CN108435140A - 一种破伤风外毒素吸附剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种破伤风外毒素吸附剂,它包含载体及固载在载体表面的结合破伤风外毒素的免疫球蛋白及全氟化合物。本发明利用免疫吸附方法治疗破伤风患者,通过将人破伤风免疫球蛋白固载于载体微球,利用免疫球蛋白与外毒素特异性结合的原理,高效清除血液中游离的破伤风外毒素,而全氟化合物的引入增加了吸附剂的溶氧量,通过体外血液循环,增加血液内氧含量,减轻患者的由于喉痉挛造成的窒息。破伤风外毒素吸附剂利用高效价的破伤风免疫球蛋白,该免疫球蛋白中和破伤风毒素特异性强,无过敏反应,而且吸附剂额外的增氧功能使临床应用时操作更简单,感染风险更小。
Description
技术领域
本发明涉及医疗生物材料领域,具体是指一种破伤风外毒素吸附剂与应用。
背景技术
破伤风是常和创伤相关联的一种特异性感染,是极为严重的疾病,死亡率高,如今仍然是一个世界性健康问题。发达国家主要发病对象为老年人群且均为主动免疫后未加强免疫,而发展中国家几乎所有人群均可发病,破伤风仍然是贫困人群死亡的重要原因。由于缺乏有效的治疗方法,破伤风的死亡率为20%~30%,重症破伤风患者的死亡率为70%。
破伤风是由破伤风梭菌经伤口深部感染引起的一种急性中毒性人畜共患病,具有急性,致死性和可预防性的特点。破伤风患者会有一系列的并发症:窒息、肺部感染、酸中毒、循环衰竭等,这些并发症往往是造成病人死亡的重要原因。破伤风患者一经确诊,需要采取积极的综合措施,传统的治疗方式包括:清创消除毒素来源,给予免疫制剂中和游离毒素,控制与解除痉挛,确保呼吸道通畅,防治并发症等。高效价的破伤风免疫球蛋白,能高效中和破伤风毒素,无过敏类反应,是治疗破伤风的首选药物。
全氟化合物具有极高的溶氧和溶二氧化碳能力,常被用于代血液,也用于一氧化碳中毒的解救和治疗再生性障碍贫血,镰刀细胞性贫血、溶血性贫血以及破伤风等厌氧菌感染。全氟化合物不溶于水,也不溶于脂肪,作为“外来者”并不能被身体识别,对人无害。通常在37℃时,一个大气压下,100mL全氟化合物可携带45~55mL的溶解态氧,可溶解140mL~160mL二氧化碳。全氟化合物在含氧高的环境下,可溶解大量氧,而在含氧量低、含二氧化碳高的环境下,可释放自身所含的氧,并溶解二氧化碳。据报道,全氟化合物对氧的交换能力和排泄能力比血红蛋白还高。
在临床上,通过血液净化来治疗破伤风的研究早有报道,例如马昌义等人曾报道利用一次性血液灌流器对破伤风患者进行血液净化,并且得到一定的效果。目前报道的案例都是通过血液灌流的方式来清除血液中的破伤风外毒素,该方法特异性较差,且有些临床案例需要割开气管,以保证血液中的氧气水平,这增加了病患感染的风险。免疫吸附是血液净化的一种重要方法,通过对血液中病毒的特异性结合作用实现清除病毒的目的,不会造成机体的损伤,针对性强,治疗效果更显著。
发明内容
本发明的目的是为了解决破伤风感染患者在治疗过程中操作复杂,死亡率高的问题,提供了一种吸附破伤风外毒素的免疫吸附剂的制备方法。
为实现上述目的,首先,本发明提供一种破伤风外毒素吸附剂,包含载体及固载在在载体表面的结合破伤风外毒素的免疫球蛋白及全氟化合物。
上述方案中,所述全氟化合物为具有溶氧能力的全氟碳化合物或全氟胺类化合物。
优选地,所述全氟化合物选自全氟萘、全氟三丙基胺、全氟正辛基溴烷、全氟醚。全氟碳化合物用于为血液提供氧气。所述全氟化合物可以是全氟萘、全氟碳和全氟胺类化合物,可以但不限于全氟萘、全氟三丙基胺、全氟正辛基溴烷、全氟醚等。全氟化合物之间性质相似,基本能以同样的偶联条件偶联在载体上。为了减小配基的空间位阻,本发明优选的是由全氟正辛基溴烷衍生出来的化合物对全氟正辛基苯胺。
对全氟正辛基苯胺的合成过程如下:
所述载体的化学修饰:可采用但不限于溴化氰、高碘酸钠、环氧氯丙烷等活化剂。本发明优选活化试剂为环氧氯丙烷,利用这种活化剂活化方式简单,效率高,得到的修饰基团反应活性高。
所述的破伤风免疫球蛋白的固载量:采用不同修饰方法对载体微球进行修饰,在下一步的偶联过程中,不同修饰方式得到的微球对破伤风免疫球蛋白的固载效率都应不低于50%,得到的吸附剂含破伤风免疫球蛋白浓度不低于20IU/mL。通过共价键连接时,连接在载体上的破伤风免疫球蛋白在应用过程中脱落量不高于0.2%。
所述全氟化合物的固载量:全氟化合物与免疫球蛋白采用相同的连接方式固载于载体上,全氟化合物的固载效率不低于30%,脱落量不高于0.2%。所述的吸附剂的应用:使用该吸附剂对破伤风外毒素的吸附效率不低于50%。
可选地,所述结合破伤风外毒素的免疫球蛋白为人破伤风免疫球蛋白。破伤风免疫球蛋白为现阶段治疗破伤风的主要药物。破伤风免疫球蛋白能迅速持久地中和血液中游离的破伤风外毒素,从而避免破伤风毒素与中枢神经结合。破伤风免疫球蛋白属于人源性蛋白,效价高,使用安全,无副作用及过敏反应。
可选地,所述人破伤风免疫球蛋白在载体上的固载方式为化学连接。
可选地,所述化学连接中,采用的试剂选自环氧氯丙烷、溴化氰、高碘酸钠、羟基二咪唑、N-羟基琥珀酰亚胺酯。
上述方案中,所述载体选自无机材料、有机材料、高分子材料;所述无机材料选自硅胶、可控孔玻璃;有机材料选自纤维素、壳聚糖、琼脂糖、葡聚糖;高分子材料选自聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸衍生物、聚苯乙烯。
本发明还公开了一种破伤风外毒素吸附柱,包含上述破伤风外毒素吸附剂。
本发明的有益效果:本发明利用免疫吸附方法治疗破伤风患者,通过将人破伤风免疫球蛋白固载于载体微球,利用免疫球蛋白与外毒素特异性结合的原理,高效清除血液中游离的破伤风外毒素,而全氟化合物的引入增加了吸附剂的溶氧量,通过体外血液循环,增加血液内氧含量,减轻患者的由于喉痉挛造成的窒息。破伤风外毒素吸附剂利用高效价的破伤风免疫球蛋白,该免疫球蛋白中和破伤风毒素特异性强,无过敏反应,而且吸附剂额外的增氧功能使临床应用时操作更简单,感染风险更小。与传统肌肉注射相比,免疫吸附疗法的治疗周期短,不需要切开患者气管,治疗方法简单,效果显著;与血液灌流治疗方法相比,不仅免疫吸附过程特异性强,吸附效率更高,而且还能提高血液中的氧含量。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述,实施例仅为举例,不用于限制本发明。下述实施例中的实验材料,如无特殊说明,均可以通过常规的商业途径购得。下述实施例中所采用的方法,如无特殊说明,均为常规方法。
实施例
将破伤风免疫球蛋白及全氟化合物通过化学连接的方法连接在载体上,所述的化学连接的方法如下:
1)琼脂糖微球的预处理:
用大量蒸馏水清洗琼脂糖微球以除去有机溶剂,抽干;
2)载体活化:
取琼脂糖微球、1-4mol/的氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷按体积比为2:1:1的比例混合,40℃反应1h;反应结束后用大量蒸馏水洗涤,即得到活化修饰的琼脂糖微球;
3)免疫球蛋白与全氟正辛基苯胺在载体上的偶联:
将破伤风免疫球蛋白用生理盐水稀释到150IU/mL,将破伤风免疫球蛋白、全氟正辛基苯胺及活化的琼脂糖微球按照体积比为破伤风免疫球蛋白:全氟正辛基苯胺(40℃以上):琼脂糖微球为1:2:5的比例混合后,于45℃反应20h;用大量生理盐水、蒸馏水清洗,即得到破伤风免疫球蛋白外毒素吸附剂。
试验例1:破伤风外毒素吸附剂对破伤风外毒素吸附效率计算。
(1)静态吸附条件下破伤风外毒素吸附剂对破伤风外毒素吸附效率
取5mL吸附剂于250L锥形瓶中,加入100mL含破伤风外毒素的PBS(0.01M,pH7.4)溶液。在恒温摇床中,37℃震荡90min,利用间接双抗体夹心Elisa法,分别检测吸附前后血浆中破伤风毒素的浓度,取比值计算吸附效率,结果如表1所示:表明在静态条件下,吸附剂对外毒素的吸附效果可达75%以上。
表1:静态条件下破伤风外毒素吸附剂对破伤风毒素的吸附效率
(2)动态条件下破伤风外毒素吸附剂对破伤风外毒素吸附效率
取5mL吸附剂注入层析的滤膜上,用软管连通,加入100mL含破伤风外毒素的PBS(0.01M,pH7.4)溶液注入10mL层析柱中,用洁净的三角瓶回收穿流的破伤风外毒素溶液。将穿流的溶液重新注入层析柱,重复“吸附-洗脱-吸附”过程50回合;再按上述方法测定吸附剂对破伤风外毒素的吸附效率,结果如表2所示:在动态吸附过程中,通过多次重复操作,吸附剂的吸附效果会有所提高,吸附效率可以达到85%以上。
表2:动态条件下破伤风外毒素吸附剂对破伤风毒素的吸附效率
(3)多次重复动态吸附条件下的吸附效率
取5mL吸附剂注入层析的滤膜上,用软管连通。将100mL含破伤风外毒素的PBS(0.01M,pH7.4)溶液注入10mL层析柱中,用洁净的三角瓶回收穿流溶液。将穿流的溶液重新注入层析柱,重复“吸附-洗脱-吸附”过程50回合,每穿流50回合便更换吸附剂1次,直至更换8次,模拟一次临床治疗,用上述方法对破伤风外毒素抗原含量进行检测,取比值计算吸附效率,结果如表3所示,表明经过多次重复的动态吸附过程,吸附剂的吸附效果可以进一步提高。
表3:多次重复动态吸附条件下破伤风外毒素吸附剂对破伤风外毒素的吸附效率
(4)家兔安全性实验
将上述吸附剂15mL,其中配基的含量为30IU/mL放入烧杯中。用生理盐水浸泡90min,再装于20mL吸附柱中,用生理盐水充分冲洗柱子。以家兔为实验对象,将兔子麻醉后,从兔子的耳中央动脉以2mL/min的速度泵出血液,血液经吸附柱灌流后灌入家兔的耳缘静脉中,灌流时间2h。在实验过程中及实验结束后的48h内,实验动物的一切生理指标均正常。由此说明,该工艺合成的破伤风外毒素吸附剂安全,无过敏反应。
试验例2:破伤风外毒素吸附剂的溶氧性测试
(1)对照组吸附剂的制备:合成未连接全氟化合物的破伤风外毒素吸附剂
参照实施例1合成只偶联破伤风免疫球蛋白的吸附剂,作为对照。(2)破伤风外毒素的制备及动物实验
根据文献报道,利用土壤制取破伤风外毒素,置冰箱冰冻保存测其效价,即为制得的破伤风外毒素。取6只家兔(白色新西兰家兔,体重1.5Kg左右),分成两组,分别用注射器腹腔注射破伤风外毒素0.5mL,放入笼内饲养观察。当兔子后肢肌肉强直性痉挛时,开始进行血液灌流。
将6只家兔分成两组进行血液灌流,实验组采用连接有全氟化合物的吸附柱,对照组采用无全氟化合物连接的吸附柱,每次灌流2h,视兔子的情况决定灌流的次数。
实验结果:在灌流三次后,对照组的家兔全部死亡,通过解剖实验表明死亡原因是窒息。而实验组的家兔在进行五次试验后,全部存活并逐渐恢复健康状态。实验结果说明,利用全氟化合物的溶氧能力可以在不割开气管的条件下保证血液中的氧气水平,避免窒息,提高存活率。
上述实施案例为本发明的优选实施方案,但本发明的实施方式不受上述实施案例的限制,其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应视为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种破伤风外毒素吸附剂,其特征在于:包含载体及固载在在载体表面的结合破伤风外毒素的免疫球蛋白及全氟化合物。
2.根据权利要求1所述的破伤风外毒素吸附剂,其特征在于:所述全氟化合物为具有溶氧能力的全氟碳化合物或全氟胺类化合物。
3.根据权利要求2所述的破伤风外毒素吸附剂,其特征在于:所述全氟化合物选自全氟萘、全氟三丙基胺、全氟正辛基溴烷、全氟醚。
4.根据权利要求1所述的破伤风外毒素吸附剂,其特征在于:所述结合破伤风外毒素的免疫球蛋白为人破伤风免疫球蛋白。
5.根据权利要求4所述的破伤风外毒素吸附剂,其特征在于:所述人破伤风免疫球蛋白在载体上的固载方式为化学连接。
6.根据权利要求4所述的破伤风外毒素吸附剂,其特征在于:所述化学连接中,采用的试剂选自环氧氯丙烷、溴化氰、高碘酸钠、羟基二咪唑、N-羟基琥珀酰亚胺酯。
7.根据权利要求1所述的破伤风外毒素吸附剂,其特征在于:所述载体选自无机材料、有机材料、高分子材料;所述无机材料选自硅胶、可控孔玻璃;有机材料选自纤维素、壳聚糖、琼脂糖、葡聚糖;高分子材料选自聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸衍生物、聚苯乙烯。
8.一种破伤风外毒素吸附柱,其特征在于:包含权利要求1至6任一项所述的破伤风外毒素吸附剂。
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