CN1367181A - 用于血液净化的蛋白a免疫吸附材料的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物分离工程领域,涉及到用于血液净化的免疫吸附材料的合成方法。其特征为:用N,N′－二羰基咪唑在室温、在丙酮溶液中活化琼脂糖凝胶,之后,与二氨基二丙基胺在丙酮溶液中反应,再与戊二醛交联,最终与蛋白A进行偶联反应得到蛋白A免疫吸附材料。该方法的优点是:克服了溴化氰活化法的毒性和不稳定性,使吸附材料对抗体和免疫复合物的吸附能力提高,降低了生产和使用成本,提高了安全性和可靠性。
Description
本发明属于生物分离工程领域，特别涉及到一种用于血液净化的蛋白A免疫吸附材料的合成方法。
血液净化是近20年来出现的新的临床治疗方法，主要是通过清除存在于血液中的致病物质实现治疗某些疑难病症的目的。其实质是生物分离技术在医学领域的应用。伴随生物分离技术的进步，血液净化技术也不断得到发展。免疫吸附疗法是血液净化的重要分支，是近年来兴起的一种治疗疑难病症的新方法，其特征是通过在体外建立的人体血液循环支路使血液通过免疫吸附柱吸附除去患者血液中的致病物质，净化人体内环境，达到治疗疾病的目的。免疫吸附柱中含有的免疫吸附材料可与血液中的致病物质特异结合，而对血液中的其它成分则无损害。由于免疫吸附疗法是直接从血液中去除致病物质，对于急危病人和恶性病症如癌症、艾滋病、自身免疫性疾病、内毒素休克等疗效显著，副作用小，是一个有很好应用前景的治疗方法。免疫吸附治疗的关键是免疫吸附柱的研制，具体的说就是免疫吸附柱中免疫吸附材料的合成。
蛋白A(protein A)是某些金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质，其分子量为42000，其氨基末端有4个高度类同的Fc结合区，可与人血浆中的抗体及其免疫复合物的Fc段特异结合，蛋白A与抗体及其免疫复合物结合后又可被pH 2.3～2.5的酸性溶液解离。人类的很多疾病都是由抗体和免疫复合物引起的，如系统性红斑狼疮、血小板减少性紫癜、重症肌无力等，这些都是无法治愈的疑难病症，利用蛋白A与抗体和免疫复合物特异结合的特性从血液中除去这些致病物质，将明显的缓解病情。蛋白A只有固定在某一载体上才有可能用于临床治疗，所以蛋白A免疫吸附材料的合成技术至关重要。目前，临床上使用的蛋白A免疫吸附材料采用的基质是琼脂糖凝胶，与蛋白A的偶联方式为溴化氰活化偶联，这种合成方法的缺点在于：(1)溴化氰是剧毒物质，合成过程对人体和环境危害较大；(2)实验已证实，用溴化氰方法偶联的蛋白基团容易脱落。这就意味着在治疗过程中将有部分蛋白进入人体，对病人产生较大的副作用。所以这一合成工艺不甚理想。
本发明的目的在于设计、提供一种无毒、无害、偶联蛋白A效果好的新的合成方法取代溴化氰合成工艺。通过选择一种可快速与琼脂糖凝胶上羟基反应的带有稳定的功能基团的有机试剂，增加材料上可与蛋白A偶联的活性基团的密度；通过改善蛋白A与抗体及其复合物结合的微环境，提高材料的稳定性和吸附性能，从而减少临床应用的副作用，提高临床疗效。
本发明的基本构想是：选用N，N′-二羰基咪唑作为活化琼脂糖凝胶的试剂。N，N′-二羰基咪唑是一个具有很高反应活性的试剂，可与琼脂糖凝胶上大量存在的羟基快速反应，形成咪唑氨基甲酸盐，咪唑氨基甲酸盐可在温和的条件下与蛋白质上的氨基形成稳定的氨基甲酸盐。N，N′-二羰基咪唑活化的材料可以在非水溶剂中稳定几年，即使在水溶液中，其水解半衰期经测量也为几小时，远远高于溴化氰活化材料的几十分钟。为了避免N，N′-二羰基咪唑活化材料上活性基团的水解问题，反应最好在有机溶剂中进行，但由于大多数蛋白在有机溶剂中会变性，故接蛋白配基的反应只能在水溶液中进行。低的键合反应温度将极大地减慢水解速度。由于N，N′-二羰基咪唑活化材料上的活性基团在pH8.5-9.0、在室温情况下30个小时其活性将完全失去，活性的咪唑氨基甲酸盐将失去二氧化碳和咪唑，完全变成羟基，所以用N，N′-二羰基咪唑活化的琼脂糖凝胶直接与蛋白反应，将不存在残余的未反应基团，减少了非特异吸附。
虽然活性的咪唑氨基甲酸盐材料与蛋白直接键合具有稳定性好、非特异性小的优点，但由于蛋白A是一个具有42000分子量的大分子，与其特异性结合的抗体及其复合物是几十万到上百万分子量的更大分子，蛋白A要保持其吸附能力，需要保证与固体材料键合后，其空间立体结构不变形，同时大分子抗体及其免疫复合物与蛋白A的接触也需要有足够的空间，蛋白A免疫吸附材料的微环境对其吸附能力的影响很大。如果在材料表面与蛋白A之间加入一定长度的间隔臂，使蛋白A与材料表面保持一定的距离，将保证其立体空间结构不变，使固定化后的蛋白A有很好的柔性和足够的空间，有利于与抗体和免疫复合物的键合，材料上蛋白A吸附效率的提高，使得在免疫吸附柱吸附容量一定的情况下，蛋白A的用量减少。由于在免疫吸附材料的生产中，蛋白A的费用占整个生产成本的90％，蛋白A用量的降低将使生产成本减少很大幅度，有更大的经济效益和社会效益。
二氨基二丙基胺可与咪唑氨基甲酸盐材料在有机溶液中反应，形成带有活性氨基的材料，所以选用二氨基二丙基胺作为间隔臂反应的第一步，可极大地减少咪唑氨基甲酸盐的水解，提高活性基团的含量，另外二氨基二丙基胺是一个亲水性的间隔臂，将减少材料表面的非特异性吸附。间隔臂分子的长度对材料上固定的蛋白A活性影响很大，间隔臂过短，不利于蛋白A活性的发挥，间隔臂过长易发生间隔臂折叠现象，15-18个原子的中等长度的间隔臂为最适。戊二醛一端可与材料上的氨基作用，另一端可与蛋白A上的氨基反应，是一个很好的交联剂，所以这里采用二氨基二丙基胺和戊二醛作为间隔臂分子(15个原子长)。
由于空间的障碍，大分子的蛋白A与带间隔臂的材料反应后，将还有一些未反应的活性基团，这些基团是产生非特异吸附的潜在因素。必须将其惰性化。可以采用一端是氨基，另一端是羟基或其它惰性基团的小分子作为封闭试剂。这里任选羟基甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸乙酯盐酸盐和乙醇氨其中的一种作为封闭试剂。
基于以上叙述，本发明的显著优势和效果是：
(1)选用N，N′-二羰基咪唑作为活化琼脂糖凝胶的试剂，克服了溴化氰活化的毒性和不稳定性，从而增加了合成的安全性，延长了材料的使用寿命；
(2)选用N，N′-二羰基咪唑作为活化琼脂糖凝胶的试剂，增加了可与蛋白A键合的活性基团的含量，提高了单位体积吸附抗体及抗体抗原复合物的数量；
(3)通过在活性材料表面和蛋白A之间引入间隔臂，为蛋白A与抗体及抗体抗原复合物的结合创造了足够的空间，改善了材料的微环境，从而提高了蛋白A的活性和对抗体及抗体抗原复合物的结合效率，减少了蛋白A的用量，降低了生产成本。
以上的优势在临床治疗上将表现为降低病人的治疗费用，同时治疗时间缩短，安全性、可靠性增加。
以下详述本发明的最佳实施例：
实施例1：
含有咪唑氨基甲酸盐的活性琼脂糖凝胶(Sepharose CL-4B)的合成
在装有搅拌器、冷凝器的5L三口烧瓶中，加入琼脂糖凝胶(Sepharose-CL 4B)1升，加入分析纯丙酮试剂，使凝胶的含量保持在30-50％的比例，搅拌均匀，加入50-100克/升的N，N′-二羰基咪唑，在室温下搅拌活化1小时。结束反应，将凝胶过滤，用几倍体积的溶剂冲洗以移走活化过程中产生的咪唑，过滤，将活化好的介质置于丙酮中，储存4℃备用。用这种方法活化的凝胶每毫升至少有100μmol的咪唑氨基甲酸盐活性基团用来键合配基。
实施例2：
带有二氨基二丙基(DAPDA)的琼脂糖凝胶(Sepharose-CL 4B)的合成
在装有搅拌器、冷凝器的5L三口烧瓶中，加入带有咪唑氨基甲酸盐的琼脂糖凝胶(Sepharose-CL 4B)1升，将200克的二氨基二丙基(213ml)溶于1000毫升的丙酮中，然后加入到三口烧瓶中。在室温下搅拌反应3小时。用1升丙酮冲洗凝胶移走未反应的二氨基二丙基，然后分别用水、1M NaCl反复冲洗彻底移走未反应的二氨基二丙基，滤干备用。用2，4，6三硝基苯磺酸(TNBS)检测冲洗是否彻底。
实施例3：
带有醛基活性基团的琼脂糖凝胶(Sepharose CL-4B)的合成
在装有搅拌器、温度计及冷凝器的5L三口烧瓶中，加带有活性氨基的琼脂糖凝胶(Sepharose-CL 4B)1L，加入戊二醛10～40ml，用硼酸盐或磷酸盐作缓冲液，pH值控制在7.0～9.0范围内，加入缓冲液1.0～1.5L，30～40℃搅拌反应2小时，反应停止后，用大量的水洗去戊二醛残余液，滤干备用。
实施例4：
醛基琼脂糖凝胶(Sepharose CL-4B)与蛋白A直接反应合成免疫吸附材料
在装有搅拌器、温度计及冷凝器的5L三口烧瓶中，加醛基琼脂糖凝胶1L，加入0.1mol/L的磷酸或硼酸缓冲液1.0～1.5L，pH值控制在7.0～8.5范围内，加入4～6g蛋白A，在25℃恒温反应16～20小时，停止反应，回收未反应的蛋白A，用0.1-0.2mol/L的羟基甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸乙酯盐酸盐和乙醇氨其中的一种试剂封闭未反应活性基团，用硼氢化钠或氰基硼氢化钠还原反应中产生的双键，在室温下反应15-20小时。用水冲洗干净未反应组分，保存在0.1mol/L pH＝7.4的磷酸缓冲液中，加入0.02～0.1％的硫柳汞作防腐剂。用紫外法检测蛋白A的键合量为3.0-6.0mg/ml，吸附人抗体量18～36mg/ml。
由于免疫吸附柱最终目的是进行临床实验，要求无菌、无热源，所以整个实验应在无菌无热源条件下进行。
实施例5：
蛋白A免疫吸附柱的离体实验
按上述合成方法合成蛋白A免疫吸附材料60ml，其中蛋白A的键合量为198mg，装于Φ40×50的柱中，用生理盐水充分冲洗柱子，将体重25Kg的狗麻醉，从狗的股动脉中抽取肝素化血液600ml，分离出血浆300ml，以30ml/min的速度过柱后与血球混合一同注入狗的股静脉中。用生理盐水冲出柱中血浆直到在280nm的吸收值为零，用0.2mol/L pH＝2.3甘氨酸-HCl缓冲液洗脱柱中吸附的抗体及其免疫复合物，由于是健康的狗，免疫复合物很少，吸附物主要为抗体，检测洗脱下的抗体量为1.48g，在实验前后，狗的生理状态未发生改变。
实施例6：
蛋白A免疫吸附柱在体外建立血液循环支路进行连续实验
按上述合成方法合成蛋白A免疫吸附材料120ml，等量装入两根Φ40×50的柱中，其中每根柱子蛋白A的键合量均为198mg。用生理盐水充分冲洗柱子，将体重13Kg的狗麻醉，实验前将动脉端、静脉端的切换管路连接好，充分熏蒸达到无菌要求，接好免疫吸附柱，用生理盐水大量冲洗，置换出里面的防腐液，管路、柱子全部肝素化。狗全身麻醉后，颈动脉插管测血压、脉搏、血流等，血从狗的后腿股动脉引出，经膜分离器将血液分成血球、血浆两部分，血浆流过柱1系统，柱2系统关闭，过柱血浆于血球在混合器中混合，输入狗体内，运行10-15分钟以后，关闭柱1系统入口，开起柱2系统，将柱1系统中的血浆用约50ml生理盐水顶出，进入混合器。关闭柱1系统出口，柱1系统进行洗脱、平衡过程，先通过250ml的洗脱液洗去吸附的蛋白，再用约150ml的平衡缓冲液平衡柱子，用约150ml的生理盐水冲洗掉平衡缓冲液，再生过程完毕。开起柱1系统入口，同时关闭柱2系统入口，重复以上操作。每个柱各切换3次，其间共取血样4次进行各种指标的检测。两个血泵流速，A泵：80ml/min，B泵：40ml/min。指标检测结果表明，经过1小时的实验，从狗的血浆中共去除7.8克抗体，狗的生理指标、生化指标、血常规正常。
Claims (2)
1.一种用于血液净化的蛋白A免疫吸附材料的合成方法，其特征在于：
以琼脂糖凝胶为基质，与N，N′-二羰基咪唑反应，得到带有咪唑氨基甲酸盐的活性材料，用二氨基二丙基胺和戊二醛作为间隔臂分子，与蛋白A进行反应，得到蛋白A免疫吸附材料。
2.根据权利要求1所述的用于血液净化的蛋白A免疫吸附材料的合成方法，其特征还在于：
a)N，N′-二羰基咪唑与琼脂糖凝胶必须在纯的丙酮溶剂中进行反应，反应温度为室温，N，N′-二羰基咪唑在反应液中的浓度为50～100克/升，琼脂糖凝胶在反应液中所占的体积比为30％～50％；
b)二氨基二丙基胺与上述活化琼脂糖凝胶的反应必须在纯的丙酮溶液中进行，反应温度为室温，二氨基二丙基胺要过量5-10倍；
c)在醛基材料与蛋白A反应完毕后，用羟基甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸乙酯盐酸盐和乙醇氨其中的一种试剂封闭未反应的活性基团，浓度为0.1-0.2mol/L，pH为7.5-8.2。
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