MX2014007850A - Procedimiento de formulacion de una vacuna que contiene al menos dos antigenos susceptibles de adsorberse en oxihidroxido de aluminio. - Google Patents

Abstract

La invención tiene por objeto un procedimiento para preparar una composición de vacuna que comprende al menos oxihidróxido de aluminio (AlOOH) y al menos el antígeno de superficie de hepatitis B y el antígeno de Haemopbilus influenzae tipo b. De conformidad con la invención el antígeno de superficie de hepatitis B se mantiene en adsorción en el AlOOH en tanto que el antígeno de Hib se mantiene en no adsorción. Para ello: - se procede a adsorber el antígeno de superficie de hepatitis B en AlOOH para obtener un complejo AlOOH/HBsAg, y - se mezcla dicho complejo AlOOH/HBsAg con el antígeno de Hib en presencia de aminoácidos catiónicos con una concentración de al menos 100mg/l, y de iones fosfato con una concentración de 35 a 45 nMol/l.

Description

PROCEDIMIENTO DE FORMULACIÓN DE UNA VACUNA QUE CONTIENE AL MENOS DOS ANTÍGENOS SUSCEPTIBLES DE ADSORBERSE EN OXIHID OXIDO DE ALUMINIO La invención se refiere al dominio de las combinaciones de vacunas que comprende a la vez la valencia de Hepatitis B constituida por el antigeno de superficie del virus de hepatitis B (HBsAg) y la valencia de Haemophilus influenzae tipo b, constituida por su polisacárido capsular, llamado polirribosilribitolfosfato (PRP) que, para ser eficaz en niños menores de dos años, se conjuga en una proteina portadora, por ejemplo la proteina tetánica.

Las combinaciones destinadas a la administración a niños pequeños, comprenden en general otros antigenos que permiten vacunar, en una sola operación, contra diversas enfermedades, al igual que un adyuvante a base de aluminio.

Asimismo, la solicitud de patente WO99/13906 divulga una composición de vacuna que comprende, al igual que la descrita en la página 13, antigenos contra la difteria, el tétanos, la poliomielitis, la tos ferina, la hepatitis B y las infecciones por Haemophilus influenzae tipo b. Algunos de estos antigenos deben, por ser inmunógenos, ser adsorbidos en una sal de aluminio. Es el caso principalmente del antigeno de superficie de la hepatitis B o HBsAg.

Además, como se indica en la página 12 de la solicitud WO99/13906, la valencia de Hib constituida por el polisacárido capsular conjugado de proteina tetánica, tiene tendencia a perder su inmunogenicidad a lo largo del tiempo cuando se adsorbe en las sales de aluminio. Para evitar este inconveniente, la solución propuesta en la técnica previa, al igual que lo recomendado anteriormente en la solicitud anterior PCT/FR96/00791, consiste en agregar aniones y principalmente iones fosfato, carbonato o citrato.

Sin embargo, los autores de la presente invención constataron que aunque la adición de aniones, principalmente de fosfatos o carbonatos, permite efectivamente evitar la adsorción de PRP-T en oxihidróxido de aluminio (A100H) , y por ende mantener su inmunogenicidad en el curso del tiempo, esta adición también presenta el inconveniente de desorber el antigeno de superficie de hepatitis B cuando este mismo también había sido adsorbido en oxihidróxido de aluminio.

Por ende es necesario lograr un procedimiento de preparación de una combinación de vacuna que comprenda oxihidróxido de aluminio, donde el antígeno de superficie de hepatitis B se mantiene en adsorción en AlOOH en tanto que el antígeno de Hib se mantiene en no adsorción.

Para ello, la presente invención tiene por objeto un procedimiento de preparación de una combinación de vacuna líquida que comprende al menos: - un antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) , - un antigeno de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) constituido por el polisacárido capsular conjugado en una proteina portadora, - oxihidróxido de aluminio (A100H) , donde el antigeno de superficie de hepatitis B se mantiene en adsorción en A100H en tanto que el antigeno de Hib se mantiene en no adsorción, según el cual: - se procede a adsorber el antigeno de superficie de hepatitis B en A100H para obtener un complejo AlOOH/HBsAg, - se mezcla dicho complejo AlOOH/HBsAg con el antigeno de Hib en presencia de aminoácidos catiónicos con una concentración de al menos 100 mg/1, y de iones fosfato con una concentración de 35 a 45 mMol/1.

Mediante el procedimiento de conformidad con la invención, es posible alcanzar el equilibrio deseado entre el mantenimiento de la adsorción del antigeno de superficie de hepatitis B en oxihidróxido de aluminio y el mantenimiento de la no adsorción del antigeno de Hib.

De conformidad con un modo particular de realización de la invención, se procede a adsorber el antigeno HBsAg sobre aluminio mezclando una suspensión de AlOOH con una suspensión de HBsAg en agitación durante al menos 4 horas, preferentemente al menos 12 horas, preferentemente entre 20 y 24 horas.

De conformidad con un modo particular de realización de la invención, se agregan los aminoácidos catiónicos a dicho complejo AlOOH/HBsAg antes de mezclar con el antigeno de Hib.

De conformidad con un modo alternativo de realización de la invención, se agregan los aminoácidos catiónicos a dicho antigeno de Hib antes de mezclar con el complejo AlOOH/HBsAg.

De conformidad con un modo de realización de la invención, se agregan los iones fosfato a dicho complejo AlOOH/HBsAg antes de mezclar con el antigeno Hib.

De conformidad con un modo de realización de la invención, se ajusta el pH de la preparación que comprende el complejo AlOOH/HBsAg a 7.1 + 0.1 antes de mezclar con el antigeno de Hib.

La invención también tiene por objeto una combinación de vacuna obtenida de conformidad con el procedimiento reivindicado y que comprende al menos: - el antigeno de superficie de hepatitis B, - el antigeno de difteria en forma de toxina diftérica D, - el antigeno del tétanos en forma de toxina tetánica T, - los antigenos de tos ferina en forma de Toxina Purificada (PTxd) y de Hemaglutinina filamentosa (FHA), - el antígeno de Haemophilus influenzae tipo b, en forma de polirribosilribitolfosfato conjugado de proteína tetánica (PRP-T) , - los antígenos de poliomielitis en forma de virus inactivados de tipo 1, 2 y 3.

Una composición de vacuna de este tipo presenta la ventaja de presentarse en forma líquida, lo que evita realizar operaciones de recuperación de liofilizado; esta resultó suficientemente estable para mantener la inmunogenicidad hasta el día de su utilización, esto es, incluso 36 meses después de la fecha de su fabricación.

De conformidad con la invención, la composición de vacuna comprende un antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) . Este antígeno puede ser principalmente un antígeno de superficie de hepatitis B como el presente en la vacuna Recombivax HB™, o en cualquier otra vacuna contra hepatitis B. Principalmente puede tratarse del antígeno recombinante obtenido mediante fermentación de una levadura Hansenula polimorpha modificada, de conformidad con la tecnología desarrollada por Crucell, como el presente en la vacuna Hepavax-Gene™. Para los fines de la invención, la cantidad de HBsAg presente en una dosis de 0.5 mi está comprendida ventajosamente entre 5 y 15 µ?, y en particular de 10 µ?.

De conformidad con la invención, la composición de vacuna comprende un antígeno de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) . Este antígeno está constituido por el polisacárido capsular de la bacteria o Polirribosilribitolfosfato (PRP) que se conjuga en una proteína portadora. La proteína portadora puede ser cualquier proteína en uso para ese fin en el dominio de las vacunas. Puede ser, por ejemplo la toxina diftérica D, la toxina tetánica T, la lipoproteína D de Haemophilus influenzae, la CRM197 o la proteína de membrana externa (OMP) de N. meningitidis . Se utiliza preferentemente la proteína tetánica para obtener el conjugado PRP-T. Para los fines de la presente invención, el conjugado PRP-T puede estar presente a razón de 1 a 30 µg de PRP por dosis de 0.5 mi; ventajosamente de 5 a 25 ug de PRP por dosis; preferentemente de 10 a 15 \ig de PRP por dosis; de manera muy preferida de 10 a 12 ]iq de PRP por dosis, y más particularmente 12 µg de PRP, conjugado a 22-36 µg de proteína tetánica.

De conformidad con la invención, la composición de vacuna comprende oxihidróxido de aluminio AlOOH. Por abusos del lenguaje, a menudo esta sal de aluminio se denomina hidróxido de aluminio. El AlOOH que se utilizará para los fines de la presente invención puede ser, por ejemplo el AlOOH comercializado por Brenntag AG o Rehydragel HPA de Reheis Corp. (Berkeley Heights, NJ) , aunque el modo de producción de cada uno de los dos adyuvantes difiere. Se calcula la cantidad de AlOOH utilizada para permitir alcanzar una respuesta inmunitaria satisfactoria; depende principalmente del número y la naturaleza de los antigenos presentes en la composición al igual que de la cantidad de cada uno de estos antigenos.

A titulo meramente informativo, la adsorción máxima del HBsAg sobre AlOOH es del orden de 780 g de proteina por mg de aluminio (típicamente la cantidad de AlOOH se expresa en cantidad de aluminio Al3+) . Para una dosis de vacuna que comprende 10 \iq de HBsAg, sin otros antígenos adicionales, bastaría con 13 g de aluminio, cantidad sin embargo insuficiente para obtener la eficacia deseada cuando se agregan otros antígenos. De esta forma, en función de la adición de uno o varios antígenos adicionales, pueden ponerse en contacto 10 µg de HBsAg con 0.01-1.25 mg de aluminio, que es la cantidad máxima recomendada por la Farmacopea Europea.

Por ejemplo, una dosis de 0.5 mi de una vacuna pediátrica que comprende antígenos de difteria, tétanos, tos ferina y hepatitis B, puede contener de manera convencional de 0.5 a 0.7 mg de aluminio, preferentemente alrededor de 0.6 mg de aluminio.

De conformidad con la invención, el antígeno de superficie de hepatitis B se mantiene en adsorción en AlOOH, lo que significa que al menos un 60%, preferentemente al menos un 65%, preferentemente al menos un 70%, preferentemente al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, preferentemente al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95% de la cantidad total de este antigeno presente en la composición está en forma adsorbida.

De conformidad con la invención, el antigeno de Hib se mantiene en no adsorción en AlOOH, lo que significa que al menos un 65%, preferentemente al menos un 70%, preferentemente al menos un 75%, de la cantidad total de este antigeno presente en la composición está en forma no adsorbida .

De conformidad con la invención, el tiempo durante el cual el antígeno de superficie de hepatitis B se mantiene en adsorción en el AlOOH y el antigeno de Hib se mantiene en no adsorción es de al menos 3 meses, preferentemente al menos 6 meses, preferentemente al menos 12 meses, preferentemente al menos 18 meses, preferentemente al menos 24 meses, incluso preferentemente al menos 36 meses a partir de la fecha de fabricación de la composición cuando la temperatura de conservación es de 5 + 3°C. Preferentemente, la cantidad de antigenos adsorbidos o no adsorbidos es estable en el curso del tiempo, pero también puede variar siempre que se mantenga dentro los límites aceptables. De esta forma, cuando al menos el 85% de la cantidad total del HBsAg presente en la composición se adsorbe sobre A100H durante 3 meses a partir de la fecha de fabricación de la composición conservada a una temperatura de 5 + 3°C, es totalmente posible que al cabo de un año y, siempre en las mismas condiciones de conservación, el 80% de la cantidad total del HBsAg presente en la composición se mantenga en adsorción.

Para apreciar la cantidad de antigeno adsorbido, el entendido en la técnica puede utilizar cualquier otro método conocido .

En lo que respecta a la determinación del porcentaje de adsorción de HBsAg, es posible utilizar un método ELISA tipo sándwich de conformidad con las normas definidas por la Farmacopea Europea 2.7.1. Resumidamente, el HBsAg es capturado por un anticuerpo monoclonal primario anti-HBsAg de tipo IgM, en pocilios de una placa de 96 pocilios. El HBsAg que de esta forma queda fijo es recubierto por un anticuerpo monoclonal secundario anti-HBsAg, de tipo IgG, que a su vez es detectado por un anticuerpo policlonal anti-IgG, acoplado a la peroxidasa. Un sustrato cromógeno de la peroxidasa, la tetrametilbencidina (TMB) , sirve de agente revelador. Al realizarse la adición se desarrolla un color cuya intensidad es proporcional a la cantidad de HBsAg capturado en los pocilios. El análisis de los resultados se realiza de conformidad con el método de las rectas paralelas descrito en la Farmacopea Europea 5.3.3. El porcentaje de adsorción se obtiene a partir de la determinación del contenido total en HBsAg y del contenido en HBsAg no adsorbido.

En lo que respecta a la cantidad de PRP-T no adsorbida, se puede realizar la evaluación mediante HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio de iones de alto rendimiento -detección amperométrica pulsada) .

De conformidad con el procedimiento de la invención, el antigeno de superficie de hepatitis B se adsorbe sobre AlOOH. Esta etapa puede realizarse poniendo en contacto el antigeno de superficie de hepatitis B y el AlOOH en ausencia de cualquier otro antigeno y dejando que el antigeno de superficie de hepatitis B se adsorba sobre AlOOH durante al menos 4 horas, preferentemente al menos 12 horas, de manera muy preferida entre 20 y 24 horas, para obtener una preparación que contiene un complejo AlOOH/HBsAg. Esta adsorción puede realizarse, de conformidad con la invención, en ausencia de iones fosfato. El objetivo que persigue un tiempo de contacto prolongado entre el antigeno de superficie de hepatitis B y el AlOOH consiste en maximizar las interacciones electroestáticas y favorecer las interacciones estables, que de esta forma pueden desencadenar una adsorción por intercambio de ligandos. Este contacto se realiza ventajosamente en agitación.

De conformidad con el procedimiento de la invención, se realiza la mezcla del complejo AlOOH/HBsAg con el antigeno de Hib en presencia de aminoácidos catiónicos y de iones fosfato.

Para los fines de la invención, se entiende por aminoácidos catiónicos aminoácidos cuyo pHi es superior al pH de la composición de vacuna y que estarán por ende en forma catiónica al pH de la vacuna; se trata principalmente de Lisina (Lys) , Arginina (Arg) o Histidina (His) ; cada uno de estos aminoácidos puede utilizarse solo o en mezcla ya sea para 2 (Lys + Arg; Lys + His; Arg + His), o para los 3 juntos (Lys + Arg + His) . De conformidad con un modo particular, los aminoácidos catiónicos pueden estar asociados en forma de dipéptido. Se citan principalmente los dipéptidos Lys-Lys, Lys-Arg, Lys-His, Arg-Arg, Arg-Lys, Arg-His, His-His, His-Lys e His-Arg. De manera alternativa, un dipéptido útil para los fines de la presente invención puede estar compuesto de un aminoácido catiónico y de un aminoácido no cargado seleccionado entre Ala, Val, Leu, Iso, Pro, Met, Phe, Trp, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp y Gln. De esta forma, en la práctica, se puede utilizar una preparación que contiene uno o varios aminoácidos catiónicos en forma libre y/o de dipéptido. También es posible utilizar preparaciones de aminoácidos que comprenden a la vez aminoácidos catiónicos en cantidad deseada, en mezcla con otros aminoácidos. Para no producir una disminución demasiado pronunciada del pH al agregar los aminoácidos, se puede evitar aumentar el pH de la preparación que comprende los aminoácidos antes de agregarla al complejo AlOOH/HBsAg, mediante una base, principalmente sosa .

De conformidad con la invención, la cantidad de aminoácidos catiónicos presentes en la composición de vacuna al final, debe ser de al menos 100 mg/1, ventajosamente de al menos 300 mg/1, ventajosamente de al menos 400 mg/1; de manera muy preferida de al menos 500 mg/1. No hay una dosis máxima critica. Sin embargo, es preferible que la cantidad máxima sea a lo sumo de 2 mg/ml, incluso preferentemente a lo sumo de 1 mg/ml; incluso preferentemente a lo sumo de 800 Ug/ml; de manera muy preferida a lo sumo de 700 µg/ml. Al calcular la cantidad de aminoácidos catiónicos que se agregará, conviene tener en cuenta aminoácidos catiónicos susceptibles de agregarse por los medios en los que están presentes los antigenos que no sean HBsAg y el antigeno de Hib.

De conformidad con una alternativa del procedimiento, se puede determinar la cantidad de aminoácidos catiónicos con respecto al peso del polisacárido capsular de Hib y prever una relación en peso de polisacárido de Hib/aminoácido catiónico de 1: 4 a 1: 100, ventajosamente de 1: 10 a 1: 80, preferentemente de 1: 15 a 1: 60, de manera muy particularmente preferida de 1: 20 a 1: 30 o 40.

De conformidad con el procedimiento de la invención, la mezcla del complejo AlOOH/HBsAg con el antigeno de Hib se realiza en presencia de aminoácidos catiónicos, pero también en presencia de iones fosfato. De conformidad con un modo de realización de la invención, los iones fosfatos se agregan al complejo AlOOH/HBsAg antes de la puesta en contacto con el antigeno Hib. La adición de iones fosfato puede, por ejemplo, efectuarse mediante adición de hidrogenofosfato de sodio o de hidrogenofosfato de potasio, o incluso mediante un mezcla de ambos. La cantidad de iones fosfato se calcula para que el máximo de antigenos de superficie de hepatitis B quede adsorbido sobre AlOOH al tiempo que se evita la adsorción del antigeno Hib. Esta cantidad varia en función de la naturaleza y del número de antigenos presentes, y principalmente en función de antigenos distintos a los antigenos HBsAg e Hib.

De esta forma, para una combinación de vacuna que comprende los antigenos utilizados típicamente en las vacunas pediátricas además de HBsAg y el antígeno Hib, los antigenos de difteria, tétanos, tos ferina, también puede ser ventajoso agregar iones fosfato de manera tal que la concentración de iones fosfato en la composición de vacuna obtenida al final sea al menos igual a 35 mMol/1, y más particularmente esté comprendida entre 35 y 45 mMol/1, incluidos los terminales; preferentemente entre 38 y 44 mMol/1, incluidos los terminales; de manera muy preferida, entre 38 y 42 mMol/1, incluidos los terminales. De conformidad con un modo preferido, la concentración de iones fosfato en la composición de vacuna obtenida en último término es 40 mMol/1.

De conformidad con un modo alternativo, los iones fosfato se agregan en cantidad tal que están presentes en la composición de vacuna en una concentración final comprendida entre 35 y 38 mMol/1, incluidos los terminales. Se completa agregando además iones carbonato, pero en cantidad limitada, dado que se ha observado que una cantidad demasiado grande de iones carbonatos era desfavorable. Ventajosamente, pueden agregarse en una cantidad tal que estén presentes en la composición de vacuna en una concentración final inferior o igual a 10 mMol/1.

Para evitar un shock iónico demasiado importante que podría desestabilizar el HBsAg y favorecer su desorción, se recomienda agregar los iones fosfato en varias (por ejemplo en 2) operaciones (etapas) distintas. De esta forma, los iones fosfato pueden agregarse en una primera operación, en una cantidad que permita alcanzar una concentración final comprendida entre 20 y 30 mMol/1, incluidos los terminales; luego, en una segunda operación, en una cantidad que permita alcanzar una concentración final como la que se indica a continuación.

De conformidad con un modo de realización preferido del procedimiento de conformidad con la invención, se ajusta además el pH de la preparación obtenida a 7.1 + 0.1, antes de mezclar el antigeno Hib con el complejo AlOOH/HBsAg. Se ha constatado que este valor de pH tiene un efecto positivo en el mantenimiento en estado no adsorbido del antigeno Hib.

De conformidad con un modo de realización particular, se ajusta además el pH a 7.1 + 0.1 después de la etapa de mezcla.

De esta forma, el procedimiento de conformidad con la invención permite obtener una composición de vacuna donde: (i) al menos el 60 o el 80%, preferentemente al menos el 85% de la cantidad total del antigeno de superficie de hepatitis B presente en la composición se adsorbe sobre AlOOH durante al menos 3 meses a partir de la fecha de fabricación de la composición conservada a una temperatura de 5 + 3°C; y (ii) al menos el 65, el 70 o el 75% de la cantidad total del antígeno Hib presente en la composición no se adsorbe sobre AlOOH.

La expresión "complejo AlOOH/HBsAg" significa que el complejo comprende al menos el antigeno HBsAg adsorbido sobre AlOOH. El complejo puede contener otros antígenos, se indique esto o no.

También pueden usarse uno o varios antigenos adicionales para formar el complejo. Principalmente puede tratarse de anatoxina diftérica (D) , anatoxina tetánica (T) , antigenos acelulares de tos ferina como: la toxina destoxificada de Bordetella pertussis (PTxd), hemaglutinina filamentosa (FHA), pertactina (antigeno de 69 kDa) y aglutinógenos (fimbriae) de esta misma bacteria. De conformidad con un modo particularmente ventajoso, para formar el complejo se pueden agregar los antigenos D, T, PTxd y FHA.

Los antigenos adicionales pueden agregarse de diversas maneras. Pueden agregarse de manera secuencial después del antigeno de superficie de hepatitis B adsorbido previamente (i) ya sea sobre la cantidad total de AlOOH que debe estar presente en la composición de vacuna; (ii) ya sea sobre una cantidad parcial, completada luego para alcanzar la cantidad total. De manera alternativa, los antigenos adicionales pueden adsorberse de manera independiente, cada uno sobre una cantidad parcial de AlOOH, como HBsAg. También se puede prever un proceso de adsorción mixta - el que algunos antigenos se adsorben de manera independiente y otros se adsorben de manera secuencial.

De conformidad con un modo particular del procedimiento de conformidad con la invención, se agita la composición obtenida después de la adición de cada antigeno.

De conformidad con un modo ventajoso y exclusivamente a modo de ejemplo, el HBsAg se adsorbe de manera independiente sobre una cantidad parcial de AlOOH correspondiente a aproxionademente un 30% (el tercio) de la cantidad total de AlOOH presente en la composición final. En paralelo, los antigenos D y T se adsorben de manera secuencial sobre la parte complementaria del AlOOH. Luego, a la preparación que contiene el complejo AlOOH-D-T, se agregan los antigenos de tos ferina PTxd y FHA, donde cada uno de estos 2 últimos antigenos fueron previamente adsorbidos individualmente sobre AlOOH. Por último, se reúnen las dos preparaciones (complejo AlOOH - HBsAg y complejo AlOOH - D-T-PTxd-FHA) para formar una preparación que comprende el complejo AlOOH - HBsAg-D-T-PTxd-FHA, donde las cantidades de cada uno de los elementos se seleccionaron para obtener dosis de vacunas de 0.5 mi que comprenden, típicamente: - de 5 a 15 pg de HBsAg/dosis; preferentemente 10 µ? ???e, - de 20 a 40 Lf de D/dosis; preferentemente de 25 a 35 Lf/dosis; de manera muy preferida, 30 Lf/dosis. (Lf = límite de floculación) , (dicho de otra forma, la cantidad de D es superior o igual a 20 UI/dosis) - de 5 a 25 Lf de T/dosis; preferentemente de 10 a 15 Lf/dosis de manera muy preferida, 10 Lf/dosis, (dicho de otra forma, la cantidad de T es superior o igual a 40 UI/dosis) - de 20 a 30 µq de FHA/dosis; preferentemente 25 pg/dosis, - de 20 a 30 pg de PTxd/dosis; preferentemente 25 pg/dosis.

De conformidad con un modo particular de realización de la invención, también se agregan antigenos de poliomielitis formados, en general, por virus inactivados. Se puede prever la adición de virus de poliomielitis de 3 tipos que habitualmente están presentes en vacunas pediátricas, es decir los tipos 1, 2 o 3, o en caso en que no fuera necesario vacunar contra los 3 tipos, solo introducir los tipos contra los que se procura obtener protección. Las cantidades de virus de poliomielitis por dosis pueden ser principalmente: - entre 20 y 43 DU (unidades de antigenos D) , en particular 40 para el tipo 1, - entre 5 y 9 DU, en particular 8, para el tipo 2, - entre 17 y 36 DU, en particular 32, para el tipo 3.

Estos antigenos no se adsorben de manera necesaria previamente sobre una sal de aluminio antes de agregarse a la preparación de vacuna.

De conformidad con un modo de realización particular, el procedimiento de conformidad con la invención es un procedimiento según el cual: (i) (a) se pone en contacto el HBsAg y el A100H en ausencia de cualquier otro antigeno, y se deja adsorber el HBsAg sobre A100H durante al menos 4 horas, preferentemente al menos 12 horas, de manera muy preferida alrededor de 24 horas, para obtener una preparación que contenga un complejo AlOOH/HBsAg; (i) (b) a la preparación obtenida en el punto (i) (a), se agrega una preparación que comprende los antigenos D, T, PTxd y FHA, previamente adsorbidos en A100H, y de manera opcional, antigenos adicionales de Bordetella. pertussis como la Pertactina y los aglutinógenos / (ii) a la preparación obtenida en el punto (i) (b) , se agregan iones fosfato para obtener una concentración final en la vacuna de 40 mMol/1, (iii) a la preparación obtenida en el punto (ii) , se agregan de manera opcional, los antigenos de poliomielitis; (iv) a la preparación obtenida en el punto (ii) o (iii) , se agrega una preparación que contiene el antigeno Hib; (v) se ajusta el pH a 7.1 + 0.1; y (vi) (a) se agrega al menos un aminoácido catiónico para completar la preparación obtenida en el punto (ii) o (iii) antes de la adición del antigeno Hib, o (b) se agrega al antigeno Hib al menos aminoácido catiónico; donde dicho aminoácido catiónico se agrega en una cantidad suficiente para obtener una concentración final en la vacuna de al menos 100 mg/1.

De conformidad con un modo particular, la composición de vacuna de conformidad con la invención es una composición que comprende HBsAg, toxina diftérica D, toxina tetánica T, antigenos de tos ferina PTxd y FHA preadsorbidos previamente sobre AlOOH, antigeno Hib, y opcionalmente la valencia de poliomielitish, donde: (i) al menos el 85%, preferentemente al menos el 90% de la cantidad total del HBsAg presente en la composición se mantiene en adsorción en el AlOOH durante al menos 3 meses a partir de la fecha de fabricación de la composición conservada a una temperatura de 5 + 3°C; y (ii) al menos el 65, el 70 o preferentemente el 75% de la cantidad total del antigeno Hib presente en la composición no se adsorbe sobre AlOOH y esta cantidad se mantiene relativamente estable en el curso del tiempo.

Además, mediante el procedimiento de conformidad con la invención, también se mantienen adsorbidos los antígenos distintos de HBsAg que se mostró era ventajoso adsorber en oxihidróxido de aluminio para ser inmunógenos.

De esta forma, se indica a modo de ejemplo que una composición de conformidad con la invención puede comprender: de 10 a 30 µg de HBsAg/ml, preferentemente 20 pg/ml; de 40 a 80 Lf de D/ml, preferentemente de 50 a 70Lf/ml; - de 10 a 50 Lf de T/ml, preferentemente de 10 a 30Lf/ml; de 40 a 60 g de FHA/ml, preferentemente 50 µg/ml; de 40 a 60 de PTxd/ml, preferentemente 50 pg/ml; - de 2 a 60 µg de PRP/ml, preferentemente 20-24 µ?/p??; de 1 a 2 mg de AlOOH/ml; preferentemente 1.2 mg de AlOOH/ml; iones fosfato en una concentración de 35 a 45 mMol/1, preferentemente de 38 a 42 mMol/1 de iones fosfato; de 100 a 1000 µg/ml de aminoácidos catiónicos, preferentemente de 400 a 800 µ?/p??; y de manera opcional, los tipos 1, 2 y 3 del virus de poliomielitis en forma inactivada en cantidad respectiva de 80, 16 y 64 DU/ml.

Como se indica anteriormente, una composición de conformidad con la invención también puede incluir antigenos adicionales de Bordetella. pertussis, como Pertactina (de 69kDa) o los aglutinógenos .

Descripción de la figura: la Figura 1 es un esquema de un procedimiento de la técnica previa según el cual se mezcla después de la adición de cada componente.

EJEMPLO - Producción a escala industrial de una preparación a granel (250 L) de una vacuna hexavalente HepB-Dt-Tt-Peartussis-polio-HiB Esta preparación se realiza en condiciones estériles y en agitación continua.

A - Preparación del HBsAg adsorbido en AlOOH En una cuba de 50 1, se introduce de manera aséptica una suspensión homogénea de gel de oxihidróxido de aluminio (AlOOH) comercializada por Brenntag AG, a 8 g de Aluminio/1.

Después de filtrar en un filtro de 0.22 µp?, el volumen necesario de HBsAg, para obtener una concentración de 20 µg/ml en la vacuna final, se agregó en modo continuo en la cuba que ya contenía el AlOOH.

La mezcla se dejó en agitación durante 20-24 horas a temperatura ambiente con el fin de obtener una suspensión homogénea .

B - Preparación de D + T + PTxd -i- FHA adsorbidas sobre gel de aluminio En paralelo, se prepara una mezcla de gel de aluminio, anatoxina diftérica (D) , anatoxina tetánica (T) , anatoxina de Bordetella pertussis (PTxd) y hemaglutinina filamentosa de Bordetella . pertussis (FHA) de la siguiente forma: En una cuba de 250 1, se introduce de manera aséptica, una suspensión homogénea de gel de A100H comercializada por Brenntag AG, a 8 g de aluminio/1.

En la cuba de 250 1 que ya contenia el AlOOH, se introducen sucesivamente, después de filtrar sobre un filtro de 0.22 µ??, las soluciones de D y, después de homogeneización, de T con el fin de obtener las concentraciones respectivas en D y T en la vacuna final de 60 Lf (limite de floculación) /mi y 20 Lf/ml.

Una vez obtenida la mezcla homogénea, se agregan sucesivamente en esta cuba, de manera aséptica, la suspensión de PTxd previamente adsorbida en AlOOH, y luego la suspensión de FHA previamente adsorbida en AlOOH para obtener las concentraciones en PTxd y FHA en la vacuna final de 25 µ?/?t??.

Por último, se agregó, después de filtrar en un filtro de 0.22 pm, el volumen necesario de tampón fosfato 500 mM para obtener una concentración en iones fosfato de 20 a 30 mMol/1.

La suspensión D-T-PTxd-FHA-AlOOH de esta forma obtenida se dejó en agitación al menos 14 horas a una temperatura de 5 + 3°C.

C - Preparación de la mezcla HBsAg + D + T + PTxd + FHA adsorbidos sobre gel de aluminio A la preparación obtenida en el punto B, se agrega de manera aséptica la preparación obtenida en el punto A.

Esta mezcla se dejó en agitación con el fin de obtener una suspensión homogénea.

Luego, se agregó el volumen necesario de tampón fosfato 500 m después de filtrar en un filtro de 0.22 µ?a para obtener una concentración en iones fosfato de 40 mMol/1 en la composición final.

D - Saturación de los sitios electroestáticos del complejo gel de aluminio/HBsAg + D + T + PTxd + FHA por una solución de aminoácidos Se realiza una solución de aminoácidos que contiene 12 aminoácidos esenciales, de la siguiente composición: Clorhidrato de Arginina g/1, ya sea 1.73 g/1 de Arginina Cistina 1.2 g/1 Histidina 0.8 g/1 Isoleucina 2.6 g/1 Leucina 2.6 g/1 Clorhidrato de Lisina 3.65 g/1 ya sea 2,91 g/1 de Lisina Metionina 0.75 g/1 Fenilalanina 1.65 g/1 Treonina 2.4 g/1 Triptófano 0.4 g/1 Tirosina 1.8 g/1 Valina 2.35 g/1 Es decir 21.2 g/1 de aminoácidos de los cuales 5.44 g/1 son aminoácidos catiónicos (His - Arg - Lys) .

Se agrega 450 mi de sosa (NaOH) 2.5 N (0.5 1/min) . Se deja proseguir la homogeneización en agitación durante 10 min.

Esta solución de aminoácidos, filtrada en un filtro de 0.22 µ?t?, se agregó en modo continuo a la mezcla obtenida en C, con el fin de obtener una concentración de 572 ug/ml de aminoácidos catiónicos en la composición final.

E - Ajuste del pH El pH de la suspensión obtenida en el punto D se ajustó a pH 7.1 (7.0 - 7.2) utilizando una solución madre de sosa a 2.5 N filtrada.

F - Adición de antigenos de poliomielitis Se introduce entonces en la cuba que contiene la suspensión obtenida en E, una preparación que contiene los serotipos 1, 2 y 3 del virus de poliomielitis en forma inactivada (linajes Mahoney, MEF-1 y Saukett respectivamente) filtrada sobre filtro de 0.22 um.

G - Adición del PRP-T Se prepara inicialmente una solución intermediaria de PRP-T de la siguiente forma: a una preparación de PRP-T filtrada sobre filtro de 0.22 µp? se agregó el tampón Tris sacarosa previamente filtrado sobre filtro de 0.22 µp? para preparar una mezcla intermediaria.

Esta mezcla se introduce asépticamente en la mezcla obtenida en F.

H - Etapa final de ajuste Después de homogeneizar la suspensión obtenida en G, se agregó una cantidad suficiente de agua PPI filtrada previamente de manera que alcanzara el volumen objetivo de 250 1. Luego, en caso de ser necesario, el pH de la mezcla se ajustó a pH 7.1 + 0.1 agregando una solución de sosa 2.5 N o de ácido acético al 10% filtrado previamente.

La mezcla se almacenó a 5 + 3°C y después se repartió en jeringas o frascos a razón de 0.5 ml/dosis.

Una dosis de 0.5 mi contiene de esta forma 600 µg de Al 3+ , 10 µg de HBsAg, no menos de 20 IU de D, no menos de 40 Iü de T, 25 µg de Pt, 25 µg de FHA, entre 20 y 43 DU (unidad de antigeno D) de poliomielitis tipo 1, entre 5 y 9 DU de poliomielitis tipo 2, entre 17 y 36 DU de poliomielitis tipo 3, 12 g de PRP (en forma de PRP-T) , iones fosfato con una concentración de 40 mMol/1, del tampón Tris sacarosa con una concentración de 2.5 mMol/1 de Tris y de 2.125% de sacarosa, al igual que 286 µg de aminoácidos catiónicos (His - Arg - Lys) .

Ensayo clínico La composición de vacuna preparada de conformidad con el siguiente ejemplo ha sido evaluada en un ensayo clínico, en comparación con una vacuna hexavalente ya existente en el mercado, Infanrix Hexa™, que permite vacunar a los niños contra las mismas enfermedades que la vacuna preparada de conformidad con la invención (difteria, tétanos, tos ferina, poliomielitis, infecciones de Hib y hepatitis B) , pero que presenta principalmente el inconveniente de tener una parte liofilizada y, por ende, requiere una operación de recuperación del liofilizado antes de la administración.

Al realizarse el ensayo clínico se administraron los dos tipos de composiciones de vacuna a niños, en esquema de vacunación que comprende 3 dosis administradas en 2, 4 y 6 meses. La vacuna líquida preparada de conformidad con el procedimiento de la invención mostró ser bien tolerada y tan inmunogena como la vacuna disponible en el mercado.

DATOS EXPERIMENTALES Porcentaje de adsorción de HBsAg/Cantidad de PRP-T no adsorbido Tres lotes de producto final a granel (PFV39-41-42) al igual que tres lotes repartidos en frascos (S12-13-14) todos los lotes se obtuvieron de conformidad con el ejemplo proporcionado - se conservaron a + 5°C y se analizaron en diferentes momentos durante un período de 9 y 22 meses respectivamente. El análisis se refirió al porcentaje de adsorción del HBsAg y la cantidad de PRP-T no adsorbido.

La determinación del porcentaje de adsorción del HBsAg se realizó, al igual que lo indicado anteriormente, a partir de la determinación del contenido total en HBsAg y del contenido en HBsAg no adsorbido, y la determinación en HBsAg se realizó mediante un método ELISA tipo sánd ich de conformidad con las normas definidas por la Farmacopea Europea 2.7.1. Resumidamente, el HBsAg fue capturado por un anticuerpo monoclonal primario anti-HBsAg de tipo IgM, en pocilios de una placa de 96 pocilios. El HBsAg fijado de esta forma se recubrió con un anticuerpo monoclonal secundario anti-HBsAg, de tipo IgG, que a su vez fue detectado por un anticuerpo policlonal anti-IgG, acoplado a la peroxidasa. Un sustrato cromógeno de la peroxidasa, la tetrametilbencidina (TMB) , sirvió de agente revelador. Al momento de la adición se produjo un color cuya intensidad era proporcional a la cantidad de HBsAg capturado en los pocilios. El análisis de los resultados se realizó de conformidad con el método de las rectas paralelas descrito en la Farmacopea Europea 5.3.3.

A fin de determinar el porcentaje de adsorción del HBsAg, se sometió la vacuna a centrifugación (8800 g; 5 min 20°C) , lo que permitió recuperar el sobrenadante que contiene el HBsAg no adsorbido. Las muestras de sobrenadantes que se evaluaron se diluyeron en tampón ELISA que comprende un tampón de desorción en serie de 2 en una gama comprendida por ejemplo entre 1/400 y 1/12800.

Las muestras de vacuna total y de gama estándar se diluyeron en tampón ELISA que comprende un tampón de desorción, en serie de 2 en una gama comprendida por ejemplo entre 1/800 y 1/25600.

Una placa de 96 pocilios recubiertos con el anticuerpo monoclonal primario se incubó 12 h a 5°C y se lavó con una solución de PBS-Tween 20. Las diluciones de los sobrenadantes, de la vacuna total y de la gama estándar se repartieron en los pocilios. Luego, se agregó el anticuerpo secundario y se reveló con el anticuerpo conjugado con peroxidasa y TMB (tetrametilbencidina) . La reacción se detuvo agregando HC1 1 N. Después de cada etapa, la placa se incubó 30 min a 25°C y se lavó con la solución de PBS-Tween 20. Se agregó un blanco (tampón de dilución) a los pocilios disponibles y se sometió a los mismos tratamientos. La placa se leyó a DO 450 y 630 nm.

Se evaluó la cantidad de PRP-T no adsorbida por HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio de iones alto rendimiento -detección amperométrica pulsada) de la siguiente forma: Se preparó primeramente una gama estándar de PRP-T de referencia de 0.5 a 12. 5 g/ml.

Se centrifugaron las muestras que se evaluaron al igual que las muestras de la gama estándar a 5000 g durante 5 min a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se recogieron, hidrolizaron con una solución de NaCl 1.5 N que contiene la glucosamina-l-fosfato como estándar interno. Se agregó un blanco (NaCl 0.9%; NaOH 1.5 N + estándar interno).

La cromatografía se realizó con una etapa móvil compuesta de NaOH 35 mM y de acetato de sodio 114 mM inyectada en la columna a razón de 1.2 ml/min.

Se calculó la concentración en PRP no adsorbido ( g/ml) a partir de la siguiente igualdad: (Superficie del pie PRP/superficie del pie estándar interno) = a x [concentración en PRP] + b donde "a" es la pendiente y "b" es la ordenada en el origen, y a y b se determinaron a partir de la recta de regresión.

Los resultados se presentan en las 4 tablas siguientes: PRP-T no adsorbido (µ?/???) en la formulación del producto final a granel (PFV 39-41-42) a + 5°C Tiempo trascurrido después de PFV39 PFV41 PFV42 la operación de formulación A modo de comparación, también se evaluó la adsorción en el curso del tiempo del HBsAg contenido en tres lotes de producto final a granel (FDN5-6-7) al igual que en tres lotes repartidos en frascos (S44-45-46) de una preparación liquida compuesta de los mismos antigenos pero obtenida de conformidad con un procedimiento de formulación linear descrito en la Figura 1 y por ende diferente del descrito en el siguiente ejemplo. Esta preparación contenia en 0.5 mi: 10 pg de HBsAg, 30 Lf de Dt, 10 Lf de Tt, 25 pg de Pt, 25 pg de FHA, 40 del virus de poliomielitis tipo 1, 8 del virus de poliomielitis tipo 2, 32 del virus de poliomielitis tipo 3, 12 pg de PRP (en forma de PRP-T) , 0.6 mg de Al, iones fosfato con una concentración de 55 mMol/1, iones carbonato con una concentración de 20 mMol/1, tampón Tris sacarosa con una concentración de 2.5 mMol/1 en Tris y 2.125% en sacarosa, y 14 pg de aminoácidos catiónicos (His - Arg - Lys) provenientes del medio M199 (valencia polio), pH 6.8 - 7.2 .

Los resultados obtenidos fueron los siguientes: Las cantidades de PRP-T no adsorbido medidas durante el mismo período indicaron que había pocas variaciones con respecto al tiempo 0 y por ende eran satisfactorias. Sin embargo, estos resultados indican que en este caso que no corresponde a una formulación obtenida mediante un procedimiento de conformidad con la invención, el antígeno de superficie de hepatitis B no quedaba adsorbido en oxihidróxido de aluminio.

Datos experimentales relativos a los aminoácidos catiónicos Una composición de conformidad con la invención preparada directamente en función del protocolo experimental aplicado en el ejemplo proporcionado y una composición obtenida mediante un protocolo modificado en el que se habla sustituido una composición que contiene únicamente los tres aminoácidos catiónicos (Arg - Lys - His) a la composición de los 12 aminoácidos esenciales, se compararon en lo que respecta a la cantidad de PRP-T no adsorbida finalmente. No se observó diferencia alguna en la cantidad de PRP-T no adsorbido, lo que demuestra que solo los aminoácidos catiónicos son importantes.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. El procedimiento de preparación de una combinación de vacuna liquida que comprende al menos: oxihidróxido de aluminio (AlOOH) , un antigeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) , - un antigeno de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) constituido por polisacárido capsular conjugado en una proteina portadora, donde el antígeno de superficie de hepatitis B se 5 mantiene en adsorción en AlOOH en tanto que el antigeno de Hib se mantiene en no adsorción, según el cual: se procede a adsorber el antigeno de superficie de 0 hepatitis B en AlOOH para obtener un complejo AlOOH/HBsAg, se mezcla dicho complejo AlOOH/HBsAg con el antigeno de Hib en presencia de aminoácidos catiónicos con una concentración de al menos 100 mg/1, y de iones fosfato 5 con una concentración de 35 a 45 mMol/1.

2. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, según el cual se procede a adsorber el Q antigeno HBsAg sobre aluminio mezclando una suspensión de AlOOH con una suspensión de HBsAg en agitación durante al menos 4 horas, preferentemente al menos 12 horas, preferentemente entre 20 y 24 horas.

3. El procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que se agregan 5 los aminoácidos catiónicos a dicho complejo AlOOH/HBsAg antes de mezclar con el antígeno de Hib.

4. El procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que se agregan los aminoácidos catiónicos a dicho antigeno de Hib antes de mezclar con el complejo AlOOH/HBsAg.

5. El procedimiento de conformidad con una de las 15 reivindicaciones anteriores, caracterizado por que se agregan los iones fosfato al complejo AlOOH/HBsAg antes de mezclar con el antigeno de Hib.

6. El procedimiento de conformidad con una de las ^° reivindicaciones anteriores, caracterizado por que se ajusta el pH de la preparación que comprende el complejo AlOOH/HBsAg a 7.1 + 0.1 antes de mezclar con el antigeno de Hib.

7. El procedimiento de conformidad con la 25 reivindicación 1, caracterizado por que además consiste en: preparar una composición que comprende al menos un antigeno seleccionado entre los antigenos de difteria, 2Q tétanos, poliomielitis, tos ferina, además de oxihidróxido de aluminio, y mezclar dicho complejo AlOOH/HBsAg con dicha composición, antes de proceder a la mezcla con el antigeno de Hib.

8. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado por que consiste en preparar dicha composición agregando cada uno de los antigenos sucesivamente a una suspensión de oxihidróxido de aluminio y agitando entre cada adición de antigenos.

9. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que: se adsorbe el HBsAg sobre una cantidad parcial de 5 AlOOH que representa el tercio del AlOOH total presente en la composición final, durante un periodo de 20 a 24 horas, a fin de formar un complejo AlOOH/HBsAg, se adsorbe en paralelo, sobre una cantidad 0 complementaria de AlOOH, sucesivamente: la toxina diftérica D, la toxina tetánica T, la toxina purificada de Bordetella pertussis PTxd adsorbida ella misma previamente sobre AlOOH, hemaglutinina filamentosa de Bordetella pertussis FHA 5 adsorbida ella misma previamente sobre AlOOH, después se añaden iones fosfato, y a continuación se agrega el complejo AlOOH/HBsAg, Q - se agregan nuevamente iones fosfato en una cantidad que permite alcanzar una concentración de 40 mMol/1 en la composición final, se agrega al menos un aminoácido catiónico en una cantidad que permite alcanzar una concentración de al menos 100 mg/1 en la composición final, se ajusta el pH a 7.1 + 0.1, se agregan antigenos de poliomielitis en forma de virus inactivados de tipo 1, y/o de tipo 2 y/o de tipo 3, se agrega el antigeno Hib, se ajusta el pH a 7.1 + 0.1, se reparte la composición obtenida en jeringa o frascos .

10. El procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que se preparan a escala industrial al menos 250 1 de composición de vacuna .

11. La composición de vacuna obtenida de conformidad con el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y que comprende al menos el antigeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) y el antigeno de Hib constituido por Polirribosilribitolfosfato conjugado de proteina tetánica (PRP-T)

12. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación anterior, caracterizada por que comprende además antigenos de difteria, tétanos, poliomielitis y tos ferina .

13. La composición de vacuna de conformidad con una de las reivindicaciones 11 o 12, caracterizada por que comprende al menos : el antigeno de superficie de hepatitis B, HBsAg, el antigeno de difteria en forma de toxina diftérica D, el antigeno de tétanos en forma de toxina tetánica T, los antigenos de tos ferina en forma de Toxina Purificada (PTxd) y de Hemaglutinina filamentosa (FHA) , el antigeno de Haemophilus influenzae tipo b, en forma de polirribosilribitolfosfato conjugado de proteina tetánica (PRP-T), los antigenos de poliomielitis en forma de virus inactivados seleccionados entre los tipos 1, 2 y 3.

14. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada por que comprende al menos: de 10 a 30 µg de HBsAg/ml, preferentemente 20 pg/ml; de 40 a 80 Lf de D/ml, preferentemente de 50 a 70 Lf/mi; de 10 a 50 Lf de T/ml, preferentemente de 10 a 30 Lf/mi; de 40 a 60 pg de FHA/ml, preferentemente 50 pg/ml; de 40 a 60 pg de PTxd/ml, preferentemente 50 pg/ml; de 2 a 60 pg de PRP/ml, preferentemente 20-24 pg/ml, en forma de conjugado PRP-T; de 1 a 2 mg de AlOOH/ml; preferentemente 1.2 mg de AlOOH/ml; de 35 a 45 mMol/1, preferentemente de 38 a 42 mMol/1 de iones fosfato; de 100 a 1000 mg/1 de aminoácidos catiónicos, preferentemente de 400 a 800 mg/1 los tipos 1, 2 y 3 del virus de poliomielitis en forma inactivada en la cantidad respectiva de 80, 16 y 64 DU/ml.