CN100446822C - 一种用于血液净化治疗的免疫吸附柱 - Google Patents
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Abstract
一种用于血液净化治疗的免疫吸附柱，其特征在于：该免疫吸附柱由分别键合了蛋白A和L-组氨酸配体的两种免疫吸附介质按比例混合匀浆装填构成，组成为蛋白A免疫吸附介质∶L-组氨酸免疫吸附介质1∶9～9∶1体积比，所述免疫吸附介质的亲和基质为Sepharose CL-4B凝胶。本发明将蛋白A与组氨酸配体吸附介质有机地结合起来，达到优势互补的效果。这种混合介质的吸附柱不仅制备简单，对IgG的吸附量较高，而且制备成本低、性能相对稳定、使用寿命长。具有良好的应用前景。
Description
技术领域：
本发明涉及血液净化治疗技术，特别提供了一种用于血液净化治疗的免疫吸附柱。
背景技术：
血液免疫吸附治疗是近年来新兴的一种临床医疗技术，对于一些药物没有明显疗效的疑难病症，如自身免疫系统疾病、器官移殖排异、重症肝炎、恶性肿瘤、肾病综合症、黄疸等进行体外免疫吸附血液净化，往往可以获得良好的效果。血液免疫吸附治疗技术正被广泛地应用于泌尿、肝脏病、血液、心功能衰竭等多种临床领域。血液免疫吸附柱的研制和生产也已成为一个重要的高技术产业。
蛋白A是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)产生的一种单肽链蛋白质，与免疫球蛋白G(IgG)有广泛的结合能力，且特异性地结合IgG的不变区(Fc)。因此蛋白A对自身免疫系统疾病中产生的循环免疫复合物(Circulating immune complexes)有着特异性相互作用。针对自身免疫系统疾病引起的体内抗体和循环免疫复合物的增加，诸如：系统性红斑狼疮、自身免疫溶血性贫血、免疫血小板减少性紫癜、初级抗磷脂综合症等，目前固载蛋白A的免疫吸附材料已被用于临床清除上述患者体内的抗体和循环免疫复合物，相关的免疫吸附医疗器械已获得美国FDA认证，在欧洲也获得相关部门认证。
作为吸附配体的蛋白A具有对IgG作用特异性强，非特异性吸附弱的优点。但是，由于蛋白A为生物大分子，容易变性失活且价格昂贵，因此蛋白A免疫吸附材料制备及保存成本较高，吸附材料的使用寿命较短。同时增加了患者的治疗费用。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种用于血液净化治疗的免疫吸附柱，该免疫吸附柱在保持较高的吸附量及特异性的同时，能降低制作成本，提高使用寿命，因而可以大幅度降低免疫吸附治疗的费用。
本发明具体提供了一种用于血液净化治疗的免疫吸附柱，其特征在于：该免疫吸附柱由分别键合了蛋白A和L-组氨酸配体的两种免疫吸附介质按比例混合匀浆装填构成，组成为蛋白A免疫吸附介质：L-组氨酸免疫吸附介质1∶9～9∶1体积比。
本发明用于血液净化治疗的免疫吸附柱中，所述吸附介质的亲和基质为Sepharose CL-4B凝胶。
本发明用于血液净化治疗的免疫吸附柱中，所述键合了L-组氨酸配体的免疫吸附介质，由亲和基质上的环氧活性基团与L-组氨酸中的伯氨基直接反应形成。
本发明用于血液净化治疗的免疫吸附柱中，所述键合了L-组氨酸配体的免疫吸附介质，由首先在亲和基质上连接己二胺间隔臂，然后采用羰基二咪唑法共价键合L-组氨酸形成。
本发明用于血液净化治疗的免疫吸附柱中，所述键合了蛋白A的免疫吸附介质，由在环氧活化的亲和基质上先连接双氨基基团，然后采用戊二醛法共价键合蛋白A形成。
L-组氨酸作为氨基酸与蛋白质等生物分子之间具有很好的生物兼容性，而且由于组氨酸分子中含有羧基和氨基活性基团，更有利于通过化学键合的手段与亲合基质相连接。采用L-组氨酸等模拟配体的免疫吸附材料克服了价格昂贵与蛋白A易变性失活的缺点，制备与治疗成本大大低于蛋白A，吸附材料使用寿命得以延长，同样具有较高的吸附率、特异性及生物兼容性。只是在非特异性，吸附率方面略逊于蛋白A。
也就是说，通过共价键合的方法，将蛋白A或者组氨酸键合在亲合基质上，均可以用于清除免疫系统疾病患者血液中过量的IgG。但是二者各有所长、各有所短。蛋白A配体特异性更强、吸附效率更高、非特异性吸附低于L-组氨酸配体；但是在化学和物理性质稳定、配体价格、优化提高配体键合量、使用寿命方面，L-组氨酸无疑优于蛋白A。
正是鉴于上述因素，本发明制备出了将键合了蛋白A和组氨酸配体的免疫吸附介质以不同的比例混合装填的血液免疫吸附柱。通过调控两种介质的比例，可制备成对人IgG标准品或人血浆中的IgG与免疫复合物不同吸附量的血液免疫吸附柱，如以1∶1(体积比)装填的吸附柱吸附量可达18mg/mL。利用基体辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测上述被吸附的人IgG的纯度，未发现有其他杂质，证明该血液免疫吸附柱有很好的特异性。
总之，本发明首次将通过共价键合的蛋白A免疫吸附介质与L-组氨酸免疫吸附介质以一定比例混合装填制备成混合介质血液免疫吸附柱。该混合介质血液免疫吸附柱很好地综合了蛋白A与L-组氨酸免疫吸附介质的各自优势，在保持较高的IgG吸附量、很好的生物兼容性及特异性的基础上，提高了免疫吸附柱的化学和物理稳定性，且大幅度降低了以单纯蛋白A免疫吸附的治疗成本。即它将蛋白A与组氨酸配体吸附介质有机地结合起来，达到优势互补的效果。这种混合介质的吸附柱不仅制备简单，对IgG的吸附量较高，而且制备成本低、性能相对稳定、使用寿命长。具有良好的应用前景。
附图说明：
图1.L-组氨酸免疫吸附介质直接法键合法制备示意图；
图2.L-组氨酸免疫吸附介质羰基二咪唑法键合法制备示意图；
图3.蛋白A免疫吸附介质制备示意图。
具体实施方式：
实施例1.直接键合法制备L-组氨酸免疫吸附介质
(1)制备环氧介质的合成
用量筒量取Sepharose CL-4B凝胶15mL，分别加入水18mL，2mol/LNaOH 7mL，环氧氯丙烷5mL，混匀。在40℃反应2小时，反应中要搅拌，反应完成后，再分别用无水乙醇和水冲洗，滤干。
(2)L-组氨酸亲合吸附介质的制备
在30mL NaHCO3缓冲液中加入1.5mmol L-组氨酸，用NaOH调节pH为13。加入环氧Sepharose CL-4B凝胶与组氨酸的溶液混匀，60℃反应24小时，反应完成后，分别用无水乙醇和水冲洗，滤干。
L-组氨酸的键合量为12.7mg/g，对人IgG(分子量160kD)吸附量为12.0mg/g。
实施例2羰基二咪唑法共价键合L-组氨酸免疫吸附介质
(1)环氧介质的合成
用量筒量取Sepharose CL-4B凝胶15mL，分别加入水18mL，2mol/LNaOH 7mL，环氧氯丙烷5mL，混匀。在40℃反应2小时，反应中要搅拌，反应完成后，再分别用无水乙醇和水冲洗，滤干。
(2)氨基介质的合成
将上述制备的环氧凝胶与5mL水，45mL 13g/L己二胺-NaHCO3缓冲液混匀，NaOH调节pH为11。80℃反应24小时，反应中要搅拌。反应完成后，分别用无水乙醇和水冲洗，滤干。
(3)L-组氨酸亲合吸附介质的合成
取一定体积二氧六环于圆底烧瓶中，加入适量钠丝及指示剂二苯甲酮，加热回流至溶液呈深蓝色。然后立即蒸出二氧六环使用。
使用蒸出的二氧六环氨基凝胶，然后加入羰基二咪唑室温下反应4小时。反应完成后分别用二氧六环和25mM Tris-HCl缓冲液冲洗。最后加入25mM Tris-HCl缓冲液与L-组氨酸，调节pH为7.4，室温反应8小时。反应完成后，用水冲洗。
L-组氨酸的键合量为8.3mg/g，对人IgG(分子量160kD)吸附量为11.5mg/g。
羰基二咪唑法共价键合L-组氨酸免疫吸附介质示意图见图2。
实施例3蛋白A免疫吸附介质的制备
(1)环氧介质的合成
用量筒量取Sepharose CL-4B凝胶15mL，分别加入水18mL，2mol/LNaOH 7mL，环氧氯丙烷5mL，混匀。在40℃反应2小时，反应中要搅拌，反应完成后，再分别用无水乙醇和水冲洗，滤干。
(2)氨基介质的合成：
将上述环氧凝胶与5mL水，45mL 13g/L己二胺-NaHCO3缓冲液混匀。摇床中50-55℃反应2小时，反应中要搅拌，反应完成后，分别用无水乙醇和水冲洗，滤干。
(3)醛基介质的合成
上述氨基凝胶与37mL水，3mL 25％的戊二醛混匀。室温反应2小时，反应中要搅拌，反应完成后，分别用水、2mol/L醋酸和水冲洗，最后用0.1mol/L pH 8.2的硼酸盐缓冲液平衡、滤干。
(4)免疫吸附介质的合成
将上述的醛基凝胶与5mL水混匀，再加入60mg的Protein A溶于25mL0.1mol/L的硼酸盐缓冲液。室温反应20小时以上，反应中要搅拌，反应完成后，滤干。分别加入水5mL和40g/L pH 8.2的甘氨酸乙酯缓冲液25mL，混匀。室温反应2小时进行封尾。最后用硼氢化钠在冰浴下加入，室温反应6-8小时。反应完成后，分别用水、0.2mol/L pH 2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液、含1mol/L氯化钠的0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液和水冲洗，滤干。
蛋白A的键合量为4.0mg/g，对人IgG(分子量160kD)吸附量为25.0mg/g。
蛋白A免疫吸附介质的制备示意图见图3。
实施例4混合介质的免疫吸附柱对人IgG的吸附
体积比为1∶1的实施例1L-组氨酸免疫吸附介质与实施例3蛋白A免疫吸附介质混合装填为混合介质吸附柱。
首先用0.2mol/L pH 2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液冲洗，再用0.02mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液平衡，然后用泵将人血浆注入protein A凝胶装柱中，使其达到饱和吸附，再用0.02mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗去不吸附的蛋白及过量的人IgG，最后用0.2mol/L pH 2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液将吸附的人IgG洗脱下来，收集洗脱液定容，用吸光光度法测量人IgG的吸附量。
混合介质的免疫吸附柱对人IgG的吸附量达到18.0mg/g以上。
实施例5混合介质的免疫吸附柱对人IgG的吸附
体积比为1∶1的实施例2L-组氨酸免疫吸附介质与实施例3蛋白A免疫吸附介质混合装填为混合介质吸附柱。
首先用0.2mol/L pH 2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液冲洗，再用0.02mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液平衡，然后用泵将人血浆注入protein A凝胶装柱中，使其达到饱和吸附，再用0.02mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗去不吸附的蛋白及过量的人IgG，最后用0.2mol/L pH 2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液将吸附的人IgG洗脱下来，收集洗脱液定容，用吸光光度法测量人IgG的吸附量。
混合介质的免疫吸附柱对人IgG的吸附量达到18.0mg/g以上。
实施例6混合介质的免疫吸附柱对人IgG的吸附
组氨酸免疫吸附介质：L-组氨酸的键合量为12.7mg/g，对人IgG(分子量160kD)吸附量为12.0mg/g。
蛋白A免疫吸附介质：蛋白A的键合量为4.0mg/g，对人IgG(分子量160kD)吸附量为25.0mg/g。
将上述免疫吸附介质分别按1∶0.5、1∶1、1∶2装填为混合介质吸附柱。
首先用0.2mol/L pH2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液冲洗，再用0.02mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液平衡，然后用泵将人血浆注入protein A凝胶装柱中，使其达到饱和吸附，再用0.02mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗去不吸附的蛋白及过量的人IgG，最后用0.2mol/L pH 2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液将吸附的人IgG洗脱下来，收集洗脱液定容，用吸光光度法测量人IgG的吸附量。
不同比例混合介质的免疫吸附柱对人IgG的吸附量见表1。
表1.不同比例混合介质的免疫吸附柱对人IgG的吸附量比较
Claims (4)
1、一种用于血液净化治疗的免疫吸附柱，其特征在于：该免疫吸附柱由分别键合了蛋白A和L-组氨酸配体的两种免疫吸附介质按比例混合匀浆装填构成，组成为蛋白A免疫吸附介质：L-组氨酸免疫吸附介质1∶9～9∶1体积比，所述免疫吸附介质的亲和基质为Sepharose CL-4B凝胶。
2、按照权利要求1所述用于血液净化治疗的免疫吸附柱，其特征在于：所述键合了L-组氨酸配体的免疫吸附介质，由亲和基质上的环氧活性基团与L-组氨酸中的伯氨基直接反应形成。
3、按照权利要求1所述用于血液净化治疗的免疫吸附柱，其特征在于：所述键合了L-组氨酸配体的免疫吸附介质，由首先在亲和基质上连接己二胺间隔臂，然后采用羰基二咪唑法共价键合L-组氨酸形成。
4、按照权利要求1所述用于血液净化治疗的免疫吸附柱，其特征在于：所述键合了蛋白A的免疫吸附介质，由在环氧活化的亲和基质上先连接双氨基基团，然后采用戊二醛法共价键合蛋白A形成。
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