CN101787143A - 一种壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物的制备方法。本发明先制备交联壳聚糖球形粒子基材，再通过层层自组装的方法将带负电的模板蛋白质BSA和带正电的壳聚糖交替吸附，通过静电作用将模板蛋白质及壳聚糖交替自组装到交联壳聚糖球形粒子基材的表面，再进行模板蛋白质分子的印迹，然后采用洗脱剂脱除模板蛋白质分子，从而使基材的表面留下可以与模板蛋白质相互识别的位点及空穴结构，使其具有蛋白质选择性吸附和分离功能，通过上述方法得到一种壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物。该方法制备的聚合物具有良好的选择性吸附模板蛋白质的能力，并且具有良好的蛋白质选择性分离功能，同时，该制备方法较简单，制各条件温和，具有较好的可重复利用性能。

Description

一种壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物的制备方法

技术领域

本发明属于高分子化学和蛋白质选择性吸附和分离领域，特别是涉及一种具有蛋白质选择性吸附和分离功能的壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物的制备方法。

背景技术

目前，生物大分子特别是蛋白质分子的高效选择性吸附分离作为一个具有挑战性的研究领域受到研究者的极大关注。近年来，蛋白质分子印迹方法已经成为一种新颖有效的蛋白质选择性吸附分离技术，显示出重要的应用价值和广泛的发展前景。目前利用分子印迹技术来分离蛋白质主要有：包埋法、表面印迹法以及抗原决定基法[化学通报，2005，7：504-509]。然而，这些蛋白质印迹的方法仍然存在一些问题，例如，制备时易导致蛋白质变性失去活性，模板蛋白质难以洗脱等。因此，这就要求努力寻找一种制备条件温和、操作简便的蛋白质印迹方法来解决上述问题。

层层自组装技术(LBL)，是一种基于静电力作用依次吸附上带异种电荷聚电解质的自组装超分子技术。它具有工艺简单，条件温和，组装范围广泛等优点，不仅可以自组装合成的聚电解质，也可以自组装荷电的蛋白质、多糖等生物大分子[高分子通报，2006，8：58-63]，利用层层自组装方法构筑多糖与蛋白质的多层膜的研究已经有文献报道[J.Phys.Chem.B，2004，108(35)：13144-13152]。另外，由于蛋白质结构复杂，易变性失去活性，因此在印迹过程中选用合适的功能单体来保持蛋白质活性很重要。值得注意的是，天然聚合物壳聚糖是一种良好的蛋白质分子印迹功能单体，其具有良好的生物相容性，有利于保持蛋白质的生物活性和空间构象。此外，壳聚糖分子链上带有大量与蛋白质结合的氨基，容易形成识别位点，因此已应用于蛋白质分离领域[高分子材料科学与工程，2007，23(2)：235-237]。

如前所述，在制备蛋白质印迹聚合物的现有技术中存在着制备过程较复杂，且容易导致蛋白质的变性失活等问题。因此，这就要求努力寻找一种制备条件温和、操作简便的蛋白质印迹方法来解决上述问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物的制备方法，该方法制备的壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物具有良好的选择性吸附模板蛋白质的能力，并且具有良好的蛋白质选择性分离功能，同时，该制备方法较简单，制备条件温和，具有较好的可重复利用性能。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：一种壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

1)制备交联壳聚糖球形粒子基材：

①按壳聚糖∶乙酸溶液∶氢氧化钠溶液＝(1.5～3.0)g∶(50～100)mL∶(1～2)L，选取壳聚糖、乙酸溶液和氢氧化钠溶液，其中，乙酸溶液的质量百分比为2％，氢氧化钠溶液的浓度为2mol/L；将壳聚糖加入到乙酸溶液中，搅拌至壳聚糖充分溶解后，超声除去气泡后得到壳聚糖溶液；再用注射器将壳聚糖溶液以2～4mL/min的滴加速度逐滴加入到上述氢氧化钠溶液中，溶液中出现白色球形粒子，待白色球形粒子沉淀到底部后，分离白色球形粒子并用去离子水冲洗4～6次，直到溶液pH值至7；然后分离，得到壳聚糖球形粒子；

②按壳聚糖∶去离子水∶环氧氯丙烷＝(1.5～3.0)g∶(50～150)mL∶0.3～0.6g，选取去离子水和环氧氯丙烷，并将所述去离子水装于锥形瓶中；将壳聚糖球形粒子转到装有去离子水的锥形瓶中，并用2～4mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值至10，再向溶液中加入环氧氯丙烷作为交联剂，在室温下反应48h，反应完成后，用去离子水冲洗4～6次以洗去未反应的环氧氯丙烷，得到交联壳聚糖球形粒子；取上述交联壳聚糖球形粒子置于烧杯中，加入0.012mol/L盐酸溶液处理10～20min，然后分离出球形粒子用去离子水冲洗4～6次，得到交联壳聚糖球形粒子基材；

2)牛血清白蛋白与壳聚糖在交联壳聚糖球形粒子基材表面的自组装：

①配制含氯化钠浓度为0.14mol/L的牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液(溶剂为去离子水)，其中含牛血清白蛋白的浓度为1mg/mL；配制含氯化钠浓度为0.14mol/L的壳聚糖溶液(溶剂为去离子水)，其中含壳聚糖的浓度为1.5mg/mL；

②将上述交联壳聚糖球形粒子基材置于牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液中15～20min，再将粒子分离出后用0.14mol/L氯化钠溶液清洗4～6次，然后将粒子置于壳聚糖溶液中15～20min，再将粒子分离出后用0.14mol/L氯化钠溶液清洗4～6次，完成交联壳聚糖球形粒子基材表面的第一个双分子层自组装，得到含一个双分子层的表面自组装壳聚糖粒子；

③重复上述步骤2)的②的过程，交联壳聚糖球形粒子基材在牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液和壳聚糖溶液中交替自组装5次，得到壳聚糖为最外层的含五个双分子层的表面自组装壳聚糖粒子；

3)牛血清白蛋白在自组装壳聚糖基材表面的印迹：

①按壳聚糖∶去离子水∶环氧氯丙烷＝(1.5～3.0)g∶(50～100)mL∶0.3～0.6g，选取去离子水和环氧氯丙烷，并将所述去离子水装于锥形瓶中；

②将上述表面自组装壳聚糖粒子转移到装有去离子水的锥形瓶中，并用2～4mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值至10，加入环氧氯丙烷在室温下反应48h，反应结束后，分离出粒子，用去离子水冲洗4～6次，得到壳聚糖粒子；

4)模板蛋白质的洗脱：

将上述步骤3)中得到的壳聚糖粒子用十二烷基硫酸钠与乙酸的混合溶液进行洗脱，以脱除模板蛋白质牛血清白蛋白，采用紫外-可见分光光度计在280nm波长处检测洗脱液中蛋白质的浓度，直至洗脱液中蛋白质吸光值为0，得到壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物。

步骤2)中，配制的牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液的pH值为6；配制的壳聚糖溶液的pH值为6。

步骤4)中，十二烷基硫酸钠与乙酸的混合溶液中十二烷基硫酸钠的质量百分比为4.8％、乙酸的质量百分比为2％，水的质量百分比为93.2％。

本发明先制备交联壳聚糖球形粒子基材，通过化学交联方法使其具有稳定的机械性能，再利用其带有的氨基使其表面具有正电荷，再在一定pH条件下，通过层层自组装的方法将带负电的模板蛋白质BSA和带正电的壳聚糖交替吸附，通过静电作用将模板蛋白质及壳聚糖交替自组装到交联壳聚糖球形粒子基材的表面，再进行模板蛋白质分子的印迹，然后采用洗脱剂脱除模板蛋白质分子，从而使基材的表面留下可以与模板蛋白质相互识别的位点及空穴结构，使其具有蛋白质选择性吸附和分离功能，通过上述方法得到一种壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物。

本发明利用的壳聚糖是一种天然高分子聚电解质，在制备蛋白质印迹聚合物的过程中，有利于减少蛋白质分子的变性和保持蛋白质分子的活性；采用具有良好生物相容性的壳聚糖，利用带正电荷的壳聚糖与带负电荷的模板蛋白质交替吸附作用在基材表面进行层层自组装，然后再进行模板蛋白质分子的印迹制备蛋白质印迹聚合物。此外，本发明使用的层层自组装技术，其制备条件温和，易于实施，能够有效增加蛋白质与壳聚糖之间的特异性识别位点，因此可以赋予该蛋白质印迹聚合物更好的蛋白质选择性吸附和分离功能，并且有利于保持蛋白质的活性。该蛋白质印迹聚合物对于模板蛋白质牛血清白蛋白(BSA)的吸附量为13.67mg/g，相对于未印迹壳聚糖的BSA吸附量上升了27.7倍，并且该蛋白质印迹聚合物对不同蛋白质的选择性吸附和分离效果明显，该蛋白质印迹聚合物具有较好的可重复利用性能，而且由于蛋白质印迹发生在基材的表面，更利于模板蛋白质的洗脱与吸附。

本发明的有益效果是：本发明制备的壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物具有良好的选择性吸附模板蛋白质的能力，并且具有良好的蛋白质选择性分离功能，同时，该制备方法较简单，制备条件温和，具有较好的可重复利用性能，成本低廉。

本发明在蛋白质选择性吸附和分离领域具有广泛的用途。

附图说明

图1是非印迹聚合物(CS)以及实施例1得到的壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物(L-CS)对模板蛋白质牛血清白蛋白(BSA)的吸附量对比图，其中BSA为牛血清白蛋白，Lys为溶菌酶，OVA为卵清蛋白。

图2是实施例1得到的壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物(L-CS)经过重复洗脱后对模板蛋白质牛血清白蛋白(BSA)的吸附量图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明制备方法作进一步说明，但不限定本发明。

实施例1：

一种壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物的制备方法，它包括如下步骤：

1)制备交联壳聚糖球形粒子基材：

①称取1.5g壳聚糖，加入到50mL的质量百分比为2％乙酸溶液中(质量百分比为2％表示100g乙酸溶液中含2g乙酸)，搅拌至壳聚糖充分溶解后，超声除去气泡后得到3mg/mL的壳聚糖溶液；再用医用注射器(7#针头)以2mL/min的滴加速度逐滴加入到2L的2mol/L氢氧化钠溶液中，溶液中出现白色球形粒子，待白色球形粒子沉淀到底部后，分离出白色球形粒子并用去离子水反复冲洗6次，直到溶液pH值至7；然后分离，得到壳聚糖球形粒子；

②分离出的壳聚糖粒子转到装有50mL去离子水的锥形瓶中，并用2mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值至10，再向溶液中加入环氧氯丙烷0.3g作为交联剂，在室温下反应48h，壳聚糖球形粒子用去离子水反复冲洗6次以洗去未反应的环氧氯丙烷，得到交联壳聚糖球形粒子；取上述交联壳聚糖球形粒子置于200mL烧杯中，加入0.012mol/L盐酸溶液处理20min，然后分离出球形粒子用去离子水反复冲洗6次，得到交联壳聚糖球形粒子基材。

2)牛血清白蛋白与壳聚糖在交联壳聚糖球形粒子基材表面的自组装：

①配制含氯化钠浓度为0.14mol/L的牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液(pH＝6)，其中含牛血清白蛋白的浓度为1mg/mL；配制含氯化钠浓度为0.14mol/L的壳聚糖溶液(pH＝6)，其中含壳聚糖的浓度为1.5mg/ml；

②将上述交联壳聚糖球形粒子基材置于牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液中20min，再将粒子分离出后用0.14mol/L氯化钠溶液反复清洗6次，然后将粒子置于壳聚糖溶液中20min，再将粒子分离出后用0.14mol/L NaCl反复清洗6次，完成壳聚糖粒子表面的第一个双分子层自组装，得到含一个双分子层的表面自组装壳聚糖粒子；

③重复上述步骤2)的②的过程，交联壳聚糖球形粒子基材在牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液和壳聚糖溶液中交替自组装5次，得到壳聚糖为最外层的含五个双分子层的表面自组装壳聚糖粒子。

3)牛血清白蛋白在自组装壳聚糖基材表面的印迹：

将上述表面自组装壳聚糖粒子转移到装有50mL去离子水的锥形瓶中，并用2mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值至10，加入环氧氯丙烷0.3g室温下反应48h，反应结束后，分离出粒子，用去离子水反复冲洗6次，得到壳聚糖粒子。

4)模板蛋白质的洗脱：

①混合溶液的准备：十二烷基硫酸钠与乙酸的混合溶液中十二烷基硫酸钠的质量百分比为4.8％、乙酸的质量百分比为2％，水的质量百分比为93.2％；

②将上述步骤3)中得到的壳聚糖粒子用十二烷基硫酸钠与乙酸的混合溶液进行洗脱，以脱除模板蛋白质牛血清白蛋白，采用紫外-可见分光光度计在280nm波长处检测洗脱液中蛋白质的浓度，直至洗脱液中蛋白质吸光值为0，得到壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物。

实施例2：

一种壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物的制备方法，它包括如下步骤：

1)制备交联壳聚糖球形粒子基材：

①称取3.0g壳聚糖，加入到100mL的质量百分比为2％乙酸溶液中，搅拌至壳聚糖充分溶解后，超声除去气泡后得到3mg/mL的壳聚糖溶液；再用医用注射器(7#针头)以4mL/min的滴加速度逐滴加入到2L的2mol/L氢氧化钠溶液中，溶液中出现白色球形粒子，待白色球形粒子沉淀到底部后，分离出白色球形粒子并用去离子水反复冲洗6次，直到溶液pH值至7；然后分离，得到壳聚糖球形粒子；

②分离出的壳聚糖球形粒子转到装有150mL去离子水的锥形瓶中，并用4mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值至10，再向溶液中加入环氧氯丙烷0.6g作为交联剂，在室温下反应48h，壳聚糖球形粒子用去离子水反复冲洗6次以洗去未反应的环氧氯丙烷，得到交联壳聚糖球形粒子；取上述交联壳聚糖球形粒子置于200mL烧杯中，加入0.012mol/L盐酸溶液处理20min，然后分离出球形粒子用去离子水反复冲洗6次，得到交联壳聚糖球形粒子基材。

2)牛血清白蛋白与壳聚糖在交联壳聚糖球形粒子基材表面的自组装：

①配制含氯化钠浓度为0.14mol/L的牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液(pH＝6)，其中含牛血清白蛋白的浓度为1mg/mL；配制含氯化钠浓度为0.14mol/L的壳聚糖溶液(pH＝6)，其中含壳聚糖的浓度为1.5mg/mL；

②将上述交联壳聚糖球形粒子基材置于牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液中20min，再将粒子分离出后用0.14mol/L氯化钠溶液反复清洗6次，然后将粒子置于壳聚糖溶液中20min，再将粒子分离出后用0.14mol/L氯化钠溶液反复清洗6次，完成壳聚糖粒子表面的第一个双分子层自组装，得到含一个双分子层的表面自组装壳聚糖粒子；

③重复上述步骤2)的②的过程，交联壳聚糖球形粒子基材在牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液和壳聚糖溶液中交替自组装5次，得到壳聚糖为最外层的含五个双分子层的表面自组装壳聚糖粒子。

3)牛血清白蛋白在自组装壳聚糖基材表面的印迹：

将上述表面自组装壳聚糖粒子转移到装有100mL去离子水的锥形瓶中，并用4mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值至10，加入环氧氯丙烷0.6g室温下反应48h，反应结束后，分离出粒子，用去离子水反复冲洗6次，得到壳聚糖粒子。

4)模板蛋白质的洗脱：

①混合溶液的准备：十二烷基硫酸钠与乙酸的混合溶液中十二烷基硫酸钠的质量百分比为4.8％、乙酸的质量百分比为2％，水的质量百分比为93.2％；

②将上述步骤3)中得到的壳聚糖粒子用十二烷基硫酸钠与乙酸的混合溶液进行洗脱，以脱除模板蛋白质牛血清白蛋白，采用紫外-可见分光光度计在280nm波长处检测洗脱液中蛋白质的浓度，直至洗脱液中蛋白质吸光值为0，得到壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物。

实施例3：

一种壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物的制备方法，它包括如下步骤：

1)制备交联壳聚糖球形粒子基材：

①称取1.5g壳聚糖，加入到50mL的质量百分比为2％乙酸溶液中，搅拌至壳聚糖充分溶解后，超声除去气泡后得到3mg/mL的壳聚糖溶液；再用医用注射器(7#针头)以2mL/min的滴加速度逐滴加入到1L的2mol/L氢氧化钠溶液中，溶液中出现白色球形粒子，待白色球形粒子沉淀到底部后，分离出白色球形粒子并用去离子水反复冲洗4次，直到溶液pH值至7；然后分离，得到壳聚糖球形粒子；

②分离出的壳聚糖球形粒子转到装有50mL去离子水的锥形瓶中，并用2mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值至10，再向溶液中加入环氧氯丙烷0.3g作为交联剂，在室温下反应48h，壳聚糖球形粒子用去离子水反复冲洗4次以洗去未反应的环氧氯丙烷，得到交联壳聚糖球形粒子；取上述交联壳聚糖球形粒子置于200mL烧杯中，加入0.012mol/L盐酸溶液处理10min，然后分离出球形粒子用去离子水反复冲洗4次，得到交联壳聚糖球形粒子基材。

2)牛血清白蛋白与壳聚糖在交联壳聚糖球形粒子基材表面的自组装：

①配制含氯化钠浓度为0.14mol/L的牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液(pH＝6)，其中含牛血清白蛋白的浓度为1mg/mL；配制含氯化钠浓度为0.14mol/L的壳聚糖溶液(pH＝6)，其中含壳聚糖的浓度为1.5mg/mL；

②将上述交联壳聚糖球形粒子基材置于牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液中15min，再将粒子分离出后用0.14mol/L氯化钠溶液反复清洗4次，然后将粒子置于壳聚糖溶液中15min，再将粒子分离出后用0.14mol/L氯化钠溶液反复清洗4次，完成壳聚糖粒子表面的第一个双分子层自组装，得到含一个双分子层的表面自组装壳聚糖粒子；

③重复上述步骤2)的②的过程，交联壳聚糖球形粒子基材在牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液和壳聚糖溶液中交替自组装5次，得到壳聚糖为最外层的含五个双分子层的表面自组装壳聚糖粒子。

3)牛血清白蛋白在自组装壳聚糖基材表面的印迹：

将上述表面自组装壳聚糖粒子转移到装有50mL去离子水的锥形瓶中，并用2mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值至10，加入环氧氯丙烷0.3g室温下反应48h，反应结束后，分离出粒子，用去离子水反复冲洗4次，得到壳聚糖粒子；

4)模板蛋白质的洗脱：

①混合溶液的准备：十二烷基硫酸钠与乙酸的混合溶液中十二烷基硫酸钠的质量百分比为4.8％、乙酸的质量百分比为2％，水的质量百分比为93.2％；

②将上述步骤3)中得到的壳聚糖粒子用十二烷基硫酸钠与乙酸的混合溶液进行洗脱，以脱除模板蛋白质牛血清白蛋白，采用紫外-可见分光光度计在280nm波长处检测洗脱液中蛋白质的浓度，直至洗脱液中蛋白质吸光值为0，得到壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物。

上述实施例1得到的一种壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物的应用：

所述壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物具有良好的蛋白质选择性吸附及分离功能，在作为蛋白质选择性吸附和分离功能材料中具有广泛的用途。

下表1为壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物(L-CS)相对于非印迹聚合物(CS)对不同蛋白质的吸附量比值图，其中BSA为牛血清白蛋白，Lys为溶菌酶，OVA为卵清蛋白。测试过程为：分别取0.5g CS及L-CS粒子置于含有8mL BSA(1mg/mL)、Lys(1mg/mL)、OVA(1mg/mL)、Hb(1mg/mL)四种蛋白质溶液的烧杯中震荡吸附，达到平衡后采用紫外-可见分光光度计在280nm波长处检测各烧杯中的蛋白质浓度，测试上述两种聚合物粒子对于这四种蛋白质的吸附量。

表1

在表1中，蛋白质的相对选择性由不同蛋白质的吸附量比值来表示，从表中可以看出L-CS对BSA与Lys的吸附量的比值(BSA/Lys)相对于CS对于BSA与Lys的吸附量的比值(BSA/Lys)提高了9.55倍，说明制备的壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物可以在BSA和Lys这两种蛋白质中很好的选择性吸附模板蛋白质牛血清白蛋白BSA；而以OVA和Hb为对比蛋白质时，L-CS相比CS对于蛋白质的相对选择性分别提高了5.28和4.00倍，这些结果均表明壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物L-CS具有良好的选择性识别模板蛋白质的效果，对模板蛋白质具有良好的选择性吸附作用，可以作为蛋白质选择性吸附和分离功能材料。

图1是非印迹聚合物(CS)及壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物(L-CS)对模板蛋白质牛血清白蛋白(BSA)的吸附量对比图。测试过程为：分别称取0.5g上述两种聚合物粒子于两个小烧杯中，然后向小烧杯中分别加入浓度为1mg/mL的模板蛋白质(BSA)溶液8mL进行震荡吸附，达到平衡后，采用紫外-可见分光光度计在280nm波长处检测烧杯中的模板蛋白质浓度，从而测试上述两种聚合物粒子对于模板蛋白质(BSA)的吸附量。从图1中可以看出，非印迹聚合物对BSA的吸附量较小(0.49mg/g)；而壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物吸附量有了显著的增加，达到了13.67mg/g，L-CS对于模板蛋白质对于模板蛋白质(BSA)的吸附量相对于非印迹聚合物提高了27.7倍，这说明制备的壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物(L-CS)有效增加了与蛋白质的识别位点，经过洗脱留下了与模板蛋白质相匹配的孔穴结构，有效提高了对模板蛋白质BSA的吸附量。以上结果表明制备的壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物具有良好的蛋白质选择性吸附作用，可以作为蛋白质选择性吸附和分离功能材料。

图2是实施例1得到的壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物(L-CS)经过重复洗脱后对模板蛋白质牛血清白蛋白(BSA)的吸附量图。测试过程为：将吸附有模板蛋白质牛血清白蛋白(BSA)的壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物(L-CS)采用质量百分比为4.8％的十二烷基硫酸钠与质量百分比为2％的乙酸混合溶液作为洗脱剂洗脱除去BSA后，再将洗脱后的L-CS浸入BSA溶液中进行震荡吸附直至达到吸附平衡，重复上述洗脱与吸附步骤，并采用紫外-可见分光光度计在280nm波长处检测溶液中的模板蛋白质浓度，测试两次模板蛋白质牛血清白蛋白吸附量的变化。由图2可以看出，经过重复洗脱后，L-CS对模板蛋白质的吸附量有所减少，但是仍然可达到7.65mg/g，为第一次洗脱后的模板蛋白质吸附量的56％，这说明制备的L-CS具有较好的可重复利用性能。

本发明各原料的上下限、区间取值，以及工艺参数(如滴加速度、时间等)的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。

Claims (3)

1.一种壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

1)制备交联壳聚糖球形粒子基材：

①按壳聚糖∶乙酸溶液∶氢氧化钠溶液＝(1.5～3.0)g∶(50～100)mL∶(1～2)L，选取壳聚糖、乙酸溶液和氢氧化钠溶液，其中，乙酸溶液的质量百分比为2％，氢氧化钠溶液的浓度为2mol/L；将壳聚糖加入到乙酸溶液中，搅拌至壳聚糖充分溶解后，超声除去气泡后得到壳聚糖溶液；再用注射器将壳聚糖溶液以2～4mL/min的滴加速度逐滴加入到上述氢氧化钠溶液中，溶液中出现白色球形粒子，待白色球形粒子沉淀到底部后，分离白色球形粒子并用去离子水冲洗4～6次，直到溶液pH值至7；然后分离，得到壳聚糖球形粒子；

②按壳聚糖∶去离子水∶环氧氯丙烷＝(1.5～3.0)g∶(50～150)mL∶0.3～0.6g，选取去离子水和环氧氯丙烷，并将所述去离子水装于锥形瓶中；将壳聚糖球形粒子转到装有去离子水的锥形瓶中，并用2～4mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值至10，再向溶液中加入环氧氯丙烷作为交联剂，在室温下反应48h，反应完成后，用去离子水冲洗4～6次，得到交联壳聚糖球形粒子；取上述交联壳聚糖球形粒子置于烧杯中，加入0.012mol/L盐酸溶液处理10～20min，然后分离出球形粒子用去离子水冲洗4～6次，得到交联壳聚糖球形粒子基材；

2)牛血清白蛋白与壳聚糖在交联壳聚糖球形粒子基材表面的自组装：

①配制含氯化钠浓度为0.14mol/L的牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液，其中含牛血清白蛋白的浓度为1mg/mL；配制含氯化钠浓度为0.14mol/L的壳聚糖溶液，其中含壳聚糖的浓度为1.5mg/mL；

②将上述交联壳聚糖球形粒子基材置于牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液中15～20min，再将粒子分离出后用0.14mol/L氯化钠溶液清洗4～6次，然后将粒子置于壳聚糖溶液中15～20min，再将粒子分离出后用0.14mol/L氯化钠溶液清洗4～6次，完成交联壳聚糖球形粒子基材表面的第一个双分子层自组装，得到含一个双分子层的表面自组装壳聚糖粒子；

③重复上述步骤2)的②的过程，交联壳聚糖球形粒子基材在牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液和壳聚糖溶液中交替自组装5次，得到壳聚糖为最外层的含五个双分子层的表面自组装壳聚糖粒子；

3)牛血清白蛋白在自组装壳聚糖基材表面的印迹：

①按壳聚糖∶去离子水∶环氧氯丙烷＝(1.5～3.0)g∶(50～100)mL∶0.3～0.6g，选取去离子水和环氧氯丙烷，并将所述去离子水装于锥形瓶中；

②将上述表面自组装壳聚糖粒子转移到装有去离子水的锥形瓶中，并用2～4mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值至10，加入环氧氯丙烷在室温下反应48h，反应结束后，分离出粒子，用去离子水冲洗4～6次，得到壳聚糖粒子；

4)模板蛋白质的洗脱：

将上述步骤3)中得到的壳聚糖粒子用十二烷基硫酸钠与乙酸的混合溶液进行洗脱，以脱除模板蛋白质牛血清白蛋白，采用紫外-可见分光光度计在280nm波长处检测洗脱液中蛋白质的浓度，直至洗脱液中蛋白质吸光值为0，得到壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物。

2.根据权利要求1所述的一种壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物的制备方法，其特征在于：步骤2)中，配制的牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液的pH值为6；配制的壳聚糖溶液的pH值为6。

3.根据权利要求1所述的一种壳聚糖的层层自组装蛋白质印迹聚合物的制备方法，其特征在于：步骤4)中，十二烷基硫酸钠与乙酸的混合溶液中十二烷基硫酸钠的质量百分比为4.8％、乙酸的质量百分比为2％，水的质量百分比为93.2％。

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