JP2020504172A - 免疫グロブリン結合ポリペプチドおよびオリゴペプチドの免疫グロブリン結合容量を増加するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

免疫グロブリン結合容量が向上した材料を生成するための組成物および方法を提供し、この材料は、その部分がポリペプチドドメインを含有する、完全長もしくは短縮型のプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬおよび他の免疫グロブリン結合タンパク質もしくはペプチド、またはポリペプチドとオリゴペプチドの組合せを含む。また、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン含有タンパク質を分離するための、部分を含む分離マトリックス、および分離マトリックスを使用する方法を提供する。

Description

関連出願
本願は、２０１６年１２月１２日に出願され、“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅｓ”と題する、発明者がＲａｊｉｖ ＤａｔａｒおよびＣａｒｏｌｅ Ｍａｒｉｅ Ｌａｉｎe'である仮出願番号第６２／４３２，８０７号の利益を主張している。

技術分野
ＩｇＧ結合オリゴペプチドと組み合わせた完全長または短縮型のプロテインＡの誘導体の組成物および使用方法を提供する。

背景
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）薬物の数は、増え続けている。２００８年、ＭＡｂは、１５０億米ドルを超える収益を挙げ（Leavy O.２０１０年Nat. Rev. Immunol １０巻：２９７頁）、ＭＡｂをすべての生物療法で最も収益の高いカテゴリーに属するものとした。２０１１年９月および１１月に公開されたＶｉｓｉｏｎｇａｉｎの報告（Visiongain ２０１１年London、UK、www.visiongain.com/Report/685/Therapeutic-Monoclonal-Antibodies-World-Market-2011-2021；Visiongain２０１１年London、UK、www.visiongain.com/Report/712/Next-Generation-Antibody-Therapies-Pipeline-and-Market-2011-2021）によれば、世界のＭＡｂ市場は、２０１５年に６２３億ドルに達し、次世代治療抗体の収益は、２０１５年に２３億ドルに達する。規制当局が、バイオシミラー抗体のための承認経路を明らかとしたため、バイオシミラー抗体もまた、既存の市場に参入し始めている。多くの抗体薬物は、がんおよび自己免疫疾患を治療し、他の多くは、希少疾患および感染性疾患の治療に使用する。残念ながら抗体は、その精製および特徴付けを複雑とする、多様なパラメーターにおいて複雑なタンパク質であり、厳格な治療学的要件を満たすことを、その開発者にとって困難なものとしている。

治療抗体構造における天然の多様性と操作された多様性の両方のために、ＭＡｂの精製技術に関して言えば、「万能」なものはない。最も近似的に汎用される方法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーであり、これは抗体生成に貢献する主力技術となった。しかし、プロテインＡは、高価であり（従来のクロマトグラフィー樹脂を１桁超えるコストにより）、プロテアーゼによる分解を受けやすく（切断されたドメインが、ＭＡｂ生成物に付着し得る、分離を複雑化する問題）（Carter-Franklin, JNら２００７年J. Chromatogr. A１１６３巻、２００７年１０５〜１１１頁）、カラム洗浄および溶出条件に対して十分には安定しない。さらに、プロテインＡは、免疫調節応答を生じ、能力が制限されて、最新の上流フィードにおいて見られるような次第に高まる力価を順応させる。

Leavy O.２０１０年Nat. Rev. Immunol １０巻：２９７頁 Visiongain ２０１１年London、UK、www.visiongain.com/Report/685/Therapeutic-Monoclonal-Antibodies-World-Market-2011-2021 Visiongain２０１１年London、UK、www.visiongain.com/Report/712/Next-Generation-Antibody-Therapies-Pipeline-and-Market-2011-2021 Carter-Franklin, JNら２００７年J. Chromatogr. A１１６３巻、２００７年１０５〜１１１頁

抗体精製の分野は進歩しているが、そこに関連する企業間では、新技術に投資、導入し、および／または精製技術をさらに進展させるのにいくぶん二の足を踏んでいた。新規の代替物は、「破壊的」であるとして記載されており（Low, Dら２００７年J. Chromatog. B ８４８巻（１号）Ｓ４８〜Ｓ６３頁）、プロテインＡは、しばらくの間、商業規模のＭＡｂ精製に使用され続けるであろうと予測している（Low, Dら２００７年J. Chromatog. B ８４８巻（１号）Ｓ４８〜Ｓ６３頁；Shukla, AAら２００７年J. Chromatogr. B ８４８巻（１号）Ｓ２８〜Ｓ３９頁）。生成コストを低下し、そのような資金を分配し、それによって医薬をより患者の手に届くものとすることが産業において必要とされている。バイオシミラー（またはバイオ後続品）の出現およびこのような製品に出資しようとする益々多くの企業により、ＩｇＧ精製のための新規のアプローチに関する必要性を作り出している（Gagnon, P. ２０１２年J. Chromatogr. A１２２１巻、５７〜７０頁）。

実施形態の要旨
本発明の態様は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン含有化合物に結合する操作されたポリペプチドであって、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、および他の免疫グロブリン結合タンパク質、ならびにそれらの機能性バリアントまたは部分の群から選択される、少なくとも１つの天然に存在するかまたは組換え免疫グロブリン結合タンパク質の少なくとも１つの機能性部分を含み、少なくとも１つの合成の機能性免疫グロブリン結合オリゴペプチドと、結合タンパク質の末端アミノ酸残基または内部リシンのような内部残基において化学的にコンジュゲートまたは遺伝子融合している、ポリペプチドを本明細書において提供する。

例えば、ポリペプチドは、前記群からの複数の前記機能性部分および／または前記機能性結合タンパク質部分のうちの１つの反復を含有する。ポリペプチドは、別の実施形態では、少なくとも２つの機能性部分をつなぐ少なくとも１つの連結エレメントをさらに含む。例えば、連結エレメントは、アミノ酸配列を有し、アミノ酸を約１８００個未満、またはアミノ酸を約９５個未満含有する。例えば、連結エレメントは、アミノ酸を約２〜約５４個、またはアミノ酸を約４〜約１０個含有する。

ポリペプチドの実施形態では、結合タンパク質の機能性部分は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、１１、１４、１５、１６および１７、ならびにその機能性バリアントおよび部分の群から選択されるアミノ酸配列を有する。ポリペプチドの実施形態では、オリゴペプチドは、配列番号８〜１０および１８〜２３のアミノ酸配列、このようなアミノ酸配列の機能性バリアントおよび部分、この配列の複数のコピーを有する反復、ならびにこれらの配列の機能性保存的アミノ酸置換のうちの少なくとも１つから選択される。

ポリペプチドの種々の実施形態では、機能性部分は、標的とするクラスのＩｇＧ免疫グロブリンまたは免疫グロブリン含有化合物に結合するために選択され、ポリペプチドは、高速流量動態を特徴とする大容量捕捉床に分離マトリックス媒体をさらに含有する。

免疫グロブリンまたは免疫グロブリン含有化合物に結合する操作されたポリペプチドであって、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、および他のＩｇ結合タンパク質、ならびにそれらの機能性バリアントまたは部分の群から選択される天然に存在するかまたは組換えの免疫グロブリン結合タンパク質またはオリゴペプチドの少なくとも１つの機能性部分を含有するポリペプチドにおいて、改良が、機能性部分またはその機能性バリアントもしくは部分のアミノ酸配列またはその部分の少なくとも１つのコピーを含有し、そしてさらに末端アミノ酸残基に化学的にコンジュゲートもしくは遺伝子融合しているか、または内部リシンのような内部残基内でコンジュゲートもしくは融合している少なくとも１つのオリゴペプチドを含む。

本発明の態様では、固体支持体とカップリングしている、本明細書に記載のポリペプチドを含む分離マトリックスを提供する。例えば、固体支持体は、好ましくは、ビーズおよびシートの群から選択される形態を有する医療グレードの多孔質ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）媒体を含む。他の例では、ＰＶＣ媒体は、多孔質タンパク質吸着性支持体表面で包埋されるか、またはそれを構成し、媒体は、より大きい孔径が平均で約０．５〜５．０マイクロメートルの範囲であり、より小さい孔径が平均で約０．００３〜０．３マイクロメートルの範囲である二峰性孔径分布を有する。種々の実施形態では、支持体表面材料は、セルロース、アガロース、ナイロン、多孔質メタロイド酸化物、多孔質金属酸化物、および多孔質混合金属酸化物、シリカ粒子、シリカゲル、調節多孔ガラス、アルミナ、スタニア（ｓｔａｎｎｉａ）、チタニア、ならびにジルコニアからなる群から選択される。種々の実施形態では、ポリペプチドならびに固体支持体および支持体表面材料が、単一点付着によりカップリングしている。あるいは、分離マトリックスは一般に、固体支持体であり、支持体表面材料が、複数付着によりカップリングしている。

本明細書において提供する本発明の分離マトリックスの態様は、非常に高い結合容量を有し、例えば、ポリペプチドの免疫グロブリン結合容量は、少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌ床体積、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ床体積、少なくとも約７５ｍｇ／ｍｌ床体積である。さらに、分離マトリックスは、少なくとも約５００倍、１０００倍、２０００倍、または少なくとも約３０００倍のスケールアップファクタの増加にわたって、線形で再現性のあるスケールアップ容量を有する。種々の実施形態の分離マトリックスは、固体支持体および支持体表面材料の少なくとも１つに付着する少なくとも１つのリンカーを含む。一般に、リンカーは、アミノ酸配列、ランダムアミノ酸ポリマー、ポリエチレングリコールから選択され、化学的に、または遺伝子融合によりポリペプチドに共有結合で付着している。

本発明の態様では、ＱＰＱＭＳＨＭ（配列番号９）；ＫＰＧＫＥＤＮＮ（配列番号１０）；ＣＰＳＴＨＷＫ（配列番号１８）；ＮＶＱＹＦＡＶ（配列番号１９）；ＡＳＨＴＱＫＳ（配列番号２０）；ＴＮＩＥＳＬＫ（配列番号２１）；ＮＣＨＫＣＷＮ（配列番号２２）；および、ＳＨＬＳＫＮＶ（配列番号２３）の群から選択されるアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを含む組成物を提供する。例えば、本発明の態様では、配列番号１６または１７によるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。種々の実施形態は、８５％同一、９０％同一、９５％同一または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態は、これらのオリゴペプチドのいずれかの少なくとも１つのコピーを含有するポリペプチドまたはタンパク質を含む。さらに他の実施形態は、樹脂、膜、フィルター、およびビーズの群から選択される支持体に固定されている、本発明のオリゴペプチドまたはポリペプチド組成物のいずれかを含有するクロマトグラフィー用媒体を含む。これらの組成物は、欠失、付加、または保存的置換に起因する１つまたは複数の変化から生じる、最大１５％のアミノ酸配列の変化を有するいずれかを含む。

本発明の態様では、免疫グロブリンを生体試料から精製する方法であって、免疫グロブリンを、分離マトリックスに選択的かつ特異的に結合させるためのイオン強度およびｐＨの条件下で試料を接触させるステップ、および他の試料成分を通過させるステップ、および必要に応じてカラムを洗浄するステップ、および結合した免疫グロブリンを、ローディングバッファーと比較して：減少したｐＨ、増大したｐＨ、増大したイオン強度、および競合的結合リガンドの存在からなる群から選択される特徴付けられる群から選択されるものを含有する溶出バッファーを用いてマトリックスから溶出するステップであって、それによって免疫グロブリンを精製するステップを含む、方法を提供する。

この方法の実施形態では、分離マトリックスは、ポリペプチド、または複数のポリペプチドからなり、これはそれぞれ、少なくとも１つまたは複数のオリゴペプチドを含み、このポリペプチドおよびオリゴペプチドはそれぞれ、非同一であり、免疫グロブリンのクラスに対して非同一の親和性を有し、この方法は、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤの群から選択される、少なくとも１つまたは複数の抗体型を精製するステップをさらに含む。代替実施形態では、方法は、ＩｇＧ種のみ、例えば、抗体型ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３およびＩｇＧ_４のすべてのうちの１つまたは複数を選択的に精製するステップをさらに含む。

図１は、プロテインＡ鎖のＮ末端である１、シグナル配列である２、続いて５つのＩｇＧ結合ドメインであるＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣを含む、天然プロテインＡドメインの概略マップである。プロテインＡ分子のＣ末端半分は、Ｘドメイン、およびＬＰＸＴＧモチーフである３、および疎水性領域である４からなる。

図２は、天然Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＮＣＴＣ株８３２５−４）プロテインＡのアミノ酸配列（配列番号１）である（Lofdahl, Sら１９８３年Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８０巻、６９７〜７０１頁）。Ｎ末端の下線を引いた配列は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓシグナルペプチドを表す。Ｃ末端の下線を引いた配列は、Ｘドメインを表す。

図３は、機能性ドメイン：ＩｇＧ結合Ｅドメイン（配列番号２）、ＩｇＧ結合Ｄドメイン（配列番号３）、ＩｇＧ結合Ａドメイン（配列番号４）、ＩｇＧ結合Ｂドメイン（配列番号５）、ＩｇＧ結合Ｃドメイン（配列番号６）およびＸドメイン（配列番号７）のアミノ酸プロテインＡ配列を示す。Ｘドメインである配列番号７は、下線を引いたセグメントにおいて、アミノ酸配列ＫＰＧＫＥＤＮＮまたはこの２つの残基のバリアントを右に有する１２個の繰返しオクタペプチド単位を含有し、配列番号７のＸ領域のこれらの繰返しの５個についてはＮＮであり、他の繰返し中ではＮＫまたはＧＮである。

図４Ａは、直鎖状ポリペプチド５を生成する特定の長さ「ｎ」を有する、天然アミノ酸により、または天然アミノ酸と非天然アミノ酸の組合せにより形成される構造の概略図である。アミノ酸鎖を含むリンカーの長さは、単一アミノ酸１個からアミノ酸１，８００個まで、またはそれを超えるアミノ酸の個数であり得る。

図４Ｂは、ＩｇＧタンパク質結合に対する親和性を有する例示的オリゴペプチドのアミノ酸配列である。これらのオリゴペプチドは、いずれかの方式、または例えば、図３に示すエレメントとの組合せで、単量体単位（単一コピー）としてより長いタンパク質に操作することができるか、または一緒に連結させてより長鎖のポリペプチドを形成するか、もしくはタンパク質の推奨する位置に散在させることができる。プロテインＡは、例えば、ヒトＩｇＧ_３に結合しないことが公知である（プロテインＡが、免疫グロブリンＩｇＧおよびＩｇＭに特異的に、ならびにヒト由来および他の哺乳動物種由来のＩｇＧのサブクラスに特異的に結合することを示す表１を参照されたい）。このようなペプチドは、本発明の主題である、タンパク質−ポリペプチドまたはポリペプチド−ポリペプチド部分の種々の実施形態に対して追加の特異性を付与して、より広範な免疫グロブリンを１ステップで捕捉するように操作することができる。

図５は、流量（横軸）の関数としてのＩｇＧ結合容量（縦軸）のグラフ表示である。左上の象限は、クロマトグラフィー樹脂またはビーズを含有する、先行技術の充填カラムの動作範囲を示し、右下の象限は、膜吸着器の動作範囲を示す。能力および速度を最適化する理想的な領域を図５に示す。最適技術間の「Ｙ」成分の差は、充填カラム技術により示される「Ｘ」成分の差を超える。

図６は、種々のタンパク質−ポリペプチド部分またはタンパク質ドメインとオリゴペプチドの組合せの概略的な例をそれぞれ示し、８および９に示すような、多様な組合せを形成するように、６および７に示すような、５つのＩｇＧ結合ドメインのいずれかの中からそれぞれ操作することが可能である。

図７は、お互いに、および図４Ａ〜４Ｂのポリペプチド部分に連結した完全長または短縮型プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの概略的な代表例である。プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインは、１つの単一ドメインの繰返し単位（例えば、ドメインＥの連続的オリゴマー、例えば、Ｅ−Ｅ−Ｅ−．．．、または１つもしくは複数のオリゴペプチドもしくはリンカーが散在するようなオリゴマー）、または特定のＩｇＧ結合作用のために望まれ得るような、お互いの組合せのいずれかであってもよい。

図８は、本明細書および本特許請求の範囲に記載の支持マトリックス１４に結合する、本明細書において操作されたポリペプチド７の描写である。支持マトリックス１４は、固体支持体であるか、または多孔質の性質である。組成物７は、支持マトリックス１４の表面に付着するか、または支持マトリックス１４の表面上および支持マトリックス１４の表面内で成長され得る。

図９は、表５におけるデータのグラフ表示であり、本発明の方法および組成物の使用による、床体積の関数としてのＩｇＧの結合が、少なくとも３桁の範囲にわたる予想外のスケールアップの線形性を示す。Ｘ軸の非常に低い下限では、床体積は４ｍＬである。上限では、床体積は１０，４５８ｍＬである。床体積に関するスケールアップファクタは、２，６１５倍である。ＩｇＧ結合量は、下限では０．１ｇであるが、上限では２６４ｇであり、少なくとも倍率が２，６４０倍のスケールアップ容量をもたらす。さらに大きな床体積を有する例では、上限において２倍となり、同程度のスケールアップの線形性が生じる。

図１０は、本明細書において操作されたプロテインＡ誘導体のアミノ酸配列、配列番号１１であり、これは細胞質発現による生成用に設計したものである。図２のアミノ末端において下線を引いて示す３６個のアミノ酸リーダー配列をコードする部分を除去するように、このアミノ酸配列をコードする遺伝子を操作して、追加のカルボキシ末端の３１個のアミノ酸をコードする遺伝物質を除去するように、さらに操作して、産生細胞においてタンパク質の発現を生じさせた。アミノ酸配列をコードする遺伝子は、コドンがＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに最適化するように設計、合成し、制限酵素分析により配列を検証した。市販の標準ベクターにおいて遺伝子をクローニングした。

図１１は、本明細書において操作されたプロテインＡ誘導体のアミノ酸配列、配列番号１２であり、これは細菌ペリプラズム発現用に設計したものである。配列番号１２をコードする遺伝子は、２０個のアミノ酸のアミノ末端リーダーシグナル配列を有するように、配列番号１１をコードする遺伝子からさらに操作して、細胞膜周辺腔内に分泌されそこに留まるプロテインＡ誘導体を結果として生じさせた。アミノ酸配列をコードする遺伝子は、コドンがＥ．ｃｏｌｉに最適化するように設計、合成し、制限酵素分析により配列を検証した。本明細書に記載の標準ベクターにおいて遺伝子をクローニングした。

図１２は、本明細書において操作されたプロテインＡ誘導体のアミノ酸配列、配列番号１３であり、細胞外発現用に設計されており、図２に示す天然Ｓ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡの完全リーダー配列を含有し、図１０の追加のカルボキシ末端の３１個のアミノ酸を欠く。アミノ酸配列をコードする遺伝子は、コドンがＥ．ｃｏｌｉに最適化するように設計、合成し、制限酵素分析により配列を検証した。標準ベクターにおいて遺伝子をクローニングした。

図１３は、プロテインＡの２つの操作されたバージョンのアミノ酸配列を示す。欠失バージョンは、４１５個のアミノ酸残基、配列番号１４を有するように設計され、天然シグナル配列を除去し、カルボキシ末端から３５個のアミノ酸を除去するように構築して、アミノ末端においてメチオニン開始残基を有した。４５０個のアミノ酸バージョン、配列番号１５は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡシグナル配列を含有させて、生成時の分泌およびプロセシングを方向付ける。残基３２７と３２８、および３３２と３３３それぞれの間の縦棒は、それぞれの位置に挿入するオリゴペプチドおよびリンカーを含有する、２つの操作されたプロテインＡ誘導体の設計および構築のためのそれぞれの挿入点を示す。アミノ酸配列、配列番号１６を有する操作されたポリペプチドＢＩＧ＿Ｈｅｐ４＿ｌｉｎ１ｏｐｔ４＿ＥｘＣは、アミノ酸残基３２７と３２８との間に挿入することにより構築し、ＢＩＧ＿Ｈｅｐ４＿ｌｉｎ３ｏｐｔ４＿ＥｘＣアミノ酸配列、配列番号１７は、３３２と３３３との間に挿入することにより構築する。

図１４は、リンカー配列、およびそのタンパク質が、免疫グロブリンとの結合が増強されるように操作された、配列番号９の操作されたヘプタペプチド反復の複数のコピーの挿入物を含有する、設計および合成したプロテインＡ誘導体のアミノ酸配列を示す。構築物ＢＩＧ＿Ｈｅｐ４＿ｌｉｎ１ｏｐｔ４＿ＥｘＣのアミノ酸配列である配列番号１６の５４３個のアミノ酸は、設計したリンカーと、濃い長方形で示すアミノ酸配列ＱＰＱＭＳＨＭ（配列番号９）をそれぞれが有する、３つの包埋したヘプタペプチド反復とを有する、灰色のハイライトで示す挿入物を残基３３３から残基４２５に含有する。構築物ＢＩＧ＿Ｈｅｐ４＿ｌｉｎ３ｏｐｔ４＿ＥｘＣである配列番号１７の５３３個のアミノ酸は、設計したリンカーと、同様に示す３つの包埋したヘプタペプチド反復とを有する挿入物を残基３２８から残基４１０に含む。

図１５は、ｐＥＴ３０Ｂ＋の基礎環境においてクローニングした、操作されたプロテインＡ構築物ＢＩＧ＿Ｈｅｐ４＿ｌｉｎ１ｏｐｔ４＿ＥｘＣの発現および分泌のための６９１９ｂｐのベクターの制限酵素地図である。プロテインＡ構築物は、反時計回りに転写されたＴ７プロモーターから発現する。

図１６は、ｐＥＴ３０Ｂ＋の基礎環境においてクローニングした、操作されたプロテインＡ構築物ＢＩＧ＿Ｈｅｐ４＿ｌｉｎ３ｏｐｔ４＿ＥｘＣの発現および分泌のための６８８９ｂｐのベクターの制限酵素地図である。プロテインＡ構築物は、反時計回りに転写されたＴ７プロモーターから発現する。

図１７は、プラスミドｐＥＴ３０Ｂ＋の基礎環境においてクローニングし、３つの各培地（ＬＢ、ＴＢおよびＭ９最少培地）中で培養した、操作されたプロテインＡ構築物ＢＩＧ＿Ｈｅｐ４＿ｌｉｎ１ｏｐｔ４＿ＥｘＣをコードする遺伝子を保有する細胞の上清の２０μＬの試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真であり、発現の誘導後に指示した時点（それぞれ０時間、３時間および６時間）で試料を採取した。矢印は、予測分子量を有する発現したタンパク質を示す。分子量標準（ＭＷ ｋＤａ）を左列に適用した。

詳細な説明
プロテインＡ：プロテインＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの細胞壁に係留された４２ｋＤａのタンパク質であり（Sjoquist, Jら１９７２年Eur. J. Biochem.３０巻（１号）１９０〜１９４頁）、免疫グロブリン（ＩｇＧ）と選択的に相互作用する能力を有する（Langone, JJ.１９８２年 Adv. Immunol.３２巻、１５７〜２５２頁）。これは、ＩｇＧ_３を除いたヒトＩｇＧのすべてのクラスに強力に結合する（ Ｌａｎｇｏｎｅ、ＪＪ 上記）。完全長のプロテインＡは、５つの相同ドメイン（Ｎ末端からのそれらの配列順にＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣと呼ばれる）および１つの細胞壁関連ドメイン（ Ｌｏｆｄａｈｌら１９８３年上記；Guss, B,ら１９８４年Eur. J. Biochem.１３８巻（２号）４１３〜４２０頁）からなる。プロテインＡは、当初は、Ｓ． ａｕｒｅｕｓのＣｏｗａｎ株を培養し、タンパク質を細菌細胞壁から抽出することにより生成した（Sjoquist, Jら１９７２年Eur. J. Biochem.２９巻（３号）５７２〜５７８頁）。天然のＳ． ａｕｒｅｕｓプロテインＡの配列を図２（配列番号１）に示す。Ｓ． ａｕｒｅｕｓの株は、その培養上清中にプロテインＡを分泌することが後に見出された（Lindmark, Rら１９７７年Eur. J. Biochem.７４巻（３号）６２３〜６２８頁）。組換えＤＮＡ技術が進歩するにつれて、プロテインＡは、その細胞壁ドメインを有しない断片として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを発現宿主として使用して発現した（Duggleby, CJら１９８３年Nucl. Acids Res.１１巻（１０号）３０６５〜３０７６頁；Hammond, PMら１９９０年Ann. NY Acad. Sci.６１３巻、８６３〜８６７頁；Cai, Sら１９９２年Chin. J. Biotechnol.８巻（２号）９３〜９８頁；Engel, Hら１９９２年Prot. Expr. Purif ３巻（２号）１９９２年：１０８〜１１３頁）。プロテインＡの種々の操作された誘導体を図１０〜１２に示す。この誘導体は、発現するように、かつ細胞内の細胞膜周辺腔内に、または細胞外の細菌発現ベクターおよび宿主細胞内にそれぞれ位置するように操作した。

ＩｇＧは、プロテインＡにＩｇＧ Ｆｃ領域で結合する（Lindmark, Rら１９８３年J. Immunol. Meth.６２巻（１号）１９８３年：１〜１３頁；Gouda, Hら１９９８年Biochem.３７巻（１号）１２９〜１３６頁）。この相互作用は、非常に特異的かつ疎水性の性質である。これは、いくつかの水素結合および２つの塩橋を含む。この高い特異性によって、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞採取培地のような複合溶液から９８％を超える不純物を、単一の精製ステップにおいて除去することが可能となる（Follman, DKら２００４年J. Chromatogr. A１０２４巻：７９〜８５頁）。プロテインＡのＩｇＧとの相互作用の周知の特異性の１つの欠点は、溶出に低いｐＨを用いるような厳しい条件における使用を必要とすることである。このことは、低いｐＨレベルで、不安定であるか、または凝集する傾向があるいくつかの抗体では問題となり得る。一般には、少量の不純物、例えば、凝集物、残留宿主細胞タンパク質、ＤＮＡおよび浸出したプロテインＡのみが、下流プロセス操作のこの単一開始単位の後に留まることとなる。これらの残存不純物は通常、１回または２回の追加のクロマトグラフィーステップにおいて除去する。

アフィニティー支持体：プロテインＡは、タンパク質の液体クロマトグラフィーに適した多数の型の支持体に固定化されている（Boschetti, Eら２０００年Academic Press：San Diego、CA、５３５頁；表２を参照）。当初は、一般的な製品は、スウェーデンのＡｍｅｒｓｈａｍ製（現在はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ ４Ｂ上に固定したプロテインＡであった。媒体は、高い選択性および低い非特異的吸着性を有すると特徴付けられるが、アガロースベースの支持体の性質のために、充填床は、高流量を可能とするには柔軟過ぎた。このような理由により、この媒体は、大規模な適用のため、より高度に架橋するＳｅｐｈａｒｏｓｅにほとんど取って代わられた。最新のプロテインＡ吸着剤は、調節多孔質ガラス、コートした多孔質ポリマーゲル充填無機材料、および他の支持体をベースとし（Hahn, sRら２００３年J. Chromatogr. B ７９０巻２００３年：３５〜５１頁）、高流量でのカラム操作を可能とする十分に剛性の材料を使用する。例示的な支持体材料は、Laine, CによりＥＰ２９０２０９４、２０１５年５月８日公開に示されている。

最先端技術：抗体のアフィニティー精製のための固定化プロテインＡの使用に関する４０年以上前の最初の報告以来（Hjelm, Hら１９７２年FEBS Lett.２８巻（１号）１９７２年７３〜７６頁；Kronvall G.１９７３年J. Immunol.１１１巻（５号）１４０１〜１４０６頁）、これは、臨床グレードＭＡｂの精製における産業の標準となった（Gagnon P.１９９６年Validated Biosystems Inc.：Tucson、AZ）。Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈのムロモナブ（Muronomab）（商品名Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３）は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により１９８６年に認可された（Becker, H.２００７年Handbook of Therapeutic Antibodies III巻：Approved Therapeutics. Dubel S編、 Wiley-VCH：Weinheim、Germany.９０５〜９４０頁）、急性移植拒絶反応の治療における使用のためのＣＤ３特異的ＭＡｂであり、その製造プロセスの捕捉ステップとしてプロテインＡを使用して製造された、早期に認可された製品である。プロテインＡによる捕捉は、抗体の下流処理における鍵となる容量低減ステップとして作用する。プロテインＡクロマトグラフィーの精製スキームは、中性ｐＨでの結合および酸性ｐＨでの溶出を含む。方法開発の容易さにより、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーが大規模製造プロセスにほぼ普遍的に採用されるようになり、ほぼ普遍的な適用性および関連する操作条件の全体的スキームは、それら自体、プラットフォーム形式に直ちに役立つ（Shukla, AAら２００７年J. Chromatogr. B ８４８巻（１号）Ｓ２８〜Ｓ３９頁）。

経済：コストは、医療費に関しては、別の非常に重要な因子である。いくつかのプロテインＡ樹脂は、１５，０００ドル／Ｌ程度のコストがかかる。表２は、２０１３年からの価格を示し、これらが現行価値を低く見積もっていることが予測される。参入者数が増加し、競争率が増大しても、価格は非常に高いままである。Ｒｅｐｌｉｇｅｎ樹脂は、約６，０００ドル／Ｌのコストがかかり、０．１ＮのＮａＯＨのみに耐容性を有する。プロテインＡの主な制限は、コストよりもむしろ能力または生産性であり（Gagnon, P.２０１２年J. Chromatogr. A １２２１巻、５７〜７０頁）、能力の問題は、固定床における多孔質粒子の使用から生じると議論されている。プロテインＡ分子それ自体は、そのサイズのため、多孔質媒体において孔内空間が多くの容量を占める。

他のクロマトグラフィー法：拡張型床吸着（ｅｘｐａｎｄｅｄ−ｂｅｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）（ＥＢＡ）として公知である、さらに開発中の流動クロマトグラフィー技術のうちの１つの型に相当量の努力が重ねられている。これは、液体媒体中に分散した吸着粒子の使用を含む。ＥＢＡの１つの主な利点は、細胞懸濁液から生成物を直接捕捉するのに抗体回収に必要とされるステップ数が低減されることである。しかし、抗体では、これを適用すると、プロテインＡを置き換えることができず、アガロースに結合した形態のプロテインＡを使用してＥＢＡ中で抗体を捕捉する。

膜吸着器（「膜クロマトグラフィー」）は、廃棄性（洗浄および確認の必要性を排除する）と高流量で操作する能力の両方の点で従来の樹脂を超える明らかな利点をもたらす。しかしながら、これらの表面領域が狭いため、ほとんどの膜吸着器では、等量の多孔質粒子と比較して結合容量が低いことに悩まされる。その制限に対する例外は、例えば、Ｎａｔｒｉｘ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓにより開発された膜技術であり（Kuczewski M,ら２０１１年Biotechnol. J.６巻（１号）５６〜６５頁）、軟性多孔質支持マトリックス中に形成した高分子ヒドロゲルからなる膜を用いる。そのマクロ多孔質ヒドロゲルポリマー構造は、高い結合部位密度および結合のための広い表面領域および急速な物質移動をもたらす。

Ｋｕｃｚｗｅｓｋｉら上記は、Ｎａｔｒｉｘ製のＣ膜を使用して膜ベース、高容量の陽イオン交換ＭＡｂ捕捉ステップを開発した。彼らは、膜１ミリリットルあたり５５ｍｇの抗体容量を報告した。これは、他の膜吸着器の容量の約５倍である（Gottschalk, U.２００５年Biopharm Int.１８巻（６号）：４２〜５８頁）。表３は、いくつかの市販のプロテインＡ吸着剤の結合容量を３０ｍｇ／ｍＬ〜４５ｍｇ／ｍＬ範囲で示す。低容量および空隙容量により生じる希釈および膜厚の変動のため、これらの吸着器のほとんどは、フロースルーモードで優先的に使用する。

単語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「オリゴペプチド」は、本明細書において使用する場合、すべてアミノ酸のポリマーを指す。アミノ酸は、一般にＬアミノ酸であり、天然に存在してもよくまたは天然に存在しなくてもよい。一般には、タンパク質は、二次、三次および四次構造に関して適切な立体構造で見出される、生物学的に発現する生成物を指す。対照的に、用語「オリゴペプチド」は、長さが少なくとも約４個のアミノ酸、一般に長さが約５０個未満のアミノ酸の短いポリマーを指し、固相開始残基およびＦ−ｍｏｃまたはＴ−ｂｏｃ保護試薬を使用して標準手順により合成されている。本発明のオリゴペプチドは、種々の標的タンパク質のリガンドとして個別に有用であり、免疫グロブリンに対する親和性を有する天然に存在するタンパク質の部分配列である、１つまたは複数のドメインと組み合わせたより大型のポリペプチドの部分として本明細書において想定される。

用語「ポリペプチド」は、本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、一般に設計される部分を指定するが、天然に存在するアミノ酸配列を含有してもよく、ペプチド合成により生成するか、または形質転換もしくはトランスフェクトした細胞において遺伝子組換えによって生成してもよい。ポリペプチドは一般に、オリゴペプチドよりも長く、例えば、数百個のアミノ酸のポリマーであってもよい。本明細書において有用な組成物は、設計し、ポリペプチドをコードする合成遺伝子から遺伝子組換えにより発現させるか、または標準の化学的カップリング手順により化学的に工学操作する。ポリペプチドは、１つまたは複数のサブコンポーネントのアミノ酸配列を含有し、それによって天然に存在する新規アミノ酸配列と合成的に設計した新規アミノ酸配列の両方が、ポリペプチドの種々の実施形態において、ポリペプチドの種々の機能性部分に存在する。

用語ポリペプチドは、この設計した結合材料をその標的と区別するために使用し、これは、これらが免疫グロブリンファミリーのメンバーである場合、本明細書においてタンパク質と呼ばれる。標的タンパク質は、脊椎動物においてｉｎ ｖｉｖｏで作製し、血液または血清から得ることができ、または、例えば、遺伝子組換えにより調製したベクターおよび細胞培地中の細胞株から発現する、遺伝子操作した細胞から培地中で生成することができる。一般には、標的タンパク質は、オリゴマーであり、天然の立体構造である。しかし、標的タンパク質は、タンパク質工学的操作の結果であり提示のベクターの変異誘発ライブラリーから単離した免疫グロブリンを含む、抗体タンパク質から操作した単鎖の免疫グロブリン誘導体を含む。

本明細書における本発明の設計および合成したポリペプチドは、コードする遺伝子を含有するベクターで形質転換またはトランスフェクトした細胞により、遺伝学的にコードされ、生物学的に発現する。成分の型のポリペプチドの設計、およびポリペプチドに存在する各成分の繰返し単位の数の選択は、使用者により決定し、各候補ポリペプチドの結合容量は、複数の所望の各標的免疫グロブリンの親和性のアッセイ、ならびに免疫グロブリンのクラスの中でも最適な程度の親和性およびそれぞれの所望のパターンの親和性を有するこれらの候補の選択により決定する。

プロテインＡは、細菌であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの細胞壁に本来見出される４２ｋＤａの表面タンパク質である。プロテインＡは、ＳｐＡ遺伝子によりコードされる。プロテインＡは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）に結合するその能力のため、生化学研究において、および生物学的薬物の生産において広範な使用が見出されている。プロテインＡは、３へリックスバンドルに折り畳む５つの相同Ｉｇ結合ドメインで構成される（図１を参照）。インタクトで天然のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプロテインＡのアミノ酸配列は、図２に示し、５つの個別のＩｇ結合ドメインおよびアンカー領域のアミノ酸配列は、図３に示す。各ドメインは、多くの哺乳動物種由来のタンパク質、とりわけＩｇＧに結合可能である（表１を参照）。これは、ほとんどの免疫グロブリンのＦｃ領域内、またヒトＶＨ３ファミリーの場合にはＦａｂ領域内の重鎖に結合する（Ljunbergら、１９９３年）。

組換えブドウ球菌性プロテインＡ（ＳｐＡ）は、Ｅ．ｃｏｌｉで生成して免疫学および他の生物学的研究に使用することが多い。プロテインＡは、蛍光色素、酵素、ビオチン、コロイド金または放射性ヨードを含む他の分子と多様にカップリングしており、抗体結合部位に影響することはない。プロテインＡはまた、磁気、ラテックス、アガロースのビーズおよび他の媒体であるホストとカップリングして広範に利用される。

プロテインＡは、固体支持体上に固定化することが多く、例えば、血清、腹水液、発酵培地またはバイオリアクターブロス由来の粗タンパク質混合物から全ＩｇＧを精製するための確かな方法として使用されるか、またはマーカーとカップリングして抗体の存在を検出する。ビーズとコンジュゲートしたプロテインＡを用いた免疫沈降試験をまた、一般的に使用して、目的のタンパク質またはタンパク質複合体に対する抗体により間接的にタンパク質またはタンパク質複合体を精製する。

多様なＩｇＧに結合するプロテインＡの能力のため、その最も重要な使用のうちの１つは、抗体および抗体断片のアフィニティークロマトグラフィー精製における使用である。免疫グロブリンは、製造または開発において世界的に最も普及しているバイオ医薬品を代表する。高い商業需要およびそれによるこの特定の治療市場の価値により、関連するコストを調節する一方で、製薬会社それぞれのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）製造プロセスの生産性を最大化するように、製薬会社に重きが置かれることとなった。

アフィニティークロマトグラフィーは、モノクローナルまたはポリクローナル抗体のようなこれらの免疫グロブリン分子の精製における鍵となるステップのうちの１つとして、多くの場合に使用される。現在のところ、ＳｐＡベースのアフィニティー媒体はおそらく、細胞培養物由来の多種多様な産業用供給原料からモノクローナル抗体およびそれらの断片を単離するのに最も広範に使用されるアフィニティー媒体である。したがって、プロテインＡリガンドを含む種々のマトリックスおよび樹脂は、例えば、天然プロテインＡ（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）の形態で、または組換えプロテインＡ（例えば、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の形態で市販されている。

プロテインＡの主な欠点は、高価であり、１ＭのＮａＯＨのような典型的なカラム洗浄／消毒条件下で不安定であるという事実を含む（Costioli, Mら、２０１０年Biopharm International ２３巻（６号）；Gagnon, P.２０１２年J. Chromatogr A １２２１巻：５７〜７０頁）。

プロテインＡの誘導体は、同等の結合特性を維持すると示されており、その上、結合容量または安定性の増加を示す（Gulich, Sら、２００２年Protein Eng １５巻（１０号）：８３５〜８４２頁；Linhult, Mら、２００４年Proteins ５５巻（２号）：４０７〜４１６頁）。いくつかのアルカリ安定化プロテインＡ誘導体が、修飾四量体Ｂ結合ドメインを使用する、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）のＭＡｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（商標）樹脂、プロテインＡのＣ結合ドメインの四量体誘導体を使用する、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製（Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）のプロテインＡセラミックＨｙｐｅｒＤ Ｆ樹脂およびＴｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ， ＵＳＡ）のＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−６５０Ｆ樹脂のようなクロマトグラフィー樹脂として現在、販売されている。

しかし、プロテインＡ誘導体は、ライセンス料および組換えタンパク質の生成および精製コストに伴うコスト高に未だに悩まされている。この精製については、コストが非常に高くつく（表２参照）。プロテインＡ樹脂の価格は、樹脂１リットルあたり１７，０００ドルまたはそれよりも高額に達し得る。このコスト高は、生物学的薬物の生産における商品原価因子を直接増大させる。

プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー媒体の操作および交換コストを減少させるために、現在利用可能なものよりもサイクル数を増加して使用することが可能なプロテインＡ媒体が、バイオプロセス産業において必要とされている。

配列決定およびプロテインＡ分子内由来の特定のドメインの操作を含む、プロテインＡ分子への修飾が、その結合容量を増加させるために行われているが、これらは単なる漸進的改善を生じさせているにすぎない（表３を参照）。

ＧｌｎまたはＡｓｐ以外のアミノ酸に変異させたＡｓｎ残基を有する変異免疫グロブリン結合タンパク質（３文字のアミノ酸コードを使用する）は、発明者Hober, S.らにより特許出願ＷＯ２００３０８０６５５Ａ１、２００３年１０月２日公開に示されており、高ｐＨにおいて化学安定性が増加することが見出された。HallらによるＷＯ２００８０３９１４１、２００８年４月３日公開において、プロテインＡのドメインＣが粗洗浄剤に耐えることが示された。Nakamura, S.らは、アミノ酸配列ＡＴＫまたはＡＳＫを有するタンパク質（１文字のアミノ酸コードを使用する）を生成して、ＷＯ２０１２０８６６６０Ａ１、２０１２年６月２８日公開において免疫グロブリンの単離に使用した。Bjoerkmanら、ＷＯ２０１２０８７２３１、２０１０年１２月２０日公開では、ａｓｎまたはｈｉｓ残基をＢドメインのＨ１８に有する、プロテインＡドメインの１つまたは複数のリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを生成し、非置換のプロテインＡと比較して溶出ｐＨの増加を観察した。Kihira, Y.らによるＥＰ０８６３２１０、１９９８年９月９日公開では、連結単位を有する免疫グロブリン結合人工タンパク質を生成した。２つまたはそれよりも多いＢまたはＺドメインを有する腐食安定性クロマトグラフィーリガンドは、アルカリに安定であるとBianらによりＥＰ２２０２３１０、２０１０年６月３０日公開において見出された。同様に、Yoshidaらにより、Ｇ残基をＡ以外のアミノ酸と置き換えることによる操作された酸安定性プロテインＡが、ＥＰ２４１２８０９、２０１２年２月１日公開において見出された。ＧまたはＡをＫと置き換える２９位における変異により、少なくとも３個のアミノ酸の欠失を有する新規のプロテインＡベースリガンドは、Ｆａｂ結合を低減させることがSpectorらによりＥＰ２５３２６７２、２０１２年１２月１２日公開において認められた。プロテインＡの親和性結合特性を模倣し得る、特定の長さ「ｎ」の短いペプチドの能力が、プロテインＡベースの大規模なアフィニティー精製のコスト高を低減させる取組みにおいて、検討されている（Yangら、J. Pept. Res.６巻：１２０〜１３７頁、２００６年）（図４参照）。

本明細書において提供する組成物は、完全長または切断バージョンのプロテインＡの内因親和性特性を組み込むポリペプチドであり、組み合わせた１つまたは複数の実体のＩｇＧ結合特性を劇的に増強する、より短いオリゴペプチドの親和性特性を有する。このような修飾では、設計したポリペプチドの外表面上に高結合オリゴペプチドを提示するための潜在的ペプチドリンカーを含む、完全長もしくは切断バージョンの組換えプロテインＡおよびそのオリゴペプチドをコードする遺伝子融合核酸部分の設計、合成、およびライゲーションにより操作するか、またはこれらの実体の化学的コンジュゲートにより操作する。

樹脂または膜支持体に結合して高価な救命的生物学的薬物を精製する、プロテインＡの既存の形態を使用するという、コストにおける深刻な欠点が存在する。これらのＭＡｂの下流精製は、製造の総コストのほぼ８０％を占める可能性があるが（Gottschalk, U.２００５年Biopharm Int.１８巻（６号）：４２〜５８頁）、プロテインＡによる精製コストは、総精製コストの４０％を超える可能性があり、新規抗体精製技術への可能性を示唆する。

結合容量の増加とともに流量の増加を最適化することが可能な、分離マトリックスに結合するタンパク質リガンドを得ることが、当分野において必要とされ続けている。

本発明は、プロテインＡベース部分の「結合容量−流量」の組合せによるパラダイムを実質的に増大させるその能力により（図５を参照）、アフィニティー精製のコストを劇的に低減させ、それによって高価な生物学的薬物の総コストにおける商品原価因子を低減させることができる。

本発明の実施形態は、制限されないが、プロテインＡベース部分のような、ＩｇＧ結合タンパク質およびペプチドのＩｇＧ結合容量を増加させるための方法の使用を本明細書において提供する。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、その高い選択性のためにモノクローナル抗体（ＭＡｂ）精製に非常に有効な捕捉ステップであり、単一のアフィニティークロマトグラフステップにおいて高い純度および比較的高い濃度を可能とする。しかし、プロテインＡは、ＭＡｂ精製においてその有用性を制限する特性を有する。天然および組換えプロテインＡは、高アルカリ条件下で安定ではなく、その結果として、理想的な洗浄／消毒溶液である１ＭのＮａＯＨをプロテインＡの洗浄に使用することができない（Jones, SCBら２００４年 ３版International Symposium on Downstream Processing of Genetically Engineered Antibodies and Related Molecules. Nice, France）。プロテインＡカラムまたはプロテインＡ膜吸着器の結合容量はまた、ＭＡｂ−プロテインＡの結合動態ならびに得られうるプロテインＡリガンドの密度により制限される（Saha, Kら２００３年J. Anal. Chem.７５巻（４号）：８３５〜８４２頁；Sheth, B. Thesis. University College of London、２００９年）。

プロテインＡクロマトグラフィーによる生成のボトルネックにより、ＭＡｂ力価の収率を増加させる、発現および生成の技術の向上の結果として、従来よりも大型のプロテインＡカラム、ならびに最終的にはポンプおよびカラムのような高価な新規のハードウェアの必要性が生じた。カラム直径は、既存の設備のフットプリントにより制限される（Palma, AD.２００５年Cost-Drive Chromatograpy. www.pharmacueticalmanufacturing.com/articles/2005）。樹脂の圧力または分離媒体が床の高さとともに増加し、圧力が高くなると、樹脂が圧縮されるか、またはポンプが損傷するため、カラムの高さの増加は非実用的である（Thillaivinayagalingam, Pら２００７年Genet. Eng. Biotechn. N.２７巻（１１号））。クロマトグラフィーサイクル数の増加によるバイオリアクター力価の増加は、合計処理時間とリソースの両方、および結果的に総コストを増大させる。表５に見られるように、ＰＶＤ−ＳｉプロテインＡの結合容量は、３桁を超える範囲のスケールアップを通じて一定のままであり、大規模な抗体生成をより効率的かつ経済的とする。

プロテインＡの不安定性は、プロテインＡのクロマトグラフィーのボトルネックおよび樹脂コスト高の主な原因である。特に樹脂の洗浄および消毒の間に生じるこの不安定性は、サイクル数を超える結合容量を減少させ、生成物処理量の収率をさらに低下させる。

小ペプチドは、細孔表面上で達し得るリガンド密度が非常に高いため、プロテインＡのような、より大型のリガンドに対する利点を有する（Yang, Hら２００６年J. Pept. Res.６６巻：１２０〜１３７頁）。プロテインＡ樹脂ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）と同様のポリマー多孔質ビーズ上では、特定の陽イオン交換樹脂上のＭＡｂ結合容量は、１００ｍｇ／ｍＬ超に達した（Ｌｉｕら、２０１１年）が、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔの結合容量は、３０〜４５ｍｇ／ｍＬの範囲であり、カラム滞留時間は、典型的な２〜３分である（Ljunglof, Aら２０１１年Bioprocess Int.９巻（７号）：６６〜６７頁）。したがって、本明細書において操作されたポリペプチドを使用する前にプロテインＡ樹脂で実現されるよりも高い能力でＭＡｂに結合することが可能である。表４は、シリカ粒子を包埋した多孔質ＰＶＣ媒体に付着した、組換えプロテインＡまたはプロテインＧリガンドを使用する本明細書の例において得られたデータを示す。種々のヒト血清抗体サブクラスは、これらの媒体にそれぞれ種々の程度まで結合することが観察された。例えば、ＰＶＣ−ＳｉプロテインＡは、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_４、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥに優先的に結合したことが観察された。対照的に、ＰＶＣ−ＳｉプロテインＧは、４つのＩｇＧサブクラスに結合するが、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤには結合しないことが観察された。明らかに、図９および表５に示す本明細書の例におけるデータは、８つの型またはサブクラスのヒト免疫グロブリンに特異的に結合する、プロテインＡおよびプロテインＧそれぞれの非同一で、さらに特有な親和性を示す。

代替実施形態では、精製媒体組成物、およびＰＶＣ−Ｓｉのようなマトリックス材料の細孔表面上および／または細孔表面上から表面開始重合により小ペプチドを「成長」させるような媒体を作製する方法を本明細書において提供する。プロテインＡと比較して非常に高いペプチド密度の可能性は、他の化学的リガンドと同様に、表面重合法により実現される（Bhutら、２００８年J. Membr. Sci.３２５巻（１号）：１７６〜１８３頁）。さらに、小ペプチドは、容易に破壊される二次および三次構造を欠き、これらの構造は、本来の条件下で、より容易に再構成されるため、小ペプチドは、消毒条件、特にアルカリ条件下で、より大型のポリペプチドおよびタンパク質よりも高い安定性を有する。それにもかかわらず、より小型のリガンドの使用から生じる懸念は、これらが、プロテインＡ分子それ自体と同程度の特異性を有しない可能性があることである。しかし、本明細書において提供するより小型のオリゴペプチドを、完全もしくは短縮型のプロテインＡ、または他の免疫グロブリン結合部分内に組み込むことによって、能力を増加させる可能性を有する組成物がもたらされ、それによって立体障害の問題に取り組む。

プロテインＡベースアフィニティー精製を支持する、本プロセス、システムおよびハードウェア、ならびにプロテインＡリガンドそれ自体の法外なコストは、単一使用技術においては受け入れられない。プロテインＡベースアフィニティー精製の上記の制限パラメーターを最適化し、単一使用プロテインＡベース精製技術および生成物の可能性を現実のものとすることは、本発明の特定の焦点および主題である。

配列番号２〜６のドメインポリペプチド（図３）と配列番号８〜１０のオリゴペプチド（図４Ｂ）の種々の組合せをコードする核酸配列を発現させて、本明細書の例におけるアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを、提示ファージを使用して、Sidhuらによる米国特許第８，６８５，８９３号、２０１４年４月１日発行、およびそこに引用する参考文献に示す方法により得た。示される配列の得られたライブラリーを濃縮して選択し、選択した免疫グロブリンのクラス、例えばＩｇＧ_１である、標的に対して最適親和性を向上させた。陽性選択は、陰性選択と組み合わせて、ＩｇＥのような不必要な免疫グロブリンの親和性を低減させた。

一連のオリゴペプチドは本明細書において、これらのファージ提示法を使用して得、ファージに結合した候補オリゴペプチドは、免疫グロブリンサブタイプに結合する能力についてスクリーニングした。この方法により得られたオリゴペプチドはすべて、試験したすべての免疫グロブリンサブタイプに結合することが見出された。これらのアミノ酸配列は、１文字のアミノ酸コードを使用して、以下：ＣＰＳＴＨＷＫ（配列番号１８）；ＮＶＱＹＦＡＶ（配列番号１９）；ＡＳＨＴＱＫＳ（配列番号２０）；ＴＮＩＥＳＬＫ（配列番号２１）；ＮＣＨＫＣＷＮ（配列番号２２）；および、ＳＨＬＳＫＮＦ（配列番号２３）を含む。

免疫グロブリンタンパク質サブクラスに対する親和性について試験したオリゴペプチドの中で、配列番号９のオリゴペプチドは、サブタイプＩｇＧ_１およびＩｇＧ_３に対する最も高い結合親和性を有することが観察された。したがって、このオリゴペプチドは、本明細書において設計し操作したプロテインＡ誘導体組成物内へリンカーを挿入するために選択された。

プロテインＡポリペプチドの設計および合成
リンカーを有するプロテインＡの部分とオリゴペプチド挿入物の２つのポリペプチドアミノ酸配列の組合せを設計して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの形質転換した細胞においてｐＥＴ３０ｂ＋（ＥＭＤ／Ｓｉｇｍａ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから市販されている）プラスミド骨格に関する発現、分泌および生成を試験した。理論的設計考察を図６に示し、ここで種々のタンパク質−ポリペプチド部分またはタンパク質ドメインとオリゴペプチドの組合せはそれぞれ、プロテインＡの５つのＩｇＧ結合ドメインのいずれかの中から選択される可能性のある操作された誘導体を示す。これらは、図７に示すように、直鎖状にさらに連結し得る。これらの図では、高結合オリゴペプチドドメインおよびリンカーを波線で示し、プロテインＡコアを円で示す。これらの操作されたプロテインＡ組成物は、図８に示すように支持マトリックスと結合し得る。

図１４に示す、配列番号１６および１７のようなこれらのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を、レシピエントプラスミドに合成およびライゲーションし、図１５および１６に示す、プラスミド：ＢＩＧ＿Ｈｅｐ４＿ｌｉｎ１ｏｐｔ４＿ＥｘＣおよびＢＩＧ＿Ｈｅｐ４＿ｌｉｎ３ｏｐｔ４＿ＥｘＣをそれぞれもたらした。プラスミドを精製およびＡｖａＩで制限酵素分解し、制限酵素分解断片の予測されるサイズを検証した。各構築物の２つの単一コロニークローンを選択し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１λＤＥ３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから市販されている）の細胞において発現および生成の最適化について分析した。

発現最適化：時間、温度、培地、添加剤
初期発現試験では、ＴＢ完全培地を有する振盪フラスコを使用し、細胞の増殖およびポリペプチドの生成を培養時間に応じて分析した。対照細胞は、ポリペプチド挿入物を有しない空のベクターを保有する同じ株であった。組換えプラスミドおよび細菌遺伝子発現系における当業者に周知の方法により、ＩＰＴＧを追加してｌａｃリプレッサーを不活化し、Ｔ７ポリメラーゼ合成の誘導の結果として所望のタンパク質を得ることによって挿入物にコードされるタンパク質を誘導した後に、操作されたポリペプチドのタンパク質生成をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。

各培養物から３時間間隔で除去した試料において、ポリペプチドの生成をモニタリングした。操作されたプロテインＡ誘導体であるポリペプチドが、播種後３時間の初期に培養上清に出現して、１８時間の培養を通じて増加し続けたことを観察した。対照株の上清において、同じ分子量を有するタンパク質バンドは、同一期間の増殖の間に観察されなかった。

代表的タンパク質発現の分析データを図１７に示す。これは、３つの標準Ｅ．ｃｏｌｉ培地：ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎブロス）、ＴＢ（Ｓｉｇｍａから市販されている）、およびＭ９最少培地における、これらの株の増殖および生成パラメーターの比較である。最も高いポリペプチド生成は、ＴＢにおいて観察され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる培養の６時間後に収率は、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌのレベルになると推定された。最少培地では、比較して、約１８０ｍｇ／Ｌの収率をもたらした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータは、これらの上清が目的の操作されたポリペプチドを優位に含有し、少量の追加のバンドが低分子量で認められたことを示した。

２つの培養の温度において発現をさらに比較したところ、その例の結果、３７℃における生成が、３０℃においてよりも高かったことが観察された。潜在的培地添加剤の作用を、ＴＢ培地に追加し増殖の間に存在していた、薬剤のグリシン、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびＴｗｅｅｎ−２０について分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる培養上清の分析では、このような各添加剤により、添加剤を含まないＴＢ培地における対照培養物と比較して、非特異性タンパク質の上清における出現が増加することが示された。非特異性タンパク質は、操作されたポリペプチドの分子量よりも高く、また低い分子量をも有することが観察された。

バッチ発酵および高細胞密度流加発酵
ＴＢ培地中の細胞を、高密度（ＯＤ_６００６〜８）または超高密度（ＯＤ_６００４０〜５０）における生成に誘導し、ｐＯ_２、ｐＨ、温度および増殖プロファイルについて発酵をモニタリングした。試料を採取して、誘導後、時間間隔ごとにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりタンパク質発現を判定した。高レベルでの発現が、バッチ発酵では約２７５ｍｇ／Ｌと同等か、またはそれよりも高いレベルで、流加発酵では約１．２ｇ／Ｌのレベルで、上清において、ほぼ純粋な形態で観察された。

設計したポリペプチドの結合容量
表面プラズモン共鳴を使用して、本明細書の各プロテインＡポリペプチドによる、各８サブクラスのヒト血清免疫グロブリンへの結合を分析する。出願人は、配列番号１６および１７のポリペプチドが、ポリペプチドの重量あたり、または分子量あたり、対照としての親プロテインＡよりも高い程度までＩｇＧタンパク質に特異的に結合すると想定する。さらに、一連の固定されたポリペプチドが、対照プロテインＡよりも洗浄剤およびリンス剤に対してより耐性を呈することが想定される。

この方法の実施形態では、分離マトリックスは、ポリペプチド、または複数のポリペプチドからなり、これはそれぞれ、少なくとも１つまたは複数のオリゴペプチドを含み、このポリペプチドおよびオリゴペプチドはそれぞれ、非同一であり、免疫グロブリンのクラスに対して非同一の親和性を有し、この方法は、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤの群から選択される、少なくとも１つまたは複数の抗体型を精製するステップをさらに含む。代替実施形態では、方法は、ＩｇＧ種のみ、例えば、抗体型ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３およびＩｇＧ_４のすべてのうちの１つまたは複数を選択的に精製するステップをさらに含む。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
免疫グロブリンまたは免疫グロブリン含有化合物に結合する操作されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、および他の免疫グロブリン結合タンパク質、ならびにそれらの機能性バリアントまたは部分の群から選択される少なくとも１つの天然に存在するかまたは組換えの免疫グロブリン結合タンパク質の少なくとも１つの機能性部分を含み、少なくとも１つの合成の機能性免疫グロブリン結合オリゴペプチドと、前記結合タンパク質の末端アミノ酸残基または内部リシンのような内部残基において化学的にコンジュゲートまたは遺伝子融合している、ポリペプチド。
（項目２）
前記群からの複数の前記機能性部分および／または前記機能性結合タンパク質部分のうちの１つの反復を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
少なくとも２つの機能性部分をつなぐ少なくとも１つの連結エレメントをさらに含み、前記連結エレメントが、アミノ酸配列を有し、アミノ酸を約１８００個未満含有する、項目１または２に記載のポリペプチド。
（項目４）
前記連結エレメントが、アミノ酸を約９５個未満含有する、項目３に記載のポリペプチド。
（項目５）
前記連結エレメントが、アミノ酸を約２〜約５４個含む、項目３に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記連結エレメントが、アミノ酸を約４〜約１０個含む、項目５に記載のポリペプチド。
（項目７）
前記結合タンパク質の機能性部分が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、１１および１４、ならびにそれらの機能性バリアントおよび部分の群から選択されるアミノ酸配列を有する、項目１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記オリゴペプチドが、配列番号８〜１０および１８〜２３のアミノ酸配列、これらのアミノ酸配列の機能性バリアントおよび部分、前記配列の複数のコピーを有する反復、ならびにこれらの配列の機能性保存的アミノ酸置換のうちの少なくとも１つから選択される、項目１から６のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目９）
前記機能性部分が、標的とするクラスのＩｇＧ免疫グロブリンまたは免疫グロブリン含有化合物に結合するために選択され、前記ポリペプチドが、高速流量動態を特徴とする大容量捕捉床に分離マトリックス媒体をさらに含む、項目１から８のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目１０）
免疫グロブリンまたは免疫グロブリン含有化合物に結合する操作されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、および他のＩｇグロブリン結合タンパク質、ならびにそれらの機能性バリアントまたは部分の群から選択される、天然に存在するかまたは組換え免疫グロブリン結合タンパク質またはオリゴペプチドの少なくとも１つの機能性部分を含有するポリペプチドにおいて、改良が、前記機能性部分またはそれらの機能性バリアントもしくは部分のアミノ酸配列またはその部分の少なくとも１つのコピーを含み、そしてさらに末端アミノ酸残基に化学的にコンジュゲートもしくは遺伝子融合しているか、または内部リシンのような内部残基内でコンジュゲートもしくは融合している少なくとも１つのオリゴペプチドを含む、ポリペプチド。
（項目１１）
固体支持体とカップリングしている、項目１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む分離マトリックス。
（項目１２）
前記固体支持体が、好ましくは、ビーズおよびシートの群から選択される形態を有する医療グレードの多孔質ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）媒体を含む、項目１１に記載の分離マトリックス。
（項目１３）
前記ＰＶＣ媒体が、多孔質タンパク質吸着性支持体表面で包埋されるか、またはそれを構成し、前記媒体が、より大きい孔径が平均で約０．５〜５．０マイクロメートルの範囲であり、より小さい孔径が平均で約０．００３〜０．３マイクロメートルの範囲である二峰性孔径分布を有する、項目１２に記載の分離マトリックス。
（項目１４）
前記支持体表面材料が、セルロース、アガロース、ナイロン、多孔質メタロイド酸化物、多孔質金属酸化物、および多孔質混合金属酸化物、シリカ粒子、シリカゲル、調節多孔ガラス、アルミナ、スタニア、チタニア、ならびにジルコニアからなる群から選択される、項目１３に記載のマトリックス。
（項目１５）
前記固体支持体および前記支持体表面材料が、単一点付着によりカップリングしている、項目１３から１４のいずれかに記載の分離マトリックス。
（項目１６）
前記固体支持体および前記支持体表面材料が、複数点付着によりカップリングしている、項目１３から１４のいずれかに記載の分離マトリックス。
（項目１７）
前記ポリペプチドの免疫グロブリン結合容量が、少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌ床体積、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ床体積、少なくとも約７５ｍｇ／ｍｌ床体積である、項目１１から１６のいずれかに記載の分離マトリックス。
（項目１８）
少なくとも約５００倍、１０００倍、２０００倍、または少なくとも約３０００倍のスケールアップファクタの増加にわたって、線形で再現性のあるスケールアップ容量を有する、項目１１から１６のいずれかに記載の分離マトリックス。
（項目１９）
前記固体支持体および前記支持体表面材料の少なくとも１つに付着する少なくとも１つのリンカーをさらに含む、項目１１から１８のいずれかに記載の分離マトリックス。
（項目２０）
前記リンカーが、アミノ酸配列、ランダムアミノ酸ポリマー、ポリエチレングリコールから選択され、化学的に、または遺伝子融合により前記ポリペプチドに共有結合で付着している、項目１９に記載の分離マトリックス。
（項目２１）
ＱＰＱＭＳＨＭ（配列番号９）；ＫＰＧＫＥＤＮＮ（配列番号１０）；ＣＰＳＴＨＷＫ（配列番号１８）；ＮＶＱＹＦＡＶ（配列番号１９）；ＡＳＨＴＱＫＳ（配列番号２０）；ＴＮＩＥＳＬＫ（配列番号２１）；ＮＣＨＫＣＷＮ（配列番号２２）；および、ＳＨＬＳＫＮＶ（配列番号２３）の群から選択されるアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを含む組成物。
（項目２２）
項目２１に記載のオリゴペプチドの少なくとも１つのコピーを含むタンパク質。
（項目２３）
樹脂、膜、フィルター、およびビーズの群から選択される支持体に固定されている、項目２１または項目２２に記載の組成物を含むクロマトグラフィー用媒体。
（項目２４）
欠失、付加、または保存的置換である、アミノ酸配列の変化をさらに含む、項目２１に記載の組成物。
（項目２５）
免疫グロブリンを生体試料から精製する方法であって、前記免疫グロブリンを、項目１１から２０のいずれかに記載の分離マトリックスに選択的かつ特異的に結合させるためのイオン強度およびｐＨの条件下で前記試料を接触させるステップ、および他の試料成分を通過させるステップ、および必要に応じてカラムを洗浄するステップ、および前記結合した免疫グロブリンを、ローディングバッファーと比較して：減少したｐＨ、増大したｐＨ、増大したイオン強度、および競合的結合リガンドの存在によって特徴付けられる群から選択されるものを含有する溶出バッファーを用いて前記マトリックスから溶出するステップであって、それによって前記免疫グロブリンを精製するステップを含む、方法。
（項目２６）
前記分離マトリックスが、複数のオリゴペプチドを含む複数のポリペプチドからなり、前記ポリペプチドおよび前記オリゴペプチドはそれぞれ非同一であり、そして免疫グロブリンのクラスに対して非同一の親和性を有し、前記方法が、ＩｇＧ _１ 、ＩｇＧ _２ 、ＩｇＧ _３ 、ＩｇＧ _４ 、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤの群から選択される、少なくとも１つまたは複数の抗体型を精製するステップをさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
抗体型ＩｇＧ _１ 、ＩｇＧ _２ 、ＩｇＧ _３ およびＩｇＧ _４ のすべてを精製するステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。

Claims (27)

1. 免疫グロブリンまたは免疫グロブリン含有化合物に結合する操作されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、および他の免疫グロブリン結合タンパク質、ならびにそれらの機能性バリアントまたは部分の群から選択される少なくとも１つの天然に存在するかまたは組換えの免疫グロブリン結合タンパク質の少なくとも１つの機能性部分を含み、少なくとも１つの合成の機能性免疫グロブリン結合オリゴペプチドと、前記結合タンパク質の末端アミノ酸残基または内部リシンのような内部残基において化学的にコンジュゲートまたは遺伝子融合している、ポリペプチド。
2. 前記群からの複数の前記機能性部分および／または前記機能性結合タンパク質部分のうちの１つの反復を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 少なくとも２つの機能性部分をつなぐ少なくとも１つの連結エレメントをさらに含み、前記連結エレメントが、アミノ酸配列を有し、アミノ酸を約１８００個未満含有する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. 前記連結エレメントが、アミノ酸を約９５個未満含有する、請求項３に記載のポリペプチド。
5. 前記連結エレメントが、アミノ酸を約２〜約５４個含む、請求項３に記載のポリペプチド。
6. 前記連結エレメントが、アミノ酸を約４〜約１０個含む、請求項５に記載のポリペプチド。
7. 前記結合タンパク質の機能性部分が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、１１および１４、ならびにそれらの機能性バリアントおよび部分の群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
8. 前記オリゴペプチドが、配列番号８〜１０および１８〜２３のアミノ酸配列、これらのアミノ酸配列の機能性バリアントおよび部分、前記配列の複数のコピーを有する反復、ならびにこれらの配列の機能性保存的アミノ酸置換のうちの少なくとも１つから選択される、請求項１から６のいずれかに記載のポリペプチド。
9. 前記機能性部分が、標的とするクラスのＩｇＧ免疫グロブリンまたは免疫グロブリン含有化合物に結合するために選択され、前記ポリペプチドが、高速流量動態を特徴とする大容量捕捉床に分離マトリックス媒体をさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載のポリペプチド。
10. 免疫グロブリンまたは免疫グロブリン含有化合物に結合する操作されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、および他のＩｇグロブリン結合タンパク質、ならびにそれらの機能性バリアントまたは部分の群から選択される、天然に存在するかまたは組換え免疫グロブリン結合タンパク質またはオリゴペプチドの少なくとも１つの機能性部分を含有するポリペプチドにおいて、改良が、前記機能性部分またはそれらの機能性バリアントもしくは部分のアミノ酸配列またはその部分の少なくとも１つのコピーを含み、そしてさらに末端アミノ酸残基に化学的にコンジュゲートもしくは遺伝子融合しているか、または内部リシンのような内部残基内でコンジュゲートもしくは融合している少なくとも１つのオリゴペプチドを含む、ポリペプチド。
11. 固体支持体とカップリングしている、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む分離マトリックス。
12. 前記固体支持体が、好ましくは、ビーズおよびシートの群から選択される形態を有する医療グレードの多孔質ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）媒体を含む、請求項１１に記載の分離マトリックス。
13. 前記ＰＶＣ媒体が、多孔質タンパク質吸着性支持体表面で包埋されるか、またはそれを構成し、前記媒体が、より大きい孔径が平均で約０．５〜５．０マイクロメートルの範囲であり、より小さい孔径が平均で約０．００３〜０．３マイクロメートルの範囲である二峰性孔径分布を有する、請求項１２に記載の分離マトリックス。
14. 前記支持体表面材料が、セルロース、アガロース、ナイロン、多孔質メタロイド酸化物、多孔質金属酸化物、および多孔質混合金属酸化物、シリカ粒子、シリカゲル、調節多孔ガラス、アルミナ、スタニア、チタニア、ならびにジルコニアからなる群から選択される、請求項１３に記載のマトリックス。
15. 前記固体支持体および前記支持体表面材料が、単一点付着によりカップリングしている、請求項１３から１４のいずれかに記載の分離マトリックス。
16. 前記固体支持体および前記支持体表面材料が、複数点付着によりカップリングしている、請求項１３から１４のいずれかに記載の分離マトリックス。
17. 前記ポリペプチドの免疫グロブリン結合容量が、少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌ床体積、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ床体積、少なくとも約７５ｍｇ／ｍｌ床体積である、請求項１１から１６のいずれかに記載の分離マトリックス。
18. 少なくとも約５００倍、１０００倍、２０００倍、または少なくとも約３０００倍のスケールアップファクタの増加にわたって、線形で再現性のあるスケールアップ容量を有する、請求項１１から１６のいずれかに記載の分離マトリックス。
19. 前記固体支持体および前記支持体表面材料の少なくとも１つに付着する少なくとも１つのリンカーをさらに含む、請求項１１から１８のいずれかに記載の分離マトリックス。
20. 前記リンカーが、アミノ酸配列、ランダムアミノ酸ポリマー、ポリエチレングリコールから選択され、化学的に、または遺伝子融合により前記ポリペプチドに共有結合で付着している、請求項１９に記載の分離マトリックス。
21. ＱＰＱＭＳＨＭ（配列番号９）；ＫＰＧＫＥＤＮＮ（配列番号１０）；ＣＰＳＴＨＷＫ（配列番号１８）；ＮＶＱＹＦＡＶ（配列番号１９）；ＡＳＨＴＱＫＳ（配列番号２０）；ＴＮＩＥＳＬＫ（配列番号２１）；ＮＣＨＫＣＷＮ（配列番号２２）；および、ＳＨＬＳＫＮＶ（配列番号２３）の群から選択されるアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを含む組成物。
22. 請求項２１に記載のオリゴペプチドの少なくとも１つのコピーを含むタンパク質。
23. 樹脂、膜、フィルター、およびビーズの群から選択される支持体に固定されている、請求項２１または請求項２２に記載の組成物を含むクロマトグラフィー用媒体。
24. 欠失、付加、または保存的置換である、アミノ酸配列の変化をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
25. 免疫グロブリンを生体試料から精製する方法であって、前記免疫グロブリンを、請求項１１から２０のいずれかに記載の分離マトリックスに選択的かつ特異的に結合させるためのイオン強度およびｐＨの条件下で前記試料を接触させるステップ、および他の試料成分を通過させるステップ、および必要に応じてカラムを洗浄するステップ、および前記結合した免疫グロブリンを、ローディングバッファーと比較して：減少したｐＨ、増大したｐＨ、増大したイオン強度、および競合的結合リガンドの存在によって特徴付けられる群から選択されるものを含有する溶出バッファーを用いて前記マトリックスから溶出するステップであって、それによって前記免疫グロブリンを精製するステップを含む、方法。
26. 前記分離マトリックスが、複数のオリゴペプチドを含む複数のポリペプチドからなり、前記ポリペプチドおよび前記オリゴペプチドはそれぞれ非同一であり、そして免疫グロブリンのクラスに対して非同一の親和性を有し、前記方法が、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤの群から選択される、少なくとも１つまたは複数の抗体型を精製するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
27. 抗体型ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３およびＩｇＧ_４のすべてを精製するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。