CN1116926C - 用于治疗高胆红素血症的免疫吸附材料 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物分离工程领域，涉及到发明了一种可治疗高胆红素血症的免疫吸附材料。其特征为：选用来自天然的多糖类材料为载体，以人血清白蛋白和疏水性间隔臂为功能化基团，采用N，N′羰基二咪唑作为活化试剂活化载体，用二氨基二丙基胺和戊二醛作为连接载体和人血清白蛋白的间隔臂分子合成了胆红素免疫吸附材料。该吸附材料的优点是：克服了现存树脂型胆红素吸附材料价格高、治疗时间长、不能重复使用的缺点，可快速、高选择性地从病人血浆中去除胆红素和胆汁酸，吸附量大，血液相容性好，同时可减少治疗时间，降低治疗费用，提高了治疗过程的安全性和可靠性。
Description
技术领域
本发明属于生物分离工程领域，特别涉及到发明了一种用于治疗高胆红素血症的免疫吸附材料。
背景技术
胆红素是衰老红细胞中血红素的代谢产物。由于细胞的新陈代谢，正常人每天产生的胆红素为每公斤体重3.9±0.7mg，血浆中胆红素的浓度为2-9mg/L，其代谢的主要部位在肝脏，若肝脏代谢出现问题，血液中则会产生胆红素的累积，严重时血浆中胆红素的浓度可达300-400mg/L，过量的胆红素是一种内源性毒素，它极易透过生物膜、透过血脑屏障与神经核团结合，干扰脑细胞的正常代谢及功能，它对大脑的毒副作用是不可逆的。胆道阻塞、急性及慢性黄疸性肝炎、中毒性肝炎、各种溶血性肝炎等都会导致肝脏对胆红素的代谢紊乱，从而导致病患者体内胆红素的积累，产生高胆红素血症，致使患者生理失调，严重时危及生命。目前，急性肝功能衰竭导致的死亡率高达80％，死亡的主要原因是肝功能衰竭导致大量的毒素累积，主要是胆红素、胆汁酸等，致使脑细胞中毒死亡。如果能够及时除去血液中的过量胆红素和胆汁酸，将极大的缓解病症，维持肝衰病人存活。由于肝细胞具有很强的再生能力，病情的缓解将使肝组织得到一定的修复，同时也给肝脏移植创造了可能，对挽救病人的生命具有重大的意义。
血液净化是近20年来出现的新的临床治疗方法，主要是通过清除存在于血液中的致病物质实现治疗某些疑难病症的目的。其实质是生物分离技术在医学领域的应用。近些年来对肝衰病人采用的主要治疗方法是血浆置换，即通过丢弃掉部分的病人血浆，补充相当量的健康人血浆来缓解病情，但这种方法存在如下缺点：1)有害物质在病人血液中仍然有大量的存留；2)异体血浆的输入会使病人产生一定的免疫反应并增加了传染疾病的可能。伴随生物分离技术的进步，血液净化技术也不断得到发展。免疫吸附疗法是血液净化的重要分支，是近年来兴起的一种治疗疑难病症的新方法，其特征是通过在体外建立的人体血液循环支路使血液通过免疫吸附柱吸附除去患者血液中的致病物质，净化人体内环境，达到治疗疾病的目的。免疫吸附柱中含有的免疫吸附材料可与血液中的致病物质特异结合，而对血液中的其它成分无损害。目前，日本等国已研制出可特异吸附胆红素的树脂型吸附剂，虽然吸附效果较好，但存在价格较高，吸附时间较长(8-12个小时)，不能重复使用等缺点。对于血液中胆红素含量较高的病人，由于胆红素吸附柱的吸附容量一定，当吸附剂吸附饱和后，血液中的胆红素虽然有一定的降低，但仍维持在较高的水平，需要再换用一新的吸附柱，这无疑增加了患者的治疗费用和时间。如果研制出可重复使用的免疫吸附柱，则可以采用双柱切换系统根据病人血浆中的胆红素浓度确定免疫吸附柱的重复使用次数，以达到最大量地移走病人体内胆红素、增强治疗效果的目的，同时也能降低治疗成本，减少治疗时间。问题的关键在于新型免疫吸附剂的合成。
发明内容
本发明的目的是：
设计、合成一种无毒、无害、吸附胆红素效果好、成本底并且可重复使用的多糖型吸附剂取代目前的树脂型吸附剂。通过选择无毒无害的琼脂糖凝胶等多糖类材料为载体，以可与胆红素特异结合的人血清白蛋白(HSA)和疏水性间隔臂为功能化分子，使用N，N′-羰基二咪唑作为活化试剂以增加材料表面固定化HSA的密度，通过改善HSA与胆红素结合的微环境，提高材料的稳定性和吸附性能，从而使胆红素免疫吸附材料具有良好的血液相容性、较高的吸附容量和良好的再生性能，以减少临床应用的时间、费用，提高临床疗效。
本发明的技术方案是：
选择与人血液相容性好的多糖类材料为载体。此材料是从天然的植物中提取出来的一种高纯度的多糖类物质，含有大量的亲水性羟基，羟基在通常情况下是惰性的，不具有吸附性，所以血液相容性较好。这里我们选用可与胆红素发生特异性作用的人血清白蛋白(HSA)为功能化分子。HSA是人体内重要的输运蛋白，HSA分子中含有一个胆红素高亲和力结合部位(或称第一结合部位)和1-2个低亲和力结合部位(或称第二结合部位)。在通常情况下，血液中的胆红素是以与HSA相结合的形式存在的。在理论上，以HSA为功能化分子应该只结合游离胆红素，而对与HSA结合的胆红素吸附甚微。但在固定化HSA过程中，可以通过化学试剂使键合到多糖材料表面的HSA分子构型发生部分改变以提高对血液中与HSA结合胆红素分子的竞争吸附能力。在固定化HSA的工艺上，选用N，N′-羰基二咪唑作为活化多糖类材料的试剂。N，N′-羰基二咪唑是一个具有很高反应活性的试剂，可与多糖类材料上大量存在的羟基快速反应，提高材料表面固定化HSA的密度。为了增强材料对胆红素的吸附效果，在多糖载体和HSA之间加入14个原子长度的、具有一定疏水性的间隔臂分子。
本发明的显著优势和效果是：
1)选用来自天然的多糖类物质为载体，与人工合成的树脂相比，具有非特异吸附小，血液相容性好等优点，增加了胆红素免疫吸附材料的安全性和可靠性。
2)选用HSA和疏水性间隔臂作为功能化基团实现对血液中胆红素的吸附作用。由于采用的是生物分子中特异性相互作用的原理，所以固定在材料上的功能基团对血浆中的胆红素吸附速度快(0.5小时就可吸附饱和，比树脂型吸附材料速度快16倍)、选择性高(主要吸附胆红素和胆汁酸)，吸附效果好。吸附上的胆红素在特定条件下可洗脱下来，使胆红素免疫吸附材料可重复使用，在临床治疗中可采用双柱切换的方式，显著增强了治疗效果。
本发明的优势和效果在临床治疗上将表现为降低病人的治疗费用、减少治疗的时间，提高治疗的效果，同时也增加整个治疗的安全性和可靠性。
具体实施方式
以下详述本发明的最佳实施例：
实施例1：
含有咪唑氨基甲酸盐的活性多糖类材料的合成
在装有搅拌器、冷凝器的5L三口烧瓶中，加入多糖类材料1升，加入分析纯丙酮试剂，使固体的含量保持在30-50％的比例，搅拌均匀，加入50-100克/升的N，N′-羰基二咪唑，在室温下搅拌活化1小时。结束反应，将材料过滤，用3-5倍体积的溶剂冲洗以移走活化过程中产生的咪唑，过滤，将活化好的介质置于丙酮中，储存4℃备用。用这种方法活化的材料每毫升至少含有100μmol的咪唑氨基甲酸盐活性基团用来键合其它分子。
实施例2：
带有二氨基二丙基胺(DAPDA)的多糖类材料的合成
在装有搅拌器、冷凝器的5L三口烧瓶中，加入带有咪唑氨基甲酸盐的多糖类材料1升，将100-200克的二氨基二丙基胺溶于1升的丙酮中，然后加入到三口烧瓶中。在室温下搅拌反应3小时。用丙酮冲洗凝胶移走未反应的二氨基二丙基胺，滤干备用。
实施例3：
带有醛基活性基团的多糖类材料的合成
在装有搅拌器、温度计及冷凝器的5L三口烧瓶中，加入带有活性氨基的多糖类材料1升，加入25％的戊二醛100-400ml，用硼酸盐或磷酸盐作缓冲液，加入缓冲液1.0～1.5L，pH值控制在7.0-9.0范围内，30～40℃搅拌反应2小时，反应停止后，用大量的水洗去戊二醛残余液，滤干备用。
实施例4：
醛基多糖类材料与HSA直接反应合成胆红素免疫吸附材料
在装有搅拌器、温度计及冷凝器的5L三口烧瓶中，加醛基多糖类材料1L，加入0.1mol/L的磷酸或硼酸缓冲液1.0-1.5L，pH值控制在7.0-8.5范围内，加入4-6g HSA，在25℃恒温反应16～20小时，停止反应，回收未反应的HSA，用0.1-0.2mol/L的羟基甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸乙酯盐酸盐和乙醇氨其中的一种试剂封闭未反应活性基团，用硼氢化钠或氰基硼氢化钠还原反应中产生的双键，在室温下反应15-20小时。用水冲洗干净未反应组分，保存在0.1mol/L、pH＝7.4的磷酸缓冲液中，加入0.02-0.1％的硫柳汞作防腐剂。用紫外法检测HSA的键合量为8.0-10.0mg/ml材料，吸附胆红素量为4.25μmol/ml材料，采用的洗脱剂为含有1M NaCl、0.02％的吐温-80、pH＝7.5的0.05M磷酸缓冲液。每次再生后的胆红素免疫吸附材料吸附能力下降约2.1％。
由于免疫吸附柱最终目的是进行临床实验，要求无菌、无热源，所以整个实验应在无菌无热源条件下进行。
实施例5
胆红素免疫吸附柱的离体实验
将按上述方法制备的胆红素免疫吸附材料5ml(HSA的键合量为50mg)装于φ10×100mm的层析柱中，用生理盐水充分冲洗柱子，将110ml高胆红素血症病人的血浆过柱循环30分钟，分析过柱前后血液中主要成分的变化，得到如下的结果：
| 血浆成分 | 实验前 | 实验后 | 去除率 |
| 总蛋白 | 55.5g/L | 52.50g/L | 0.066g/ml材料 |
| 白蛋白 | 25.5g/L | 24.39g/L | 0.024g/ml材料 |
| 球蛋白 | 30.0g/L | 28.11g/L | 0.042g/ml材料 |
| A/G | 0.9 | 0.87 | |
| 谷丙转氨酶 | 67.4U/L | 66U/L | 0.031U/ml材料 |
| 谷草转氨酶 | 155.4U/L | 141.5U/L | 0.306U/ml材料 |
| AST/ALT | 2.29 | 2.10 | |
| 碱性磷酸酶 | 121.1U/L | 111.8U/L | 0.205U/ml材料 |
| 谷氨酰转肽酶 | 23.2U/L | 19.7U/L | 0.078U/ml材料 |
| 乳酸脱氢酶 | 187.4U/L | 177.4U/L | 0.22U/ml材料 |
| 胆碱脂酶 | 3085.00U/L | 2027.00U/L | 23.28U/mL |
| 总胆红素 | 337.28μmol/L | 144.13μmol/L | 4.25μmol/ml材料 |
| 直接胆红素 | 134.61μmol/L | 61.78μmol/L | 1.6μmol/ml材料 |
| 间接胆红素 | 202.67μmol/L | 82.35μmol/L | 2.65g/ml材料 |
| 胆汁酸 | 639.60μmol/L | 362.9μmol/L | 6.09g/ml材料 |
| 胆固醇 | 1.42mmol/L | 1.37mmo1/L | 0.001mmol/ml材料 |
以上结果证实，胆红素免疫吸附剂对直接胆红素、间接胆红素及胆汁酸、胆碱脂酶都有很强的吸附能力，对血浆中的其它成分吸附很少，说明此吸附剂的选择性较好。免疫吸附刑在30分钟内达到其最大吸附量，说明对胆红素的吸附速度较快。
实施例6：
胆红素免疫吸附材料的再生性能
将按上述方法制备的胆红素免疫吸附材料5ml(HSA的键合量为50mg)装于φ10×100mm的层析柱中，用生理盐水充分冲洗柱子，将110ml患高胆红素血症病人的血浆过柱循环30分钟，用含有1M NaCl、0.02％的吐温-80、pH＝7.5的0.05M磷酸缓冲液作为洗脱剂将吸附在免疫吸附剂上的胆红素等物质洗脱下来，洗脱的整个过程大概需要20-30分钟。洗脱完毕后，用生理盐水将柱中的洗脱剂置换出来，再将110ml患高胆红素血症病人的血浆过柱循环30分钟。重复以上操作6次，每次都分析过柱前后血浆中的主要成分，确定对总胆红素的吸附容量。得到如下表的结果：
胆红素吸附剂再生次数与吸附容量之间的关系
| 实验次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 总胆红素吸附量μmol/ml材料 | 4.25 | 4.17 | 4.09 | 4.00 | 3.89 | 3.81 |
以上结果说明，每次吸附剂再生，其对总胆红素的吸附容量都约有2.1％的下降，使用20次后其吸附容量仅为最初的一半。一个体重70公斤，血浆内胆红素浓度700μmol/L的高胆红素血症患者，若使用每个吸附柱含有70ml吸附材料的双柱系统进行治疗，每柱只需重复使用4次就可将病人血浆中胆红素的浓度降到30μmol/L以下，接近正常值，整个治疗时间需要4个小时左右。可见，免疫吸附材料的再生效果完全满足治疗要求。
Claims (2)
1.一种用于治疗高胆红素血症的免疫吸附材料，以来自天然的多糖类材料为载体，采用N，N′羰基二咪唑作为活化试剂活化载体，用二氨基二丙基胺和戊二醛作为间隔臂分子将人血清白蛋白以共价键的方式固定在载体表面，从而合成了一种对胆红素具有较高吸附能力并能够反复使用的胆红素免疫吸附材料，其特征在于：
a)作为载体的多糖类材料包括琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素、壳
聚糖；在合成每一步骤中，多糖类材料在反应液中所占的体积比均为
30％～50％，反应温度为室温；
b)N，N′-羰基二咪唑与多糖类材料的反应必须在纯的丙酮溶剂中进行，
N，N-羰基二咪唑在反应液中的浓度为50～100克/升；
c)二氨基二丙基胺与上述活化的多糖类材料的反应必须在纯的丙酮溶
液中进行，二氨基二丙基胺在反应液中的浓度为50-100克/升；
d)戊二醛与带有活性氨基的多糖类材料的反应在pH＝7-9的硼酸或磷酸
缓冲液中进行，戊二醛在反应液中的浓度为10-50克/升；
e)人血清白蛋白与活性醛基多糖类材料的反应在pH＝7-8.5的硼酸或磷
酸缓冲液中进行，人血清白蛋白在反应液中的浓度为1.6-3.0克/升。
2.根据权利要求1所述的用于治疗高胆红素血症的免疫吸附材料，其特征还在于：吸附剂再生采用的洗脱剂为含有1M NaCl、0.02％的吐温-80、pH＝7.5的0.05M磷酸缓冲液。
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