CN103458925A - 包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于保护免患破伤风的疫苗的领域，并且具体涉及包含吸附在铝盐上的破伤风类毒素的疫苗的生产方法。提供方法，由此将破伤风类毒素吸附至具有用于最佳结果的确定特征的铝盐佐剂上。

Description

包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法

发明领域

本发明涉及用于保护免患破伤风的疫苗的领域，并且具体是包含吸附在铝盐上的破伤风类毒素的疫苗的生产方法。

背景技术

已知可以预防通常组合有百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)的破伤风梭菌(Clostridiumtetani)的疫苗。此类疫苗可以包含一种或多种吸附在铝盐上的源于破伤风梭菌、百日咳博德特氏菌和/或白喉棒杆菌的抗原。本发明人已经惊奇地发现铝盐的蛋白吸附和/或如通过X射线衍射测定的晶体大小对吸附至所述铝盐上的抗原并且具体为源于破伤风梭菌的类毒素([例如]破伤风类毒素)的免疫原性是重要的。

发明概述

因此，本发明提供了包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法，其包括将破伤风类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒具有2.5-3.5 mg蛋白/mg铝盐的蛋白吸附能力。

在本发明的进一步方面，提供了包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法，其包括将破伤风类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒具有如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm的晶体大小。

在进一步的方面，本发明提供了铝盐佐剂的灭菌方法，其包括照射步骤并且不包括高压灭菌步骤。

附图简述

图1 ζ电势pH 7.0 (mV)相比于蛋白吸附(mg BSA/mg Al³⁺)。

图2 辐射对蛋白吸附和表面电荷(ZP)的作用。

发明详述

本发明人已经发现其上吸附有破伤风类毒素的铝盐的蛋白吸附、ζ电势和/或晶体大小对于破伤风类毒素疫苗的免疫学特征非常重要。因此，本发明提供了包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法，其包括将破伤风类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒具有2.5-3.5 mg蛋白/mg铝盐的蛋白吸附能力。

破伤风类毒素(TT)及其制备方法在本领域是众所周知的。在一个实施方案中，通过从破伤风梭菌的培养物纯化毒素随后通过化学解毒作用来生产TT，但或者通过纯化重组的或遗传解毒的毒素类似物来制备它(例如，如EP 209281中描述)。解毒作用的优选方法如下。发酵后，在硅藻土作为助滤剂存在的情况下，将培养液在0.1-0.3µm滤器上过滤。将收获物经0.22µm滤器澄清，浓缩并在30kD平板膜上对10体积的磷酸盐缓冲液(20mM – pH 7.3)渗滤。随后在37℃下将渗滤后的毒素在以下条件下解毒4周：甲醛20mM – 赖氨酸3mM – 磷酸钾100mM – 起始pH 7.3 – 500 Lf/ml。将所获的类毒素通过硫酸铵分级纯化，浓缩并对WFI渗滤(30kD)以去除硫酸铵。加入NaCl至终浓度为0.9%，将pH调节至7.3并将纯化的破伤风类毒素无菌过滤。

可以使用任何合适的破伤风类毒素。‘破伤风类毒素’可以包含全长蛋白的免疫原性片段(例如片段C－见EP 478602)。

将本发明的破伤风类毒素吸附至铝盐上。在本发明的一个具体实施方案中，铝盐是氢氧化铝。在另一个实施方案中，可以将本发明的破伤风类毒素吸附至铝盐诸如磷酸铝上。在进一步的实施方案中，可以将破伤风类毒素吸附至氢氧化铝和磷酸铝的混合物上。

将蛋白包括破伤风类毒素吸附至铝盐上的方法对于技术人员是熟知的(例如疫苗制备通常描述于Vaccine Design “The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York中)。

在本发明的一个具体实施方案中，铝盐具有2.5-3.5、2.6-3.4、2.7-3.3或2.9-3.2 mg蛋白/mg铝盐的蛋白吸附能力，例如2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4或3.5 mg蛋白/mg铝盐的蛋白吸附能力。铝盐可以具有2.5-3.7、2.6-3.6、2.7-3.5或2.8-3.4 mg蛋白(BSA)/mg铝盐的蛋白吸附能力，例如3.6 mg蛋白(BSA)/mg铝盐的蛋白吸附能力。铝盐的蛋白吸附能力可以通过技术人员已知的任何方法来测定。在本发明的一个具体实施方案中，使用如实施例1中描述的方法(其利用BSA)或其变化测定铝盐的蛋白吸附能力。在本发明的一个具体实施方案中，铝盐的蛋白吸附能力为2.9-3.2 mg BSA/mg铝盐。

在本发明进一步的实施方案中，本发明的铝盐具有如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm的晶体大小，例如2.9-5.6nm、2.8-3.5nm、2.9-3.4nm或3.4-5.6nm。X射线衍射对于技术人员是熟知的。在本发明的一个具体实施方案中，使用实施例1中描述的方法测定晶体大小。

在本发明进一步的实施方案中，铝盐在pH 7具有约17-23 mV、18-22 mV或19-21 mV的ζ电位，例如17、18、19、20、21、22或23 mV的ζ电位。铝盐在pH 7可以具有14-22 mV、15-21 mV或16-20 mV的ζ电位，例如14、15或16 mV的ζ电位。可以通过技术人员已知的任何方法例如通过数字光散射(DLS)测定ζ电位。在本发明的一个具体实施方案中，使用如实施例1中描述的方法测定ζ电位。

已经发现具有至少在以上范围内的蛋白吸附能力并任选具有在以上范围内的晶体大小和/或ζ电位的铝盐对于配制包含破伤风类毒素的组合疫苗、在破伤风类毒素效价以及共配制抗原的免疫原性方面是最佳的。抗原诸如破伤风类毒素效价的提高提供了使用更低量的抗原来实现相同水平的免疫应答的可能性，从而利于节约抗原。

可以通过技术人员已知的任何方法制备本发明的铝盐(例如见，疫苗制备通常描述于Vaccine Design “The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York、US4882140A和US4826606A中)。技术人员知道如何改变蛋白吸附、晶体大小和/或表面电荷(在pH 7的ζ电位)，并且因此如何使铝盐展示出在确定参数内的这些特征。

或者，用于本发明的方法中的铝盐可以是商业来源的，例如Rehydragel^TM HS (在水中3%的氢氧化铝[General Chemical])或Alhydrogel^TM 85 (Brenntag BioSector [Denmark])。

在本发明的一个具体实施方案中，如本文描述的铝盐(例如Rehydragel^TM HS或Alhydrogel^TM 85)在购买后尚未进行高压灭菌。(Alhydrogel^TM 85由制造商高压灭菌(即，在购买前)，而Rehydragel^TM HS改为由制造商通过照射灭菌。)为了产生本发明的无菌铝盐，将铝盐通过其他方法具体为通过照射进行灭菌。可以使用紫外线(UV)、来自放射性同位素源(例如钴-60)的γ(λ)辐射、β(β)辐射、电子束或X射线照射将铝盐照射以产生无菌铝盐。在一个具体实施方案中，将本发明的铝盐通过γ辐射灭菌。在另一个实施方案中，提供铝盐佐剂的灭菌方法，其包括将所述佐剂仅高压灭菌一次。在该实施方案中，可以以实现灭菌所需的最少时间将佐剂高压灭菌，例如从高压灭菌循环开始至结束不超过约90分钟。任选地，一次高压灭菌的佐剂还可以通过照射灭菌。

本发明人已经显示高压灭菌本发明的铝盐可以降低吸附至所述铝盐上的蛋白(尤其是破伤风类毒素)的免疫原性。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了铝盐佐剂的灭菌方法，其包括照射步骤并且不包括高压灭菌步骤。

在进一步的实施方案中，本发明提供了包含破伤风类毒素和白喉类毒素的免疫原性组合物的生产方法，其包括将白喉类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒如本文描述。

白喉类毒素(DT)及其制备方法广泛记载。可以使用任何合适的白喉类毒素。例如，可以通过从白喉棒杆菌的培养物纯化毒素随后通过化学解毒作用来生产DT，但或者通过纯化重组的或遗传解毒的毒素类似物来制备(例如，CRM197，或如US 4,709,017、US 5,843,711、US 5,601,827和US 5,917,017中描述的其他突变体)。解毒作用的优选方法如下。发酵后，将白喉类毒素通过TFF 0.45µm收获，经0.22µm滤器澄清，浓缩并在10kD平板膜上对10体积的磷酸盐缓冲液(20mM – pH 7.2)渗滤。随后在37℃下将渗滤后的毒素在以下条件下解毒6周：甲醛50mM – 赖氨酸25mM – 磷酸钾50mM – 起始pH 7.2 – 300 Lf/ml。将所获的类毒素通过硫酸铵分级纯化，浓缩并对WFI渗滤(30kD)以去除硫酸铵。加入NaCl至终浓度为0.9%，将pH调节至7.3并将纯化的白喉类毒素无菌过滤。

在一个具体的实施方案中，提供本发明的方法，其中将破伤风和白喉类毒素单独或者共同吸附至铝盐上。在进一步的实施方案中，提供本发明的方法，其中将本发明的破伤风类毒素吸附至本发明的铝盐上，并且其中将白喉类毒素吸附至不同的铝盐上，所述铝盐可以是本发明的铝盐或任何其他铝盐。

在进一步的实施方案中，提供本发明的方法，其进一步包括将免疫原性组合物与灭活脊髓灰质炎疫苗配制的步骤。灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV)可以包含1型IPV或2型IPV或3型IPV、或1型和2型IPV、或1型和3型IPV、或2型和3型IPV、或1型、2型和3型IPV。

灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)的制备方法是本领域熟知的。在一个实施方案中，如同疫苗领域中普遍的，IPV应该包含1型、2型和3型，并且可以是用甲醛灭活的索尔克脊髓灰质炎疫苗(例如见Sutter等, 2000, Pediatr. Clin. North Am. 47:287; Zimmerman和Spann 1999, Am Fam Physician 59:113; Salk等, 1954, Official Monthly Publication of the American Public Health Association 44(5):563; Hennesen, 1981, Develop. Biol. Standard 47:139; Budowsky, 1991, Adv. Virus Res. 39:255)。或者，IPV可以使用Sabin菌株制成(Sabin-IPV; Kersten等 (1999), Vaccine 17:2059)。

在一个实施方案中，(例如，在与其他组分混合之前)IPV不吸附。在另一个实施方案中，(例如，在与其他组分混合之前或之后)可以将本发明的IPV组分吸附至铝盐诸如氢氧化铝上。在另一个实施方案中，可以将本发明的IPV组分吸附至铝盐诸如磷酸铝上。在进一步的实施方案中，可以将IPV组分吸附至氢氧化铝和磷酸铝两者的混合物上。如果吸附的话，可以将一种或多种IPV组分单独吸附或作为混合物共同吸附。在进一步的实施方案中，如本文描述将IPV吸附至铝盐/颗粒上。

在进一步的实施方案中，提供本发明的方法，其进一步包括将免疫原性组合物与百日咳杆菌粘附素配制的步骤。百日咳杆菌粘附素(百日咳的69 kDa抗原)是外膜蛋白，其是热稳定的并且能通过本领域已知的方法制备(见EP0162639)。任选将百日咳杆菌粘附素吸附至铝盐颗粒上。在本发明的一个实施方案中，将百日咳杆菌粘附素吸附至氢氧化铝上。在本发明的一个具体实施方案中，如本文描述将百日咳杆菌粘附素吸附至铝盐上。

在进一步的实施方案中，提供本发明的方法，其进一步包括将免疫原性组合物与丝状血细胞凝集素(FHA)配制的步骤。可以以本领域熟知的方法制备FHA(见WO/1990/013313 (US7479283)中公开且引用的方法)。任选将FHA吸附至铝盐颗粒上。在本发明的一个实施方案中，将FHA吸附至氢氧化铝上。在本发明的一个具体实施方案中，如本文描述将FHA吸附至铝盐上。

在进一步的实施方案中，提供本发明的方法，其进一步包括将免疫原性组合物与百日咳类毒素配制的步骤。百日咳类毒素的生产方法对于技术人员是熟知的。可以通过甲醛处理的熟知方法或通过突变方法(PT衍生物)将百日咳毒素解毒。已经发现蛋白的S1亚基内的残基替换产生保留百日咳毒素的免疫学和保护特性但具有降低的或没有毒性的蛋白(EP 322533)。在EP322533的权利要求中讨论的解毒突变是本发明的PT解毒突变体的实例。任选将百日咳类毒素吸附至铝盐颗粒上。在本发明的一个实施方案中，将百日咳类毒素吸附至氢氧化铝上。在本发明的一个具体实施方案中，如本文描述将百日咳类毒素吸附至铝盐上。

在进一步的实施方案中，提供本发明的方法，其进一步包括将免疫原性组合物与来自b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(Hib)的荚膜糖配制的步骤，其任选吸附至铝盐颗粒上。

来自b型流感嗜血杆菌的多核糖基核糖醇磷酸荚膜糖(PRP)可以与载体蛋白缀合。糖是核糖、核糖醇和磷酸的聚合物。如WO97/00697中描述可以任选将Hib抗原吸附至磷酸铝上，或者如WO02/00249中描述可以不吸附或者可以不进行具体的吸附处理。

本文的抗原‘未吸附至铝佐剂盐上’(“未吸附(unadsorbed)”或“未吸附(not adsorbed)”)表示例如在组合物的配制方法中不涉及明确的或专门的抗原在新的铝佐剂盐上的吸附步骤。

Hib可以与任何载体缀合，所述载体可以提供至少一种辅助T细胞表位，并且可以是破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM-197(白喉类毒素突变体)或来自非分型流感嗜血杆菌的蛋白D(EP0594610)。

在进一步的实施方案中，提供本发明的方法，其进一步包括将免疫原性组合物与乙肝表面抗原配制的步骤。

乙肝表面抗原(HBsAg)的制备广泛记载。例如见Hartford等, 1983, Develop. Biol. Standard 54:125; Gregg等, 1987, Biotechnology 5:479; EP0226846; EP0299108。它可以如下制备。由于在HBV感染过程中，大量HBsAg在肝脏中合成并释放至血流中，因此一种方法涉及从慢性乙肝携带者的血浆中纯化微粒形式的抗原。另一种方法涉及通过重组DNA方法表达蛋白。可以通过在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母、毕赤酵母、昆虫细胞(例如Hi5)或哺乳动物细胞中表达来制备HBsAg。可以将HBsAg插入至质粒中，并且可以通过启动子诸如“GAPDH”启动子(来自甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)来控制它从质粒的表达。酵母可以培养在合成培养基中。可以随后通过包括步骤诸如沉淀、离子交换层析和超滤的方法来纯化HBsAg。纯化后，HBsAg可以进行透析(例如用半胱氨酸)。HBsAg可以以微粒形式使用。

如本文所用，表达方式“乙肝表面抗原”或“HBsAg”包括展示出HBV表面抗原的抗原性的任何HBsAg抗原或其片段。将理解除了HBsAg S抗原的226个氨基酸的序列之外(见Tiollais等, 1985, Nature 317:489和其中的参考文献)，如需要，如本文描述的HBsAg可以包括如以上参考文献中和EP0278940中描述的前S序列的全部或部分。具体而言，HBsAg可以包含含有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含相对于ad血清型的乙肝病毒的L-蛋白的可读框(该多肽称为L*; 见EP0414374)，HBsAg的L-蛋白的残基133-145和随后的残基175-400。在本发明的范围内，HBsAg还可以包括EP0198474 (Endotronics)中描述的前S1-前S2–S多肽或者其类似物诸如EP0304578 (McCormick and Jones)中描述的那些。如本文使用的HBsAg还可以指突变体，例如WO 91/14703或EP0511855A1中描述的“逃逸突变体”，尤其是其中在145位上的氨基酸替换为甘氨酸至精氨酸的HBsAg。

HBsAg可以是颗粒形式。颗粒可以包含例如单独S蛋白或者可以是复合颗粒，例如L*, S)，其中L*如上文定义并且S表示HBsAg的S蛋白。所述颗粒有利地为它在酵母中表达所处于的形式。

在一个实施方案中，HBsAg是用于EngerixB™ (GlaxoSmithKline Biologicals S.A.)中的抗原，其还描述于WO93/24148中。

可以将乙肝表面抗原任选吸附至铝盐具体为磷酸铝上，其可以在与其他组分混合前完成(描述于WO93/24148)。乙肝组分应该基本上不含硫柳汞(不含硫柳汞的HBsAg的制备方法之前已在EP1307473中公开)。

在本发明进一步的实施方案中，提供了铝盐佐剂的灭菌方法，其包括照射步骤并且不包括高压灭菌步骤。通过照射灭菌可以以技术人员已知的任何方法并且具体通过本文描述的任何照射方法来进行。

在本发明的进一步的实施方案中，提供了这样的方法，其中铝盐为氢氧化铝，其中，单位晶体大小为如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm，例如2.9-5.6nm、2.8-3.5nm、2.7-3.4nm或3.4-5.6nm，并且其中照射选自紫外线(UV)、来自放射性同位素源(例如钴-60)的γ(λ)辐射、β(β)辐射、电子束或X射线照射。

在本发明的进一步的实施方案中，提供了包含白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素、丝状血细胞凝集素和百日咳杆菌粘附素中的一种或多种的疫苗的制备方法，其中将白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素、丝状血细胞凝集素和百日咳杆菌粘附素中的一种或多种吸附至通过任何铝盐佐剂的灭菌方法制备的铝佐剂上，所述灭菌方法包括照射步骤并且不包括本文描述的高压灭菌步骤。

在本发明的一个具体实施方案中，提供如本文描述的方法，其中破伤风类毒素和/或白喉类毒素存在并且吸附至通过任何铝盐佐剂的灭菌方法制备的铝佐剂上，所述灭菌方法包括照射步骤并且不包括本文描述的高压灭菌步骤。

在本发明进一步的实施方案中，提供如本文描述的方法，其中白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素、丝状血细胞凝集素和百日咳杆菌粘附素均存在并且吸附至通过任何铝盐佐剂的灭菌方法制备的铝佐剂上，所述灭菌方法包括照射步骤并且不包括本文描述的高压灭菌步骤。

在每一种情况下，发明人意在本文的术语“包含(comprising)”、“包含(comprise)”和“包含(comprises)”可以分别由术语“由…组成(consisting of)”、“由…组成(consist of)”和“由…组成(consists of)”所替换。

术语“免疫原性组合物”任选由术语“疫苗”所替换，并且反之亦然。

以下实施例说明但不限制本发明的范围。

实施例

与以下实施例相关的注释：如上讨论，Alhydrogel^TM 85 (和Alhydrogel^TM)在购买前高压灭菌，同时ReHydragel^TM HS和其他“ReHydragel^TM”表示的铝盐没有高压灭菌。因此，当说明“Alhydrogel^TM”产品已经高压灭菌或再高压灭菌时，这表示在购买后高压灭菌(即第二次)。当说明“ReHydragel^TM”产品已经高压灭菌时，这表示购买后进行的第一次高压灭菌。

实施例1：铝盐的表征

对多种氢氧化铝测定蛋白吸附能力、表面电荷(ζ电位; ZP)和晶体大小。

1.1 氢氧化铝的 BSA 吸附能力

制备牛血清白蛋白(BSA)的贮存液，其包含在MilliQ水中6mg/ml的BSA和在MilliQ水中1mgAl³⁺/ml的氢氧化铝。

通过原子分光光度测定用亚硝火焰测定铝含量。使用在盐酸(HCl)中制备的一定范围的铝标准溶液建立标准曲线。将HCl用作空白。将已知量的铝样品用作阳性对照。将测试样品和阳性对照在HCl中稀释以获得在标准曲线范围内的铝的终浓度。通过加热矿化后，将样品冷却至室温并用纯水加至所需体积。随后用一氧化二氮-乙炔火焰测定铝浓度。从标准曲线测定测试溶液中的铝含量。

用不同比例的BSA/铝制备样品，例如：

(在上表中，最左侧的栏中“Vol”和“V”表示“体积”)。

根据铝盐的假定吸附能力调整BSA/Al³⁺的比例：

用NaOH 0.05N或HCl 0.1N将pH调节至6.1 +/-0.1。在室温下允许BSA过夜(16+/-4h)吸附至氢氧化铝上。随后将样品在4000 rpm下离心20 min直至观察到澄清的上清液。通过BCA(二喹啉甲酸)蛋白测定(Pierce)测定上清液中的BSA浓度，并且通过计算初始浓度和上清液中的浓度之间的差异来计算吸附在氢氧化铝上的BSA量。将吸附的BSA作为上清液中的BSA函数绘图以产生显示平台的曲线。将平台的高度计算为吸附能力。

1.2 铝盐的表面电荷 (ZP) 测定

使用DLS Malvern Zetasizer Nano S测定ζ电位(ZP)。使所有样品和稀释剂达到室温。将氢氧化铝在MilliQ水中稀释至浓度为0.05-0.2 mg Al³⁺/ml。将设备校准(-68mV标准)并用以下测定参数测定ZP：

测定类型： ζ电位

室： DTS1060

样品： Model Smoluchowsky, Al(OH)3

分散剂： 水

T°： 21℃ (室温)

平衡持续时间： 自动

测定数： 3或5

测定之间延迟： 30-60秒

电压： 自动

结果计算： 单模。

1.3 通过 X 射线衍射测定晶体大小

通过去除任何NaCl(通过透析)并干燥(通过干燥或冷冻干燥)制备样品。随后使用以下标准X射线分析参数测定晶体大小：

角度5-90°, 步大小= 0.02°, 步扫描= 2,4 s，连续方式

170 min数据采集

6mm直径支持

管功率，40V 40mA

随后如下计算晶体大小：

Sherrer定律联系衍射峰半高处的宽度与平均微晶大小：

D = (k * λ) / (ß * cos(θ))

其中

D : 平均晶体大小

k : 形式(形状)因子, 通常 = 1

λ: 波长 0,154056 nm (Kalpha Cu)

ß : 校正的峰宽弧度

θ: 布拉格角 (此处19,168°)。

1.4 结果

不同氢氧化铝的吸附能力、表面电荷和晶体大小显示在以下两个表中。显示的值是包括各个氢氧化铝的至少一个(一般是多个)批次的多个测定结果的平均值。第二个表与第一个表类似，但它是在已进行进一步测定后形成的。

图1显示了使用上表中的值的ζ电位对蛋白吸附能力作图。

1.5 高压灭菌的影响

对不同批次的Rehydragel^TM HS和Alhydrogel^TM 85测定高压灭菌铝盐的效果。如下表中显示，高压灭菌降低了铝盐的吸附能力。

如下表中显示，测定为ζ电位的表面电荷也受到高压灭菌的影响。

1.6 照射的影响

由于高压灭菌影响了铝盐的表面电荷和蛋白吸附，因此研究了通过辐射灭菌的影响。

图2显示了照射既未影响吸附能力，也未影响表面电荷。

实施例2：TT的效价

不同铝盐在白喉、破伤风、无细胞百日咳和灭活脊髓灰质炎病毒 (DTaP IPV) 组合疫苗中的 TT 效价 ( 破伤风类毒素的效价 ) 。

将DT和TT的混合物吸附至不同铝盐上并检测TT效价。根据如欧洲药典要求的试验(方法号2.07.08)检测TT效价。结果显示于下表中。(将底部一行中的Rehydragel^TM HS DT浓缩物储存在4℃下，同时等待向DTaP IPV中配制，而所有其他的DT浓缩物在最终配制之前在37℃下成熟7天。在该表中，如实施例2中的其他表中，“DT”表示“白喉类毒素和破伤风类毒素”; “效价T”表示“破伤风类毒素的效价”; “RP”表示“相对效价”; 并且“LCL” 和“HCL”分别表示“低置信界限”和“高置信界限”。)

(注意：上表括号中给出的吸附能力值是不可用的，并且是基于相应的AlOOH上的可用经验估计的)。

在第二个实验中，使用两种不同的破伤风类毒素。(将顶部一行中用于TT1的高压灭菌的Alhydrogel^TM DT浓缩物储存在4℃下，同时等待向DTaP IPV中配制，而所有其他的DT浓缩物在最终配制之前在37℃下成熟7天。)

(注意：上表括号中给出的吸附能力值是不可用的，并且是基于相应的AlOOH上的可用经验估计的)。

在第三个实验中，使用两组DT和TT，其中使用不同的解毒方法产生抗原。(在最终配制之前，将DT浓缩物储存在37℃下7天)。

不同铝盐在 DTaP HBV ( 乙肝病毒 ) IPV 组合疫苗中的 TT 效价。

研究1

将DT和TT吸附至不同铝盐上并检测TT效价。根据如欧洲药典要求的试验(方法号2.07.08)检测TT效价。结果显示于下表中。(将所有的DT浓缩物在室温下保持3-4天，并随后在2-8℃下等待向DTaP HBV IPV中配制。对于高压灭菌的Alhydrogel^TM 85和Rehydragel^TM HS每一种的上面和下面的效价值分别代表使用两种不同D类毒素的DT浓缩物。)

(注意：上表括号中给出的吸附能力值是不可用的，并且是基于相应的AlOOH上的可用经验估计的)。

研究2

将DT和TT吸附至不同铝盐上并检测TT效价。根据如欧洲药典要求的试验(方法号2.07.08)检测TT效价。结果显示于下表中。(在向DTaP HBV IPV中最终配制之前，将所有的DT浓缩物在37℃下成熟7天。使用四种不同的TT(以不同方式类毒素的：破伤风TTS03-FA02、破伤风TTS03-FA4、破伤风TTS03-FA3和破伤风TTS02-FA21)。破伤风TTS03-FA02类毒素的底部一行(Rehydragel^TM HS)使用相对于其他样品降低的DT量)。

实施例3：临床研究

详细标题

当作为初次接种过程向2、3和4个月年龄的健康婴儿施用时，用于评价GlaxoSmithKline Biologicals的DTPa-HBV-IPV/Hib疫苗新制剂的安全性和免疫原性的I/II期、双盲、随机、多中心研究。

说明

健康婴儿在生命第一年中对白喉、破伤风、百日咳、乙肝、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌(Hib)疾病的初次免疫。

研究和研究设计的原理

GSK Biologicals已经在临床前环境中验证了两种新的DTPa-HBV-IPV/Hib制剂(分别含有吸附至本发明的不同铝盐上的D和T抗原)并且目前将其进展至临床评价：

● 疫苗的制剂A(D_AT_APa-HBV-IPV/Hib)包含在氨基酸存在的情况下解毒并吸附至一次高压灭菌并照射的氢氧化铝佐剂(测定其具有平均3.1的吸附能力和16的ζ电位)上的白喉(D)和破伤风(T)抗原，而其他抗原与婴护宁六合一(Infanrix hexa)批准制剂中存在的抗原相同。

● 疫苗的制剂B(D_BT_BPa-HBV-IPV/Hib)包含在氨基酸存在的情况下解毒并吸附至照射的氢氧化铝佐剂(测定其具有平均3.6的吸附能力和20的ζ电位)上的白喉(D)和破伤风(T)抗原，而其他抗原与婴护宁六合一批准制剂中存在的抗原相同。

目前试验为I/II期研究，目的在于评价当作为初次接种过程向2、3和4个月年龄的健康婴儿施用时两种新制剂的安全性和免疫原性。

已经将婴护宁六合一疫苗的批准制剂用作基准来建立对所有疫苗抗原免疫应答的非次等性。

研究目的在于证明至少一种这些新制剂的免疫原性不次于目前批准的关于白喉、破伤风、乙肝、多核糖基-核糖醇-磷酸(PRP)和百日咳抗原的疫苗制剂的免疫原性。

研究采用随机双盲设计来预先防止新制剂评价中任何偏差机会。

目标

初级

● 为了证明在初次接种的第三次剂量后一个月至少一种DTPa-HBV-IPV/Hib制剂的免疫原性在对白喉、破伤风、乙肝和PRP抗原的血清保护率方面以及在对百日咳抗原的抗体几何平均浓度(GMCs)方面不次于批准制剂。

二级

● 为了评价初次接种的第三次剂量后一个月在血清保护状态、血清阳性状态和抗体浓度或滴度方面对研究疫苗的免疫应答。

● 为了评价在初次接种的第一次剂量前在血清保护状态、血清阳性状态和抗体浓度方面对白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎抗原的免疫状态。

● 为了评价初次接种的第三次剂量后一个月在疫苗应答方面对百日咳抗原的免疫应答。

● 为了评价在征求(solicited)和非征求(unsolicited)、局部和全身症状和严重不利事件方面研究疫苗的安全性和反应原性。

研究设计

● 实验设计：具有三个平行组的I/II期、双盲、随机、多中心研究。

● 研究持续时间为每个受试者大约三个月。

● 对照：GSK Biologicals的DTPa-HBV-IPV/Hib疫苗(婴护宁六合一)。

● 疫苗时间表：按照他们的组分配，所有受试者在2、3和4个月年龄时接受DTPa-HBVIPV/Hib三种制剂中的一种的三次剂量。

● 此外，所有受试者在2、3和4个月年龄时接受Wyeth-Lederle的13-价肺炎球菌疫苗(Prevenar13)的三次剂量。

治疗组：简介表1显示了研究组和研究中施用的疫苗。

简介表1 治疗组

● 治疗分配：随机的1:1:1。

● 盲：这是双盲研究。

● 血液取样：在以下两个取样时间点上从所有受试者取血液样品：

○ 在第一次疫苗剂量之前(Pre-Pri)，收集至少3.5 ml的血液样品；

○ 在第三次疫苗剂量之后一个月(Post-Pri)，收集5ml血液样品。

● 研究类型：自包含。

● 数据采集：使用电子病例报告形式(eCRFs)远程数据输入(RDE)。

受试者数

● 目标样本大小为720名受试者(每组中240名)来提供可评价免疫原性的648名受试者(每组中216名)。对于免疫原性的实际根据协议(ATP)人群为651名 (制剂A = 215; 制剂B = 217; 对照= 219)。

终点

初级

● 关于研究疫苗组分的免疫原性

○ 初次接种第三次剂量后一个月的抗白喉、抗破伤风、抗HBs和抗PRP血清保护状态

○ 初次接种第三次剂量后一个月的抗百日咳类毒素(抗PT)、抗丝状血细胞凝集素(抗FHA)和抗百日咳杆菌粘附素(抗PRN)抗体浓度。

次级

● 关于研究疫苗组分的免疫原性

○ 初次接种第三次剂量后一个月的抗白喉、抗破伤风、抗HBs、抗1型脊髓灰质炎病毒、抗2型脊髓灰质炎病毒、抗3型脊髓灰质炎病毒、抗PRP、抗PT、抗FHA、抗PRN、抗肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、抗体浓度或滴度和血清保护和/或血清阳性状态。

○ 初次接种第三次剂量后一个月的对PT、FHA和PRN的疫苗应答。

○ 初次接种第一次剂量之前的抗白喉、抗破伤风、抗PT、抗FHA、抗PRN、抗1型脊髓灰质炎病毒、抗2型脊髓灰质炎病毒和抗3型脊髓灰质炎病毒抗体浓度或滴度和血清保护和/或血清阳性状态。

● 征求的局部和全身不利事件。

○ 每次接种后8天(第0-7天)随访期内征求的局部症状的发生。

○ 每次接种后8天(第0-7天)随访期内征求的全身症状的发生。

● 未征求的不利事件。

○ 按照医学词典对调控活动(MedDRA)的分类，每次接种后31天(第0-30天)随访期内未征求AEs的发生。

● 严重不利事件。

○ 从剂量1直至研究结束严重不利事件的发生。

结果

● 之前进行重配制的DTPa-HBV-IPV/Hib疫苗的II期试验(随机、观察者盲、自包含、初次免疫、多中心研究)，所述DTPa-HBV-IPV/Hib疫苗包含通过新方法生产并吸附至氢氧化铝Alhydrogel^TM(再高压灭菌的)上的D和T抗原。在2、3和4个月，144个婴儿接受了测试疫苗并且149个婴儿接受了批准对照。第三次疫苗剂量后一个月，D和T血清保护不次于批准对照。然而，在对于HBV的血清保护率方面和在对于抗FHA和抗PRN的GMC比例方面，没有符合非次等的标准。

● 在本研究中，在上述的先前试验中，制剂A显示出代表相对于测试制剂的实质性改善。除了D和T优秀的免疫原性(对D和T血清保护符合非次等标准)，HBV血清保护率显著高于在先前试验中的，并且不次于批准的制剂。与先前试验相比，观察到D、T和HBV抗原在GMCs方面更高的免疫应答的相同趋势。抗FHA GMC类似地符合非次等的标准，同时抗PRN GMC显示出对于先前试验的适度改善，并且在最低限度上超过了非次等的截止值。制剂B也显示出D、T、HBV的血清保护率和抗FHA GMCs的非次等性，但抗PRN GMCs低于制剂A中的。

Claims (36)

1.包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法，其包括将所述破伤风类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒具有2.5-3.5、2.6-3.4、2.7-3.3或2.9-3.2的蛋白吸附能力。

2.包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法，其包括将所述破伤风类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒具有2.5-3.7、2.6-3.6、2.7-3.5或2.8-3.4的蛋白吸附能力。

3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述铝盐具有如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm的晶体大小，例如2.9-5.6nm、2.8-3.5nm、2.9-3.4nm或3.4-5.6nm的晶体大小。

4.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述铝盐具有如通过X射线衍射测定的3.3-5.7nm的晶体大小。

5.权利要求1或权利要求3的方法，其中所述铝盐颗粒具有2.5-3.6的蛋白吸附能力和2.9-5.6nm的晶体大小。

6.包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法，其包括将所述破伤风类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒具有如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm的晶体大小，例如2.9-5.6nm、2.8-3.5nm、2.7-3.4nm或3.4-5.6nm的晶体大小。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其用于生产包含破伤风类毒素和白喉类毒素的免疫原性组合物，包括将所述白喉类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒(所述白喉类毒素吸附在其上)具有2.5-3.5、2.6-3.4、2.7-3.3或2.9-3.2的蛋白吸附能力。

8.权利要求7的方法，其中所述铝盐颗粒(所述白喉类毒素吸附在其上)具有如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm的晶体大小，例如2.9-5.6nm、2.8-3.5nm、2.7-3.4nm或3.4-5.6nm的晶体大小。

9.权利要求1-6中任一项的方法，其用于生产包含破伤风类毒素和白喉类毒素的免疫原性组合物，包括将所述白喉类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒具有如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm的晶体大小，例如2.9-5.6nm、2.8-3.5nm、2.7-3.4nm或3.4-5.6nm的晶体大小。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述铝盐颗粒在pH 7具有约17-23 mV、18-22 mV或19-21 mV的ζ电位。

11.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述铝盐颗粒在pH 7具有约14-22 mV、15-21 mV或16-20 mV的ζ电位。

12.权利要求7-11中任一项的方法，其中所述白喉类毒素和破伤风类毒素单独吸附或共同吸附至所述铝盐颗粒上。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中已经通过将破伤风毒素化学解毒而生产所述破伤风类毒素。

14.权利要求1-12中任一项的方法，其中已经通过将破伤风毒素遗传解毒而生产所述破伤风类毒素。

15.权利要求7-14中任一项的方法，其中已经通过将白喉毒素化学解毒而生产所述白喉类毒素。

16.权利要求7-14中任一项的方法，其中已经通过将白喉毒素(具体为CRM197)遗传解毒而生产所述白喉类毒素。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其进一步包括将所述免疫原性组合物与灭活脊髓灰质炎疫苗配制的步骤，任选所述灭活脊髓灰质炎疫苗已吸附至铝盐颗粒上。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其进一步包括将所述免疫原性组合物与百日咳杆菌粘附素配制的步骤，任选所述百日咳杆菌粘附素已吸附至铝盐颗粒上。

19.权利要求1-18中任一项的方法，其进一步包括将所述免疫原性组合物与丝状血细胞凝集素配制的步骤，任选所述丝状血细胞凝集素已吸附至铝盐颗粒上。

20.权利要求1-19中任一项的方法，其进一步包括将所述免疫原性组合物与百日咳类毒素配制的步骤，任选所述百日咳类毒素已吸附至铝盐颗粒上。

21.权利要求17-20中任一项的方法，其中(所述进一步步骤的)所述铝盐颗粒在pH 7具有约17-23 mV、18-22 mV或19-21 mV的ζ电位。

22.权利要求17-21中任一项的方法，其中(所述进一步步骤的)所述铝盐颗粒具有2.5-3.5、2.6-3.4、2.7-3.3或2.9-3.2的蛋白吸附能力。

23.权利要求17-22中任一项的方法，其中(所述进一步步骤的)所述铝盐颗粒具有如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm的晶体大小，例如2.9-5.6nm、2.8-3.5nm、2.7-3.4nm或3.4-5.6nm的晶体大小。

24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述铝盐是氢氧化铝。

25.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述铝盐尚未进行高压灭菌。

26.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述铝盐已经进行仅一次的高压灭菌。

27.权利要求26的方法，其中以实现灭菌所需的最少时间将所述铝盐高压灭菌，例如从高压灭菌循环开始至结束不超过约90分钟。

28.权利要求1-27中任一项的方法，其中所述铝盐通过照射灭菌。

29.权利要求1-28中任一项的方法，其进一步包括将所述免疫原性组合物与来自b型流感嗜血杆菌的荚膜糖配制的步骤，任选所述来自b型流感嗜血杆菌的荚膜糖已吸附至铝盐颗粒上。

30.权利要求1-29中任一项的方法，其进一步包括将所述免疫原性组合物与乙肝表面抗原配制的步骤，任选所述乙肝表面抗原已吸附至铝盐颗粒上。

31.权利要求29或30的方法，其中所述铝颗粒是磷酸铝。

32.权利要求1-31中任一项的方法，其中所述铝盐颗粒具有2.5-3.7、2.5-3.5、2.6-3.6、2.6-3.4、2.7-3.5、2.7-3.3、2.8-3.4或2.9-3.2 mg BSA/mg铝盐的蛋白吸附能力。

33.疫苗生产方法，所述疫苗包含白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素、丝状血细胞凝集素和百日咳杆菌粘附素中的一种或多种，其中将白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素、丝状血细胞凝集素和百日咳杆菌粘附素中的一种或多种吸附至铝佐剂上，其中通过包括照射步骤并且不包括高压灭菌步骤的方法将所述佐剂灭菌。

34.权利要求33的方法，其中破伤风类毒素和/或白喉类毒素存在并且吸附至所述铝佐剂上。

35.权利要求33或34的方法，其中白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素、丝状血细胞凝集素和百日咳杆菌粘附素均存在并且吸附至所述铝佐剂上。

36.通过权利要求1-35中任一项的方法制备的免疫原性组合物。

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