CN102216319A - 使用包含特异性配体的亲和树脂的抗体纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于抗体，例如单克隆抗体的新的纯化方法。所述方法利用包含在其上固定有一个或多个低分子量合成配体的固相材料的亲和树脂。所述亲和树脂能够从非常密切相关的蛋白质中分离出抗体。

Description

使用包含特异性配体的亲和树脂的抗体纯化方法

发明领域

本发明涉及用于抗体，例如单克隆抗体的新的纯化方法。所述方法利用包含在其上固定有一个或多个低分子量合成配体的固相材料的亲和树脂。所述亲和树脂能够从非常密切相关的蛋白质中分离出抗体。

发明背景

近年来，单克隆抗体(mAb)已经成为许多大型生物技术公司的主要焦点。将mAb作为生物药物进行测试，用于治疗各种疾病，尤其是免疫和自身免疫性疾病以及癌症。因为未来市场上mAb药物数量预期有极大地增加，因此对降低生产成本的需要也随之增加。在目前的生产中，mAb生产的纯化步骤占生产成本的大约70％。

目前可通过各种方法从发酵上清液中纯化抗体，所述方法例如常规色谱、具有蛋白质配体或小分子配体的亲和色谱。

涉及多步骤的常规色谱有以下一个或多个缺陷：总收率低、缓冲液消耗高、工艺时间长和工艺设备投资大、人工成本增加。

具有蛋白质配体的亲和树脂导致收率较高、缓冲液消耗较低和工艺设备投资较低。然而，与小合成配体相比，具有蛋白质配体的亲和树脂的生产成本非常昂贵而且化学和构象稳定性较差，并且具有纯化抗体被来自蛋白质配体的蛋白质片段或来自具有蛋白质配体的亲和树脂的生产中的其它生物材料污染的危险。

US 6,117,996公开了具有以下通式的包含配体的亲和配体-基质缀合物：

所述配体连接在支持基质的位置(A)上，任选通过插入基质与配体之间的间隔臂。也公开了使用这类亲和配体-基质缀合物，来纯化蛋白质材料例如胰岛素、因子VII、人生长激素或类似物、抗体例如免疫球蛋白、其衍生物和片段以及前体的方法。

US 6,498,236公开了具有以下通式的亲和配体用于免疫球蛋白的纯化：

(H₂N-X₁-Thr-X₂-CO)n-R。

WO 2006/066598公开了包含一个或多个疏水性官能团和一个或多个阳离子官能团的亲和配体用于单克隆抗体的纯化。

US 6,207,807公开了用于纯化免疫球蛋白的三肽亲和配体。从组合文库扫描中鉴定了四聚体三肽(Arg-Thr-Tyr)₄(参考：Fassina等.JOURNAL OF MOLECULAR RECOGNITION，VOL.9，564-569(1996))，所得到的亲和树脂用于从血清中分离免疫球蛋白。为了改善稳定性，制备了多聚体三肽的所有D-氨基酸形式并用于单克隆抗体的纯化(参考：Fassina等，Journal of Immunological Methods 333(2008)126-138)。

D’Agostino等[(2008)；Affinity purification of IgG monoclonal antibodies using the D-PAM synthetic ligand：Chromatographic comparison with protein A and thermodynamic investigation of the D-PAM/IgG interaction(用D-PAM合成配体亲和纯化IgG单克隆抗体：与蛋白A的色谱对比和热动力学考察D-PAM/IgG相互作用).Journal of Immunological Methods，第333卷，第1-2期，第126-138页]仅描述了多聚体分子用于抗体的纯化。其中结合种类(例如线形三肽Arg-Thr-Tyr)与三赖氨酸支架偶联，以产生对抗体具有增加的亲合力的多价配体。然而，三赖氨酸核心支架不与抗体相互作用。

的确，涵盖小分子亲和树脂的现有技术是克服了蛋白质配体亲和树脂的部分缺陷。然而，仍然需要用于抗体纯化的新方法和材料，尤其是需要比现有技术公开的那些更便宜、基质更稳定(more base stable)和更具选择性的亲和树脂。此外，需要能允许不影响靶蛋白活性的温和洗脱条件的树脂。

发明概述

本发明涉及提供亲和树脂，所述树脂包含对抗体、尤其是单克隆抗体具有选择性的新的合成亲和配体，并且不以蛋白质配体为基础，同时又是便宜和基质稳定的。

附图简述

图1.三聚配体(A)和四聚配体(B)的通用结构的示意图。

图2.在最初的两个主成分中的229,957个虚拟配体结构的主成分图。数据点按照支架而着色，黑方块是用于文库设计的28个先前已鉴定的结合物(WO 2006/066598)。

图3.在用于图2的同样的两个主成分中绘制的所有文库成员。可以看到770个所选配体结构跨越了全部虚拟文库所跨越的化学空间的主要部分。

图4.679个已鉴定配体的平均荧光值。可以看到某些配体的荧光值明显超出背景噪声水平。

图5.平均荧光值超过40的所有配体的图。各点按照荧光水平着色：绿色：40-70，黄色：70-100，红色：100-200，蓝色：＞200。高亲和配体都集中在较小的省略符号(smaller ellipsis)所指示的化学空间的区域。

图6.5个支架的频率(A)，命中(hit)的14个结构单元1的频率(B)，11个结构单元2的频率(C)。

图7.人IgG4的亲和纯化色谱图。

图8.凝胶分析：分子量标准(从右边开始的第1道)、IgG4参考(2)、收获物(3)、流通液(4)、洗涤液(5)、洗脱液(6)。

图9.柱洗脱液的分析型HPLC色谱图。

发明详述

本发明涉及包括使用亲和配体和亲和树脂的抗体纯化方法，其中所述配体是抗体的特异性结合配偶体并因此可用于抗体纯化。

更具体地讲，本发明涉及提供亲和树脂，所述树脂包含对抗体、尤其是单克隆抗体具有选择性的新的合成亲和配体，并且不以蛋白质配体为基础，同时又是便宜和基质稳定的。

所述亲和树脂是在其上共价固定有对目标抗体具有高度特异性的配体的固相材料(进一步参见以下)。

因此，本发明的一个实施方案提供用于抗体纯化的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在促进所述抗体的一部分与亲和树脂结合的条件下，使含有所述抗体的溶液或悬液与所述亲和树脂接触；

(b)任选用洗涤缓冲液洗涤含有结合抗体的所述亲和树脂；和

(c)用洗脱缓冲液洗脱含有结合抗体的所述亲和树脂，并收集作为洗脱物的纯化抗体。

在本发明的一个实施方案中，所述亲和树脂是在其上共价固定有一个或多个以下通式(I)的配体的固相材料：

其中

i＝1，2，...，m，

j＝1，2，...，n；

n和m独立地为范围在0-3的整数，前提条件是n+m之和在1-4的范围之内；

p、q和r独立地为范围在0-6的整数；

A11，...，A1m和A21，...，A2n独立选自α-氨基酸部分、β-氨基酸部分、α-氨基磺酸部分和β-氨基磺酸部分；

Z1和Z2独立选自氢、C_1-6烷基、羧酸部分(Z-C(＝O)-)和磺酸部分(Z-S(＝O)₂-)，其中Z选自氢、任选取代的C_1-12-烷基、任选取代的C_3-12-环烷基、任选取代的C_1-12-烯基、任选取代的C_1-12-炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂环基；

R1和R2独立选自氢和C_1-6-烷基；

X是用于将所述配体与所述固相材料连接的基团，无论是直接连接还是通过接头连接，X选自羧酸(-COOH)、羧酸酯(-COOR)、羧酸酐(-COOCOR)、羧酸酰卤(-COHal)、磺酸(-S(＝O)₂OH)、磺酰氯(-S(＝O)₂Cl)、巯基(-SH)、二硫化物(-S-S-R)、羟基(-OH)、醛(C(＝O)H)、环氧化物(-CH(O)CH₂)、氰化物(-CN)、卤素(-Hal)、伯胺(-NH₂)、仲胺(-NHR)、酰肼(-NH＝NH₂)和叠氮化物(-N₃)，其中R选自任选取代的C_1-12-烷基，Hal为卤素；和

所述配体(不包括“X”和任何接头)的总分子量为200-2000g/mol。

惊奇地发现，基于以下的支架提供了有兴趣的配体类型：例如α，ω-二氨基-羧酸和类似类型例如α，β-二氨基-丙酸(p＝1、q＝r＝0)、α，γ-二氨基-丁酸和α，δ-二氨基-戊酸，尤其是α，β-二氨基-丙酸(p＝1、q＝r＝0)；所述配体类型对抗体具有良好的结合性能，并且与细胞培养物上清液或血浆等中存在的其它蛋白质相比，所述配体种类还表现出与抗体的特异性结合。

另外，不包括“X”和任何接头的配体的优选分子量大于200Da，例如大于300Da，例如大于400Da，例如大于500Da，例如大于600Da，例如大于700Da，例如分子量大于800Da。与其独立的是，配体的优选分子量小于5000Da，例如小于4000Da，例如小于3000Da，例如小于2500Da，例如小于2000Da，例如小于1500Da，例如分子量小于1000Da。

在本发明的一个实施方案中，每个Z1-(A1i)_m-N(R1)-和Z2-(A2j)_n-N(R2)-都代表分子量为50-500g/mol的有机部分，其中配体的总分子量为250-1500g/mol，例如300-1200g/mol，例如350-1000g/mol。

在本发明的一个实施方案中，A11，...，A1m和A21，...，A2n独立选自α-氨基酸部分和β-氨基酸部分，尤其是选自α-氨基酸部分。

在本发明的一个实施方案中，A11，...，A1m和A21，...，A2n独立选自下列氨基酸的L型或D型中的任一种：甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、半胱氨酸、组氨酸和亮氨酸，尤其是甘氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸、D-谷氨酰胺、D-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸和L-亮氨酸。

在本发明的一个实施方案中，A11，...，A1m和A21，...，A2n中的至少一个选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸、D-谷氨酰胺、D-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸和L-亮氨酸。

在本发明的一个实施方案中，A1₁，...、A1_m、A2₁，...、A2_n包括至少一个选自精氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺的氨基酸部分，尤其是至少一个选自L-精氨酸、L-酪氨酸和D-谷氨酰胺的氨基酸部分。

在本发明的一个实施方案中，Z1和Z2独立选自氢、C_1-6烷基、羧酸部分和磺酸部分。

在本发明的一个实施方案中，其变量Z1和Z2包括至少一个羧酸部分或磺酸部分，尤其是至少一个羧酸部分。

在本发明的一个实施方案中，Z1和Z2独立选自氢、C_1-6烷基、3，3-二苯基-丙酰基、3，5-二-叔丁基-4-羟基-苯甲酰基、一-甲基-邻苯二甲酰基、3-(3，5-二-叔丁基-4-羟基苯基)丙酰基、苯甲酰基、2-噻吩-乙酰基、水杨酰基、4-叔丁基-苯甲酰基、3，5-二甲氧基-2-萘基、萘基、苯基-乙酰基和硫茚基。

在本发明的一个实施方案中，Z1和Z2独立选自3，5-二-叔丁基-4-羟基-苯甲酰基和硫茚基。

在本发明的一个实施方案中，包括Z1和Z2中的至少一个为硫茚-2-羰基的那些配体。

在本发明的一个实施方案中，对于氨基酸/氨基磺酸的数量而言，n优选为0-2，例如0-1，尤其是0；m优选为1-3，例如2-3，尤其是2。n+m之和优选为2-4，例如2-3，尤其是2或3。

在本发明的一个实施方案中，当n为0时，Z2优选选自羧酸部分和磺酸部分。同样，当m为0时，Z1优选选自羧酸部分和磺酸部分。

在本发明的一个实施方案中，对于支架中的碳原子数而言，p优选为0-3，例如0-2，例如1-2，尤其是2；q优选为0-3，例如0-2，尤其是0或1。p+q之和优选为1-7，例如2-5，尤其是2或3。与其独立的是，r优选为0-6，例如0-4，例如0-2，尤其是0或1，更特别是0。

在本发明的一个实施方案中，对于支架中碳原子数的更多变量而言，(p，q)为(0，1)、(0，2)、(0，3)、(0，4)、(1，0)、(2，0)、(3，0)或(4，0)。

在本发明的一个实施方案中，对其更多变量而言，r优选为0。

如上所述，X是用于将配体与固相材料或直接或通过接头(进一步参见以下)连接在一起的反应基团。在本发明的一个实施方案中，接头是通过区段-CON(R)-(尤其是-NHCO-)与支架连接，其中该羰基是代表“X”的支架的组成部分，因为这将使通过固相肽合成的已知标准方法来制备配体成为可能。

在本发明的一个实施方案中，X通常选自羧酸(-COOH)、羧酸酯(-COOR)、羧酸酐(-COOCOR)、羧酸酰卤(-COHal)、磺酸(-S(＝O)₂OH)、磺酰氯(-S(＝O)₂Cl)、巯基(-SH)、二硫化物(-S-S-R)、羟基(-OH)、醛(-C(＝O)H)、环氧化物(-CH(O)CH₂)、氰化物(-CN)、卤素(-Hal)、伯胺(-NH₂)、仲胺(-NHR)、酰肼(-NH＝NH₂)和叠氮化物(-N₃)，其中R选自任选取代的C_1-12-烷基，Hal为卤素。

X的一个特别有趣的含义是COOH。

在本发明的一个实施方案中，亲和树脂包含具有通式(I)的配体的固相材料，其任选通过接头连接，其中

A11，...，A1m和A21，...，A2n独立选自甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、组氨酸和亮氨酸，尤其是选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸、D-谷氨酰胺、D-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸和L-亮氨酸；

Z1和Z2独立选自3，3-二苯基-丙酰基、3，5-二-叔丁基-4-羟基-苯甲酰基、一-甲基-邻苯二甲酰基、3-(3，5-二-叔丁基-4-羟基苯基)丙酰基、苯甲酰基、2-噻吩-乙酰基、水杨酰基、4-叔丁基-苯甲酰基、3，5-二甲氧基-2-萘基、萘基、苯基-乙酰基和硫茚基；

R1和R2独立选自氢和C_1-6-烷基；和

m为0或1，n为0或1，(p，q)为(0，1)、(0，2)、(0，3)、(0，4)、(1，0)、(2，0)、(3，0)或(4，0)，r为0；

在本发明的一个实施方案中，所述配体具有以下通式(II)：

其中Z1、Z2、A11，...，A1m、p和q的定义同以上通式(I)，包括该通式的所述实施方案。

在本发明的一个实施方案中，特别优选的是通式(II)的那些配体，其中

p和q独立地为范围在0-6的整数；

i＝1，2，...，m，而m是范围在1-4、例如1-3、例如1-2的整数；

A11，...，A1m独立选自甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、组氨酸和亮氨酸，尤其是甘氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸、D-谷氨酰胺、D-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸和L-亮氨酸；和

Z1和Z2独立选自3，3-二苯基-丙酰基、3，5-二-叔丁基-4-羟基-苯甲酰基、一-甲基-邻苯二甲酰基、3-(3，5-二-叔丁基-4-羟基苯基)丙酰基、苯甲酰基、2-噻吩-乙酰基、水杨酰基、4-叔丁基-苯甲酰基、3，5-二甲氧基-2-萘基、萘基、苯基-乙酰基和硫茚基。

在本发明的一个实施方案中，特别优选的是通式(II)的那些配体，其中

p和q独立地为范围在0-6的整数；

i＝1，2，...，m，而m是范围在1-4、例如1-3、例如1-2的整数；

A11，...，A1m独立选自L-脯氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸、D-谷氨酰胺、D-酪氨酸、L-缬氨酸；和

Z1和Z2独立选自3，3-二苯基-丙酰基、3，5-二-叔丁基-4-羟基-苯甲酰基、一-甲基-邻苯二甲酰基、3-(3，5-二-叔丁基-4-羟基苯基)丙酰基、苯甲酰基、2-噻吩-乙酰基、水杨酰基、4-叔丁基-苯甲酰基、3，5-二甲氧基-2-萘基、萘基、苯基-乙酰基和硫茚基。

在本发明的一个实施方案中，所述配体具有通式(I)，其中A2₁优选选自精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和赖氨酸，A2₂选自精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸和色氨酸。

在本发明的一个实施方案中，所述配体具有选自以下配体(1)-(12)的结构：

在本发明的一个实施方案中，所述配体具有以下通式(III)：

其中Z1、Z2、A11，...，A1m和A21，...，A2n的定义同以上通式(I)和(II)，包括这些通式的所述实施方案。

在本发明的通式(III)配体的一个实施方案中，Z1和Z2独立选自3，3-二苯基-丙酰基、3，5-二-叔丁基-4-羟基-苯甲酰基、一-甲基-邻苯二甲酰基、3-(3，5-二-叔丁基-4-羟基苯基)丙酰基、苯甲酰基、2-噻吩-乙酰基、水杨酰基、4-叔丁基-苯甲酰基、3，5-二甲氧基-2-萘基、萘基、苯基-乙酰基和硫茚基、乙酰基、2-苯基-2-环戊基乙酰基、2-喹啉酰基(quinaldoyl)、吲哚-2-羰基、邻氨羰苯甲酰基、4-羟基-3-(吗啉代甲基)苯甲酰基、2-苯基-4-喹啉羰基、4，4-二(4-羟基苯基)-N-戊酰基、4-氨磺酰苯甲酰基、羟基喹啉酰基和5-乙酰氨基-2-羟基苯甲酰基。

在本发明的通式(III)配体的一个实施方案中，Z1和Z2独立选自3，5-二甲氧基-2-萘基、硫茚基、3，3-二苯基-丙酰基、3，5-二-叔丁基-4-羟基-苯甲酰基、一-甲基-邻苯二甲酰基、3-(3，5-二-叔丁基-4-羟基苯基)丙酰基、苯甲酰基、2-噻吩-乙酰基、水杨酰基、4-叔丁基-苯甲酰基、萘基、2-萘基乙酰基、苯基-乙酰基、乙酰基、2-苯基-2-环戊基乙酰基、2-喹啉酰基、吲哚-2-羰基、邻氨羰苯甲酰基、4-羟基-3-(吗啉代甲基)苯甲酰基、2-苯基-4-喹啉羰基、4，4-二(4-羟基苯基)-N-戊酰基、4-氨磺酰苯甲酰基、羟基喹啉酰基和5-乙酰氨基-2-羟基苯甲酰基。

本文所述的配体包括在任何或所有不对称原子上的富集的或拆分的旋光异构体，正如根据本文的描述或叙述是显而易见的那样。可分离或合成外消旋和非对映体混合物、以及各旋光异构体，使之基本上不含其对映体或非对映体的对应物，这些都在本发明的范围之内。

定义

“α-氨基酸部分”是指氨基与α-碳共价连接的天然发生的氨基酸和合成的氨基酸(包括必需氨基酸)。当存在于本发明的配体中时，所述α-氨基酸部分以-N(R)-X-C(＝O)-片段的形式存在，其中X代表α-碳和任何侧链。

“β-氨基酸部分”是指氨基与β-碳共价连接的天然发生的氨基酸和合成的氨基酸(包括必需氨基酸)。当存在于本发明的配体中时，所述β-氨基酸部分以-N(R)-X-C(＝O)-片段的形式存在，其中X代表α-碳和β-碳和任何侧链。

“α-氨基磺酸部分”对应于“α-氨基酸部分”，其中羰基(-C(＝O)-)已被磺酸基(-S(＝O)₂-)取代。当存在于本发明的配体中时，所述α-氨基磺酸部分以-N(R)-X-S(＝O)₂-片段的形式存在，其中X代表α-碳和任何侧链。

“β-氨基磺酸部分”对应于“β-氨基酸部分”，其中羰基(-C(＝O)-)已经被磺酸基(-S(＝O)₂-)取代。当存在于本发明的配体中时，所述β-氨基磺酸部分以-N(R)-X-S(＝O)₂-片段的形式存在，其中X代表α-碳和β-碳和任何侧链。

术语“必需氨基酸”是指20个遗传编码的L-α-氨基酸及其立体异构的D-α-氨基酸的任何一个。因此，本发明范围之内的术语“氨基酸部分”采用其最广泛的含义，是指包括其天然发生的L-氨基酸。天然存在的氨基酸的常用的单字母缩写和三字母缩写用于本文(Lehninger，Biochemistry，第2版，第71-92页，(Worth Publishers：New York，1975)。该术语也包括D-氨基酸(及其残基)以及化学修饰的氨基酸例如氨基酸类似物，包括不常掺入到蛋白质中的天然发生的氨基酸(例如正亮氨酸)以及经化学合成的并具有本领域已知的氨基酸性质的化合物。

通常能够掺入本发明配体并作为“氨基酸部分”的氨基酸的实例列举如下：

Glycyl(GLY)；氨基多元羧酸，例如天冬氨酸(ASP)、对羟基天冬氨酸、谷氨酸(GLU)、β-羟基谷氨酸、β-甲基天冬氨酸、β-甲基谷氨酸、β，β-二甲基天冬氨酸、γ-羟基谷氨酸、β，γ-二羟基谷氨酸、β-苯基谷氨酸、γ-亚甲基谷氨酸、3-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、2-氨基辛二酸和2-氨基癸二酸残基；谷氨酰胺(GLN)；天冬酰胺(ASN)；精氨酸(ARG)、赖氨酸(LYS)、β-氨基丙氨酸、γ-氨基氨基丁酸、鸟氨酸(ORN)、瓜氨酸、高精氨酸、高瓜氨酸、5-羟基-2，6-二氨基己酸、二氨基丁酸；组氨酸(HIS)；α，α′-二氨基琥珀酸、α，α′-二氨基戊二酸、α，α′-二氨基己二酸、α，α′-二氨基庚二酸、α，α′-二氨基-β-羟基庚二酸、α，α′-二氨基辛二酸、α，α′-二氨基壬二酸和α，α′-二氨基癸二酸残基；脯氨酸(PRO)、4-或3-羟基-2-吡咯烷-羧酸、y-甲基脯氨酸、哌啶酸、5-羟基哌啶酸、-N[CH₂]₂CO-、氮杂环丁烷-2-甲酸；丙氨酸(ALA)、缬氨酸(VAL)、亮氨酸(LEU)、烯丙基甘氨酸、氨基丁酸、正缬氨酸、正亮氨酸(NLE)、氨基庚烷酸、α-甲基丝氨酸、α-氨基-α-甲基-γ-羟基戊酸、α-氨基-α-甲基-6-羟基戊酸、α-氨基-α-甲基-ε-羟基己酸、异缬氨酸、α-甲基谷氨酸、α-氨基异丁酸、α-氨基二乙基乙酸、α-氨基二异丙基乙酸、α-氨基二-正-丙基乙酸、α-氨基二异丁基乙酸、α-氨基二-正丁基乙酸、α-氨基乙基异丙基乙酸、α-氨基-正丙基乙酸、α-氨基-二异戊基乙酸、α-甲基天冬氨酸、α-甲基谷氨酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸；异亮氨酸(ILE)、别异亮氨酸、叔-亮氨酸、β-甲基色氨酸；α-氨基-α-乙基-β-苯基丙酸；β-苯基丝氨酰基；丝氨酸(SER)、β-羟基亮氨酸、β-羟基正亮氨酸、β-羟基正缬氨酸、α-氨基-α-羟基硬脂酸；高丝氨酸、γ-羟基正缬氨酸、δ-羟基正缬氨酸、ε-羟基正亮氨酸；canavinyl、canalinyl；γ-羟基鸟氨酸基(ornithinyl)；2-氨基己酸(hexosaminic acid)、D-氨基葡萄糖酸、D-氨基半乳糖酸；α-氨基-β-硫醇、青霉胺、β-巯基正缬氨酸、β-巯基氨基丁酸；半胱氨酸(CYS)；高胱氨酸；β-苯基甲硫氨酸；甲硫氨酸(MET)；S-烯丙基-(L)-半胱氨酸亚砜；2-巯基组氨酸；胱硫醚；苯丙氨酸(PHE)、色氨酸(TRP)、α-氨基苯基乙酸、α-氨基环己基乙酸、α-氨基-β-环己基丙酸；芳基-、C_1-6-烷基-、羟基-、卤素-、胍-、氧基烷基醚-、硝基-、硫取代的或卤素取代的苯基(例如酪氨酸(TYR)、甲基酪氨酸和邻-氯-、对-氯-、3，4-二氯、邻-、间-或对-甲基-、2，4，6-三甲基-、2-乙氧基-5-硝基、2-羟基-5-硝基和对-硝基-苯丙氨酸)；呋喃基-、噻吩基-、吡啶基-、嘧啶基-、嘌呤或萘基丙氨酸；犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸、2-羟基色氨酸、4-羧基色氨酸；肌氨酸(N-甲基甘氨酸；SAR)、N-苄基甘氨酸、N-甲基丙氨酸、N-苄基丙氨酸、N-甲基苯丙氨酸、N-苄基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸和N-苄基缬氨酸；苏氨酸(THR)、别苏氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸。

在本文中，术语“C_1-12-烷基”和“C_1-6-烷基”分别是指具有1-12个碳原子和1-6个碳原子的直链、环状或支链烃基，例如甲基、乙基、丙基、异-丙基、戊基、环戊基、己基、环己基。术语“C_1-4-烷基”是指具有1-4个碳原子的直链、环状或支链烃基，例如甲基、乙基、丙基、异-丙基、环丙基、丁基、异-丁基、叔丁基、环丁基。

尽管术语“C_3-12-环烷基”包括在术语“C_1-12-烷基”之内，它尤其是指单环和双环对应物，包括具有外环原子的烷基，例如环己基-甲基。

同样，术语“C_2-12-烯基”和“C_2-6-烯基”包括分别具有2-12个碳原子和2-6个碳原子的直链、环状或分枝烃基并且包含(至少)一个不饱和键。烯基的实例是乙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、十七烯基。烯基的优选实例是乙烯基、烯丙基、丁烯基，尤其是烯丙基。

尽管术语“C_3-12-环烯基”包括在术语“C_2-12-烯基”之内，但它尤其是指单环和双环对应物，包括具有外环原子的烯基，例如环己烯基-甲基。

同样，术语“C_2-12-炔基”和“C_2-6-炔基”包括分别具有2-12个碳原子和2-6个碳原子的直链、环状或分枝烃基并且包含(至少)一个三键。

术语“C_1-6-烷氧基”是指“C_1-6-烷基-O”。

在本文的情况下，即当与术语“烷基”、“烷氧基”、“烯基”、“炔基”等连接时，术语“任选取代的”是指目标基团被选自以下的基团取代一次或多次，优选1-3次：羟基(当与不饱和碳原子结合时，它可以互变异构的酮式存在)、C_1-6-烷氧基(即C_1-6-烷基-氧基)、C_2-6-烯氧基、羧基、氧代基(形成酮或醛官能团)、C_1-6-烷氧基羰基、C_1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基、芳基氨基、芳基羰基、芳氧基羰基、芳基羰基氧基、芳基氨基羰基、芳基羰基氨基、杂芳基、杂芳基氧基、杂芳基氨基、杂芳基羰基、杂芳基氧基羰基、杂芳基羰基氧基、杂芳基氨基羰基、杂芳基羰基氨基、杂环基、杂环基氧基、杂环基氨基、杂环基羰基、杂环基氧基羰基、杂环基羰基氧基、杂环基氨基羰基、杂环基羰基氨基、氨基、一(C_1-6-烷基)氨基和二(C_1-6-烷基)氨基、-N(C_1-4-烷基)₃ ⁺、氨基甲酰基、一(C_1-6-烷基)氨基羰基和二(C_1-6-烷基)氨基羰基、C_1-6-烷基羰基氨基、氰基、胍基、脲基、C_1-6-烷基-磺酰基-氨基、芳基-磺酰基-氨基、杂芳基-磺酰基-氨基、C_1-6-烷酰基氧基、C_1-6-烷基-磺酰基、C_1-6-烷基-亚磺酰基、C_1-6-烷基磺酰基氧基、硝基、C_1-6-烷硫基和卤素，其中任何芳基、杂芳基和杂环基都可被取代，如同以下明确描述的用于芳基、杂芳基和杂环基的取代，而且任何烷基、烷氧基等代表的取代基都可被以下基团取代：羟基、C_1-6-烷氧基、氨基、一(C_1-6-烷基)氨基和二(C_1-6-烷基)氨基、羧基、C_1-6-烷基羰基氨基、C_1-6-烷基氨基羰基或卤素。

通常，取代基选自羟基(当与不饱和碳原子结合时，它可以互变异构的酮式存在)、C_1-6-烷氧基(即C_1-6-烷基-氧基)、C_2-6-烯氧基、羧基、氧代基(形成酮或醛官能团)、C_1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基、芳基氨基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基、杂芳基氨基、杂芳基羰基、杂环基、杂环基氧基、杂环基氨基、杂环基羰基、氨基、一(C_1-6-烷基)氨基和二(C_1-6-烷基)氨基；氨基甲酰基、一(C_1-6-烷基)氨基羰基和二(C_1-6-烷基)氨基羰基、氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基、一(C_1-6-烷基)氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基和二(C_1-6-烷基)氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基、C_1-6-烷基羰基氨基、胍基、脲基、C_1-6-烷基-磺酰基-氨基、C_1-6-烷基-磺酰基、C_1-6-烷基-亚磺酰基、C_1-6-烷硫基、卤素，其中任何芳基、杂芳基和杂环基都可被取代，如同以下明确描述的用于芳基、杂芳基和杂环基的取代。

在某些实施方案中，取代基选自羟基、C_1-6-烷氧基、氨基、一(C_1-6-烷基)氨基和二(C_1-6-烷基)氨基、羧基、C_1-6-烷基羰基氨基、C_1-6-烷基氨基羰基或卤素。

术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。

在本文中，术语“芳基”是指完全或部分芳族碳环或环系，例如苯基、萘基、1，2，3，4-四氢萘基、联苯、蒽基、phenanthracyl、芘基、苯并芘基、芴基和氧杂蒽基，其中苯基是优选实例。

术语“杂芳基”是指其中的一个或多个碳原子已被例如以下的杂原子取代的完全或部分芳族碳环或环系：氮原子(＝N-或-NH-)、硫原子和/或氧原子。这类杂芳基的实例是

唑基、异

唑基、噻唑基、异噻唑基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、香豆素基、呋喃基、噻吩基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并二唑基、苯并唑基、酞嗪基、phthalanyl、三唑基、四唑基、异喹啉基、吖啶基、咔唑基、二苯氮杂

基、吲哚基、苯并吡唑基、phenoxazonyl。特别有趣的杂芳基是苯并咪唑基、

唑基、异

唑基、噻唑基、异噻唑基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、呋喃基、噻吩基、喹啉基、三唑基、四唑基、异喹啉基、吲哚基，尤其是苯并咪唑基、吡咯基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、喹啉基、四唑基和异喹啉基。

术语“杂环基”是指其中的一个或多个碳原子已被例如以下的杂原子取代的非芳族碳环或环系：氮原子(＝N-或-NH-)、硫原子和/或氧原子。这类杂环基(按照环来命名)的实例是咪唑烷、哌嗪、六氢哒嗪、六氢嘧啶、二氮杂环庚烷、二氮杂环辛烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷、氮杂环辛烷、氮杂环丙烷、氮杂环丙烯(azirine)、氮杂环丁烷、甲基氢醌、莨菪烷、

嗪烷(吗啉)、氮杂

二氢氮杂

四氢氮杂和六氢氮杂氧杂氮杂环戊烷、氧杂氮杂环庚烷、氧杂氮杂环辛烷、噻唑烷、噻嗪烷、硫杂氮杂环庚烷、硫杂氮杂环辛烷、氧杂氮杂环丁烷、二氮杂环丁烷、硫杂氮杂环丁烷、四氢呋喃、四氢吡喃、氧杂环庚烷、四氢噻吩、四氢噻喃、硫杂环庚烷、二噻烷、二硫杂环庚烷、二

烷、二氧杂环庚烷、氧杂硫杂环己烷、氧杂硫杂环庚烷。最有趣的实例是四氢呋喃、咪唑烷、哌嗪、六氢哒嗪、六氢嘧啶、二氮杂环庚烷、二氮杂环辛烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷、氮杂环辛烷、氮杂环丁烷、莨菪烷、

嗪烷(吗啉)、氧杂氮杂环戊烷、氧杂氮杂环庚烷、噻唑烷、噻嗪烷和硫杂氮杂环庚烷，尤其是四氢呋喃、咪唑烷、哌嗪、六氢哒嗪、六氢嘧啶、二氮杂环庚烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷、

嗪烷(吗啉)和噻嗪烷。

在本文的情况下，即当与术语“芳基”、“杂芳基”、“杂环基”等连接时(例如“芳氧基”、“杂芳基羰基”等)，术语“任选取代的”是指目标基团被选自以下的基团取代一次或多次，优选1-5次，尤其是1-3次：羟基(当在烯醇系中存在时，它可以互变异构的酮式存在)、C_1-6-烷基、C_1-6-烷氧基、C_2-6-烯氧基、氧代基(它可以互变异构的烯醇式存在)、氧化物(仅涉及N-氧化物)、羧基、C_1-6-烷氧基羰基、C_1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基、芳基氨基、芳氧基羰基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氨基、氨基、一(C_1-6-烷基)氨基和二(C_1-6-烷基)氨基；氨基甲酰基、一(C_1-6-烷基)氨基羰基和二(C_1-6-烷基)氨基羰基、氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基、一(C_1-6-烷基)氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基和二(C_1-6-烷基)氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基、C_1-6-烷基羰基氨基、氰基、胍基、脲基、C_1-6-烷酰基氧基、C_1-6-烷基-磺酰基-氨基、芳基-磺酰基-氨基、杂芳基-磺酰基-氨基、C_1-6-烷基-磺酰基、C_1-6-烷基-亚磺酰基、C_1-6-烷基磺酰基氧基、硝基、硫烷基、氨基、氨基-磺酰基、一(C_1-6-烷基)氨基-磺酰基和二(C_1-6-烷基)氨基-磺酰基、二卤-C_1-4-烷基、三卤-C_1-4-烷基、卤素，其中芳基和杂芳基代表的取代基可以被以下基团取代1-3次：C_1-4-烷基、C_1-4-烷氧基、硝基、氰基、氨基或卤素，并且任何烷基、烷氧基等代表的取代基可被以下基团取代：羟基、C_1-6-烷氧基、C_2-6-烯氧基、氨基、一(C_1-6-烷基)氨基和二(C_1-6-烷基)氨基、羧基、C_1-6-烷基羰基氨基、卤素、C_1-6-烷硫基、C_1-6-烷基-磺酰基-氨基或胍基。

通常，取代基选自羟基、C_1-6-烷基、C_1-6-烷氧基、氧代基(其可以互变异构的烯醇式存在)、羧基、C_1-6-烷基羰基、甲酰基、氨基、一(C_1-6-烷基)氨基和二(C_1-6-烷基)氨基；氨基甲酰基、一(C_1-6-烷基)氨基羰基和二(C_1-6-烷基)氨基羰基、氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基、C_1-6-烷基羰基氨基、胍基、脲基、C_1-6-烷基-磺酰基-氨基、芳基-磺酰基-氨基、杂芳基-磺酰基-氨基、C_1-6-烷基-磺酰基、C_1-6-烷基-亚磺酰基、C_1-6-烷基磺酰基氧基、硫烷基、氨基、氨基-磺酰基、一(C_1-6-烷基)氨基-磺酰基和二(C_1-6-烷基)氨基-磺酰基或卤素，其中任何烷基、烷氧基等代表的取代基都可被以下基团取代：羟基、C_1-6-烷氧基、C_2-6-烯氧基、氨基、一(C_1-6-烷基)氨基和二(C_1-6-烷基)氨基、羧基、C_1-6-烷基羰基氨基、卤素、C_1-6-烷硫基、C_1-6-烷基-磺酰基-氨基或胍基。在某些实施方案中，取代基选自C_1-6-烷基、C_1-6-烷氧基、氨基、一(C_1-6-烷基)氨基和二(C_1-6-烷基)氨基、硫烷基、羧基或卤素，其中任何烷基、烷氧基等代表的取代基都可被以下基团取代：羟基、C_1-6-烷氧基、C_2-6-烯氧基、氨基、一(C_1-6-烷基)氨基和二(C_1-6-烷基)氨基、羧基、C_1-6-烷基羰基氨基、卤素、C_1-6-烷硫基、C_1-6-烷基-磺酰基-氨基或胍基。

羧酸部分是指当Z1和Z2为Q-C(＝O)-时所包括的部分，其中Q选自任选取代的C_1-12-烷基、任选取代的C_2-12-烯基、任选取代的C_2-12-炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂环基。

磺酸部分是指当Z1和Z2为Q-S(＝O)₂-时所包括的部分，其中Q选自任选取代的C_1-12-烷基、任选取代的C_2-12-烯基、任选取代的C_2-12-炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂环基。

当用于本文时，术语“有机部分”是指包含一个或多个碳原子和共价结合的一个或多个氢(H)、氧(O)、氮(N)、硫(S)、溴(Br)、氯(Cl)、氟(F)或磷(P)原子的分子片段。

在本发明的某些方面，每个有机部分Z1-(A1)_n-X1和Z2-(A2)_m-X2通常都具有通式C_xH_yO_zN_kS_lBr_mCl_nF_p，P_q，其中0≤x≤15，0≤y≤2x+1，0≤z≤x，0≤k≤x，0≤l≤x，0≤m≤3x，0≤n≤3x，0≤p≤3x，0≤q≤x和50≤12x+y+16z+14k+32l+80m+35n+19p+31q≤500。

固相材料

如上所述，所述亲和树脂是其上固定有一个或多个合成配体的固相材料。固相材料(有时也称为“基质”或“聚合物基质”)原则上可选自常用于色谱目的和用于肽合成的宽范围的材料。这类材料的实例如下。

配体共价固定在固相材料(例如多孔的无机基质或聚合物基质)上，任选以交联和/或珠状形式或以整体多孔实体。优选聚合物基质的孔对靶蛋白而言足够宽，以便通过所述孔而扩散并与孔内面上的配体相互作用。对于分子量约150kDa的抗体而言，优选50-150nm的平均孔径，例如约90nm。

在一个实施方案中，珠状和任选交联的聚合物基质包括多个亲水性部分。亲水性部分可以是聚合物链，当交联时其可形成交联聚合物基质。实例包括例如聚乙二醇部分、聚胺部分、聚乙烯胺部分和多元醇部分。

在本发明的一个实施方案中，珠状聚合物基质的核心和/或表面包括选自聚乙烯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚酯和聚酰胺的聚合材料。

珠状聚合物基质也可选自PS、POEPS、POEPOP、SPOCC、PEGA、CLEAR、Expansin、Polyamide、Jandagel、PS-BDODMA、PS-HDODA、PS-TTEGDA、PS-TEGDA、GDMA-PMMA、PS-TRPGDA、ArgoGel、Argopore树脂、ULTRAMINE、交联LUPAMINE、高容量PEGA、Silica、Fractogel、交联葡聚糖、琼脂糖、玻璃珠、交联聚丙烯酸酯及其上述的衍生物；具体地讲，聚合物基质选自SPOCC、PEGA、HYDRA、POEPOP、PEG-聚丙烯酸共聚物、聚醚-聚胺共聚物和交联聚乙烯二胺。

除了上述实例之外，能构成聚合物基质的任何材料原则上都可用于生产本发明的珠子。优选珠子的核心材料是聚合物。在某些实施方案中，核心包括亲水性聚合材料或由所述材料组成。在其它实施方案中，核心包括疏水性聚合材料或由这些材料组成。在某些实施方案中，珠子表面包括与核心相同的材料或由与核心相同的材料组成。

大规模应用的树脂可以是上述之一或其它市售树脂，例如Sephadex^TM、Sepharose^TM、Fractogel^TM、CIMGEL^TM、Toyopearl、HEMA^TM、交联琼脂糖和大孔聚苯乙烯或聚丙烯酸酯。基质也可以主要具有无机特性，例如大孔玻璃或粘土矿物或树脂和无机物的组合例如Ceramic HyperD^TM或硅胶。

可从各种各样的可聚合单体制备本发明的聚合物珠，所述单体包括苯乙烯、丙烯酸和不饱和氯化物、酯、乙酸酯、酰胺和醇类，包括但不限于聚苯乙烯(包括高密度聚苯乙烯乳胶例如溴化聚苯乙烯)、聚甲基丙烯酸甲酯和其它聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚丙烯酰胺、聚丙烯醛、聚二甲基硅氧烷、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚氨酯、聚乙烯乙酸酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡啶、聚乙烯苯甲基氯(polyvinylbenzylchloride)、聚乙烯甲苯、聚偏氯乙烯和聚二乙烯苯。在其它实施方案中，珠子可从苯乙烯单体或基于PEG的大单体制备而来。在优选的实施方案中，聚合物选自聚醚、聚乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚氨酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚酯、聚酰胺及其组合。高度优选的表面和核心部分包括交联PEG部分、聚胺部分、聚乙烯胺部分和多元醇部分。

优选用于生产本发明组合物的珠子的疏水性聚合物是PS-DVB(聚苯乙烯二乙烯苯)。PS-DVB已广泛用于固相肽合成(SPPS)，并且最近已经证明在特定有机分子的聚合物支持的制备中的用途(Adams等(1998)J.Org.Chem.63：3706-3716)。在适当制备(

等(2000)J.Combi.Chem.2：108-119)时，PS-DVB固相材料具有用于化学合成的良好性能，例如高装载量、在有机溶剂中适当溶胀和物理稳定性。

接头

上述配体可通过接头共价固定在固相材料上。在优选的实施方案中，配体与接头共价连接，而接头又与聚合物基质共价连接。使亲和配体与固相材料连接的通用技术可参见下文：Hermanson，Krishna Mallia和Smith，Immobilized Affinity Ligand Techniques(固定化亲和配体技术)”，Academic Press，1992。

应当理解，接头应给配体提供合适灵活性，但不应参与配体与目标抗体的结合。事实上，固定化配体的结合应当类似于非固定化配体的结合。

接头可用于将配体与固相材料例如聚合物基质或无机支持物连接起来。优选的接头在配体与固相材料之间形成强而持久的键合。当本发明的固相材料用于抗体的重复纯化时，这一点是特别重要的。

然而，在本发明的一个实施方案中，可将接头选择性地裂解下来。当固相材料用于分析目的时，这一点是有用的。

氨基酸和多肽是常用接头的实例。其它可能的接头包括碳水化合物和核酸。

在一个实施方案中，与聚合物基质连接的接头残基L可通过酸、碱、温度、光照或通过与化学试剂接触而裂解下来。具体地讲，与聚合物基质连接的接头可以是(3-甲酰基吲哚-1-基)乙酸、2，4-二甲氧基-4′-羟基-二苯甲酮、HMPA、HMPB、HMPPA、Rink酸、Rink酰胺、Knorr接头、PAL接头、DCHD接头、Wang接头和三苯甲基接头。

配体可通过接头与固相材料缔合，所述接头的长度优选小于

例如长度为3至

例如长度为3至例如长度为3至

优选地，接头通过羧酸基团或氨基(尤其是通过羧酸基团)与配体连接。

接头也可包括多个共价连接的亚基，例如所述亚基选自相同和不同接头亚基。在一个变量中，接头是灵活的并且包括3个至优选小于50个相同或不同的共价连接的亚基。

在本发明的一个实施方案中，接头L选自甘氨酸、丙氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸和HMBA。

在本发明的实施方案中，接头可选自烷烃，例如直链烷烃，例如具有2-12个碳原子的直链烷烃；单分散的聚乙二醇(PEG)，例如具有2-20个重复单元的PEG；和肽，例如包含1-20个连接氨基酸的肽。

接头也可选自多分散的聚乙二醇；单分散的聚乙二醇，例如三甘醇、四甘醇、五甘醇、六甘醇、七甘醇；氨基酸；二肽；三肽；四肽；五肽；六肽；七肽；八肽；九肽；十肽；多聚丙氨酸；多聚甘氨酸；包括其任何组合。

固相材料通常呈珠子形式，例如平均直径范围为0.1-1000μm的颗粒材料，或呈条、膜、球、整体(monolith)等形式。

溶液或悬液

本文的术语“溶液或悬液”是指包含生长激素多肽、尤其是人生长激素多肽的固体或/和液体物质。术语“溶液或悬液”尤其是“大”体积或质量，即是指来自大规模和工业规模工艺的体积和质量。

生长激素多肽的“悬液或溶液”通常来自例如细胞培养、微生物过程、克隆的动物(例如牛、猪、绵羊、山羊和鱼)或昆虫等，尤其是来自细胞培养或工业规模的生产过程。或者，生长激素多肽的悬液或溶液可来自血浆等。

生长激素多肽的悬液或溶液通常是在特定细胞培养物中的细胞裂解之后获得或直接得自细胞培养液。然后，如有必要或有益的话，可通过改变pH、离子强度或通过二价金属离子螯合等，调节含生长激素多肽的悬液或溶液。

在本发明的一个实施方案中，含生长激素多肽的悬液或溶液直接得自前述纯化步骤，或得自前述纯化步骤，然后调节pH、离子强度、二价金属离子螯合等，如有必要或有益的话。

配体

当用于本文时，术语“配体”是指可与大分子结合的分子(参考：Physical Biochemistry：Applications to Biochemistry and Moleculare Biology，David Freifelder编著.第2版.W.H.Freemann and co.NY 1982.第654页)或与靶化合物结合的分子，所述靶化合物在本文中可以是抗体，尤其是人抗体例如人免疫球蛋白(IgG)或更尤其是重组IgG。术语“配体”在本文中更尤其是指“非蛋白质配体”。

优选地，本发明的配体应当至少以充分特异性的方式与目标抗体结合(“特异性结合”)。

术语“一个或多个配体”是指固相材料可具有不止一种类型配体固定在其上的事实。这就是说，一种类型配体(“配体”)的固定通常将会涉及多个相同种类的配体的固定。

在本文中，“特异性结合”是指配体与抗体(即结合配偶体)的结合特性优先使结合抗体的相对量是并非抗体的其它结合种类相对量的至少2倍，例如50倍，例如100倍，例如1000倍或以上。结合化合物的相对量是指结合的特异性结合物的相对量＝(特异性结合量/结合的总化合物量)/(非特异性结合量/结合的总化合物量)。

抗体

术语“抗体”、“单克隆抗体”和“多克隆抗体”定义和讨论如下。

本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白，无论是天然的还是完全或部分合成产生的。所有片段及其保持特异性结合能力的衍生物也包括在该术语中。典型片段是Fc、F(ab)、重链和轻链。该术语也涵盖具有同源或基本同源的结合结构域的任何多肽，例如至少95％相同，当将其氨基酸序列与免疫球蛋白结合结构域相比较时。这些多肽可来自天然来源，或者是部分或完全合成产生。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可以是任何免疫球蛋白类型的成员，包括人类的任何免疫球蛋白类型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。然而，IgG类的衍生物在本发明的一个实施方案中是优选的。

抗体具有一个或多个拷贝的Y形单元，由4个多肽链组成。每个Y都含有两个相同拷贝的“重链”和两个相同拷贝的“轻链”，按照其相对分子量来命名。

抗体可根据Y单元的数目和重链类型分为5类：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重链决定每种抗体的亚类。IgG、IgM、IgA、IgD和IgE的重链分别称为gamma、mu、alpha、delta和epsilon。任何抗体的轻链可分为kappa(κ)或lambda(λ)类型(是对多肽分子特征的描述)。

对于药用，最常用的抗体是IgG，其可被蛋白水解酶木瓜蛋白酶裂解为3部分：2个F(ab)区和1个Fc区，或可被蛋白水解酶胃蛋白酶裂解为2部分：1个F(ab’)₂和1个Fc区。

F(ab)区包括抗体“臂”，它是抗原结合至关重要的。Fc区包括抗体“尾”并在免疫应答中起作用，而且它在某些免疫化学方法中作为操纵抗体的有用“把手”。在抗体中F(ab)区的数量对应于其亚类，并决定抗体的“价位”(粗略地讲，抗体可结合其抗原的“臂”的数目)。

术语“抗体片段”是指小于全长的抗体的任何衍生物。优选地，抗体片段保留全长抗体特异性结合能力的至少重要部分。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)₂、scFv、Fv、dsFv双抗体和Fd片段。可通过任何方式产生抗体片段。例如可通过酶促或化学方法使完整抗体断裂而产生抗体片段，或者可从编码部分抗体序列的基因经重组产生抗体片段。或者，可全部或部分合成而产生抗体片段。抗体片段可任选是单链抗体片段。或者，片段可包括例如通过二硫键连接在一起的多条链。片段也可任选是多分子复合物。功能性抗体片段通常将会包括至少约50个氨基酸和更通常将会包括至少约200个氨基酸。

“单链Fv”(scFv)是由轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)通过多肽接头彼此共价结合而组成的重组抗体片段。V_L或V_H都是氨基端结构域。多肽接头可以具有可变的长度和组成，只要这两个可变区连接而没有严重的空间阻碍。通常，接头主要由甘氨酸和丝氨酸残基延伸而组成，并有若干散在谷氨酸或赖氨酸残基，利于溶解。“双抗体”是二聚scFv。双抗体的组分通常具有比大多数scFv更短的肽接头而且它们表现出缔合为二聚体的偏好。“Fv”片段是由1个V_H区和1个V_L区通过非共价相互作用结合在一起而组成的抗体片段。术语“dsFv”在本文中是指具有经工程改造的分子间二硫键、以稳定V_H-V_L对的Fv。“F(ab′)₂”片段是这样的抗体片段：其基本上相当于通过用胃蛋白酶在pH 4.0-4.5消化而得自免疫球蛋白(通常是IgG)的那些。片段可经重组产生。“Fab′”片段是这样的抗体片段：其基本上相当于通过使连接F(ab′)₂片段中的两个重链片段的二硫键或桥还原而得到的那些。Fab′片段可经重组产生。“Fab”片段是这样的抗体片段：其基本上相当于通过用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白(通常是IgG)而得到的那些。Fab片段可经重组产生。Fab片段的重链区段是Fd片段。“Fc”区是特定抗体类型的恒定区。

抗原与抗体间的结合取决于氢键、疏水键、静电引力和范德华力。这些都是微弱的非共价键，但抗原与抗体间的某些缔合也可以相当强。因此，抗体-抗原结合的亲和常数可跨越宽范围，从10⁵mol^-1以下延伸到10¹²mol^-1以上。亲和常数受温度、pH和溶剂的影响。除了抗体对配体的亲和性之外，抗体-配体复合物的总体稳定性也由抗原和抗体的价位以及互相作用部分的结构排列来决定。

准确的亲和常数仅可对单克隆抗体来决定，所述单克隆抗体是识别抗原上的一个表位的遗传上相同的分子，而对于多克隆抗体，广泛的亲和性分布可得到表观亲和常数。表观亲和常数也可由以下事实所致：多克隆抗体可识别同一抗原上的不止一个表位。因为抗体通常在每个分子上具有不止一个结合结构域，在抗体及其抗原间发生多个协同结合；该效应就称为亲合力。因为单克隆抗体仅与抗原上的一个表位反应，它们通过抗原的化学处理后比多克隆抗体更容易失去表位。这可通过将两个以上单克隆抗体集中到同一抗原上而抵消。

可通过将B淋巴细胞与永久细胞培养物融合产生杂交瘤而得到单克隆抗体。杂交瘤将会产生多拷贝的完全相同的抗体，这是开发抗体用于治疗或诊断应用的基本特征。

亲和树脂的制备

亲和树脂原则上可通过以下两种完全不同的方式来制备：即(i)通过合成游离形式的配体，然后将配体直接或通过接头固定到固相材料上(参见上文)，或(ii)通过使固相材料官能化，然后序贯合成配体。对于第一种方式，固定化技术是本领域现成的，例如载于Hermanson等(参见上文)。对于第二种方式，技术也是现成的，例如本领域已知的固相肽合成及其衍生技术(Fields，G.B.等(1992)Principles and practice of solid-phase peptide synthesis(固相肽合成的原理和实践).In Synthetic Peptides：A User’s Guide(Grant，G.A.编著)，第77-183页，W.H.Freeman；Fields，G.B.编著(1997)Solid-phase peptide synthesis(固相肽合成).Methods in Enzymology 289和Dorwald，F.Z.Organic synthesis on solid phase-supports，linkers，reactions(固相有机合成-支持物、接头、反应)；Wiley-VCH：Weinheim，2000)。

在该方法的第一步骤中，在促进抗体部分与亲和树脂结合的条件下，使含所述抗体的溶液或悬液与所述亲和树脂接触。目的在于促进所述抗体的相关部分与所述亲和树脂结合。

术语“使含抗体/抗体的溶液或悬液接触”当与步骤(a)联用时是指

术语“部分”当与步骤(a)联用时是指含抗体的溶液或悬液中存在的至少30％(即30-100％)的抗体量。应当理解，大多数情况下最好结合远远大于30％的抗体量，例如至少50％，或至少70％，或主要部分的抗体量。术语“主要部分”是指溶液或悬液中存在的至少90％的抗体量。优选在含抗体的溶液或悬液中存在的甚至更高部分与亲和树脂结合，例如至少95％的量，或至少98％的量，或至少99％的量，或甚至几乎所有抗体量。

含抗体的溶液或悬液通常来自生产过程，例如细胞培养、工业规模/工业过程、微生物过程、克隆的动物(例如牛、猪、绵羊、山羊和鱼)或昆虫等，尤其是来自细胞培养。或者，抗体的溶液或悬液可来自血浆等。

亲和树脂的最常见配置是以柱形式。在分批容器中的配置当然也可以。

溶液或悬液通常直接得自细胞培养液或者得自细胞培养液并随后调节pH、离子强度、二价金属离子螯合等，如有必要或有益的话。在另一个实施方案中，溶液或悬液直接得自前述纯化步骤，或得自前述纯化步骤，然后调节pH、离子强度、二价金属离子螯合等，如有必要或有益的话。

通常按照常规方案(即浓度、温度、离子强度等)，使溶液或悬液中存在的抗体进行接触，并且在常规使用之前，可洗涤亲和树脂并使之平衡。

抗体载量通常是每升亲和树脂至少5g，例如每升湿润形式的亲和树脂中抗体范围为1-30g，例如3-15g，并且含抗体的溶液或悬液通常在装载时的流速是每小时1-50柱体积(CV/h)，例如25-35CV/h。

在应用于亲和树脂之前和应用时，溶液或悬液的pH看来起到形成污染物的相关作用，例如以抗体的二聚体形式和降解产物形式。因此，优选溶液或悬液呈液体形式并且pH范围为3.0-10.0，例如范围为3.0-7.0，或6.5-10.0，当用于亲和树脂时。在某些有趣的实施方案中，含抗体的溶液或悬液的pH范围为4.0-7.0，或范围为7.0-9.0，或范围为4.5-8.5。优选的pH范围为6.0-8.0。

含抗体的溶液或悬液的温度通常为10-30℃，例如约15-25℃。

具有结合抗体的亲和树脂的温度通常为10-30℃，例如约15-25℃，例如通过使用冷却和/或加热夹套和控制温度的溶液而保持在指定范围之内。

步骤(B)-洗涤步骤(任选)

当抗体与亲和树脂结合之后，通常进行洗涤步骤(b)以除去与亲和树脂非特异性结合的蛋白质。通过该步骤，亲和树脂上残留(结合)的抗体部分将会含有少得多的污染物。

该洗涤步骤(b)优选用pH范围为2.0-6.9的洗涤缓冲液进行。在某些有趣的实施方案中，洗涤缓冲液的pH范围为6.0-10.0，例如范围为6.0-7.0，或6.5-10.0，当用于亲和树脂时。在某些有趣的实施方案中，洗涤缓冲液的pH范围为6.0-7.0，或范围为7.0-9.0，或范围为3.0-5.0。

洗涤步骤(b)通常以每小时1-50柱体积的流速进行。

洗涤缓冲液通常是含缓冲剂的水溶液，缓冲剂通常包含至少一种选自以下的酸和盐的成分：MES、PIPES、ACES、BES、TES、HEPES、TRIS、BISTRIS、三乙醇胺、组氨酸、咪唑、甘氨酸、双甘氨肽、甘氨酰胺、磷酸、乙酸盐(例如乙酸钠)、乳酸、戊二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、马来酸和琥珀酸。应当理解，缓冲剂可包含两种以上成分的混合物，其中所述混合物能提供指定范围的pH值。实例可包括乙酸和乙酸钠等。

除了缓冲剂之外，洗涤缓冲液还可含有非离子型去垢剂，例如NP40、Triton-X100、吐温-80或其它添加剂例如辛酸。

除了缓冲剂之外，洗涤缓冲液还可含有不改变缓冲液pH的离子强度增强剂，例如氯化钠、硫酸钠等。

洗脱缓冲液可含有5-30％v/v甘油或丙二醇，与上述任一种缓冲剂的组合。

在一个目前优选的实施方案种，步骤(b)包括含有磷酸缓冲液的至少一种洗涤缓冲液。

应当理解，可通过使用1种、2种或多种不同洗涤缓冲液，或者通过使用梯度洗涤缓冲液，进行洗涤步骤(b)。

也应当注意，洗涤步骤和洗脱步骤不一定是分开的步骤，也可以合并，尤其是当梯度洗脱缓冲液用于洗脱步骤时。

步骤(C)-洗脱步骤

洗涤步骤(c)之后，用洗脱缓冲液洗脱亲和树脂，并收集作为洗脱物的纯化抗体。

洗脱步骤(c)中有许多可变性。

洗脱类型并非特别重要，因此，可以例如用包含逐步降低盐梯度的洗脱缓冲液来洗脱，用线性降低的盐梯度来洗脱(或梯度-保持-梯度方式(gradient-hold-gradient profile)或其它不同形式)，或使用pH梯度，或使用温度梯度，或上述的组合。

最终洗脱缓冲液的电导率优选比步骤(a)中含抗体的溶液或悬液的组合物的电导率更高。

在大多数情况下，步骤(c)的洗脱缓冲液通常具有比步骤(a)和(b)的洗脱缓冲液更低的pH。然而，步骤(c)的洗脱缓冲液也可具有比步骤(a)和(b)的洗脱缓冲液更高的pH。

还优选的是步骤(c)的洗脱缓冲液pH介于3.0至5.0之间的实施方案。

在本发明的一个实施方案中，洗脱缓冲液包括10mM甲酸。

在本发明的一个实施方案中，洗脱缓冲液的pH介于3.0至5.0之间并包含离子强度增强剂例如优选浓度为10-500mM的氯化钠。

洗脱步骤(c)通常以1-50柱体积/小时的流速进行。

通常，本发明的方法能降低其它蛋白质含量至少50％，然而更优选和实际上，减低至少60％，例如至少70％或甚至至少80％或至少85％。

通常，亲和树脂可通过一系列步骤而再生，用于后续使用的目的。

应当注意，洗涤步骤和洗脱步骤不一定是分开的步骤，也可以合并，尤其是当梯度洗脱缓冲液用于洗脱步骤时。

尽管不限于此，本发明的方法对于“工业规模”(或“大规模”)的含抗体的溶液或悬液而言是特别可用的。术语“工业规模”通常是指这样的方法：其中液体抗体组合物的体积为至少10L，例如至少50L，例如至少500L，或至少5000L，或者产物重量为至少10g(干物质)，例如至少100g，例如至少500g，例如1-15,000g。

新的亲和树脂

据信本文所述的某些最有趣的亲和树脂是最新型的。因此，本发明也提供新的亲和树脂，所述树脂包含在其上共价固定有一个或多个配体(即上述配体)的固相材料。

本发明也提供新的亲和树脂，所述树脂包含在其上共价固定有一个或多个配体(即上述配体)的固相材料。

本发明的一个实施方案提供用于抗体纯化的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在促进所述抗体部分与亲和树脂结合的条件下，使含有所述抗体的溶液或悬液与所述亲和树脂接触；

(b)任选用洗涤缓冲液洗涤含有结合抗体的所述亲和树脂；和

(c)用洗脱缓冲液洗脱含有结合抗体的所述亲和树脂，并收集作为洗脱物的纯化抗体；

其中所述亲和树脂是在其上共价固定有一个或多个以下通式(I)的配体的固相材料：

其中i＝1，2，...，m，

其中j＝1，2，...，n，

其中n和m独立地为范围在0-3的整数，前提条件是n+m之和在1-4的范围之内，

其中p、q和r独立地为范围在0-6的整数，

A11，...，A1m和A21，...，A2n独立选自α-氨基酸部分、β-氨基酸部分、α-氨基磺酸部分和β-氨基磺酸部分，

Z1和Z2独立选自氢、C_1-6烷基、羧酸部分(Z-C(＝O)-)和磺酸部分(Z-S(＝O)₂-)，其中Z选自氢、任选取代的C_1-12-烷基、任选取代的C_3-12-环烷基、任选取代的C_1-12-烯基、任选取代的C_1-12-炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂环基，

R1和R2独立选自氢和C_1-6-烷基；

X是用于将配体与固相材料连接的基团，无论是直接连接还是通过接头连接，X选自羧酸(-COOH)、羧酸酯(-COOR)、羧酸酐(-COOCOR)、羧酸酰卤(-COHal)、磺酸(-S(＝O)₂OH)、磺酰氯(-S(＝O)₂Cl)、巯基(-SH)、二硫化物(-S-S-R)、羟基(-OH)、醛(C(＝O)H)、环氧化物(-CH(O)CH₂)、氰化物(-CN)、卤素(-Hal)、伯胺(-NH₂)、仲胺(-NHR)、酰肼(-NH＝NH₂)和叠氮化物(-N₃)，其中R选自任选取代的C_1-12-烷基，Hal为卤素；和

所述配体(不包括“X”和任何接头)的总分子量为200-2000g/mol。

本发明的一个实施方案提供抗体纯化方法，其中A11，...，A1m和A21，...，A2n独立选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸、D-谷氨酰胺、D-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸和L-亮氨酸；

本发明的一个实施方案提供抗体纯化方法，其中Z1和Z2独立选自3，3-二苯基-丙酰基、3，5-二-叔丁基-4-羟基-苯甲酰基、一-甲基-邻苯二甲酰基、3-(3，5-二-叔丁基-4-羟基苯基)丙酰基、苯甲酰基、2-噻吩-乙酰基、水杨酰基、4-叔丁基-苯甲酰基、3，5-二甲氧基-2-萘基、萘基、苯基-乙酰基和硫茚基；

R1和R2独立选自氢和C_1-6-烷基；

m为0或1，n为0或1，(p，q)为(0，1)、(0，2)、(0，3)、(0，4)、(1，0)、(2，0)、(3，0)或(4，0)，r为0。

本发明的一个实施方案提供抗体纯化方法，其中所述配体具有以下通式(II)：

本发明的一个实施方案提供抗体纯化方法，其中

p和q独立地为范围在0-6的整数，

其中i＝1，2，...，m，而m是范围在1-4、例如1-3、例如1-2的整数；

A11，...，A1m独立选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸、D-谷氨酰胺、D-酪氨酸和L-缬氨酸；

Z1和Z2独立选自3，3-二苯基-丙酰基、3，5-二-叔丁基-4-羟基-苯甲酰基、一-甲基-邻苯二甲酰基、3-(3，5-二-叔丁基-4-羟基苯基)丙酰基、苯甲酰基、2-噻吩-乙酰基、水杨酰基、4-叔丁基-苯甲酰基、3，5-二甲氧基-2-萘基、萘基、苯基-乙酰基和硫茚基；

5.权利要求4的方法，其中所述配体选自以下(1)-(12)：

本发明的一个实施方案提供抗体纯化方法，其中配体具有以下通式(III)：

7.一种亲和树脂，所述树脂包含其上共价固定有一个或多个下式配体的固相材料：

其中i＝1，2，...，m，

其中j＝1，2，...，n，

其中n和m独立地为范围在0-3的整数，前提条件是n+m之和在1-4的范围之内，

其中p、q和r独立地为范围在0-6的整数，

A11，...，A1m和A21，...，A2n独立选自α-氨基酸部分、β-氨基酸部分、α-氨基磺酸部分和β-氨基磺酸部分，

Z1和Z2独立选自氢、C_1-6烷基、羧酸部分(Z-C(＝O)-)和磺酸部分(Z-S(＝O)₂-)，其中Z选自氢、任选取代的C_1-12-烷基、任选取代的C_3-12-环烷基、任选取代的C_1-12-烯基、任选取代的C_1-12-炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂环基，

R1和R2独立选自氢和C_1-6-烷基；

X是用于将所述配体与所述固相材料连接的基团，无论是直接连接还是通过接头连接，X选自羧酸(-COOH)、羧酸酯(-COOR)、羧酸酐(-COOCOR)、羧酸酰卤(-COHal)、磺酸(-S(＝O)₂OH)、磺酰氯(-S(＝O)₂Cl)、巯基(-SH)、二硫化物(-S-S-R)、羟基(-OH)、醛(C(＝O)H)、环氧化物(-CH(O)CH₂)、氰化物(-CN)、卤素(-Hal)、伯胺(-NH₂)、仲胺(-NHR)、酰肼(-NH＝NH₂)和叠氮化物(-N₃)，其中R选自任选取代的C_1-12-烷基，Hal为卤素；和

所述配体(不包括“X”和任何接头)的总分子量为200-2000g/mol。

本发明的一个实施方案提供亲和树脂，其中所述配体具有以下通式(II)：

本发明的一个实施方案提供亲和树脂，其中所述配体具有以下通式(III)：

本发明的一个实施方案提供选自以上给出的配体(1)-(12)的亲和配体。

在本发明的一个实施方案中，配体如同以上指定的通式(I)、(II)和(III)并且还与多个实施方案一致，尤其是通式(II)和(III)的那些实施方案。目前最有趣的配体是以上给出的配体(1)-(12)。

新的亲和树脂尤其可用于生物分子(例如蛋白质，尤其是抗体)的纯化和/或分离。亲和配体是抗体的特异性结合配偶体并且可从密切相关的蛋白质中分离出所述抗体。

在本发明的一个实施方案中，配体是固定在传感器或阵列板(“固相材料”)表面并用于检测和/或定量检测生物样品中的抗体。

当用于本文时，术语“生物样品”包括天然样品或得自工业过程例如重组过程的抗体，并且包括“体液”，即从生物体或生物体的组织中提取、排泄或分泌的任何液体物质。体液不一定含有细胞。本发明相关体液包括但不限于全血、血清、尿、血浆、脑脊液、泪、乳汁、滑液(sinovial fluid)和羊水。

在本发明的一个实施方案中，多个配体固定在阵列板(“固相材料”)表面并排列成多个点，每个点代表一个配体。这样的官能化阵列可用于检测溶液中抗体的存在。这样的阵列可用于诊断应用，以检测生物样品中抗体的存在。

在本发明的一个实施方案中，多个配体固定在悬臂传感器(“固相材料”)结合表面，用于检测和任选定量检测抗体。多个亲和配体可固定在多个悬臂上，每个悬臂代表一个配体。这样的官能化阵列可用于检测溶液中不同抗体的存在。这样的多重传感器(multi-sensor)可用于诊断应用，以检测生物样品中某些抗体的存在。

此外，据信某些配体是最新型的。

因此，本发明还提供以上指定的具有通式(I)、(II)和(III)的亲和配体，尤其是选自配体(1)-(12)的那些。

实施例

实施例1.采用PCA，选择组合文库的结构单元(BUILDING BLOCK)

通过使用两种平行方法来设计组合文库。首先产生包含229,957个成员的虚拟组合文库。对于每个虚拟文库成员，根据以下文献的方法计算一组118个理化描述符：Cruciani等[Ref.Cruciani，C.等，Molecular fields in quantitative structure-permeation relationships：the VolSurf approach.Journal of Molecular structure-Theochem，2000.503(1-2)：第17-30页；Cruciani，G.，M.Pastor，和W.Guba，VolSurf：a new tool for the pharmacokinetic optimization of lead compounds.European Journal of Pharmaceutical Sciences，2000.11：第S29-S39页]。采用多变量统计来分析所得模型。为了简化模型，将这118个描述符设计成两个主成分。

再优化该组合文库的化学多样性，即通过采用实验设计，合理选择跨越13因次的化学空间(thirteen-dimensional chemical space)的最大可能部分的294个结构。在这些配体中结构单元的频率用于选择过量代表的结构单元(over-represented building block)，其都包括在待合成的组合文库中。

然后在实验室测试所有所选结构单元的偶联得率(coupling yield)并弃去表现出低偶联得率或形成副产物的结构单元。结果就是由770个结构组成的文库。

实施例2：组合文库的合成

旨在与Fc片段结合的亲和配体的组合文库的通用结构见图1。支架选自脂族二-氨基-羧酸，结构单元1和结构单元2独立选自天然氨基酸、非天然氨基酸和羧酸。

图1.三聚配体(A)和四聚配体(B)的通用结构的示意图。

通过采用一珠-一化合物分裂和混合固相合成，合成组合文库。将770个不同配体合成在大约20,000个珠子的光学编码的氨基-功能性聚乙二醇-丙烯酰胺(PEGA)珠上。为了在整个合成过程中与所有化合物保持接触，编码珠技术(encoded bead technology)用于阅读合成所用的光学编码的珠子[WO 2005/061094，WO 2005/062018。用于合成的结构单元见下表I。

表I.用于文库合成的结构单元的完整列表。当用于合成时，提供具有保护基的结构单元。为了与支架偶联，首先使Fmoc-保护的胺反应。

将4.8mL PEGA1900已编码的珠子放入10mL注射器并用NMP(8mL)洗涤4次。然后让珠子在溶剂(8mL)中溶胀45分钟。然后让珠子排干，并通过用20％哌啶的NMP溶液处理而除去Fmoc保护基。经阳性Kaiser试验证实脱保护。然后将树脂等分到5个2ml反应注射器中。受保护的二氨基支架(10当量)用TBTU(9.7当量)和DIPEA(13.3当量)预活化5min，再加入到合适的反应器中。在室温下剧烈振荡45min进行偶联。再排干树脂并用NMP洗涤(8x，2ml；2x 5min)。从每个反应器中取出少量珠子并进行Kaiser试验。在所有情况下，都得到阴性Kaiser试验。在Kaiser试验之后，珠子用水洗涤(10x，2ml；4x 5min)，然后在珠解码器上阅读珠编码。

记录编码之后，将来自各反应器的树脂混合并转移到10ml注射器中，在此用NMP洗涤(8x，8ml，2x 5min+2x 10min)。如前所述地裂解Fmoc基团。将树脂等分到14x 2ml反应注射器中。结构单元1(10当量)用TBTU(9.7当量)和DIPEA(13.3当量)预活化5min，再加入到合适的反应器中。对于氨基酸，在室温下剧烈振荡45min进行偶联，同时残留的结构单元偶联4h。偶联之后，排干树脂，用NMP(8x，2ml，2x 5min)、水(10x，2ml，2x 10min+2x 5min)洗涤，然后阅读珠编码。以类似方式偶联第二结构单元。

实施例3：文库的筛选和结合配体的鉴定

在最后的合成步骤之后，将组合文库分到11个反应器中。将其用新鲜配制的PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤10次。向3.4ml罗丹明X标记的Fc-片段中，加入1.85ml PBS缓冲液(pH 7.4)，得到最终蛋白质浓度为0.40mg/ml。将400μl(160μg蛋白)加入到各反应器中，并将文库孵育过夜(16h)。翌日早晨将反应器用PBS缓冲液洗涤10次并用MilliQ水洗涤10次。然后记录每个珠子的珠编码和荧光强度。对于770个合成配体中的679个，获取数据。对于679个配体的每一个，平均荧光的曲线见下图2。

图2.679个已鉴定配体的平均荧光值。可以看到某些配体的荧光值明显超出背景噪声水平。

根据荧光和解码数据，我们发现，根据其高的平均荧光值，下表II中给出的12个结构是最有希望的亲和配体。

表II.12个配体(与固相结合)的示意图，发现它们因其高荧光值是最有希望与固相材料偶联的。

我们将平均荧光超过69的26个配体作为“命中(hit)”。我们测定了支架和命中的结构单元1和2的频率。结果见下图3。

图3.5个支架的频率(A)、命中的14个结构单元1的频率(B)和11个结构单元2的频率(C)。

图6尤其显示出支架5号(L-二-氨基丙酸)、结构单元1的3号(L-精氨酸)、结构单元1的5号(L-酪氨酸)、结构单元1的6号(D-谷氨酰胺)和结构单元2的10号(硫茚-2-甲酸)是过量代表的(over-represented)。

实施例4：配体命中的再合成和色谱树脂的偶联。

配体合成

使用HMBA接头和Fmoc化学，以克为规模，通过固相合成配体。用氢氧化钠从树脂上裂解而得到配体酸之后，将其通过HPLC纯化。

配体偶联到氨基琼脂糖

将合成配体偶联到氨基-琼脂糖(10μmol/ml，GE Healthcare)色谱树脂。对于每次偶联，将1.7ml氨基-琼脂糖在NMP中溶胀超过1小时的时间。配体(3.5当量)的NMP溶液在室温下用EDC(3当量)、HOAt(3当量)和DIPEA(4当量)预活化5min，再加入到树脂中。然后密封反应管并让反应在60℃振摇下进行3小时。偶联时间结束之后，树脂用NMP、乙醇和水洗涤10次。

配体偶联到Fractogel

将2份1.2ml的氨基Fractogel放入2个反应器中并用NMP充分洗涤45分钟以上。配体(3.5当量)的NMP溶液用EDC(3当量)、HOAt(3当量)和DIPEA(4当量)在室温下预活化5min，再加入到树脂中。然后密封反应管并让反应在60℃剧烈振摇下进行3小时。偶联时间结束之后，树脂用NMP(10x，8ml)、乙醇和水洗涤。

实施例5：用带有FC-结合配体的亲和配体进行抗体纯化。

将树脂填装到Tricorn 5/50柱(GE Healthcare)中直至床体积为1ml(5.1cm床高)。将柱子连接到

Explorer系统并用5ml平衡缓冲液(即50mM NaP，pH 7，0.1M NaCl)平衡。通过超级进样环(superloop)将抗体进料装入柱子，然后用15ml洗涤缓冲液(即50mMNaP，pH 7，0.1M NaCl)洗涤。吸附到柱上的抗体再通过15ml洗脱缓冲液(例如10mM甲酸钠，pH 3.6，100mM NaCl)洗脱。洗脱步骤之后，采用原位清洗步骤，用5ml CIP-溶剂(例如1M氢氧化钠溶液)使柱子再生，然后用10ml平衡缓冲液(即50mM NaP，pH 7，0.1M NaCl)进行重新平衡步骤(未显示在图1中)。平衡、装载、洗涤和洗脱步骤的流速为0.33ml/min(100cm/h)，而CIP和重新平衡步骤的流速为0.5ml/min。典型色谱图见下图4。必要时通过0.5M Na₂HPO₄将洗脱流分调节至pH 7，然后通过SEC-HPLC(图6)和SDS-PAGE(图5)分析纯度。获取的抗体纯度约85％。

图4.人IgG4亲和纯化的色谱图。

图5.凝胶分析：分子量标准(从右边开始的第1道)、IgG4参考(2)、收获物(3)、流通液(4)、洗涤液(5)、洗脱液(6)。

图6.柱洗脱液的分析型HPLC色谱图。

Claims (10)

1.一种用于抗体纯化的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在促进所述抗体的一部分与亲和树脂结合的条件下，使含有所述抗体的溶液或悬液与所述亲和树脂接触；

(b)任选用洗涤缓冲液洗涤含有结合抗体的所述亲和树脂；和

(c)用洗脱缓冲液洗脱含有结合抗体的所述亲和树脂，并收集作为洗脱物的纯化抗体；

其中所述亲和树脂是在其上共价固定有一个或多个以下通式(I)的配体的固相材料：

其中i＝1，2，...，m，

其中j＝1，2，...，n，

其中n和m独立地为范围在0-3的整数，前提条件是n+m之和在1-4的范围之内，

其中p、q和r独立地为范围在0-6的整数，

A11，...，A1m和A21，...，A2n独立选自α-氨基酸部分、β-氨基酸部分、α-氨基磺酸部分和β-氨基磺酸部分，

Z1和Z2独立选自氢、C_1-6烷基、羧酸部分(Z-C(＝O)-)和磺酸部分(Z-S(＝O)₂-)，其中Z选自氢、任选取代的C_1-12-烷基、任选取代的C_3-12-环烷基、任选取代的C_1-12-烯基、任选取代的C_1-12-炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂环基，

R1和R2独立选自氢和C_1-6-烷基；

X是用于将所述配体与所述固相材料连接的基团，无论是直接连接还是通过接头连接，X选自羧酸(-COOH)、羧酸酯(-COOR)、羧酸酐(-COOCOR)、羧酸酰卤(-COHal)、磺酸(-S(＝O)₂OH)、磺酰氯(-S(＝O)₂Cl)、巯基(-SH)、二硫化物(-S-S-R)、羟基(-OH)、醛(C(＝O)H)、环氧化物(-CH(O)CH₂)、氰化物(-CN)、卤素(-Hal)、伯胺(-NH₂)、仲胺(-NHR)、酰肼(-NH＝NH₂)和叠氮化物(-N₃)，其中R选自任选取代的C_1-12-烷基，Hal为卤素；和

不包括“X”和任何接头的所述配体的总分子量为200-2000g/mol。

2.权利要求1的方法，其中

A11，...，A1m和A21，...，A2n独立选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸、D-谷氨酰胺、D-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸和L-亮氨酸；

Z1和Z2独立选自3，3-二苯基-丙酰基、3，5-二-叔丁基-4-羟基-苯甲酰基、一-甲基-邻苯二甲酰基、3-(3，5-二-叔丁基-4-羟基苯基)丙酰基、苯甲酰基、2-噻吩-乙酰基、水杨酰基、4-叔丁基-苯甲酰基、3，5-二甲氧基-2-萘基、萘基、苯基-乙酰基和硫茚基；

R1和R2独立选自氢和C_1-6-烷基；

m为0或1，n为0或1，(p，q)为(0，1)、(0，2)、(0，3)、(0，4)、(1，0)、(2，0)、(3，0)或(4，0)，r为0。

3.权利要求1的方法，其中所述配体具有以下通式(II)：

4.权利要求3的方法，其中

p和q独立地为范围在0-6的整数，

其中i＝1，2，...，m，而m是范围在1-4、例如1-3、例如1-2的整数；

A11，...，A1m独立选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸、D-谷氨酰胺、D-酪氨酸和L-缬氨酸；

Z1和Z2独立选自3，3-二苯基-丙酰基、3，5-二-叔丁基-4-羟基-苯甲酰基、一-甲基-邻苯二甲酰基、3-(3，5-二-叔丁基-4-羟基苯基)丙酰基、苯甲酰基、2-噻吩-乙酰基、水杨酰基、4-叔丁基-苯甲酰基、3，5-二甲氧基-2-萘基、萘基、苯基-乙酰基和硫茚基。

5.权利要求4的方法，其中所述配体选自以下(1)-(12)：

6.权利要求1的方法，其中所述配体具有以下通式(III)：

7.一种亲和树脂，所述树脂包含其上共价固定有一个或多个下式配体的固相材料：

其中i＝1，2，...，m，

其中j＝1，2，...，n，

其中n和m独立地为范围在0-3的整数，前提条件是n+m之和在1-4的范围之内，

其中p、q和r独立地为范围在0-6的整数，

A11，...，A1m和A21，...，A2n独立选自α-氨基酸部分、β-氨基酸部分、α-氨基磺酸部分和β-氨基磺酸部分，

Z1和Z2独立选自氢、C_1-6烷基、羧酸部分(Z-C(＝O)-)和磺酸部分(Z-S(＝O)₂-)，其中Z选自氢、任选取代的C_1-12-烷基、任选取代的C_3-12-环烷基、任选取代的C_1-12-烯基、任选取代的C_1-12-炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂环基，

R1和R2独立选自氢和C_1-6-烷基；

X是用于将所述配体与所述固相材料连接的基团，无论是直接连接还是通过接头连接，X选自羧酸(-COOH)、羧酸酯(-COOR)、羧酸酐(-COOCOR)、羧酸酰卤(-COHal)、磺酸(-S(＝O)₂OH)、磺酰氯(-S(＝O)₂Cl)、巯基(-SH)、二硫化物(-S-S-R)、羟基(-OH)、醛(C(＝O)H)、环氧化物(-CH(O)CH₂)、氰化物(-CN)、卤素(-Hal)、伯胺(-NH₂)、仲胺(-NHR)、酰肼(-NH＝NH₂)和叠氮化物(-N₃)，其中R选自任选取代的C_1-12-烷基，Hal为卤素；和

不包括“X”和任何接头的所述配体的总分子量为200-2000g/mol。

8.权利要求7的亲和树脂，其中所述配体具有以下通式(II)：

9.权利要求7的亲和树脂，其中所述配体具有以下通式(III)：

10.一种选自本文给出的配体(1)-(12)的亲和配体。

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