CN104603153A - 用于抗体纯化的载体、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供其上固定有蛋白A的载体及所述载体的制备方法,所述蛋白A具有允许抗体在其中许多抗体不必经受酸修饰的温和pH条件(具体地,pH4.0至5.5)下解吸的特定氨基酸序列;及所述载体的制备方法。一种固定化载体(不包括具有整体结构的固定化载体),其上通过静电相互作用吸附有蛋白,所述蛋白由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成,其中由R1-R2-R3表示的部分被用于固定至固定化载体上,其中:该序列表示从氨基末端侧到羧基末端侧的序列;R2部分的序列是作为待被固定的蛋白的蛋白A突变体的序列,或其中蛋白A突变体的序列的1至3个单位被连接在一起的序列,所述蛋白A突变体具有在中性条件下与抗体强烈结合并在pH4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体解离的特性。
Description
技术领域
本发明涉及用于抗体纯化的载体及其制备方法。本发明进一步涉及以用于抗体纯化的载体填充的亲和色谱柱,以及用于使用该柱纯化抗体的方法。
背景技术
近年来,对基于抗体的具有有限副作用的抗体药物的需求逐年增加。使用其上固定有蛋白A(Protein A)的载体的亲和色谱法被广泛用作用于纯化抗体的方法。此处所用的蛋白A是指源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A(在A.Forsgren和J.Sjoquist,J.Immunol.(1966)97,822-827中被描述)或能表现出与抗体结合的功能的构成该蛋白的结构域序列的一部分。
用于利用亲和色谱法纯化抗体的典型方法如下,所述亲和色谱法使用其上固定有蛋白A的载体。即,该方法包括(1)使含有抗体的原材料粗溶液经过以其上固定有蛋白A的载体填充的柱,以使期望的抗体吸附至载体,(2)用中性缓冲溶液洗涤抗体吸附至其的载体,以去除杂质,以及然后(3)使用酸性缓冲溶液(具体地,pH 2.5至3.0)洗脱吸附至载体的抗体。
本发明人开发了一种技术作为用于通过提高每载体与抗体结合的容量(capacity)有效纯化抗体的手段,包括通过控制定向(orientation)将源自蛋白A的蛋白作为与抗体的Fc结构域特异性结合同时控制定向的蛋白引入不溶性载体(参见专利文献1至16)。
当以更一般化的形式表述时,本发明人开发的定向控制的(orientation-controlled)固定方法如下。
该方法是一种定向控制的固定方法,包括使用由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6(其中所述序列表示从氨基末端侧到羧基末端侧的序列;R1部分的序列可不存在,且如果存在,是包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的序列;R2部分的序列是待被固定的源自蛋白A的蛋白的序列,及被改造为不包含赖氨酸或半胱氨酸残基的序列,从而它可保持与抗体结合的特性;R3部分的序列可不存在,且如果存在,是包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的间隔序列(spacer sequence);R4部分的序列是包含由半胱氨酸-X(其中X表示赖氨酸或除半胱氨酸之外的氨基酸残基)表示的2个氨基酸残基的序列;R5部分的序列可不存在,且如果存在,是不包含赖氨酸或半胱氨酸残基的序列,以及包含能够使得由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的整个蛋白的等电点在酸性侧的酸性氨基酸残基的序列;且R6部分的序列是用于纯化蛋白的亲和标签序列)表示的氨基酸序列组成的蛋白以氰化(cyanate)在R4部分唯一存在的半胱氨酸残基的SH基团,以及使半胱氨酸氰化的(cyanocysteinated)蛋白与引入氨基作为官能团的不溶性载体反应,以通过在其羧基端和载体的氨基端之间酰胺键合来固定由R1-R2-R3表示的部分。
此外,迄今为止,在使用由本发明人开发的通过蛋白A的定向控制固定的载体的抗体纯化中,已经应用包括以下的纯化手段:(1)使含有抗体的原材料粗溶液经过以其上固定有蛋白A的载体填充的柱,以使期望的抗体吸附至载体,(2)用中性缓冲溶液洗涤抗体吸附至其的载体,以去除杂质,以及(3)使用酸性缓冲溶液(具体地,pH 2.5至3.0)洗脱吸附至载体的抗体,提供用于通过提高的每载体与抗体结合的容量有效纯化抗体的手段。
然而,包括使用具有2.5至3.0的pH的酸性缓冲溶液洗脱抗体的上述方法具有严重的缺陷。具体地,存在以下问题:抗体与强酸(例如,pH 3.0或更小)缓冲溶液的接触导致抗体的酸修饰并改变抗体的高级结构,导致诱导聚集以及作为药物的抗体的活性的损失。为了解决该问题,试图开发更稳定的抗体分子;然而,明显的是,这样的解决方案不可能是针对伴随通过使用其上固定有蛋白A的载体的亲和色谱法纯化的问题的常规解决方案,且对能够广泛应用于许多抗体分子的制备的方法的开发存在需求。
引用列表
专利文献
专利文献1:日本专利公开(Kokai)号2011-132140 A
专利文献2:日本专利公开(Kokai)号2011-132145 A
专利文献3:日本专利公开(Kokai)号2011-132141 A
专利文献4:日本专利号2990271
专利文献5:日本专利号3047020
专利文献6:日本专利号3740529
专利文献7:日本专利公开(Kokai)号2005-112827 A
专利文献8:日本专利号4528951
专利文献9:日本专利公开(Kokai)号2008-115151 A
专利文献10:日本专利公开(Kokai)号2008-115152 A
专利文献11:日本专利公开(Kokai)号2008-115153 A
专利文献12:日本专利公开(Kokai)号2008-266219 A
专利文献13:日本专利公开(Kokai)号2008-266221 A
专利文献14:日本专利公开(Kokai)号2009-156767 A
专利文献15:日本专利公开(Kokai)号2010-127856 A
专利文献16:日本专利号40006523
发明概述
技术问题
为了提供针对上述伴随通过使用其上固定有包含蛋白A的蛋白的载体的亲和色谱法的纯化的问题的常规解决方案,本发明提供了其上固定有蛋白A的载体及其制备方法,所述蛋白A具有允许抗体在其中许多抗体不经受酸修饰的温和pH条件(具体地,pH 4.0至5.5)下解吸的特定氨基酸序列。另外,本发明提供了用于抗体纯化的亲和色谱柱及使用该柱纯化抗体的方法,所述亲和色谱柱以其上固定有包含蛋白A的蛋白的载体填充。
问题的解决方案
本发明人已进行了关于解决上述在蛋白A的固定中待消除的问题的深入研究。
本发明人已经获得一个想法,如果蛋白A突变体可被开发作为在包含由通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列的序列部分中负责与抗体结合的R2部分中使用的蛋白A,可解决上述问题,所述由通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列用于蛋白的定向控制的固定,蛋白A突变体具有以下特性:在抗体纯化期间,在使含有抗体的原材料粗溶液经过以蛋白A固定的载体填充的柱并使期望的抗体吸附至载体、随后洗脱的步骤中,其在洗脱吸附至载体的抗体中通过使用酸性缓冲溶液允许抗体在作为温和pH条件的pH 4.0至5.5的范围内解吸,而不影响用中性缓冲溶液洗涤抗体吸附至其的载体以去除杂质的操作。
在完成本发明之前的时间点,本发明人发现蛋白A表现出与抗体强烈的结合反应,该蛋白A通过用精氨酸或甘氨酸取代源自蛋白A的A-结构域的序列中所有赖氨酸残基被改造为在R2部分不包含赖氨酸或半胱氨酸,所述源自蛋白A的A结构域的序列通过SEQ ID NO:1表示(日本专利公开(Kokai)号2011-132140 A、2011-132145 A、和2011-132141 A)。因此,制备了由被改造为上述通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6的序列组成的蛋白,其包含蛋白A的氨基酸序列(该蛋白被称作AD-1.SEQ ID NO:2),并基于该序列进行另外详尽的单个氨基酸取代,以制备AD-1的约800个突变体。如果能够遵循如由本发明人开发的用于改良蛋白的方法(日本专利No.4534030、日本国内再公开号01/000797、M.Iwakura等J.Biol.Chem.281,13234-13246(2006)、和日本专利公开(Kokai)号2005-058059 A)来确定在酸性条件下所有约800个突变体的抗体洗脱特性,则认为能够得到作为本发明目的的突变体。
源自蛋白A的A-结构域的序列(SEQ ID NO:1):
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Lys-Lys
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Lys
AD-1的序列(通过基于蛋白A的A-结构域序列改造为R1-R2-R3-R4-R5-R6形式制备的序列)(SEQ ID NO:2):
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly-Gly-Gly
Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
His-His-His-His-His-His
此处,在通式为R1-R2-R3-R4-R5-R6中,在SEQ ID NO:2中显示的序列(AD-1)的R1、R2、R3、R4、R5和R6为以下序列。
R1(源自用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的起始密码子的甲硫氨酸,通常由于在表达后几乎都被移除而不存在):
Met
R2(其中蛋白A的A-结构域的氨基酸序列被修饰为不包含半胱氨酸和赖氨酸的序列)(SEQ ID NO:3):
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
R3(不包含半胱氨酸和赖氨酸的接头序列):
Gly-Gly-Gly-Gly
R4(用于通过氰化半胱氨酸引起固定化反应的序列):
Cys-Ala
R5(用于使得等电点为负值的序列):
Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
R6(用于纯化的标签序列)
His-His-His-His-His-His
本发明人详尽地制备了突变体蛋白,其中基于名为AD-1的氨基酸序列,组成R2的所有氨基酸残基经受单个氨基酸取代。
然而,鉴于以前的发现结果,从多达800个单个氨基酸取代突变体中有效选择作为本发明目的的突变体蛋白是困难的,所述突变体蛋白具有允许抗体在其中许多抗体不经受酸修饰的温和pH条件(pH 4.0至5.5)下解吸的特定氨基酸序列。因此,获得上述突变体蛋白的目的无法实现。这是因为,为了确定一个突变体是否具有期望的特性,将所有候选突变体固定至载体上、制备亲和柱、并使用制备的柱进行纯化实验是必需的。因此,仅确定一个突变体的期望特性就花费数天到2周;从时间和费用的角度,将该操作应用到约800个单个氨基酸取代实际上是困难的。
作为在这种情况下深入研究的结果,本发明人设想利用阵列分析装置,如本发明人已经开发的(日本专利号4528951、日本专利公开(Kokai)号2010-127856 A、和日本专利号4006523)。
在本发明中使用的阵列分析装置中,阵列基板使用二氧化硅整体多孔材料的薄层作为支持层。聚-L-赖氨酸被引入硅胶整体多孔材料的表面,并且使用点样仪(spotter)将突变体点样到薄层上以通过离子相互作用将突变体蛋白吸附到其上,接着使用氰化试剂氰化吸附在斑点上的蛋白中的半胱氨酸残基的SH基团,用于通过氰化半胱氨酸的定向控制的固定化反应。其后,用具有高盐浓度的缓冲溶液洗涤所得物,以去除突变体蛋白中源自R4-R5-R6的部分,并且其上已固定有R1-R2-R3部分的阵列基板,在其羧基末端以定向控制的方式在二氧化硅整体多孔材料上形成斑点。其上固定突变体蛋白的阵列基板(1)经受抗体溶液的通过、(2)用中性缓冲溶液洗涤、(3)经受作为用于抗体洗脱的缓冲溶液的pH 5.0的缓冲溶液的通过、以及之后(4)经受用于再生的pH 2.5的缓冲溶液的通过。在该过程中,通过使用阵列分析装置,在280nm下测定每个斑点透射光的量随时间的变化。当抗体与各突变体斑点结合时,由于结合的抗体在280nm下的吸收,在280nm下的透射光的量降低。
当抗体随着抗体的洗脱从各突变体斑点解离时,在280nm下的透射光的量增加。在该测定中,当pH 5.0的缓冲溶液作为用于抗体洗脱的缓冲溶液通过时(上述步骤(3)),获得在280nm下透射光的量(量对应于吸光度的改变的量)的对数,并且针对经过的时间制图。直到当pH 5.0的缓冲溶液经过时在280nm下的透射光的量的对数值与用于再生的pH 2.5的缓冲溶液通过之后(上述步骤(4))在280nm下透射光的量的对数值之间的差减少一半时,确定经过的时间(T0.5)。使用该时刻的值作为指示,选出给出尽可能小的值的突变体。然后,其中给出小T0.5的各突变被组合的突变体被制备并进行相似测定,并且组合突变体已经被制备并测定T0.5值。期望的突变体能够从这样的组合突变体中发现。制备了其中发现的突变体序列的一些重复段被连接的突变体,并且制备了经受其定向控制的固定的载体。使用该载体制备了亲和柱;在不同pH值的洗脱条件下进行洗脱;并分析色谱图。结果,证实实现了本发明的目的:获得包含具有允许抗体在温和pH条件下解吸的特定氨基酸序列的蛋白A的载体,从而完成了本发明。
因此,本发明如下。
[1]一种固定化载体,所述固定化载体不包括具有整体结构(monolithstructure)的固定化载体,蛋白通过静电相互作用吸附到所述固定化载体上,所述蛋白由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成,其中由R1-R2-R3表示的部分被用于固定在固定化载体上,其中:该序列表示从氨基末端端侧到羧基末端侧的序列;
R1部分的序列可不存在,且如果存在,是包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的序列;
R2部分的序列是作为待被固定的蛋白的蛋白A突变体的序列或其中蛋白A突变体的序列的1至3个单位被连接在一起的序列,以及是不包含赖氨酸或半胱氨酸残基的序列,所述蛋白A突变体具有在中性条件下与抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体解离的特性;
R3部分的序列可不存在,且如果存在,是包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的间隔序列;
R4部分的序列是包含由半胱氨酸-X表示的2个氨基酸残基的序列,其中X表示丙氨酸或除丙氨酸和半胱氨酸之外的氨基酸残基;
R5部分的序列可不存在,且如果存在,是不包含赖氨酸和半胱氨酸残基的序列,以及包含能够使得由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的整个蛋白的等电点在酸性侧的酸性氨基酸残基的序列;且R6部分的序列是用于蛋白纯化的亲和标签序列。
[2]根据[1]所述的固定化载体,其中所述蛋白A突变体是以下蛋白A突变体:当抗体与固定在阵列基板上的所述蛋白A突变体结合并用pH 5.0的0.1M柠檬酸钠溶液洗脱时,其直到一半量的结合的抗体解离时经过的时间(T0.5)以及其与抗体的解离常数,与由SEQ ID NO:3表示的蛋白A突变体的T0.5和解离常数相比是减小的。
[3]根据[1]或[2]所述的固定化载体,其中所述蛋白A突变体是由其中在源自金黄色葡萄球菌的蛋白A的氨基酸序列中1至3个氨基酸残基被取代的氨基酸序列组成的突变体。
[4]根据[1]至[3]任一项所述的固定化载体,其中所述蛋白A突变体是蛋白A的A-结构域的突变体。
[5]根据[1]至[4]任一项所述的固定化载体,其中所述R2部分的序列是由SEQ ID NO:4至7的任何序列组成的蛋白A的A-结构域的突变体蛋白的序列,或其中由SEQ ID NO:4至7的任何序列组成的蛋白A的A-结构域的突变体蛋白的序列的1至3个单位被连接在一起的序列。
[6]根据[1]至[5]任一项所述的固定化载体,用于将存在于由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白中唯一的半胱氨酸残基的巯基基团转化为硫氰酸基基团,并使所得物作用于具有伯胺作为官能团的任何固定化载体,用于使R1-R2-R3部分通过酰胺键合与载体结合,所述R1-R2-R3部分是蛋白的半胱氨酸残基的氨基末端侧存在的氨基酸序列部分。
[7]根据[1]至[6]任一项所述的固定化载体,其中由通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列中R3部分的序列是由1至10个甘氨酸残基组成的序列。
[8]根据[1]至[7]任一项所述的固定化载体,其中由通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列中R5部分的序列是由天冬氨酸和/或谷氨酸的氨基酸残基组成的1至10个氨基酸残基的序列。
[9]根据[1]至[8]任一项所述的固定化载体,其中由通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列中R5部分的序列是由1至10个天冬氨酸残基组成的序列。
[10]根据[1]至[9]任一项所述的固定化载体,其中由通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列中R6部分的序列是由4个或更多个组氨酸残基组成的序列。
[11]根据[1]至[10]任一项所述的固定化载体,其中所述载体选自由二氧化硅载体、玻璃珠和聚合物组成的组。
[12]一种用于制备根据[1]至[11]任一项所述的固定化载体的方法,包括通过静电相互作用将由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白吸附至载体。
[13]一种固定化载体,其上固定有蛋白A突变体,所述固定化载体通过以下制备:将根据[1]至[11]任一项的由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白中存在的唯一半胱氨酸残基的巯基基团转化为硫氰酸基基团,并使所得物作用于具有伯胺作为官能团的任何固定化载体,用于使R1-R2-R3部分作为蛋白的半胱氨酸残基的氨基末端侧存在的氨基酸序列部分通过酰胺键合与载体结合。
[14]一种用于制备根据[12]所述的固定化载体的方法,包括将根据[1]至[11]任一项的由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白中存在的唯一半胱氨酸残基的巯基基团转化为硫氰酸基基团,并使所得物作用于具有伯胺作为官能团的任何固定化载体,用于使R1-R2-R3部分作为蛋白的半胱氨酸残基的氨基末端侧存在的氨基酸序列部分通过酰胺键合与载体结合。
[15]一种用于抗体纯化的亲和色谱柱,所述亲和色谱柱以根据[13]所述的固定化载体填充。
[16]一种用于纯化抗体的方法,包括将包含抗体的溶液应用至根据[15]所述的用于抗体纯化的亲和色谱柱,以使抗体与蛋白A突变体结合,并且然后使用洗脱缓冲溶液解离并洗脱抗体。
[17]一种用于设计由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白的方法,所述蛋白用于将由通过通式:R1-R2-R3表示的氨基酸序列组成的蛋白固定至固定化载体上,所述方法包括选择R1、R2、R3、R4、R5和R6部分的氨基酸序列以符合以下条件:
(a)允许R1部分的序列不存在,或如果允许其存在,选择包括除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的序列;
(b)作为R2部分的序列,选择蛋白A突变体的序列或其中蛋白A突变体的序列的1至3个单位被连接在一起的序列,以及是不包含赖氨酸或半胱氨酸残基的序列,所述蛋白A突变体具有在中性条件下与抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体解离的特性;
(c)允许R3部分的序列不存在,或如果允许其存在,选择包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的间隔序列;
(d)作为R4部分的序列,选择包含由半胱氨酸-X(其中X表示丙氨酸或除半胱氨酸之外的氨基酸残基)表示的2个氨基酸残基的序列;
(e)允许R5部分的序列不存在,或如果允许其存在,选择不包含赖氨酸或半胱氨酸残基的序列,其中所述序列包含能够使得由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的整个蛋白的等电点在酸性侧的酸性氨基酸残基;以及
(f)作为R6部分的序列,选择用于纯化蛋白的亲和标签序列。
[18]根据[17]所述的方法,其中所述蛋白A突变体是以下蛋白A突变体:当抗体与固定在阵列基板上的所述蛋白A突变体结合并用pH 5.0的0.1M柠檬酸钠溶液洗脱时,其直到一半量的结合的抗体解离时经过的时间(T0.5)以及其与抗体的解离常数,与由SEQ ID NO:3表示的蛋白A突变体的T0.5和解离常数相比是减小的。
[19]根据[17]或[18]所述的方法,其中所述蛋白A突变体是由其中在源自金黄色葡萄球菌的蛋白A的氨基酸序列中1至3个氨基酸残基被取代的氨基酸序列组成的突变体。
[20]根据[17]至[19]任一项所述的方法,其中所述蛋白A突变体是蛋白A的A-结构域的突变体。
[21]根据[17]至[20]任一项所述的方法,其中所述R2部分的序列是由SEQ ID NO:4至7的任何序列组成的蛋白A的A-结构域的突变体蛋白的序列,或由其中SEQ ID NO:4至7的任何序列的1至3个单位被连接在一起的序列组成的蛋白A的A-结构域的突变体蛋白的序列。
本说明书包含日本专利申请号2012-134905的说明书和/或附图的内容,本申请的优先权基于该日本专利申请。
发明的有益效果
根据本发明的方法,可以获得在洗脱性能方面出色的固定化载体,其在纯化抗体中通过以下允许蛋白A结合的抗体在更温和pH条件(pH 4.0至5.5)下的洗脱:设计包含蛋白A突变体作为R2的由通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列、制备由该氨基酸序列组成的蛋白、并使用该蛋白将蛋白A突变体固定至载体上。该固定化载体的使用允许抗体在温和pH条件(pH 4.0至5.5)下的洗脱,并且提高了所获得的抗体的回收率。另外,该固定化载体作为填料的使用可提供在纯化能力方面出色的亲和色谱柱,并且使用该柱还可提供用于纯化抗体的有效方法。
附图简述
[图1]是显示绘制pH5.0时AD-1的洗脱参数和T0.5的值的结果的图。
[图2]是显示在使用各蛋白A的亲和色谱法中抗体的洗脱/回收的量的pH依赖性的一系列图。在图2的A至F的图中,水平轴表示用于洗脱的缓冲溶液的pH,且垂直轴表示当在各pH下进行洗脱时洗脱的抗体的回收率(%)(黑圈)。
[图3]是显示使用蛋白A的亲和色谱法的色谱图的一系列图。图3的A、B和C的图分别显示当使用具有3.0、4.0和5.0的pH的洗脱溶液时的色谱图。
具体实施方式
以下将详细描述本发明。
在根据本发明的由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白中R2部分的序列是待固定的蛋白A,并且由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白的使用可提供固定的蛋白,其中R2部分被固定。在上述通式中,序列表示从氨基末端侧到羧基末端侧的氨基酸序列。
R1部分的序列可不存在,且如果存在,是包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的序列。其具体实例包括源自用于在大肠杆菌中表达的起始密码子的甲硫氨酸。然而,由于在表达后几乎都被移除,甲硫氨酸通常不存在。
R2部分的序列是由通过SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列组成的天然存在的蛋白A的突变体的氨基酸序列。使用蛋白A的突变体的氨基酸序列作为序列单位并由该序列单位的重复段组成的氨基酸序列可被使用。在这种情况下,重复段的数目为1至3。在此,由重复段组成的氨基酸序列也被称为其中蛋白A的突变体的氨基酸序列的1至3个单位被连接在一起的序列。在R2部分使用的蛋白A的突变体的氨基酸序列不包含赖氨酸残基和半胱氨酸残基。使用的蛋白A的突变体具有在中性条件下与抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体解离的特性。
作为蛋白A作为R2部分的实例,蛋白A突变体可被列出,其通过使用常见的基因修饰技术,通过设计修饰源自金黄色葡萄球菌的蛋白A的氨基端序列(在A.Forsgren和J.Sjoquist,J.Immunol.(1966)97,822-827中描述)获得。作为R2部分的蛋白可以是能够与抗体的Fc区结合的蛋白A的结构域的突变体。该结构域的实例包括E-结构域、D-结构域、A-结构域、B-结构域和C-结构域。在这些中,A-结构域的突变体是优选的。为了本发明的目的,术语“蛋白A”也包括这些结构域。
当具有ε-氨基基团的赖氨酸残基或具有巯基基团的半胱氨酸残基被包含在蛋白A的氨基酸序列中时,用其他氨基酸取代赖氨酸和半胱氨酸以保证蛋白A的氨基酸序列中不包含赖氨酸和半胱氨酸,以使蛋白A与抗体的结合活性不会降低。本发明人已建立了用于制备不包含赖氨酸或半胱氨酸的蛋白的方法(日本专利公开(Kokai)号2008-266219 A)。基于天然存在的蛋白A的氨基酸序列,根据该方法,该氨基酸序列可以被修饰以制备由包含18种氨基酸、不包含赖氨酸或半胱氨酸残基的氨基酸序列组成的蛋白A,其是在与抗体结合的特性方面能够表现出与天然存在的蛋白A可比的性能的蛋白。
源自金黄色葡萄球菌的蛋白A的A-结构域的氨基酸序列显示在SEQID NO:1中。
源自蛋白A的A-结构域的序列(SEQ ID NO:1):
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Lys-Lys
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Lys
蛋白A具有4个赖氨酸残基(在第35位、第49位、第50位和第58位的氨基酸位置处),且其中赖氨酸残基被精氨酸残基或甘氨酸残基取代的蛋白A的A-结构域的氨基酸序列显示在以下SEQ ID NO:3中。
其中蛋白A的A-结构域被修饰为不包含半胱氨酸和赖氨酸的序列(SEQ ID NO:3):
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
基于显示在SEQ ID NO:3中的氨基酸序列修饰的具有在中性条件下与抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体解离的特性的蛋白A的A-结构域的实例,包括以下突变体。由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成、包含每一个突变体的氨基酸序列作为R2部分的蛋白称为:AD-3、AD-4、AD-6-1和AD-6-2。
作为AD-3的R2部分的蛋白A的A-结构域的突变体由以下氨基酸序列(SEQ ID NO:4)组成,其中在SEQ ID NO:3的氨基酸序列中第15位的E(谷氨酸)和第29位的G(甘氨酸)分别被H(组氨酸)和A(丙氨酸)取代。
AD-3的氨基酸序列(SEQ ID NO:4):
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
作为AD-4的R2部分的蛋白A的A-结构域的突变体由以下氨基酸序列(SEQ ID NO:5)组成,其中在SEQ ID NO:3的氨基酸序列中第15位的E(谷氨酸)、第19位的M(甲硫氨酸)和第29位的G(甘氨酸)分别被H(组氨酸)、V(缬氨酸)和A(丙氨酸)取代。
AD-4的氨基酸序列(SEQ ID NO:5):
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Val-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
作为AD-6-1的R2部分的蛋白A的A-结构域的突变体由以下氨基酸序列(SEQ ID NO:6)组成,其中在SEQ ID NO:3的氨基酸序列中第15位的E(谷氨酸)、第19位的M(甲硫氨酸)和第29位置的G(甘氨酸)分别被H(组氨酸)、V(缬氨酸)和E(谷氨酸)取代。
AD-6-1的氨基酸序列(SEQ ID NO:6):
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Val-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Glu-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
作为AD-6-2的R2部分的蛋白A的A-结构域的突变体由以下氨基酸序列(SEQ ID NO:7)组成,其中在SEQ ID NO:3的氨基酸序列中第15位的E(谷氨酸)、第19位的M(甲硫氨酸)和第29位的G(甘氨酸)分别被H(组氨酸)、V(缬氨酸)和D(天冬氨酸)取代。
AD-6-2的氨基酸序列(SEQ ID NO:7):
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Val-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Asp-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
R3部分的序列是包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的任何间隔序列。R3部分可不存在。R3部分的序列与R2部分一起被固定在固定化载体上。R3部分具有作为用于防止R2部分的功能在固定化中被其与固定化载体的结合抑制的合适的接头的作用。作为接头的作用是为了在作为R2部分的具有特定功能的蛋白和固定化载体之间保持合适的距离。因此,R3部分被要求是具有固定长度和无活性的任何氨基酸序列。R3部分中的氨基酸的数目不限;然而,其为0(即,不存在),或1至10,优选2至5。R3部分的序列的实例包括由0至10或2至5个甘氨酸残基组成的聚甘氨酸;其具体实例包括由Gly-Gly-Gly-Gly表示的序列。
R4部分的序列是包含由半胱氨酸-X(X:除赖氨酸和半胱氨酸之外的氨基酸残基)表示的2个氨基酸残基的序列;其实例包括Cys-Ala。在由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白中,只有R4序列部分具有唯一的半胱氨酸残基。因此,唯一的半胱氨酸残基的SH基团作为其侧链官能团可以被氰化,以将该残基转化为氰化半胱氨酸残基,之后通过使氰化半胱氨酸残基与固定化载体上的伯胺反应,以通过定向控制仅将由通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列的由R1-R2-R3表示的部分固定至固定化载体上。
R5部分的序列是不包含赖氨酸残基和半胱氨酸残基的任何序列,以及包含能够使得由通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的整个氨基酸序列的等电点在酸性侧的酸性氨基酸残基的序列。如本文所用的,“包含能够使得整个蛋白的等电点在酸性侧的酸性氨基酸残基的序列”是指包含足以能够使得整个蛋白的等电点在酸性侧的酸性氨基酸残基的类型和数目的序列。R5部分优选是富含天冬氨酸和谷氨酸的序列。蛋白的等电点依赖于构成的氨基酸残基的类型和数目。例如,富含碱性氨基酸诸如赖氨酸和精氨酸时需要天冬氨酸或谷氨酸的数目超过碱性氨基酸总数。本领域普通技术人员可以通过计算容易估计蛋白的等电点。富含天冬氨酸或谷氨酸的序列可以被设计,以使得由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白的等电点为4和5之间的值。R5部分的序列中氨基酸的数目不限;然而,其为0(即,不存在),或1至20,优选1至10,或0至20,优选0至10。其实例包括由2至10个天冬氨酸残基组成的聚天冬氨酸。当不包含R5部分的部分的等电点从开始就是酸性时,R5部分可不存在。
R6部分的序列是能够与特定化合物结合的任何亲和标签序列。R6部分的序列是用于纯化由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的合成蛋白的序列部分。R6部分的序列的实例包括能够与特定化合物结合的序列,即,亲和标签序列。当使用标签特异性的抗体纯化含有该标签的蛋白时,该标签有时被称为表位标签。亲和标签序列的实例包括由2至12、优选4或更多、更优选4至7、仍然更优选5或6个组氨酸残基组成的聚组氨酸序列;其具体实例包括His-His-His-His-His-His。在这种情况中,使用镍作为配体的镍螯合柱色谱法可被用来纯化上述多肽。纯化也可通过使用其上固定有聚组氨酸的抗体作为配体的柱的亲和色谱法进行。另外,由包含组氨酸的序列组成的HAT标签、HN标签等也可被使用。
由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的用于固定的蛋白的具体实例显示在SEQ ID NO:2中。
AD-1的序列(基于蛋白A的A-结构域序列,通过改造为R1-R2-R3-R4-R5-R6的形式制备的序列)(SEQ ID NO:2):
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly-Gly-Gly
Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
His-His-His-His-His-His
在SEQ ID NO:2所示的序列中,R1部分不存在;R2部分是不包含赖氨酸或半胱氨酸的蛋白A的A-结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:3);R3部分是由Gly-Gly-Gly-Gly表示的序列;R4部分是由Cys-Ala表示的序列;R5部分是由Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp表示的序列;以及R6部分是由His-His-His-His-His-His表示的序列。
AD-3、AD-4、AD-6-1和AD-6-2的R1部分、R3部分、R4部分、R5部分和R6部分与AD-1的那些相同。
根据如日本专利号3788828、2990271或3047020或日本专利公开(Kokai)号2003-344396 A、2008-115151 A、2008-115152 A、2008-115153 A或2008-266221 A等中描述的方法,可进行使用根据本发明的由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的用于固定的蛋白,待固定的蛋白至载体上的固定。
具体地,根据本发明的由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白的R4部分中的半胱氨酸残基被氰化生成氰化半胱氨酸残基,之后在弱碱性条件(pH 8至10)下,使含有氰化半胱氨酸的蛋白与具有由通式“NH2-Y”(其中Y表示任何固定化载体)表示的伯氨基基团作为官能团的固定化载体反应,以将R1-R2-R3部分固定至固定化载体上。结合至固定化载体的R1-R2-R3部分由R1-R2-R3-CO-NH-Y(其中Y具有上述含义)表示,并且R1-R2-R3部分在R2部分中的一个羧基末端与固定化载体结合。氰化反应可使用氰化试剂进行。氰化试剂可以是2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB)(参见Y.Degani,A.Ptchornik,Biochemistry,13,1-11(1974))、1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)等。
在日本专利公开(Kokai)号2003-344396 A中描述的方法中,由对应于根据本发明的通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的蛋白被吸附至固定化载体,之后氰化半胱氨酸残基,并且然后进行上述反应以将由通过R1-R2-R3表示的氨基酸序列组成的蛋白固定在固定化载体上。为了将蛋白吸附至固定化载体,该蛋白可在中性至弱碱性条件(pH 7至10)下与固定化载体反应。在弱碱性条件下,蛋白带负电荷,而固定化载体带正电荷;它们通过静电相互作用彼此吸附并结合。
本发明是其上吸附有由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白的固定化载体,并且包含氰化半胱氨酸残基之前的固定化载体以及其上通过氰化固定有由R1-R2-R3表示的部分的固定化载体。
在其中R1-R2-R3部分被固定的固定化蛋白中的固定化载体部分中存在许多未反应的伯胺,所述固定化蛋白通过使用根据本发明的由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白经由氰化半胱氨酸的固定化反应制备。当赖氨酸残基或半胱氨酸残基在固定的蛋白中存在时,可能的是剩余的活化的酰胺限制本发明的固定的蛋白的利用。然而,因为作为固定的蛋白部分的R1-R2-R3部分不包含赖氨酸残基和半胱氨酸残基,其上固定有蛋白的载体表面上剩余的伯胺可以用掩蔽剂处理而不改变蛋白部分的化学控制。掩蔽剂优选为乙酸酐、顺丁烯二酸酐等;然而,任何掩蔽剂都可被使用。
本发明还提供了固定的蛋白,其中通过上述方法获得的由不包含半胱氨酸残基和赖氨酸残基的氨基酸序列组成的蛋白通过酰胺(肽)键合经由接头序列与具有伯氨基基团的固定化载体牢固结合。
在本发明中,能够用于色谱法的载体可被用作用于固定的载体。然而,本发明所用的载体不包括具有整体结构的载体。在此,整体结构是具有从顶面(upper face)至底面(lower face)贯穿延伸的大孔的多孔体;该多孔体特征在于在大孔里面具有微孔;并且该多孔体具有1至100μm的大孔和0至100nm的微孔。该整体结构的实例包括含有硅的二氧化硅整体结构。该整体结构在日本专利公开(Kokoku)号8-029952 B、日本专利公开(Kokai)号07-041374 A和2010-127853 A等中被描述。
固定化载体包括可在其上固定蛋白的任何不溶性载体,诸如颗粒载体、膜状载体(film-form carrier)、纤维载体、全纤维状载体(holofiber-formcarrier)、板状或片状基板和磁珠。“固定化载体”包括“固定化基板”。具有此形状的形成载体的材料每一个都可以是向其表面引入用于介导蛋白(mediated protein)的定向控制固定的官能团的任何材料;各种各样的材料都可被使用,包括作为聚合物或共聚物的聚合物材料,典型的例子是聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚酯、或聚丙烯酸酯;天然材料,典型的例子是水凝胶、琼脂糖、葡聚糖、纤维素、壳聚糖等;无机材料,典型的例子是二氧化硅、玻璃、陶瓷等;以及另外的金属材料,典型的例子是金、氧化铝、银等。载体可以是市售可得的载体诸如Sepharose(R)、Sephadex(R)或Cellufine(R)。此外,微通道也可被用作载体。在此,微通道是指微芯片等,其中在流动通道单元或玻璃基板上形成微米级的高精密通道;蛋白可以被固定至通道中的玻璃上。
在此,具有引入的官能团的市售可得的固定化的载体的实例包括Amino-Cellulofine(由Seikagaku Corporation出售)、AF-AminoTOYOPEARL(由TOSOH出售)、EAH-Sepharose 4B和Lysine-Sepharose 4B(由Amersham Bioscience出售)、Porus 20NH(由Boeringer Mannheim出售)、POROS(由Life Technologies出售)、CNBr-activated Sepharose FF和NHS-activated Sepharose FF。本领域普通技术人员通过使用具有伯氨基基团的硅烷化合物(例如,3-氨基丙基甲氧基硅烷),可容易地将官能团诸如氨基基团引入二氧化硅载体、玻璃珠、玻璃平板等。
当在用于抗体纯化的亲和色谱法中使用时,根据本发明的包含蛋白A突变体的载体通过以呈颗粒形式的该载体填充色谱柱被使用。
可通过以下方法获得蛋白A突变体,所述蛋白A突变体具有在中性条件下与上述抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体解离的特性。
首先制备以下蛋白,在所述蛋白的每一个中,修饰为不包含赖氨酸或半胱氨酸的蛋白A(例如,由显示在SEQ ID NO:3中的氨基酸组成的蛋白A的A-结构域)中的一个氨基酸被另一个氨基酸取代。从这些蛋白中选出具有在中性条件下与抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体解离的特性的蛋白A突变体。如果有必要,制备以下蛋白,在所述蛋白的每一个中,选出的蛋白A突变体中的一个氨基酸被另一个氨基酸进一步取代,即,具有组合的多个氨基酸取代的突变体,并且从这些突变体中选出具有在中性条件下与抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体解离的特性的蛋白A突变体。这一操作可被重复数次以制备强烈提供上述特性的蛋白A突变体。最终,具有多个取代的氨基酸的蛋白A突变体可被获得作为具有在中性条件下与抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体解离的特性的蛋白A突变体。例如,当蛋白A的A-结构域被用作蛋白A时,可获得以下蛋白A突变体,在所述蛋白A突变体中,其中赖氨酸和半胱氨酸被其他氨基酸取代以不包含赖氨酸和半胱氨酸残基的突变体中的1、2或3个氨基酸被进一步取代。在这种情况下,来自包含赖氨酸和半胱氨酸的野生型氨基酸的6至9个氨基酸被取代。还可获得以下突变体,在所述突变体中,其中赖氨酸和半胱氨酸被其他氨基酸取代以使整个蛋白A不包含赖氨酸和半胱氨酸残基的突变体中的1至9个氨基酸被进一步取代。在这种情况下,来自包含赖氨酸和半胱氨酸的野生型氨基酸的7至15个氨基酸被取代。在这些氨基酸中,6个赖氨酸和半胱氨酸残基被其他氨基酸取代,并且剩余的1至9个氨基酸被取代以赋予在中性条件下与抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体解离的特性。其具体实例包括由通过AD-3、AD-4、AD-6-1和AD-6-2的氨基酸序列的每一个的R2部分表示的氨基酸序列组成的突变体。
蛋白A突变体在中性条件下与抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体解离的性质可例如通过以下方法被测试。
制备蛋白,其中蛋白A突变体的氨基酸序列被包含在由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的固定化蛋白中作为R2部分,并且通过上述利用氰化的方法将该蛋白用于将R1-R2-R3部分固定在阵列基板上。此处所用的阵列可以是日本专利号4528951、日本专利公开(Kokai)号2010-127856、日本专利号4006523等中描述的阵列。
把其上固定有突变体的阵列基板放入阵列分析装置中,并与装置中的溶液进给系统连接;阵列用280nm下的紫外光照射,同时使溶液自动经过其用于以下分析;并且用CCD随时间的推移对透射光拍照以捕获阵列的图像进入PC。初始缓冲溶液(150mM氯化钠、50mM磷酸钠,pH 7.0)、抗体溶液(其中人多克隆抗体用运行缓冲溶液稀释至0.2mg/ml的溶液)、用于洗涤的缓冲溶液(1M氯化钠、50mM磷酸钠,pH 7.0)、用于洗脱的缓冲溶液(0.1M柠檬酸钠,pH 5.0)和用于再生的缓冲溶液(0.1M甘氨酸,pH 2.5)以0.6ml/min的速度持续25分钟依次经过其,并以8秒的间隔随时间的推移对阵列图像拍照并捕获进入PC用于保存。在数据分析中,使用随装置提供的分析软件自动检测阵列图像中的点以计算点区域中像素的平均亮度和点周围像素的平均亮度,以确定它们之间比的对数作为该点的信号强度。该值被证实与该点上蛋白的量是成比例的。各点的信号强度针对从开始通过阵列基板起所经过的时间被制图。从信号强度针对经过的时间的图产生的曲线可被分析以评价突变体蛋白的特性。信号强度的时间进程可以被确定以定量分析其中抗体吸附和解离的状态。将洗脱期间信号强度的变化拟合为衰减曲线以确定直到一半量的结合的抗体解离时的经过的时间(T0.5),以计算其与上述邻近该阵列的AD-1中蛋白A的A-结构域的T0.5的比,以确定标准的T0.5,以评价该值作为酸洗脱特性的指示或易被酸洗脱的指示。较低的T0.5可被确定作为指示更好的酸洗脱特性,即,在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体更好的解离特性。除T0.5之外,抗体的解离常数(Kd)也可被用作一个指示。
解离常数可通过例如使用Biacore(Biacore Co.,Ltd.)作为表面等离子共振生物传感器、通过进行蛋白A突变体和抗体之间的结合表征来测定。在这种情况下,其中蛋白A突变体的氨基酸序列被包含在由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的固定的蛋白中作为R2部分的蛋白可被使用以使R1-R2-R3部分与载体结合以使用蛋白固定的载体。观察到的表面等离子共振传感器表面质量随时间的变化可使用RU(由Biacore定义的单位)测定,以确定结合速率常数(kass)、解离速率常数(kdis)和解离常数(Kd=kass/kdis)。具有较小解离常数的蛋白A突变体可被确定为能够在中性条件下与抗体更强烈结合的突变体。
通过上述方法确定的T0.5和解离常数被绘制在如图1所示的坐标平面上,并且T0.5和解离常数在恒定值范围的,即,被绘制在坐标中的特定范围的蛋白A的A-结构域的突变体可被选出作为在以下方面出色的突变体:在中性条件下与抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体解离的特性。
例如,对其上固定有使用由上述SEQ ID NO:2表示的AD-1制备的蛋白A的A-结构域的载体进行相同分析,且其中T0.5小于通过使用AD-1中蛋白A的A-结构域测定获得的T0.5,且解离常数小于通过使用AD-1中蛋白A的A-结构域测定获得的解离常数的蛋白A可被选出作为根据本发明的在以下方面出色的突变体:在中性条件下与抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体解离的特性。根据本发明的在以下方面出色的突变体:在中性条件下与抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体解离的特性,具有(当使用以上阵列测定时)1.00或更小、优选0.80或更小、更优选0.60或更小、尤其优选0.55或更小的T0.5,和(使用上述Biacore测定的)6×10-9或更小、优选8×10-9或更小、更优选10-10或更小的解离常数。
根据本发明的其上固定有由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白的固定化载体可被使用以提供其中由R1-R2-R3表示的部分被固定的固定的蛋白。其上固定有由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白的固定化载体,可通过将由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白吸附至固定化载体上制备。将蛋白吸附至固定化载体可通过如以上描述的在中性至弱碱性条件下(pH 7至10)使蛋白与固定化载体反应来进行。如上所述,在其上固定有由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白的固定化载体中,蛋白的R3部分中包含的半胱氨酸残基可被氰化,以产生其上固定有由通过通式:R1-R2-R3表示的氨基酸序列组成的蛋白的固定化载体。本发明还包括其上固定有由通过通式:R1-R2-R3表示的氨基酸序列组成的蛋白的固定化载体。
抗体可通过使用其上固定有由通过R1-R2-R3表示的氨基酸序列组成的蛋白的固定化载体的亲和色谱法被纯化。用于亲和色谱法的亲和色谱柱可通过以其上固定有由通过R1-R2-R3表示的氨基酸序列组成的蛋白的固定化载体填充柱来制备。柱可通过公知的方法用载体填充。本发明还包括用于抗体纯化的包含其上固定有由通过R1-R2-R3表示的氨基酸序列组成的蛋白的固定化载体的亲和色谱柱。
使用本发明的亲和色谱柱的抗体纯化可通过公知的亲和色谱法进行;其特征在于在温和pH条件下,与蛋白A突变体结合的抗体可从抗体被洗脱。在抗体纯化中,含有待纯化的抗体的溶液(原材料粗溶液)首先经过以其上固定有由通过R1-R2-R3表示的氨基酸序列组成的蛋白的固定化载体填充的亲和色谱柱,以使抗体吸附至载体上的蛋白A突变体。在这种情况下,原材料粗溶液预先被调整为pH 6.0至8.5。用于pH调整的缓冲溶液不限;然而,例如,磷酸钠、磷酸钾、HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)或MES(2-吗啉乙磺酸)可被使用。亲和色谱柱优选预先使用pH 6.0至8.5的上述缓冲溶液平衡。之后,将抗体吸附至其的载体用中性缓冲溶液诸如磷酸钠缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液洗涤以去除杂质。其后,结合的抗体可使用pH 4.0至5.5的缓冲溶液洗脱用于回收。pH 4.0至5.5的缓冲溶液可以是乙酸钠缓冲溶液、柠檬酸钠缓冲溶液、磷酸钠缓冲溶液、MES(2-吗啉乙磺酸)等。使用的缓冲溶液的浓度不限;然而,可使用10至50mM浓度的溶液。取决于用作样品的含有抗体的原材料粗溶液的体积,柱的尺寸可以为,例如,2.5至30cm的长度。
实施例
以下将参照实施例对本发明进行描述。然而,本发明不限于这些实施例。
在以下实施例中,通常使用以下实验方法。
(实施例1)
基因合成
实施例中描述的基因由合成基因的合约制造商合成。dsDNA基于以下显示的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)被合成,并被插入pUC18载体的BamHI-EcoRI位点;得到的克隆的序列通过单链分析被证实,并进行核苷酸序列的信息的交叉核对;通过诸如定点诱变的方法对鉴定为错配的位点进行突变校正;并且交付产生的获得的质粒DNA(约1μg)。交付的质粒的期望部分通过测序再次证实其序列。
SEQ ID NO:8的核苷酸序列
GGATCCTTGACAATATCTTAACTATCTGTTATAATATATTGACCAGGTTAACTAACTAAGCAGCAAAAGGAGGAACGACTATGGCGGATAACAACTTTAACCGCGAACAGCAGAACGCGTTTTATGAAATTCTGAACATGCCGAACCTGAACGAAGAACAGCGCAACGGCTTTATTCAGAGCCTGCGCGATGATCCGAGCCAGAGCGCGAATCTGCTGAGCGAAGCGCGTCGTCTGAATGAAAGCCAGGCGCCGGGCTGTGCGGATGACGACGACGATGATCACCACCATCACCATCATTAAGAATTC
单个氨基酸取代突变体的制备
使用各自具有24个核苷酸的原始序列的DNA引物及其互补DNA引物,通过将编码待取代的位点的氨基酸的DNA序列转化为期望的密码子序列并遵照QuickChang方法(在来自Stratagene Co.,Ltd.的QuickChangSite-directed Mutagenesis试剂盒中描述的方法),进行基于AD-1(其氨基酸序列在SEQ ID NO:2中显示)的蛋白A的A-结构域中的氨基酸取代。
蛋白纯化
将以重组质粒转化的大肠杆菌菌株JM109在35℃下2L培养基(含有20g氯化钠、20g酵母提取物、32g胰蛋白酶和100mg氨苄青霉素钠)中过夜培养。其后,使培养物溶液经受20分钟的低速离心(以5,000rpm),以提供3至5g按湿重计的细菌细胞。将这些细菌细胞悬浮在20mL 10mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)中,并且使用弗氏按压装置(French press apparatus)将细胞压碎,随后高速离心(以20,000rpm)20分钟,以分离上清液。向所得上清液加入硫酸链霉素至终浓度为2%,并搅拌20分钟,然后使其经受20分钟的高速离心(20,000rpm),以分离上清液。之后,将所得物用硫酸铵处理;将上清液应用于镍螯合柱(购自GE Healthcare BioscienceCorporation);将柱以20ml或更多的用于洗涤的缓冲溶液(5mM咪唑、20mM磷酸钠、0.5M氯化钠,pH 7.4)充分洗涤;并且在洗涤后,应用20ml用于洗脱的缓冲溶液(0.5M咪唑、20mM磷酸钠、0.5M氯化钠,pH 7.4)以洗脱期望的蛋白。其后,为了从蛋白溶液去除咪唑,将其对5L的10mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)透析。MWCO3500(购自Spectrum Laboratories Co.,Ltd.)被用作透析膜。透析之后,使用离心真空干燥器干燥期望的蛋白。
人IgG抗体分子的结合表征
根据由Biacore Co.,Ltd提供的操作方案,使用Biacore(Biacore Co.,Ltd.)作为表面等离子共振生物传感器,进行期望蛋白的结合表征。
作为运行缓冲溶液,具有10mM HEPES(pH 7.4)、150mM氯化钠、5μM EDTA和0.005%表面活性剂P20的组成(Biacore Co.,Ltd.)并预先脱气的溶液被使用。
SensorChip NTA(Biacore Co.,Ltd.)被用作传感器芯片。使用运行缓冲溶液将传感器芯片充分平衡,随后注入5mM氯化镍溶液以完成镍离子配位。之后,将重组蛋白溶液(在运行缓冲液中具有100μg/mL的浓度)注入传感器芯片以固定重组蛋白。
对于固定的重组蛋白和人IgG之间的结合反应,相继注入使用运行缓冲溶液稀释/制备为0.25至20μg/ml的7个浓度的人IgG(Sigma-Aldrich,Inc.)溶液,并且随后替换为运行缓冲溶液以维持进给,以定量观察抗体的结合/解离现象。进给流速被设置为20μL/min.;观察结合的时间(抗体溶液注入时间)为4分钟;并且观察解离的时间为4分钟。各浓度的抗体溶液各自被注入以观察结合/解离现象,随后接着注入6M盐酸胍溶液持续3分钟以解离所有与固定的重组蛋白结合的人IgG,该固定的重组蛋白随后使用运行缓冲溶液被再生,并用于后续测定。
使用RU(由Biacore定义的单位)测定表面等离子共振传感器表面的质量随时间的观察变化,以确定结合速率常数(kass)、解离速率常数(kdis)和解离常数(Kd=kass/kdis)。
针对洗脱参数(T0.5)的值绘制解离常数的结果显示在图1中,所述解离常数指示通过Biacore测定的AD-1中蛋白A的A-结构域的详尽的单个氨基酸取代突变体与抗体的结合强度,所述洗脱参数(T0.5)的值由通过使用阵列分析装置的测定获得的pH 5.0下的洗脱确定。
使用阵列分析装置分析抗体的酸洗脱特性
使用阵列分析装置的测定如下进行。
蛋白在阵列基板上的固定
将各突变体蛋白溶解于10mM pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液,通过使用BCA方法测定其浓度,将其调整为2mg/ml的终浓度。将0.2μL的约2mg/ml的各蛋白溶液以1.2mm的间隔点样在阵列基板(二氧化硅整体多孔材料的薄层)上8×12矩阵上的96个点处。在这一方面,相同的突变体蛋白被点样在一个阵列上的2个点处,以确保数据的重复性的证实。AD-1蛋白被点样在每行的2个点处作为用于比较的蛋白,以确保各突变体蛋白的数据和AD-1蛋白的数据之间的比较。点样后,对各蛋白相继进行还原反应、氰化反应、通过氰化半胱氨酸的定向控制的固定化反应、用具有高盐浓度的缓冲溶液的洗涤以及掩蔽剩余氨基基团的反应,以将蛋白固定至阵列基板上。
测定
将突变体被点样固定(spot-immobilized)在其上的阵列基板放入阵列分析装置,并与装置中的溶液进给系统连接;阵列用280nm下的紫外光照射,同时使溶液自动经过其用于如以下描述的分析;并且用CCD随时间的推移对透射光拍照以捕获阵列的图像进入PC。初始缓冲溶液(150mM氯化钠、50mM磷酸钠,pH 7.0)、抗体溶液(其中人多克隆抗体用运行缓冲溶液稀释至0.2mg/ml的溶液)、用于洗涤的缓冲溶液(1M氯化钠、50mM磷酸钠,pH 7.0)、用于洗脱的缓冲溶液(0.1M柠檬酸钠,pH 5.0)和用于再生的缓冲溶液(0.1M甘氨酸,pH 2.5)以0.6ml/min的速度持续25分钟依次经过其,并以8秒的间隔随时间的推移对阵列图像拍照并捕获进入PC用于保存。
数据分析
在数据分析中,使用随装置提供的分析软件自动检测阵列图像中的点以计算点区域中像素的平均亮度和点周围像素的平均亮度,以确定它们之间比的对数作为该点的信号强度。该值被证实与该点上蛋白的量是成比例的。各点的信号强度针对从开始通过阵列基板起所经过的时间被制图。从信号强度针对经过的时间的图产生的曲线可被分析以评价突变体蛋白的特性。信号强度的时间进程可以被确定以定量分析其中抗体吸附和解离的状态。
作为分析的结果,发现当用于洗脱的缓冲溶液经过时,抗体的解离速度,即,抗体的酸洗脱特性取决于突变体蛋白的类型变化很大。因此,针对洗脱期间信号强度的变化拟合衰减曲线以确定直到一半量的吸附的抗体解离时所经过的时间(T0.5),以计算其与上述邻近该阵列的AD-1中的蛋白A的A-结构域的T0.5的比,以确定标准化的T0.5,以使用该值作为酸洗脱特性的指示或易于被酸洗脱的指示。
然后,基于酸洗脱特性和通过在上述“人IgG抗体分子的结合表征”中描述的方法确定的解离常数(Kd)两种指示作为指示,试图选出突变体蛋白。结果,可选出多个突变体蛋白,其与AD-1中的蛋白A的A-结构域相比,具有高结合亲和力(低Kd值)并且易于经受酸洗脱(具有低T0.5值)。更易于经受酸洗脱的突变体蛋白可通过以下发现:制备其中突变被组合的各突变体蛋白并针对其制备阵列以测定/分析抗体的酸洗脱特性。
显示在SEQ ID NO:1中的其中第15位的E(谷氨酸)被H(组氨酸)取代(E15H)的氨基酸序列,具有良好的酸洗脱特性。
(实施例2)
基于实施例1的结果,将其他单个氨基酸取代突变进一步添加至E15H突变。作为添加的突变,检查了在位点M19(在SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列中第19位的甲硫氨酸)和G29(在SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列中第29位的甘氨酸)处的取代突变。这是因为M19是唯一存在于AD-1的甲硫氨酸残基并对空气氧化敏感,并且该位点的氨基酸取代被预期增加作为化学性质的抗氧化性能。位点G29是如以下位点之一所示的位点:作为阵列分析的结果,其突变被预期改善在pH 5.0下的洗脱特性。对于位点M19,选择M19V(在第19位用V(缬氨酸)取代甲硫氨酸)作为突变,其中作为在pH 5时易于洗脱的参数的T0.5被改善,以及对于位点G29,选择G29 A(在第29位用A(丙氨酸)取代甘氨酸)、G29D(在第29位用D(天冬氨酸)取代甘氨酸)、和G29E(在第29位用E(谷氨酸)取代G)。结果显示在表1中。
[表1]
残基号 | 名称 | Kd(hIgG) | Kon | Koff | T0.5(pH 5.0) |
15 | E15H | 1.11E-11 | 6.05E+04 | 6.70E-07 | 0.46 |
19 | M19V | 1.17E-08 | 4.69E+04 | 5.50E-04 | 0.53 |
29 | G29A | 2.92E-09 | 2.44E+05 | 7.12E-04 | 0.49 |
G29D | 4.49E-09 | 1.12E+05 | 5.03E-04 | 0.38 | |
G29E | 2.87E-09 | 2.10E+05 | 6.03E-04 | 0.40 |
根据上述方法,针对E15H+G29A(AD-3中的R2部分)、E15H+M19+G29A(AD-4中的R2部分)、E15H+M19+G29D(AD-6-2中的R2部分)和E15H+M19+G29E(AD-6-1中的R2部分)作为组合突变的4种组合突变,其中上述突变在每一个组合突变中被组合,进行表达基因的制备、在大肠杆菌中表达、以及分离并纯化来自大肠杆菌的表达的重组蛋白,以制备约1g的各蛋白的各纯化产物。使用各制备的蛋白,制备由通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的蛋白。R2部分是蛋白A的上述突变体的每一个;R1不存在;R3是由Gly-Gly-Gly-Gly表示的序列;R4是由Cys-Ala表示的序列;R5是由Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp表示的序列;以及R6是由His-His-His-His-His-His表示的序列。根据如在日本专利号3788828或2990271或日本专利公开(Kokai)号2003-344396 A、2008-115151 A、2008-115152 A、2008-115153 A或2008-266221 A等中描述的方法,R4部分中的半胱氨酸被氰化以生成氰化半胱氨酸,且R1-R2-R3部分(事实上,R2-R3部分)被固定在载体上,以制备将配体引入其中的各亲和载体。其制备方法显示在以下“重组蛋白的固定化”中。上述的“将配体引入其中的亲和载体”与以下“蛋白固定的硅胶”相同。使用约1ml的各亲和载体制备分离柱。用各制备的分离柱进行使用多克隆抗体的色谱分析,并且改变洗脱期间的pH以测定抗体洗脱/回收量的pH依赖性。
通过如以下描述的方法进行使用固定化载体的色谱分析。
来自GE Healthcare Co.,Ltd.的Akta被用作液相色谱装置。
以其上固定有配体的载体(蛋白固定的硅胶)填充柱(1ml)(尺寸:φ=5mm、高度=50mm),并将柱与液相色谱装置附接。
首先,(1)(初始化)使10ml的10mM磷酸钠缓冲液通过;
(2)(样品应用)然后,通过使用样品环,使多克隆IgG抗体溶液(1ml)通过,并切换溶剂切换阀;
(3)(洗涤)使10ml的10mM磷酸钠缓冲液通过,并且之后切换溶剂切换阀;
(4)(洗脱)使10ml具有预先设定的各pH的柠檬酸盐缓冲液通过,并切换溶剂切换阀;
(5)(再生)使10ml用于再生的溶液(0.1M柠檬酸溶液)通过,并切换溶剂切换阀;以及
(6)(完成)使10ml(1)中的10mM磷酸钠缓冲液通过以完成色谱分析中的通过操作(operation of passage)。
通过期间,通过使用装置中包括的UV检测器和电导仪,测定从柱洗脱的溶液在280nm的吸光度和电导率,并且记录所得值。从使用280nm下吸光度的色谱曲线鉴定洗脱峰,并计算其峰面积;并通过计算确定应用的抗体被回收的如何。
结果显示在图2中。图2的A显示AD-2中R2部分的结果;B,AD-3中R2部分的结果;C,AD-4中R2部分的结果;D,AD-5中R2部分的结果;E,AD-6-1中R2部分的结果;以及F,AD-6-2中R2部分的结果。
使用固定化载体的亲和色谱分析的色谱图显示在图3中。
图3的A、B和C分别显示了在pH 3.0、4.0和4.5时的色谱图。在图3中,(1)显示了当pH 3.0、4.0或4.5的洗脱溶液流过时的洗脱峰,以及(2)显示了当用于再生的溶液(pH 2.5)流过时的洗脱峰。(1)和(2)洗脱峰的面积(分别称为S1和S2)被用于通过100*S1/(s1+S2)计算回收率,以及图2是一系列图,在各图中,所得值针对洗脱溶液的pH被制图。
重组蛋白的固定
在回流条件下(95℃)的水介质中,将50g硅胶(来自Daiso Co.,Ltd.)与10g 3-环氧丙氧基丙基三甲氧基甲硅烷持续4小时反应,以制备50g环氧化的硅胶。
将依照上述获得的环氧化的硅胶悬浮在0.1M硼酸盐缓冲液(pH 9.5)中,之后向其中加入5g聚-L-赖氨酸(来自Sigma的P6516),随后在室温下搅拌持续24小时。然后,向其中加入500ml的5mM 2-硝基-5-硫氰基苯甲酸盐溶液和2g的重组蛋白(AD-3、AD-4、AD-6-1或AD-6-2)并搅拌持续24小时,并且随后将缓冲液用10mM硼酸盐缓冲液(pH 9.5)替换,接着再次搅拌持续24小时以最终制备47g其上固定有各重组蛋白的硅胶。固定化载体的IgG结合容量的测定
以上制备的固定化硅胶的IgG结合容量被如下测定。
以其上固定有AD-3中蛋白A的A-结构域的载体填充玻璃柱(5mmφ×20mm)(0.4ml,来自GE Healthcare Co.,Ltd.)。将已知浓度的溶解于pH 7磷酸钠缓冲液的人多克隆IgG抗体(0.5mg/ml,来自Oriental Yeast Co.,Ltd.),在不同接触时间(1.0、2.4和6.0min.)下上样。从此处的穿透曲线(breakthrough curve)计算10%穿透点,由此获得各接触时间的以下的动态结合容量(DBC)。通过该表,静态结合容量可被估算为约60mg/ml。结果显示在表2中。
[表2]
接触时间(min) | 1.0 | 2.4 | 6.0 |
10%动态结合容量(mg/ml) | 45 | 62 | 62 |
以相似的方式,测定AD-4、AD-6-1和AD-6-2各蛋白中蛋白A的A-结构域的结合容量,并且获得了以下结果。结果显示在表3中。
[表3]
工业适用性
本发明涉及的技术领域包括宽范围的技术领域,其中包括固定的抗体,例如,使用抗体柱和抗体阵列以及固定的抗体的测试技术诸如成分测试和临床测试的领域,以及利用抗体柱的分离和纯化领域。
序列表独立文本
SEQ ID NO:1至8 合成
本申请中引用的所有出版物、专利和专利申请预期通过引用以其整体并入本文。
Claims (21)
1.一种固定化载体,所述固定化载体不包括具有整体结构的固定化载体,蛋白通过静电相互作用吸附在所述固定化载体上,所述蛋白由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成,其中由R1-R2-R3表示的部分被用于固定在所述固定化载体上,其中:
所述序列表示从氨基末端侧到羧基末端侧的序列;
R1部分的序列可不存在,且如果存在,是包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的序列;
R2部分的序列是作为待被固定的蛋白的蛋白A突变体的序列或其中蛋白A突变体的序列的1至3个单位被连接在一起的序列,以及是不包含赖氨酸或半胱氨酸残基的序列,所述蛋白A突变体具有在中性条件下与抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的所述抗体解离的特性;
R3部分的序列可不存在,且如果存在,是包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的间隔序列;
R4部分的序列是包含由半胱氨酸-X表示的2个氨基酸残基的序列,其中X表示丙氨酸或除丙氨酸和半胱氨酸之外的氨基酸残基;
R5部分的序列可不存在,且如果存在,是不包含赖氨酸和半胱氨酸残基的序列,以及是包含能够使得由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的整个蛋白的等电点在酸性侧的酸性氨基酸残基的序列;且
R6部分的序列是用于蛋白纯化的亲和标签序列。
2.根据权利要求1所述的固定化载体,其中所述蛋白A突变体是以下蛋白A突变体:当抗体与固定在阵列基板上的所述蛋白A突变体结合并用pH 5.0的0.1M的柠檬酸钠溶液洗脱时,其直到一半量的结合的所述抗体解离时经过的时间(T0.5)和其与所述抗体的解离常数,与由SEQ ID NO:3表示的蛋白A突变体的T0.5和解离常数相比是减小的。
3.根据权利要求1或2所述的固定化载体,其中所述蛋白A突变体是由其中在源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的氨基酸序列中1至3个氨基酸残基被取代的氨基酸序列组成的突变体。
4.根据权利要求1至3任一项所述的固定化载体,其中所述蛋白A突变体是蛋白A的A-结构域的突变体。
5.根据权利要求1至4任一项所述的固定化载体,其中所述R2部分的序列是由SEQ ID NO:4至7的任何序列组成的蛋白A的A-结构域的突变体蛋白的序列,或其中由SEQ ID NO:4至7的任何序列组成的蛋白A的A-结构域的突变体蛋白的序列的1至3个单位被连接在一起的序列。
6.根据权利要求1至5任一项所述的固定化载体,用于将存在于由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白中唯一的半胱氨酸残基的巯基基团转化为硫氰酸基基团,并使所得物作用于具有伯胺作为官能团的任何固定化载体,用于使R1-R2-R3部分通过酰胺键合与所述载体结合,所述R1-R2-R3部分是所述蛋白的半胱氨酸残基的氨基末端侧存在的氨基酸序列部分。
7.根据权利要求1至6任一项所述的固定化载体,其中由通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列中所述R3部分的序列是由1至10个甘氨酸残基组成的序列。
8.根据权利要求1至7任一项所述的固定化载体,其中由通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列中所述R5部分的序列是由天冬氨酸和/或谷氨酸的氨基酸残基组成的1至10个氨基酸残基的序列。
9.根据权利要求8所述的固定化载体,其中由通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列中所述R5部分的序列是由1至10个天冬氨酸残基组成的序列。
10.根据权利要求1至9任一项所述的固定化载体,其中由通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列中所述R6部分的序列是由4个或更多个组氨酸残基组成的序列。
11.根据权利要求1至10任一项所述的固定化载体,其中所述载体选自由以下组成的组:二氧化硅载体、玻璃珠和聚合物。
12.一种用于制备根据权利要求1至11任一项所述的固定化载体的方法,包括通过静电相互作用将由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白吸附至载体。
13.一种固定化载体,其上固定有蛋白A突变体,所述固定化载体通过以下制备:将根据权利要求1至11任一项的由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白中存在的唯一半胱氨酸残基的巯基基团转化为硫氰酸基基团,并使所得物作用于具有伯胺作为官能团的任何固定化载体,用于使R1-R2-R3部分作为所述蛋白的半胱氨酸残基的氨基末端侧存在的氨基酸序列部分通过酰胺键合与所述载体结合。
14.一种用于制备根据权利要求12所述的固定化载体的方法,包括将根据权利要求1至11任一项的由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白中存在的唯一半胱氨酸残基的巯基基团转化为硫氰酸基基团,并使所得物作用于具有伯胺作为官能团的任何固定化载体,用于使R1-R2-R3部分作为所述蛋白的半胱氨酸残基的氨基末端侧存在的氨基酸序列部分通过酰胺键合与所述载体结合。
15.一种用于抗体纯化的亲和色谱柱,所述亲和色谱柱以根据权利要求13所述的固定化载体填充。
16.一种用于纯化抗体的方法,包括将包含抗体的溶液应用至根据权利要求15所述的用于抗体纯化的亲和色谱柱,以使所述抗体与所述蛋白A突变体结合,并且然后使用洗脱缓冲溶液解离并洗脱所述抗体。
17.一种用于设计由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的蛋白的方法,所述蛋白用于将由通过R1-R2-R3表示的氨基酸序列组成的蛋白固定至固定化载体上,所述方法包括选择R1、R2、R3、R4、R5和R6部分的氨基酸序列以符合以下条件:
(a)允许所述R1部分的序列不存在,或如果允许其存在,选择包括除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的序列;
(b)作为所述R2部分的序列,选择蛋白A突变体的序列或其中蛋白A突变体的序列的1至3个单位被连接在一起的序列,以及是不包含赖氨酸或半胱氨酸残基的序列,所述蛋白A突变体具有在中性条件下与抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的所述抗体解离的特性;
(c)允许所述R3部分的序列不存在,或如果允许其存在,选择包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的间隔序列;
(d)作为所述R4部分的序列,选择包含由半胱氨酸-X(其中X表示丙氨酸或除半胱氨酸之外的氨基酸残基)表示的2个氨基酸残基的序列;
(e)允许所述R5部分的序列不存在,或如果允许其存在,选择不包含赖氨酸或半胱氨酸残基的序列,其中所述序列包含能够使得由通过通式:R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的整个蛋白的等电点在酸性侧的酸性氨基酸残基;以及
(f)作为所述R6部分的序列,选择用于纯化蛋白的亲和标签序列。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述蛋白A突变体是以下蛋白A突变体:当抗体与固定在阵列基板上的所述蛋白A突变体结合并用pH5.0的0.1M柠檬酸钠溶液洗脱时,其直到一半量的结合的所述抗体解离时经过的时间(T0.5)以及其与所述抗体的解离常数,与由SEQ ID NO:3表示的蛋白A突变体的T0.5和解离常数相比是减小的。
19.根据权利要求17或18所述的方法,其中所述蛋白A突变体是由其中在源自金黄色葡萄球菌的蛋白A的氨基酸序列中1至3个氨基酸残基被取代的氨基酸序列组成的突变体。
20.根据权利要求17至19任一项所述的方法,其中所述蛋白A突变体是蛋白A的A-结构域的突变体。
21.根据权利要求17至20任一项所述的方法,其中所述R2部分的序列是由SEQ ID NO:4至7的任何序列组成的蛋白A的A-结构域的突变体蛋白的序列,或由其中SEQ ID NO:4至7的任何序列的1至3个单位被连接在一起的序列组成的蛋白A的A-结构域的突变体蛋白的序列。
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