤＵ、
− ３型については、１７〜３６ＤＵ、特に３２ＤＵ
であり得る。

これらの抗原は、必ずしも、ワクチン調製物に加えられる前にアルミニウム塩に予め吸着しているわけではない。

特定の一実施態様によると、本発明の方法は、
（ｉ）（ａ）ＨＢｓＡｇとＡｌＯＯＨを他の抗原の不在下で接触させ、ＨＢｓＡｇを少なくとも４時間、好ましくは少なくとも１２時間、好ましくは約２４時間ＡｌＯＯＨに吸着させ、その結果、ＡｌＯＯＨ／ＨＢｓＡｇ複合体を含有する調製物を得ること；
（ｉ）（ｂ）上記（ｉ）（ａ）で得られる調製物に、ＡｌＯＯＨに予め吸着している、Ｄ抗原、Ｔ抗原、ＰＴｘｄ抗原およびＦＨＡ抗原を含んでおり、さらにパータクチンおよび凝集原のような百日咳菌抗原を含んでいてもよい、調製物を加えること；
（ｉｉ）上記（ｉ）（ｂ）で得られる調製物にリン酸イオンを加えて、４０ｍＭｏｌ／Ｌのワクチン中最終濃度を得ること；
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）で得られる調製物に、ポリオ抗原を加えてもよいこと；
（ｉｖ）上記（ｉｉ）または（ｉｉｉ）で得られる調製物に、Ｈｉｂ抗原を含有する調製物を加えること；
（ｖ）ｐＨを７.１±０.１に調整すること；および
（ｖｉ）（ａ）Ｈｉｂ抗原の添加前に、少なくとも１種類の陽イオンアミノ酸を加えて、上記（ｉｉ）または（ｉｉｉ）で得られる調製物を完成すること、または
（ｂ）Ｈｉｂ抗原に少なくとも１種類の陽イオンアミノ酸を加えること
を含む方法であって、該陽イオンアミノ酸が、少なくとも１００ｍｇ／Ｌのワクチン中最終濃度を得るのに十分な量で添加される、方法である。

特定の一実施態様によると、本発明のワクチン組成物は、ＡｌＯＯＨに予め吸着している、ＨＢｓＡｇ、ジフテリア毒素Ｄ、破傷風毒素Ｔ、ＰＴｘｄおよびＦＨＡ百日咳抗原、ならびにＨｉｂ抗原を含んでおり、さらにポリオ抗体価を含んでいてもよい、組成物であり、
（ｉ）当該組成物中に含まれるＨＢｓＡｇの総量の少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％が、５±３℃の温度で貯蔵された当該組成物の製造日から少なくとも３か月間、ＡｌＯＯＨに吸着されたままであり；
（ｉｉ）当該組成物中に含まれるＨｉｂ抗原の総量の少なくとも６５％、７０％または好ましくは７５％が、ＡｌＯＯＨに吸着されておらず、この量は経時的に相対的に安定なままである、
組成物である。

さらに、本発明の方法により、免疫原性となるように水酸化酸化アルミニウムに吸着されるのが有利であることが示されたＨＢｓＡｇ以外の抗原もまた吸着されたままである。

かくして、例えば、本発明の組成物は、
− ＨＢｓＡｇ １０〜３０μｇ／ｍＬ；好ましくは、２０μｇ／ｍＬ；
− Ｄ ４０〜８０Ｌｆ／ｍＬ、好ましくは５０〜７０Ｌｆ／ｍＬ；
− Ｔ １０〜５０Ｌｆ／ｍＬ、好ましくは１０〜３０Ｌｆ／ｍＬ；
− ＦＨＡ ４０〜６０μｇ／ｍＬ；好ましくは５０μｇ／ｍＬ；
− ＰＴｘｄ ４０〜６０μｇ／ｍＬ；好ましくは５０μｇ／ｍＬ；
− ＰＲＰ ２〜６０μｇ／ｍＬ；好ましくは２０〜２４μｇ／ｍＬ；
− ＡｌＯＯＨ １〜２ｍｇ／ｍＬ；好ましくはＡｌＯＯＨ １.２ｍｇ／ｍＬ；
− ３５〜４５ｍＭｏｌ／Ｌの濃度のリン酸イオン、好ましくは３８〜４２ｍＭｏｌ／Ｌのリン酸イオン；
− １００〜１０００μｇ／ｍＬの陽イオンアミノ酸、好ましくは４００〜８００μｇ／ｍＬ；および任意に
− それぞれ８０、１６および６４ＤＵ／ｍＬの１型、２型および３型の不活化ウイルスの形態のポリオウイルス
を含むことができる。

上記したように、本発明の組成物は、パータクチン（６９ｋＤａ）または凝集原のようなさらなる百日咳菌抗原を含んでもよい。

図１は、各成分の添加後に混合が行われる従来技術の方法のスキームである。

実施例 − ＨｅｐＢ−Ｄｔ−Ｔｔ−百日咳−ポリオ−ＨｉＢ六価ワクチンのバルク（２５０Ｌ）の工業規模製造
この製造は、滅菌条件下で連続的に撹拌しながら行われる。

Ａ − ＡｌＯＯＨに吸着されたＨＢｓＡｇの調製
Brenntag AGによって販売されている水酸化酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）ゲルの均質懸濁液（アルミニウム８ｇ／Ｌ）を５０Ｌタンクに無菌的に導入する。
最終ワクチン中２０μｇ／ｍＬの濃度を得るために必要な量のＨＢｓＡｇを、０.２２μｍフィルターで濾過した後、すでにＡｌＯＯＨを含有している上記タンクに加える。
混合物を周囲温度で２０〜２４時間撹拌して、均質懸濁液を得る。

Ｂ − アルミニウムゲルに吸着されたＤ＋Ｔ＋ＰＴｘｄ＋ＦＨＡの調製
並行して、アルミニウムゲル、ジフテリアトキソイド（Ｄ）、破傷風トキソイド（Ｔ）、百日咳菌トキソイド（ＰＴｘｄ）および百日咳菌糸状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）の混合物を下記の方法で調製する：
Brenntag AGによって販売されているＡｌＯＯＨゲルの均質懸濁液（アルミニウム８ｇ／Ｌ）を２５０Ｌタンクに無菌的に導入する。
Ｄの溶液、次いで、均質化後にＴの溶液を、０.２２μｍフィルターで濾過した後、すでにＡｌＯＯＨを入れた上記２５０Ｌタンクに連続的に加えて、それぞれ最終ワクチン中６０Ｌｆ（フロキュレーションの限界）／ｍＬおよび２０Ｌｆ／ｍＬのＤ濃度およびＴ濃度を得る。
均質混合物が得られたらすぐに、このタンクに、ＡｌＯＯＨに予め吸着されたＰＴｘｄの懸濁液、次いで、ＡｌＯＯＨに予め吸着されたＦＨＡの懸濁液を連続して無菌的に添加して、最終ワクチン中２５μｇ／ｍＬのＰＴｘｄ濃度およびＦＨＡ濃度を得る。
最後に、２０〜３０ｍＭｏｌ／Ｌのリン酸イオン濃度を得るために必要な量の５００ｍＭリン酸緩衝液を、０.２２μｍフィルターで濾過した後に加える。
得られたＤ−Ｔ−ＰＴｘｄ−ＦＨＡ−ＡｌＯＯＨ懸濁液を５±３℃の温度で少なくとも１４時間撹拌する。

Ｃ − アルミニウムゲルに吸着されたＨＢｓＡｇ＋Ｄ＋Ｔ＋ＰＴｘｄ＋ＦＨＡ混合物の調製
上記Ａで得られた調製物を上記Ｂで得られた調製物に無菌的に加える。
この混合物を撹拌して、均質懸濁液を得る。
次いで、最終組成物中４０ｍＭｏｌ／Ｌのリン酸イオン濃度を得るために必要な量の５００ｍＭリン酸緩衝液を、０.２２μｍフィルターで濾過した後に加える。

Ｄ − アルミニウムゲル／ＨＢｓＡｇ＋Ｄ＋Ｔ＋ＰＴｘｄ＋ＦＨＡ複合体の静電的部位のアミノ酸の溶液による飽和
下記の組成を有する、１２種類の必須アミノ酸を含有するアミノ酸溶液を調製する：
すなわち、陽イオンアミノ酸（Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ）５.４４ｇ／Ｌを含むアミノ酸２１.２ｇ／Ｌである。
２.５Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）４５０ｍｌを添加する（０.５Ｌ／分）。１０分間撹拌しながら均質化を続ける。
このアミノ酸溶液を０.２２μｍフィルターで濾過し、これを上記Ｃで得られた混合物に引き続き加えて、最終組成物中５７２μｇ／ｍＬの濃度の陽イオンアミノ酸を得る。

Ｅ − ｐＨ調整
上記Ｄで得られた懸濁液のｐＨを、２.５Ｎの水酸化ナトリウム濾過貯蔵溶液を使用してｐＨ７.１（７.０〜７.２）に調整する。

Ｆ − ポリオ抗原の添加
不活化形態のポリオウイルス血清型１、２および３を含有する調製物（それぞれＭａｈｏｎｅｙ株、ＭＥＦ−１株およびＳａｕｋｅｔｔ株）を０.２２μｍフィルターで濾過し、これを、次いで、上記Ｅで得られた懸濁液を入れたタンク中に導入する。

Ｇ − ＰＲＰ−Ｔの添加
まず、ＰＲＰ−Ｔの中間溶液を以下の方法で調製する： 予め０.２２μｍフィルターで濾過したトリス−シュークロース緩衝液を、０.２２μｍフィルターで濾過したＰＲＰ−Ｔ調製物に添加して、中間混合物を調製する。
この混合物を、上記Ｆで得られた混合物に無菌的に導入する。

Ｈ − 最終調整相
上記Ｇで得られた懸濁液を均質化した後、目標体積２５０Ｌに達するために十分な量の予め濾過した注射用水を添加する。次いで、必要に応じて、予め濾過した２.５Ｎ水酸化ナトリウムまたは１０％酢酸溶液を添加して該混合物のｐＨをｐＨ７.１±０.１に調整する。
該混合物を５±３℃で貯蔵し、次いで１用量あたり０.５ｍｌの割合で注射器またはビンに分注する。
かくして、１用量０.５ｍｌは、Ａｌ³⁺ ６００μｇ、ＨＢｓＡｇ １０μｇ、Ｄ ２０ＩＵ以上、Ｔ ４０ＩＵ以上、Ｐｔ ２５μｇ、ＦＨＡ ２５μｇ、１型ポリオ２０〜４３ＤＵ（Ｄ抗原単位）、２型ポリオ５〜９ＤＵ、３型ポリオ１７〜３６ＤＵ、ＰＲＰ（ＰＲＰ−Ｔの形態）１２μｇ、４０ｍＭｏｌ／Ｌの濃度のリン酸イオン、トリスの濃度２.５ｍＭｏｌ／Ｌおよびシュークロースの濃度２.１２５％のトリス−シュークロース緩衝液、ならびに陽イオンアミノ酸（Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ）２８６μｇを含有する。

臨床試験
上記実施例に従って調製されたワクチン組成物を、Ｉｎｆａｎｒｉｘ Ｈｅｘａ^TMと称されているすでに市販されている六価ワクチンと比較して、臨床試験した。この市販の六価ワクチンは、本発明に従って調製されたワクチンと同一の疾患（ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、Ｈｉｂ感染およびＢ型肝炎）に対して小児にワクチン接種することができるが、その一部が凍結乾燥されているので投与前に凍結乾燥品を溶解する操作を要するという欠点を有する。
臨床試験の間、２か月目、４か月目および６か月目に投与する３回投与からなるワクチン計画で、２種類のワクチン組成物を小児に投与した。本発明の方法に従って調製された液体ワクチンは、非常に十分な忍容性を示し、かつ、市販のワクチンと同程度の免疫原性を示すことが判明した。

実験データ
ＨＢｓＡｇの吸着率／吸着していないＰＲＰ−Ｔの量
最終バルク生成物の３つのバッチ（ＰＦＶ３９−４１−４２）およびビンに分注した３つのバッチ（Ｓ１２−１３−１４）［これらのバッチは全て上記実施例に従って得られた］を＋５℃で貯蔵し、それぞれ、９か月間および２２か月間にわたって様々な時点で分析した。分析は、ＨＢｓＡｇの吸着率および吸着していないＰＲＰ−Ｔの量に関するものであった。
ＨＢｓＡｇの吸着率は、上記のように、ＨＢｓＡｇの総含有量および吸着していないＨＢｓＡｇの含有量から決定され、ＨＢｓＡｇの決定は、欧州薬局方２.７.１によって定められた規則に従って、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて行われた。すなわち、９６ウェルプレート中にてＨＢｓＡｇをＩｇＭ型の抗ＨＢｓＡｇ一次モノクローナル抗体によって捕捉した。このようにして結合したＨＢｓＡｇを、自身がペルオキシダーゼ結合抗ＩｇＧポリクローナル抗体によって検出されるＩｇＧ型の抗ＨＢｓＡｇ二次モノクローナル抗体でコーティングした。ペルオキシダーゼに対する発色基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を現像主薬として用いた。この現像主薬を添加すると発色し、その強度は、ウェル中で捕捉されているＨＢｓＡｇの量に比例した。この結果を、欧州薬局方５.３.３に記載の平行線法に従って分析した。
ＨＢｓＡｇの吸着率を決定するために、該ワクチンを遠心分離し（８８００ｇ；５分；２０℃）、吸着していないＨＢｓＡｇを含有する上清を回収することができた。試験しようとする上清のサンプルを、脱着緩衝液を含むＥＬＩＳＡ緩衝液で、２倍段階希釈法で、例えば１／４００〜１／１２８００の範囲で、希釈した。
全ワクチンおよび標準レンジサンプルを、脱着緩衝液を含むＥＬＩＳＡ緩衝液で、２倍段階希釈法で、１／８〜１／２５６００の範囲で、希釈した。
一次モノクローナル抗体でコーティングした９６ウェルプレートを５℃で１２時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液で洗浄した。全ワクチンおよび標準レンジの上清の希釈液をウェルに分配した。次いで、二次抗体を添加し、ペルオキシダーゼ結合抗体およびＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）で現像を行った。１Ｎ ＨＣｌの添加によって、この反応を停止した。各工程の後に、プレートを２５℃で３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液で洗浄した。利用可能なウェルにブランク（希釈緩衝液）を添加し、同じ処理を行った。プレートをＯＤ ４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで読み取った。
吸着していないＰＲＰ−Ｔの量は、下記の方法で、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（高速アニオン交換クロマトグラフィー−アンペロメトリック電気化学検出法）によって評価した：
まず、０.５〜１２.５μｇ／ｍＬの標準レンジの参照ＰＲＰ−Ｔを調製した。
試験しようとしているサンプルおよび標準レンジサンプルを周囲温度にて５０００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、次いで、内部標準としてグルコサミン−１−リン酸を含有する１.５Ｎ ＮａＣｌ溶液で加水分解した。ブランク（０.９％ＮａＣｌ；１.５Ｎ ＮａＯＨ＋内部標準）を添加した。
３５ｍＭ ＮａＯＨおよび１１４ｍＭ酢酸ナトリウムからなる移動相をカラムに１.２ｍｌ／分の速度で注入して用いてクロマトグラフィー処理を行った。
吸着していないＰＲＰの濃度（μｇ／ｍＬ）を下記の式を用いて算出した：
(ＰＲＰピークの表面積／内部標準ピークの表面積)＝ａ×[ＰＲＰ濃度]＋ｂ
式中、「ａ」は傾きであり、「ｂ」はｙ軸の切片であり、ａおよびｂは回帰線から決定される。

結果を下記の４つの表に示す：

比較のために、同一抗原からなる液体製剤であるが、図１に記載の一次的処方方法に従って得られていて、上記の実施例に記載のものとは異なる製剤の最終バルク生成物の３つのバッチ（ＦＤＮ５−６−７）およびビンに分注した３つのバッチ（Ｓ４４−４５−４６）に含まれるＨＢｓＡｇの経時的吸着を試験した。この調製物は、０.５ｍｌ中にＨＢｓＡｇ １０μｇ、Ｄｔ ３０Ｌｆ、Ｔｔ １０Ｌｆ、Ｐｔ ２５μｇ、ＦＨＡ ２５μｇ、１型ポリオウイルス４０ＤＵ、２型ポリオウイルス８ＤＵ、３型ポリオウイルス３２ＤＵ、ＰＲＰ（ＰＲＰ−Ｔの形態）１２μｇ、Ａｌ ０.６ｍｇ、５５ｍＭｏｌ／Ｌの濃度のリン酸イオン、２０ｍＭｏｌ／Ｌの濃度の炭酸イオン、トリスの濃度２.５ｍＭｏｌ／Ｌおよびシュークロースの濃度２.１２５％のトリス−シュークロース緩衝液、ならびにＭ１９９培地（ポリオ抗体価）由来の陽イオンアミノ酸（Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ）１４μｇを含むものであった（ｐＨ ６.８〜７.２）。

得られた結果は、下記のとおりであった：

同一の期間にわたって測定した吸着していないＰＲＰ−Ｔの量は、０時と比べてあまり変化がないことを示したので、十分なものであった。しかしながら、これらの結果は、本発明の方法によって得られた処方物に相当しないこのケースにおいて、Ｂ型肝炎表面抗原が水酸化酸化アルミニウムに吸着されたままではなかったことを示している。

陽イオンアミノ酸に関する実験データ
最後に、上記の実施例で行われた実験プロトコールから直接得られた本発明の組成物と、３種類の陽イオンアミノ酸（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ）だけを含有する組成物の代わりに１２種類の必須アミノ酸の組成物を用いる点で変更されたプロトコールによって得られた組成物を、吸着していないＰＲＰ−Ｔの量に関して比較した。吸着していないＰＲＰ−Ｔの量に違いは見られず、それによって、陽イオンアミノ酸だけが重要であることが示された。

Claims (4)

1. 少なくとも、
   − Ｂ型肝炎表面抗原、ＨＢｓＡｇ、
   − ジフテリア毒素Ｄの形態のジフテリア抗原、
   − 破傷風毒素Ｔの形態の破傷風抗原、
   − 精製毒素（ＰＴｘｄ）の形態の百日咳抗原および糸状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）の形態の百日咳抗原、
   − 破傷風タンパク質とコンジュゲートしたポリリボシルリビトールリン酸の形態のヘモフィルスインフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）抗原（ＰＲＰ−Ｔ）、
   − １型、２型および３型から選択される不活化ウイルスの形態のポリオ抗原、
   − リン酸イオン ３５〜４５ｍＭｏｌ／Ｌ、
   − 陽イオンアミノ酸 １００〜１０００ｍｇ／Ｌ
   を含むことを特徴とするワクチン組成物であって、該Ｂ型肝炎表面抗原は水酸化酸化アルミニウムに吸着されており、該Ｈｉｂ抗原は吸着されないままである、ワクチン組成物。
2. リン酸イオン ３８〜４２ｍＭｏｌ／Ｌを含む、請求項１記載のワクチン組成物。
3. 陽イオンアミノ酸 ４００〜８００ｍｇ／Ｌを含む、請求項１記載のワクチン組成物。
4. ＨＢｓＡｇ １０〜３０μｇ／ｍＬ、
   ジフテリア毒素Ｄの形態のジフテリア抗原 ４０〜８０Ｌｆ／ｍＬ、
   破傷風毒素Ｔの形態の破傷風抗原 １０〜５０Ｌｆ／ｍＬ、
   ＦＨＡ ４０〜６０μｇ／ｍＬ、
   ＰＴｘｄ ４０〜６０μｇ／ｍＬ、
   ＰＲＰ−Ｔコンジュゲート形態で、ＰＲＰ ２〜６０μｇ／ｍＬ、
   不活化形態の１型、２型および３型ポリオウイルス
   を含む、請求項１記載のワクチン組成物。