BR112014017416A2

BR112014017416A2 - processo de formulação de uma vacina contendo pelo menos dois antígenos capazes de se adsorverem sobre o óxi-hidróxido de alumínio

Info

Publication number: BR112014017416A2
Application number: BR112014017416-4A
Authority: BR
Inventors: Landry Bertaux; Isabelle Chacornac; Alain Françon; Jean-François Hau; Sandrine Lentsch Graf
Original assignee: Sanofi Pasteur
Priority date: 2012-01-17
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2021-05-25
Also published as: SI2804628T1; CN104039348A; ZA201405431B; US20140370049A1; AU2013210927A1; EP2804628A1; FR2985663B1; CR20140356A; UA113000C2; CA2861304A1; DK2804628T3; AR089737A1; PL2804628T3; JP6356886B2; AP2014007848A0; MX349411B; ES2625011T3; BR112014017416A8; KR20140119109A; PH12014501546B1

Abstract

processo de formulação de uma vacina contendo pelo menos dois antígenos capazes de se adsorverem sobre o óxi-hidróxido de alumínio. a invenção tem por objeto um processo para preparar uma composição vacinal, compreendendo pelo menos o óxi-hidróxido de alumínio (alooh) e pelo menos o antígeno de superfície da hepatite b e o antígeno de haemophilus influenzae tipo b. de acordo com a invenção o antígeno de superfície da hepatite b é mantido adsorvido sobre aiooh, enquanto que o antígeno de hib é mantido não adsorvido. para esse fim: se procede à adsorção do antígeno de superfície da hepatite b sobre aiooh, a fim de obter um complexo aiooh/hbsag, depois se mistura esse complexo aiooh/hbsag com o antígeno de hib em presença dos ácidos aminados catiônicos a uma concentração de pelo menos 100 mg/l, e de íons fosfato a uma concentração de 35 a 45 mmol/l.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRO-

CESSO DE FORMULAÇÃO DE UMA VACINA CONTENDO PELO MENOS DOIS ANTÍGENOS CAPAZES DE SE ADSORVEREM SO- BRE O ÓXI-HIDRÓXIDO DE ALUMÍNIO".

[001] A presente invenção é relativa ao domínio das combina- ções vacinais, compreendendo, ao mesmo tempo, a valência Hepatite B constituída pelo antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HB- sAg) e a valência Haemophilus influenzae tipo b, constituída por seu poli-sacarídeo capsular, denominado poli-ribosil ribitol fosfato (PRP) que é, para ser eficaz nas crianças de menos de dois anos, conjugado a uma proteína portadora, por exemplo, a proteína tetânica.

[002] Essas combinações que são destinadas à administração das crianças de baixa idade, compreendem geralmente outros antíge- nos, permitindo vacinar, em uma única operação, contra várias doen- ças, assim como um adjuvante à base de alumínio.

[003] Assim, o pedido de patente WO99/13906 divulga uma com- posição vacinal, compreendendo, assim como foi descrito na página 13, antígenos contra a difteria, o tétano, a pólio, a coqueluche, a hepa- tite B e as infecções a Haemophilus influenzae tipo b. Determinados desses antígenos necessitam de, para serem imunógenos, ser adsor- vidos sobre um sal de alumínio. É o caso notadamente do antígeno de superfície da hepatite B ou HBsAg.

[004] Ora, assim como foi indicado na página 12 do pedido WO99/13906, a valência HIB constituída pelo poli-sacarídeo capsular conjugado à proteína tetânica, tem tendência a perder sua imunogeni- cidade no decorrer do tempo, quando ela é adsorvida sobre sais de alumínio. Para evitar esse inconveniente, a solução proposta nessa técnica anterior é, assim como já foi recomendado no pedido anterior PCT/FR96/00791, acrescentar ânions e notadamente íons fosfato, carbonato ou citrato.

[005] Todavia, os autores da presente invenção observaram que, se o acréscimo de ânions, notadamente de fosfatos ou de carbonatos, permitir efetivamente evitar a adsorção do PRP-T sobre o óxi-hidróxido de alumínio (AlOOH), e, portanto, manter sua imunogenicidade no de- correr do tempo, esse acréscimo terá também por inconveniente des- sorver o antígeno de superfície da hepatite B quando este fora, tam- bém adsorvido sobre o óxi-hidróxido de alumínio.

[006] É, portanto, necessário encontrar um processo de preparo de uma combinação vacinal, compreendendo o óxi-hidróxido de alu- mínio, na qual o antígeno de superfície da hepatite B é mantido adsor- vido sobre AlOOH, enquanto que o antígeno de Hib é mantido não ad- sorvido.

[007] Para isso, a presente invenção tem por objeto um processo de preparo de uma combinação vacinal líquida, compreendendo pelo menos:

[008] - um antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg);

[009] - um antígeno de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) cons- tituído por poli-sacarídeo capsular conjugado a uma proteína portado- ra;

[0010] - o óxi-hidróxido de alumínio (AlOOH), na qual o antígeno de superfície da hepatite B é mantido adsorvido sobre AIOOH, enquanto que o antígeno de Hib é mantido não adsorvi- do,

[0011] segundo o qual:

[0012] - se procede à adsorção do antígeno de superfície da hepa- tite B sobre AIOOH, a fim de obter um complexo AIOOH/HBsAg,

[0013] - se mistura esse complexo AIOOH/HBsAg com o antígeno de Hib em presença de ácidos aminados catiônicos a uma concentra- ção de pelo menos 100 mg/l, e de íons fosfato a uma concentração de a 45 mMol/l.

[0014] Graças ao processo, de acordo com a invenção, é possível atingir o equilíbrio desejado entre a manutenção da adsorção do antí- geno de superfície da hepatite B sobre o óxi-hidróxido de alumínio e a manutenção da não adsorção do antígeno de Hib.

[0015] De acordo com um modo particular de realização da inven- ção, procede-se à adsorção do antígeno HBsAg sobre o alumínio, mis- turando uma suspensão de AlOOH a uma suspensão de HBsAg sob agitação durante pelo menos quatro horas, de preferência, pelo menos 12 horas, de preferência, entre 20 e 24 horas.

[0016] De acordo com um modo particular de realização da inven- ção, acrescentam-se os ácidos aminados catiônicos a esse complexo AlOOH/HBsAg, antes da mistura com o antígeno Hib.

[0017] De acordo com um modo particular de realização da inven- ção, acrescentam-se os ácidos aminados catiônicos a esse antígeno de Hib antes da mistura com o complexo AlOOH/HBsAg.

[0018] De acordo com um modo de realização da invenção, acres- centam-se os íons fosfato a esse complexo AlOOH/HBsAg, antes da mistura com o antígeno Hib.

[0019] De acordo com um modo de realização da invenção, ajusta- se o pH do preparado, compreendendo o complexo AlOOH/HBsAg a

7.1 + 0,1 antes da mistura com o antígeno de Hib.

[0020] A invenção tem também por objeto uma combinação vaci- nal obtida, segundo o processo reivindicado e compreendendo pelo menos:

[0021] - o antígeno de superfície da hepatite B,

[0022] - o antígeno da difteria sob a forma de toxina diftérica D,

[0023] - o antígeno do tétano sob a forma de toxina tetânica T,

[0024] - os antígenos da coqueluche sob a forma de Toxina Purifi- cada (PTxd) e de Hemaglutinina Filamentosa (FHA),

[0025] - o antígeno de Haemophilus influenzae tipo b, sob a forma de poli-ribosil ribitol fosfato conjugado à proteína tetânica (PRP-T),

[0026] - os antígenos da pólio sob a forma de vírus inativados de tipo 1, 2 e 3.

[0027] Essa composição vacinal apresenta a vantagem de se a- presentar sob a forma líquida, o que evita operações de retomada de liofilizado; ela se mostrou suficientemente estável para permanecer imunógeno até hoje de sua utilização e isto mesmo a 36 meses depois de sua data de fabricação.

[0028] De acordo com a invenção, a composição vacinal compre- ende um antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg). Esse antígeno pode notadamente ser um antígeno de superfície da hepatite B, tal como aquele presente na vacina Recombivax HBTM, ou em qualquer outra vacina contra hepatite B. Pode notadamente tratar-se do antíge- no recombinante obtido por fermentação de um lêvedo Hansenula polymorpha modificada, segundo a tecnologia desenvolvida por Cru- cell, tal como aquele presente na vacina Hepavax-GeneTM. Para fins da invenção, a quantidade de HBsAg presente em uma dose de 0,5 ml está vantajosamente compreendida entre 5 e 15 µg e, em particular, de 10 µg.

[0029] De acordo com a invenção, a composição vacinal compre- ende um antígeno de Haemophilus influenzae tipo B, (Hib). Esse antí- geno é constituído pelo poli-sacarídeo capsular da bactéria ou poli- ribosil ribitol fosfato que é conjugado a uma proteína portadora. A pro- teína portadora pode ser qualquer proteína em uso a esse respeito no domínio das vacinas. Pode ser, por exemplo, a toxina diftérica D, a to- xina tetânica T, a lipoproteína D de Haemophilus influenzae, a CRM197 ou a proteína da membrana externa (OMP) de N. meningiti- dis. Utiliza-se, de preferência, a proteína tetânica, a fim de se obter o conjugado PRP-T. Para fins da presente invenção, o conjugado PRP-T pode estar presente, à razão de 1 a 30 µg de PRP por dose de 0,5 ml;

vantajosamente de 5 a 25 µg de PRP por dose; de preferência, de 10 a 15 µg de PRP por dose; de maneira inteiramente preferida de 10 a 12 µg de PRP por dose, e, mais particularmente, 12 µg de PRP, con- jugado a 22-36 µg de proteína tetânica.

[0030] De acordo com a invenção, a composição vacinal compre- ende óxi-hidróxido de alumínio AlOOH. Esse sal de alumínio é muito freqüentemente denominado, por abuso de linguagem, hidróxido de alumínio. O AlOOH podendo ser utilizado para fins da presente inven- ção pode ser, por exemplo, o AlOOH comercializado por Brenntag AG ou o Rehydragel HPA de Reheis Corp. (Berkeley Heights, NJ), embora o modo de produção de cada um dos dois adjuvantes difira. A quanti- dade de AlOOH utilizada é calculada para permitir o alcance de uma resposta imunitária satisfatória; ela depende notadamente do número e da natureza dos antígenos presentes na composição, assim como a quantidade de cada um desses antígenos.

[0031] A título informativo somente, o máximo de adsorção do HB- sAg sobre o AlOOH é da ordem de 780 µg de proteína por mg de alu- mínio (de maneira clássica a quantidade de AlOOH é expressa em quantidade de alumínio Al3+). Para uma dose vacinal que compreende µg de HBsAg, sem outros antígenos adicionais, bastaria, portanto, 13 µg de alumínio, quantidade, todavia, insuficiente para se obter a eficácia buscada, quando outros antígenos são acrescentados. Assim, em função do acréscimo de um ou vários antígenos suplementares, pode-se colocar em contato 10 µg de HBsAg com 0,01 mg a 1,25 mg de alumínio que é a quantidade máxima recomendada pela farmaco- peia europeia.

[0032] Por exemplo, uma dose de 0,5 ml de uma vacina pediátrica, compreendendo antígenos da difteria, do tétano, da coqueluche, da hepatite B, pode conter, de maneira convencional, de 0,5 a 0,7 mg de alumínio, de preferência, aproximadamente 0,6 mg de alumínio.

[0033] De acordo com a invenção o antígeno da superfície da he- patite B é mantido adsorvido sobre aquele AlOOH, o que significa que pelo menos 60%, de preferência, pelo menos 65%, de preferência, pe- lo menos 70%, de preferência, pelo menos 75%, de preferência, pelo menos 80%, de preferência, 85%, de preferência, pelo menos 90%, de preferência, pelo menos 95% da quantidade total desse antígeno pre- sente na composição o é sob a forma adsorvida.

[0034] De acordo com a invenção, o antígeno de Hib é mantido não adsorvido sobre AlOOH, o que significa que pelo menos 65%, de preferência, pelo menos 70%, de preferência, pelo menos 75%, da quantidade total desse antígeno presente na composição o é sob a forma não adsorvida.

[0035] De acordo com a invenção, a duração durante a qual o an- tígeno de superfície da hepatite B é mantido adsorvido sobre o AlOOH e o antígeno de Hib é mantido não adsorvido é de pelo menos 3 me- ses, de preferência, pelo menos 6 meses, de preferência, pelo menos 12 meses, de preferência, pelo menos 18 meses, de preferência, pelo menos 24 meses, de preferência, ainda pelo menos 36 meses, a partir da data de fabricação da composição, quando a temperatura de con- servação é de 5 + 3 oC. De preferência, a quantidade de antígenos ad- sorvidos ou não adsorvidos é estável no decorrer do tempo, mas ela pode também variar, à condição de permanecer em limites aceitáveis. Assim, quando pelo menos 85% da quantidade total do HBsAg presen- te na composição são adsorvidos sobre o AlOOH durante 3 meses, a partir da data de fabricação da composição conservada a uma tempe- ratura de 5 + 3 oC, é inteiramente possível que, ao cabo de um ano e sempre nas mesmas condições de conservação, 80% da quantidade total do HBsAg presente na composição sejam mantidos adsorvidos.

[0036] Para apreciar a quantidade de antígeno adsorvido, o técni- co pode utilizar qualquer método conhecido.

[0037] No que se refere à determinação da percentagem de ad- sorção do HBsAg, é possível utilizar um método ELISA de tipo sanduí- che segundo as regras definidas pela farmacopéia européia 2.7.1. Brevemente, o HBsAg é capturado por um anticorpo monoclonal pri- mário anti-HBsAg de tipo IgM, em poços de uma placa de 96 poços. O HBsAg assim fixado é recoberto por um anticorpo monoclonal anti- HBsAg, de tipo IgG que é ele próprio detectado por um anticorpo poli- clonal anti-IgG, acoplado à peroxidase. Um substrato cromógeno da peroxidase, a tetra-metil benzidina (TMB), serve de agente revelador. Quando de seu acréscimo, uma cor se desenvolve, cuja intensidade é proporcional à quantidade de HBsAg capturado no poço. A análise dos resultados é feita segundo o método das retas paralelas descrito na Farmacopeia Europeia 5.3.3. A percentagem de adsorção é obtida a partir da determinação do conteúdo total em HBsAg e do conteúdo em HBsAg não adsorvido.

[0038] No que se refere à quantidade de PRP-T não adsorvida, pode-se fazer a avaliação por HPAEC-PAD (cromatografia de troca de íons elevado desempenho-detecção amperométrica pulsada).

[0039] De acordo com o processo da invenção, o antígeno da su- perfície da hepatite B é adsorvido sobre o AlOOH. Essa etapa é reali- zada colocando em contato o antígeno de superfície da hepatite B e o AlOOH na ausência de qualquer outro antígeno e deixando o antígeno da superfície da hepatite B se adsorver sobre o AlOOH, durante pelo menos 4 horas, de preferência, pelo menos 12 horas, de maneira intei- ramente preferida entre 20 e 24 horas, para se obter um preparado contendo um complexo AlOOH/HBsAg. Essa adsorção pode ser reali- zada, segundo a invenção, na ausência de íons fosfatos. O objetivo prosseguido por um tempo de contato prolongado entre o antígeno de superfície da hepatite B e o AlOOH consiste em maximizar as intera- ções eletrostáticas e em favorecer as interações estáveis, podendo chegar assim a uma adsorção por troca de ligante. Esse contato é vantajosamente prosseguido sob agitação.

[0040] De acordo com o processo da invenção, realiza-se a mistu- ra do complexo AlOOH/HBsAg com o antígeno de Hib em presença de ácidos aminados catiônicos e de íons fosfatos.

[0041] Para fins da invenção, entendem-se por ácidos aminados catiônicos ácidos aminados dos quais o pHi é superior ao pH da com- posição vacinal e que estarão, sob a forma catiônica no pH da vacina; trata-se notadamente da Lisina (Lys), da Arginina (Arg) ou da Histidina (His); cada um desses ácidos aminados pode ser utilizado sozinho, ou em mistura seja por 2 (Lys + Arg; Lys + His; Arg + His), seja os 3 con- juntos (Lys + Arg + His). Segundo um modo particular, os ácidos ami- nados catiônicos podem ser associados sob a forma de dipeptídeo. Citam-se notadamente os dipeptídeos Lys-Lys, Lys-Arg, Lys-His, Arg- Arg, Arg-Lys, Arg-His, His-His, His-Lys e His-Arg. De maneira alternati- va, um dipeptídeo útil para fins da presente invenção pode ser com- posto de um ácido aminado catiônico e um ácido aminado não carre- gado selecionado dentre Ala, Val, Leu, Iso, Pro, Met, Phe, Trp, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp e Gln. Assim, na prática, pode-se utilizar um preparado contendo um ou vários ácidos aminados catiônicos sob a forma livre e/ou de dipeptídeo. É também possível utilizar preparados de ácidos aminados, compreendendo, ao mesmo tempo, ácidos ami- nados catiônicos em quantidade desejada, em mistura com outros áci- dos aminados. A fim de não produzir uma queda muito grande do pH, quando do acréscimo dos ácidos aminados, pode-se prever aumentar o pH do preparado compreendendo os ácidos aminados antes de a- crescentá-lo ao complexo AlOOH/HBsAg, por meio de uma base, no- tadamente da soda.

[0042] De acordo com a invenção, a quantidade de ácidos amina- dos catiônicos presentes na composição vacinal no final, deve ser de pelo menos 10 mg/L, vantajosamente de pelo menos 30 mg/L, vanta- josamente de pelo menos 400 mg/L; de maneira inteiramente preferi- da, de pelo menos 500 mg/L. Não existe dose máxima crítica. Todavia, é preferível que a quantidade máxima seja no máximo 2 mg/ml, de preferência, ainda no máximo igual 1 mg/ml; de preferência, ainda no máximo 800 µg/ml; de maneira inteiramente preferida no máximo 700 µg/ml. Quando do cálculo da quantidade de ácidos aminados catiôni- cos a acrescentar, convém considerar ácidos aminados catiônicos ca- pazes de serem fornecidos pelos meios nos quais estão presentes os antígenos diferentes do HBsAg e o antígeno do Hib.

[0043] Segundo uma alternativa do processo, pode-se determinar a quantidade de ácidos aminados catiônicos em relação ao peso do poli-sacarídeo capsular de Hib e prever uma relação em peso poli- sacarídeo de Hib/ácido aminado catiônico de 1 : 4 a 1 : 100, vantajo- samente de 1 : 10 a 1 : 80, de preferência, de 1 : 15 a 1 : 60, de ma- neira particularmente preferida 1 : 20 a 1 : 30 ou 40.

[0044] De acordo com o processo da invenção, a mistura do com- plexo AlOOH/HBsAg com o antígeno de Hib é realizado em presença de ácidos aminados catiônicos, mas também em presença de íons Fosfatos. De acordo com um modo de realização da invenção, os íons fosfatos são acrescentados ao complexo AlOOH/HBsAg antes de sua colocação em contato com o antígeno Hib. O fornecimento de íons fos- fato pode, por exemplo, ser realizado por acréscimo de hidrogeno fos- fato de sódio ou de hidrogeno fosfato de potássio, ou ainda por uma mistura dos dois. A quantidade de íons fosfatos é calculada para que o máximo de antígenos de superfície da hepatite B permaneça adsorvi- do sobre o AlOOH, evitando a adsorção do antígeno Hib. Essa quanti- dade varia em função da natureza e do número dos antígenos presen- tes, e notadamente em função dos antígenos, diferentes dos antígenos HBsAg e Hib.

[0045] Assim, para uma combinação vacinal compreendendo os antígenos habitualmente utilizados nas vacinas pediátricas sejam, a- lém disso, o HBsAg e do antígeno, os antígenos da difteria, do tétano, da coqueluche, pode ser vantajoso acrescentar íons fosfatos, de tal modo que a concentração de íons fosfatos na composição vacinal ob- tida ao final seja pelo menos igual a 35 mMol/l, e, mais particularmen- te, esteja compreendida entre 35 e 45 mMol/l, bornes incluídos; de preferência, entre 38 e 44 mMol/l, bornes inclusos; de maneira inteira- mente preferida, entre 38 e 42 mMol/l, bornes inclusos. De acordo com um modo preferido, a concentração de íons fosfato na composição va- cinal obtida em último lugar é de 40 mMol/l.

[0046] De acordo com um modo alternativo, os íons fosfato são acrescentados em quantidade tal que estão presentes na composição vacinal a uma concentração final compreendida entre 35 mMol/l, bor- nes inclusos. Completa-se, acrescentando-se, além disso, íons de carbonato, mas, todavia, em quantidade limitada, pois se observou, com efeito, que uma quantidade de íons carbonatos muito grande era desfavorável. Vantajosamente, eles podem ser acrescentados em quantidade tal que estão presentes na composição vacinal a uma con- centração final inferior ou igual a 10 mMol/l.

[0047] A fim de evitar um choque iônico muito importante que po- deria desestabilizar o HBsAg e favorecer sua dessorção, preconiza-se acrescentar íons fosfato em várias (por exemplo, em 2) operações (e- tapas) distintas. Assim, os íons fosfato podem ser acrescentados em uma primeira operação, em quantidade permitindo atingir uma concen- tração final compreendida entre 20 e 30 mMol/l bornes inclusos; de- pois, em uma segunda operação, em quantidade, permitindo atingir uma concentração final tal como especificada acima.

[0048] De acordo com um modo de realização preferido, conforme a invenção, ajusta-se, além disso, o pH do preparado obtido a 7.1 +

0,1, antes de misturar o antígeno Hib com o complexo AlOOH/HBsAg. Observou-se, com efeito que esse valor de pH tinha um efeito positivo sobre a manutenção no estado não adsorvido do antígeno Hib.

[0049] De acordo com um modo de realização particular, ajusta- se, além disso, o pH a 7.1 + 0.1, após a fase de mistura.

[0050] Assim, graças ao processo, de acordo com a invenção, po- de-se obter uma composição vacinal, na qual:

[0051] (i) pelo menos 60 ou 80%, de preferência, pelo menos 85% da quantidade total do antígeno de superfície da hepatite B presente na composição é adsorvido sobre o AlOOH durante pelo menos 3 me- ses, a partir da data de fabricação da composição conservada a uma temperatura de 5 + 3 oC; e

[0052] (ii) pelo menos 65, 70 ou 75% da quantidade total do antí- geno Hib presente na composição não é adsorvido sobre AlOOH.

[0053] A expressão "complexo AlOOH/HBsAg" deve ser interpre- tada como significante que o complexo compreende pelo menos o an- tígeno HBsAg adsorvido sobre o AlOOH. O complexo pode conter ou- tros antígenos, quer isto seja precisado ou não.

[0054] Um ou vários antígenos adicionais pode(m) vir, além disso, formar o complexo. Pode notadamente tratar-se da anatoxina diftérica (D), da anatoxina tetânica (T), antígenos acelulares da coqueluche, tais como: a toxina destoxificada de Bordetella pertussis (PTxd), a he- maglutinina filamentosa (FHA), a pertactina (antígeno de 69 kDa) e aglutinógenos (fimbriae) dessa mesma bactéria. De acordo com um modo particularmente vantajoso, para formar o complexo, podem-se acrescentar antígenos D, T, PTxd e FHA.

[0055] Os antígenos adicionais podem ser acrescentados de di- versas maneiras. Eles podem ser acrescentados, de maneira seqüen- cial, na sequência do antígeno de superfície da hepatite B adsorvido previamente (I), seja sobre a quantidade total de AlOOH que deve es-

tar presente na composição vacinal; (II) seja sobre uma quantidade parcial, completada na sequência para atingir a quantidade total. De maneira alternativa, os antígenos adicionais podem ser adsorvidos de maneira separada, cada um sobre uma quantidade parcial de AlOOH, como o HBsAg. Pode-se também prever um processo de adsorção mista - determinados antígenos sendo adsorvidos de maneira separa- da; outros sendo adsorvidos, de maneira sequencial.

[0056] De acordo com um modo particular do processo, segundo a invenção, agita-se a composição obtida, após acréscimo de cada antí- geno.

[0057] De acordo com um modo vantajoso e dado unicamente a título de exemplo, o HBsAg é adsorvido, de maneira separada, sobre uma quantidade parcial de AlOOH correspondente a aproximadamente 30% (um terço) da quantidade total de AlOOH presente na composi- ção final. Em paralelo, os antígenos D são adsorvidos, de maneira se- quencial, sobre a parte complementar do AlOOH. Depois ao prepara- do, contendo o complexo AlOOH-D-T, acrescentam-se os antígenos da coqueluche PTxd e FHA, cada um desses dois últimos antígenos tendo sido eles próprios adsorvidos individualmente sobre o AlOOH. Enfim, reúnem-se os dois preparados (complexo AlOOH - HbsAg e complexo AlOOH - D - T - PTxd - FHA) para formar um preparado compreendendo o complexo AlOOH - HbsAg - D - T - PTxd - FHA, no qual as quantidades de cada um dos elementos foram escolhidos para serem obtidas doses vacinais de 0,5 ml compreendendo, de forma clássica:

[0058] - de 5 a 15 µg de HBsAg / dose; de preferência, 10 µg / do- se,

[0059] - de 20 a 40 Lf de D / dose; de preferência, 25 a 35 Lf / do- se; de maneira inteiramente preferida, 30 Lf / dose. (Lf = limite de flo- culação), (expressa, de uma outra maneira, a quantidade de D é supe-

rior ou igual a 20 UI / dose),

[0060] - de 5 a 25 Lf de T / dose; de preferência, de 10 a 15 Lf / dose; de maneira inteiramente preferida, 10 Lf / dose, (expressa de outra maneira, a quantidade de T é superior ou igual a 40 UI / dose),

[0061] - de 20 a 30 µg de FHA / dose; de preferência, 25 µg / do- se,

[0062] - de 20 a 30 µg de PTxd / dose; de preferência, 25 µg / do- se.

[0063] De acordo com um modo particular de realização da inven- ção, acrescentam-se antígenos da pólio que são constituídos, de for- ma convencional, por vírus inativados. Pode-se prever acrescentar ví- rus da pólio dos três tipos habitualmente presentes nas vacinas pediá- tricas, isto é, os tipos 1, 2 ou 3, ou, no caso em que não seria necessá- rio vacinar contra os três tipos, introduzir apenas os tipos contra os quais a proteção é buscada. As quantidades de vírus da pólio por dose podem notadamente ser:

[0064] - entre 20 e 43 DU (unidades de antígenos D), em particular 40 para o tipo 1,

[0065] - entre 5 e 9 DU, em particular 8, para o tipo 2,

[0066] - entre 17 e 36 DU, em particular 32, para o tipo 3.

[0067] Esses antígenos não são necessariamente adsorvidos pre- viamente sobre um sal de alumínio, antes de serem acrescentados ao preparo vacinal.

[0068] De acordo com um modo de realização particular, o pro- cesso conforme a invenção, é um processo segundo o qual:

[0069] - (i) (a) se coloca em contato o HBsAg e o AlOOH na au- sência de qualquer outro antígeno, e se deixa o HBsAg se adsorver sobre o AlOOH durante pelo menos 4 horas, de preferência, pelo me- nos 12 horas, de maneira inteiramente preferida de aproximadamente 24 horas, para se obter um preparado contendo um complexo de AlO-

OH/HBsAg;

[0070] (i) (b) ao preparado obtido no ponto (i) (a), se acrescenta um preparado compreendendo os antígenos D, T, PTxd e FHA, previ- amente adsorvidos sobre AlOOH, e de maneira opcional antígenos adicionais de Bordetella. pertussis, tais como a Pertactina e os agluti- nogênios;

[0071] (ii) ao preparado obtido no ponto (i) (b), se acrescentam í- ons fosfato, a fim de se obter uma concentração final na vacina de 40 mMol/l,

[0072] (iii) ao preparado obtido no ponto (ii), se acrescentam, de maneira opcional, os antígenos da pólio,

[0073] (iv) ao preparado obtido no ponto (ii) ou (iii), se acrescenta um preparado contendo o antígeno Hib,

[0074] (v) se ajusta o pH em 7.1 + 0.1; e

[0075] (vi) (a) se acrescenta pelo menos um ácido aminado catiô- nico para completar o preparado obtido no ponto (ii) ou (iii) antes do acréscimo do antígeno Hib, ou

[0076] (b) se acrescenta ao antígeno Hib pelo menos ácido ami- nado catiônico; esse ácido aminado catiônico sendo acrescentado em quantidade su- ficiente, a fim de se obter uma concentração final na vacina de pelo menos 100 mg/l.

[0077] De acordo com um modo particular, a composição vacinal, segundo a invenção, é uma composição que compreende o HBsAg, a toxina diftérica D, a toxina tetânica T, os antígenos da coqueluche PTxd e FHA tendo sido pré-adsorvidos sobre o AlOOH, o antígeno Hib, e opcionalmente a valência pólio, na qual:

[0078] (i) pelo menos 85%, de preferência, pelo menos 90% da quantidade total do HBsAg presente na composição é mantido adsor- vido sobre o AlOOH durante pelo menos 3 meses, a partir da data de fabricação da composição conservado a uma temperatura de 5 + 3 oC; e

[0079] (ii) pelo menos 65, 70, ou, de preferência, 75% da quanti- dade total do antígeno Hib presente na composição não é adsorvido sobre o AlOOH, essa quantidade permanecendo relativamente estável no decorrer do tempo.

[0080] Além disso, graças ao processo, de acordo com a inven- ção, os antígenos, além do HBsAg, que mostraram que era vantajoso que eles fossem adsorvidos sobre o óxi-hidróxido de alumínio para se- rem imunógenos, são também mantidos adsorvidos.

[0081] Assim, indica-se, a título de exemplo, que uma composição, de acordo com a invenção, pode compreender:

[0082] - de 10 a 30 µg do HBsAg / ml, de preferência, 20 µg / ml;

[0083] - de 40 a 80 Lf de D/ml, de preferência, 50 a 70 Lf/ml;

[0084] - de 10 a 50 Lf de T/ml, de preferência, 10 a 30 Lf/ml;

[0085] - de 40 a 60 µg de FHA/ml, de preferência, 50 µg/ml;

[0086] - de 40 a 60 µg de PTxd/ml, de preferência, 50 µg/ml;

[0087] - de 2 a 60 µg de PRP/ml, de preferência, 20-24 µg/ml;

[0088] - de 1 a 2 mg de AlOOH/ml; de preferência, 1.2 mg de A- lOOH/ml;

[0089] - íons fosfato a uma concentração de 35 a 45 mMol/l, de preferência, 38 a 42 mMol/l de íons fosfato;

[0090] - 100 a 1000 µg/ml de ácidos aminados catiônicos, de pre- ferência, de 400 a 800 µg/ml; e, de maneira opcional;

[0091] - os tipos 1, 2 e 3 do vírus pólio sob a forma inativa em quantidade respectiva de 80, 16 e 64 DU/ml.

[0092] Conforme indicado anteriormente, uma composição, de a- cordo com a invenção, pode também compreender antígenos adicio- nais de Bordetella. pertussis, tais como a Pertactina (de 69 kDa) ou os aglutinogênios.

[0093] Descrição da Figura: A Figura 1 é um esquema de um processo da técnica anterior, segundo o qual, após o acréscimo de cada componente, se mistura. Exemplo - Preparo na escala industrial a granel (250 L) de uma vacina hexavalente HepB-Dt-Tt-Pertussis-pólio-HiB

[0094] Esse preparo é feito nas condições estéreis e sob agitação contínua: A - Preparo do HBsAg adsorvido sobre AlOOH

[0095] Em uma cuba de 50 l, introduz-se, de maneira asséptica, uma suspensão homogênea de gel de óxi-hidróxido de alumínio (AlO- OH) comercializado por Brenntag AG, a 8 g de alumínio/l.

[0096] Após filtragem sobre um filtro 0,22 µm, o volume necessário de HBsAg, para se obter uma concentração de 20 µg/ml na vacina fi- nal, é acrescentado em contínuo na cuba, contendo já o AlOOH.

[0097] A mistura é deixada sob agitação durante 20 a 24 horas à temperatura ambiente, de maneira a se obter uma suspensão homo- gênea. B - Preparo de D + T + PTxd + FHA adsorvidas sobre o gel de alumí- nio

[0098] Em paralelo, prepara-se uma mistura de gel de alumínio, de anatoxina diftérica (D), de anatoxina tetânica (T), de anatoxina de Bor- detella pertussis (PTxd) e de hemaglutinina filamentosa de Bordetella pertussis (FHA) da seguinte maneira:

[0099] em uma cuba 250 l, introduz-se, de maneira asséptica, uma suspensão homogênea de gel de AlOOH comercializado por Brenntag AG, a 8 g de Alumínio / l;

[00100] na cuba de 250 l, contendo já o AlOOH, são introduzidos sucessivamente, após filtragem sobre filtro 0,22 µm, as soluções de D, depois, após homogeneização, de T de maneira a se obterem as con- centrações respectivas em D e T na vacina final de 60 Lf (limite de flo-

culação)/ml e 20 Lf/ml.

[00101] Uma vez a mistura homogênea obtida, são acrescentados sucessivamente nessa cuba, de maneira asséptica, a suspensão de PTxd previamente absorvida sobre AlOOH, depois a suspensão de FHA previamente adsorvida sobre AlOOH, a fim de se obterem as concentrações em PTxd e FHA na vacina final de 25 µg/ml.

[00102] Enfim, acrescenta-se, após filtragem sobre um filtro 0,22 µm, o volume necessário de tampão fosfato 500 mM para se obter uma concentração em íons fosfato de 20 a 30 mMol/l.

[00103] A suspensão D - T - PTxd - FHA - AlOOH assim obtida é deixada sob agitação pelo menos durante 14 horas a uma temperatura de 5 + 3 oC. C - Preparo da mistura HBsAg + D + T + PTxd + FHA adsorvidos so- bre gel de alumínio.

[00104] Ao preparo obtido no ponto B, acrescenta-se, de maneira asséptica, o preparo obtido no ponto A.

[00105] Essa mistura é deixada sob agitação, de maneira a se obter uma suspensão homogênea.

[00106] Depois se acrescenta o volume necessário de tampão fos- fato 500 mM, após filtragem sobre um filtro 0,22 µm, para se obter uma concentração em íons fosfato de 40 mMol/l na composição final. D - Saturação dos locais eletrostáticos do complexo gel de alumínio / HBsAg + D + T + PTxd + FHA por uma solução de ácidos aminados.

[00107] Fabrica-se uma solução de ácidos aminados contendo 12 ácidos aminados essenciais, da seguinte composição: - cloridrato de arginina ................. 2,1 g/l, 1,73 g/l de arginina - cistina ........................................ 1,2 g/l - histidina ..................................... 0,8 g/l - isoleucina ................................... 2,6 g/l - leucina ....................................... 2.6 g/l

- cloridrato de lisina ....................... 3.65 g/l seja 2,91 g/l de lisina - metionina ................................... 0,75 g/l - fenil alanina ............................... 1,65 g/l - treonina ...................................... 2,4 g/l - triptofano .................................... 0,4 g/l - tirosina ....................................... 1,8 g/l - valina ......................................... 2,35 g/l

[00108] Seja 21,2 g/l de ácidos aminados dos quais 5,44 g/l de áci- dos aminados catiônicos (His - Arg - Lys).

[00109] Acrescentam-se 450 ml de soda (NaOH) 2.5 N (0,5 l / por minuto). Deixa-se a homogeneização prosseguir, sob agitação, duran- te 10 minutos.

[00110] Essa solução de ácidos aminados, filtrada sobre filtro 0,22 µm, é acrescentada em contínuo na mistura obtida em C, de maneira a se obter uma concentração de 572 µg/ml de ácidos aminados catiôni- cos na composição final. E - Ajuste do pH

[00111] O pH da suspensão obtida no ponto D é ajustado em pH

7.1 (7.0 - 7.2), utilizando uma solução de estoque de soda com 2.5 N filtrada. F - Acréscimo dos antígenos pólio

[00112] É então introduzida na cuba contendo a suspensão obtida em E, um preparado contendo os sorotipos 1, 2 e 3 do vírus da pólio sob a forma inativada (cepas Mahoney, MEF-1 e Saukett respectiva- mente) filtrada sobre filtro 0,22 µm. G - Acréscimo PRP-T

[00113] Prepara-se inicialmente uma solução intermediária de PRP- T da seguinte maneira: a um preparado de PRP-T filtrada sobre filtro 0,22 µm é acrescentado do tampão Tris sacarose previamente filtrado sobre filtro 0,22 µm para constituir uma mistura intermediária.

[00114] Essa mistura é introduzida assepticamente na mistura obti- da em F. H - Fase final de ajuste

[00115] Após homogeneização da suspensão obtida em G, é a- crescentada uma quantidade suficiente de água PPI filtrada previa- mente, de maneira a atingir o volume alvo de 250 l. Depois, se neces- sário, o pH da mistura é ajustado em pH 7.1 + 0.1, acrescentando-se uma solução de soda 2.5 N ou de ácido acético 10% filtrada previa- mente.

[00116] A mistura é estocada a 5 + 3 oC; depois repartida em serin- gas ou em frascos à razão de 0,5 ml/dose.

[00117] Uma dose de 0,5 ml contém assim 600 µg de Al3+, 10 µg de HBsAg, não menos de 20 IU de D, não menos de 40 IU de T, 25 µg de Pt, 25 µg de FHA, entre 20 e 43 DU (unidade de antígeno D) de pólio tipo I, entre 5 e 9 DU do pólio tipo 2, entre 17 e 36 DU do pólio tipo 3, 12 µg do PRP (sob a forma do PRP-T), íons fosfato a uma concentra- ção de 40 mMol/l, do tampão Tris sacarose a uma concentração de 2.5 mMol/l de Tris e de 2.125% de sacarose, assim como 286 µg de áci- dos aminados catiônicos (His - Arg - Lys). Teste clínico

[00118] A composição vacinal preparada, segundo o exemplo aci- ma, foi testada em um teste clínico, comparativamente a uma vacina hexavalente já presente no mercado, o Infanrix HexaTM, que permite vacinar crianças contra as mesmas doenças que a vacina preparada, de acordo com a invenção (a difteria, o tétano, a coqueluche, a pólio, as infecções com Hib e a hepatite B), mas que apresenta notadamente o inconveniente de ter uma parte liofilizada, e, portanto, necessitar de uma operação de retomada de liofilizado previamente ao ato de admi- nistração.

[00119] Quando do teste clínico, os 2 tipos de composições vaci-

nais foram administrados em crianças, em um esquema vacinal com- preendendo 3 doses administradas em 2, 4 e 6 meses. A vacina líqui- da preparada, segundo o processo da invenção, se mostrou bem mais tolerada, e também imunógena, que a vacina presente no mercado.

DADOS EXPERIMENTAIS Percentagem de adsorção do HBsAg / Quantidade de PRP-T não ad- sorvido

[00120] Três lotes de produto final a granel (PFV39-41-42), assim como três lotes repartidos em frascos (S12-13-14) - todos os lotes ten- do sido obtidos, segundo o exemplo fornecido - foram conservados a + oC e analisados em diferentes tempos em um período de 9 a 22 me- ses respectivamente. A análise se referiu sobre a percentagem de ad- sorção do HBsAg e a quantidade de PRP-T não adsorvido.

[00121] A determinação da percentagem de adsorção do HBsAg foi realizada, assim conforme foi indicado anteriormente, a partir da de- terminação do conteúdo total em HBsAg e do conteúdo em HBsAg não adsorvido, a determinação em HBsAg sendo realizada, graças a um método ELISA de tipo sanduíche, segundo as regras definidas pela Farmacopéia Européia 2.7.1. Brevemente, o HBsAg foi capturado por um anticorpo monoclonal primário anti-HBsAg de tipo IgM, em poços de uma placa de 96 poços. O HBsAg assim fixado foi recoberto por um anticorpo monoclonal secundário anti-HBsAg, de tipo IgG que foi ele próprio detectado por um anticorpo policlonal anti-IgG, acoplado à pe- roxidase. Um substrato cromógeno da peroxidase, a tetrametil benzi- dina (TMB), serviu de agente revelador. Quando de seu acréscimo, uma cor se desenvolveu, cuja intensidade era proporcional à quanti- dade de HBsAg capturado no poço. A análise dos resultados foi feita segundo o método das retas paralelas descrita na Farmacopeia Euro- peia 5.3.3.

[00122] A fim de determinar a percentagem de adsorção do HBsAg,

submeteu a vacina a uma centrifugação (8800 g; 5 minutos; 20 oC), o que permitiu recuperar o que flutua contendo o HBsAg não adsorvido. As amostras do que flutua a testar foram diluídas em tampão ELISA, compreendendo um tampão de dessorção em série de 2 em uma faixa compreendida, por exemplo, entre 1/400 e 1/2800.

[00123] As amostras de vacina total e de faixa padrão foram diluí- das em tampão ELISA, compreendendo um tampão de dessorção, em série de 2 em uma faixa compreendida, por exemplo, entre 1/800 e 1/25600.

[00124] Uma placa de 96 poços recobertos pelo anticorpo monoclo- nal primário foi incubada 12 horas a 5%, depois lavado com uma solu- ção PBS-Tween 20. As diluições do que flutua, da vacina total e da faixa padrão, foram repartidas nos poços. Depois se acrescentou o anticorpo secundário e se revelou com o anticorpo conjugado à pero- xidase e a TMB (tetra metil benzidina). A reação foi parada acrescen- tando-se o HCl 1 N. Após cada etapa, a placa foi incubada durante 30 minutos a 25 oC, depois em seguida lavada com a solução PBS-Tween

20. Um branco (tampão de diluição) foi acrescentado nos poços dispo- níveis e sofreu os mesmos tratamentos. A placa foi lida em DO 450 e 630 nm.

[00125] Avaliou-se a quantidade de PRP-T não adsorvida por HPA- EC-PAD (cromatografia de troca de íons de elevado desempenho - detecção amperométrica pulsada) da seguinte maneira:

[00126] preparou-se inicialmente uma faixa padrão de PRP-T de referência de 0,5 a 12,5 µg/ml.

[00127] As amostras a testar foram centrifugadas, assim como as amostras da faixa padrão a 5000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. O que flutua foi recolhido, depois hidrolisados com uma so- lução de NaCl 1,5 N, contendo a glicosamina -1- fosfato como padrão interno. Acrescentou-se um branco (NaCl 0,9%; NaOH 1,5 N + padrão interno).

[00128] A cromatografia foi utilizada com uma fase móvel composta de NaOH 35 mM e de acetato de sódio 114 mM injetada na coluna à razão de 1.2 ml/ minutos.

[00129] Calculou-se a concentração em PRP não adsorvido (µg/ml), a partir da seguinte igualdade:

[00130] (Superfície do pico PRP / superfície do pico padrão interno) = a x [concentração em PRP] + b, na qual "a" é a inclinação e "b" é a ordenada na origem, a e b tendo sido determinados, a partir da reta de regressão.

[00131] Os resultados são apresentados nas 4 tabelas abaixo: Percentagem de adsorção do HBsAg na formulação do produto final a granel (PFV 39 - 41 - 42) a + 5 oC Tempo decorrido após a PFV 39 PFV 41 PFV 42 operação de formulação 0 95 97 98 1 mês 92 93 95 2 meses 92 92 93 3 meses 91 90 91 4 meses 89 90 92 5 meses 85 88 91 6 meses 89 88 89 9 meses 88 86 91 Percentagem de adsorção do HBsAg na formulação conservada em frascos (lotes S12 - S13 - S14) a + 5 oC Tempo decorrido após a S12 S13 S14 operação de formulação 0 95 97 98 4 meses 88 88 90 5 meses 85 86 88 7 meses 85 80 86

Percentagem de adsorção do HBsAg na formulação conservada em frascos (lotes S12 - S13 - S14) a + 5 oC Tempo decorrido após a S12 S13 S14 operação de formulação 10 meses 83 84 87 13 meses 82 86 84 16 meses 81 83 85 22 meses 83 78 86

PRP - T não adsorvido (µg/ml) na formulação do produto final a gra- nel (PFV 39 - 41 - 42) a + 5 oC Tempo decorrido após a PFV 39 PFV 41 PFV 42 operação de formulação 0 22.6 20.0 21.0 1 mês 23.1 19.5 20.4 2 meses 23.3 21.6 22.0 3 meses 24.9 22.6 23.1 4 meses 24.2 22.0 20.7 5 meses 22.2 22.7 24.5 6 meses 27.7 22.9 21.6 9 meses 27.0 24.8 23

PRP - T não adsorvido (µg/ml) na formulação conservada em frascos (lotes S12 - S13 - S14) a + 5 oC Tempo decorrido após a S12 S13 S14 operação de formulação 0 22,6 20,0 21,0 4 meses 21,1 21,1 19,8 5 meses 23,0 19,6 18,6 7 meses 23,1 21,0 19,5 10 meses 25,0 23,4 21,8 13 meses 24,6 22,6 20,8 16 meses 23,5 22,3 20,8 22 meses 23,9 22,0 19,9

[00132] Para comparação, testou-se também a adsorção no decor- rer do tempo do HBsAg contido nos três lotes de produto final a granel (FDN5-6-7), assim como três lotes repartidos em frascos (S44-45-46) de um preparado líquido composto dos mesmos antígenos, mas obtido segundo um processo de formulação linear descrito na Figura 1 e, por- tanto, diferente daquele descrito no exemplo acima. Esse preparado continha em 0,5 ml : 10 µg de HBsAg, 30 Lf de Dt, 10 Lf de Tt, 25 µg de Pt, 25 µg de FHA, 40 DU de vírus pólio tipo 1, 8 DU de vírus pólio tipo 2, 32 DU de vírus pólio de tipo 3, 12 µg de PRP (sob a forma de PRP-T), 0,6 mg de Al, íons fosfato a uma concentração de 55 mMol/l, íons carbonato a uma concentração de 20 mMol/l, tampão Tris sacaro- se a uma concentração de 2.5 mMol/l em Tris e 2.125% em sacarose e 14 µg de ácidos aminados catiônicos (His - Arg - Lys) provenientes do meio M199 (valência pólio), pH 6,8 - 7,2.

[00133] Os resultados obtidos eram os seguintes: Percentagem de adsorção do HBsAg na formulação do produto final a granel (FDN5-6-7) a + 5 oC Tempo decorrido após a FDN5 FDN6 FDN7 operação de formulação 0 81 85 81 1 mês 78 82 62 2 meses 74 78 63 3 meses 66 84 62 6 meses 61 77 61 Percentagem de adsorção do HBsAg na formulação conservada em frascos (lotes S44-S45-S46) a 5 oC Tempo decorrido após a S44 S45 S46 operação de formulação 0 81 85 81 7 meses 63 64 77 10 meses 57 65 51

Percentagem de adsorção do HBsAg na formulação conservada em frascos (lotes S44-S45-S46) a 5 oC Tempo decorrido após a S44 S45 S46 operação de formulação 13 meses 47 54 53 16 meses 33 56 38 22 meses 44 47 36 28 meses 44 51 44 34 meses 45 54 42 40 meses 49 52 48

[00134] As quantidades de PRP-T não adsorvido, medidas no mesmo período, mostraram que havia pouca variação em relação ao tempo 0 e eram, portanto, satisfatórias. Todavia, esses resultados mostram que, nesse caso, que não corresponde a uma formulação obtida, graças a um processo, de acordo com a invenção, o antígeno de superfície da hepatite B não restava adsorvido sobre o óxi-hidróxido de alumínio. Dados experimentais, referindo aos ácidos aminados catiônicos.

[00135] Uma composição, de acordo com a invenção, destacando diretamente do protocolo experimental, utilizado no exemplo fornecido e uma composição obtida graças a um protocolo modificado pelo fato de que se tinha substituído uma composição contendo unicamente os três ácidos aminados catiônicos (Arg - Lys - His) à composição dos 12 ácidos aminados essenciais, foram comparadas no que se refere à quantidade de PRP-T não adsorvida no final. Nenhuma diferença na quantidade do PRP-T não adsorvido foi observada, o que mostra que só importam os ácidos aminados catiônicos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de preparo de uma combinação vacinal líquida compreendendo pelo menos: - o óxi-hidróxido de alumínio (AlOOH), - um antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg), - um antígeno de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) cons- tituído por poli-sacarídeo capilar conjugado a uma proteína portadora, na qual o antígeno de superfície da hepatite B é mantida adsorvido sobre AIOOH, enquanto que o antígeno de Hib é mantido não adsorvi- do, caracterizado pelo fato de que compreende: - adsorver o antígeno de superfície da hepatite B sobre AI- OOH, a fim de obter um complexo AIOOH/HBsAg, - misturar esse complexo AIOOH/HBsAg com o antígeno de Hib em presença de ácidos aminados catiônicos a uma concentração de pelo menos 100 mg/l, e de íons fosfato a uma concentração de 35 a 45 mMol/l.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de se proceder à adsorção do antígeno HBsAg sobre o alu- mínio, misturando-se uma suspensão de AlOOH a uma suspensão de HBsAg sob agitação durante pelo menos quatro horas, de preferência, pelo menos 12 horas, de preferência, entre 20 e 24 horas.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de se acrescentarem os á- cidos aminados catiônicos a esse complexo AlOOH/HBsAg antes da mistura com o antígeno de Hib.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte- rizado pelo fato de se acrescentarem os ácidos aminados catiônicos a esse antígeno de Hib antes da mistura com o complexo AlO- OH/HBsAg.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de se acrescentarem os í- ons fosfato ao complexo AlOOH/HBsAg antes da mistura com o antí- geno de Hib.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de se ajustar o pH do prepa- ro, compreendendo o complexo AlOOH/HBsAg a 7.1 + 0.1, antes da mistura com o antígeno de Hib.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de consistir, além disso, em: - preparar uma composição, compreendendo pelo menos um antígeno escolhido dentre os antígenos da difteria, do tétano, da pólio, da coqueluche, assim como o óxi-hidróxido de alumínio, e - em misturar esse complexo AlOOH/HBsAg com essa composição, antes de proceder à mistura com o antígeno de Hib.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de consistir em preparar essa composição, acrescentando-se cada um dos antígenos sucessivamente a uma suspensão de óxi- hidróxido de alumínio e agitando-se entre cada acréscimo de antíge- nos.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de: - se adsorver o HBsAg sobre uma quantidade parcial de AlOOH, representando um terço do AlOOH total presente na composi- ção final, por uma duração de 20 a 24 horas, a fim de formar um com- plexo AlOOH/HBsAg, - se adsorver em paralelo, em uma quantidade complemen- tar de AlOOH, sucessivamente: a toxina diftérica D, a toxina tetânica T, a toxina purificada de Bordetella, pertussis PTxd, ela própria previa- mente adsorvida sobre o AlOOH, a hemaglutinina filamentosa de Bor-

detella pertussis FHA, ela prória previamente adsorvida sobre o AlO- OH, depois se acrescentam aí íons fosfatos, depois se acrescentam aí o complexo AlOOH/HBsAg, - se acrescenta de novo íons fosfato em quantidade que permite atingir uma concentração de 40 mMol/l na composição final, - se acrescentar pelo menos um ácido aminado catiônico em quantidade que permite atingir uma concentração de pelo 100 mg/l na composição final, - se ajustar o pH 7.1 + 0.1, - se acrescentarem antígenos da pólio sob a forma de vírus inativados de tipo 1, e/ou de tipo 2 e/ou de tipo 3; - se acrescentar o antígeno Hib. - se ajustar o pH em 7.1 + 0.1, - se repartir a composição obtida em seringa ou em frascos.

10. Processo de acordo com uma das reivindicações pre- cedentes, caracterizado pelo fato de se preparar na escala industrial pelo menos 250 l de composição vacinal.

11. Composição vacinal obtida por um processo como defi- nido em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos o antígeno de superfície da he- patite B (HBsAg) e o antígeno de Hib que é constituído por poli-ribosil ribitol fosfato conjugado à proteína tetânica (PRP-T).

12. Composição vacinal de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender, além disso, antígenos da difteria, do tétano, da pólio, da coqueluche.

13. Composição vacinal de acordo a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos: - o antígeno de superfície da hepatite B, HBsAg; - o antígeno da difteria sob a forma de toxina diftérica D, - o antígeno do tétano sob a forma de toxina tetânica T,

- os antígenos da coqueluche sob a forma de Toxina Purifi- cada (PTxd) e de Hemaglutinina Filamentosa (FHA), - o antígeno de Haemophilus influenzae tipo b, sob a forma de poli-ribosil ribitol fosfato conjugado à proteína tetânica (PRP-T), - os antígenos da pólio sob a forma de vírus inativados es- colhidos dentre os tipos 1, 2 e 3.

14. Composição vacinal, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos: - de 10 a 30 µg do HBsAg / ml, de preferência, 20 µg / ml; - de 40 a 80 Lf de D/ml, de preferência, 50 a 70 Lf/ml; - de 10 a 50 Lf de T/ml, de preferência, 10 a 30 Lf/ml; - de 40 a 60 µg de FHA/ml, de preferência, 50 µg/ml; - de 40 a 60 µg de PTxd/ml, de preferência, 50 µg/ml; - de 2 a 60 µg de PRP/ml, de preferência, 20-24 µg/ml; sob a forma de conjugado PRP-T; - de 1 a 2 mg de AlOOH/ml; de preferência, 1.2 mg de A- lOOH/ml; - de 35 a 45 mMol/l, de preferência, de 38 a 42 mMol/l de íons fosfatos, - 100 a 1000 mg/ml de ácidos aminados catiônicos, de pre- ferência, de 400 a 800 mg/ml; - os tipos 1, 2 e 3 do vírus pólio sob a forma inativada em quantidade respectiva de 80, 16 e 64 DU/ml.