CN101124238A - 结合抗体的亲和性配体 - Google Patents

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CN101124238A CNA2005800484009A CN200580048400A CN101124238A CN 101124238 A CN101124238 A CN 101124238A CN A2005800484009 A CNA2005800484009 A CN A2005800484009A CN 200580048400 A CN200580048400 A CN 200580048400A CN 101124238 A CN101124238 A CN 101124238A
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M·R·加莱戈
R·米凯尔
F·内特尔费
D·安布罗修斯
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Abstract

本申请公开了固体支撑材料，其上共价固定有亲和性配体，所述配体包含一个或多个疏水性官能团和一个或多个阳离子官能团或者一个或多个杂芳族官能团，其中至少一个疏水性官能团与至少一个阳离子/杂芳族官能团被5至20的直达键距所分开，其中所述配体具有120Da至5,000Da的分子量。通常，亲和性树脂具有大于5mg单克隆抗体/mL亲和性树脂的结合能力。还公开了分离生物分子，例如蛋白质，特别是抗体，诸如单克隆抗体，或其衍生物的方法。

Description

结合抗体的亲和性配体
发明领域
本发明涉及共价键合于固体支撑材料、例如聚合物基质的亲和性配体，和其在生物分子、例如蛋白质、特别是抗体、诸如单克隆抗体的纯化和/或分离中的用途。亲和性配体包含两种不同的结构域或官能团：(i)疏水性结构域，和(ii)阳离子结构域。
发明背景
亲和性色谱能够选择性和可逆性吸附生物物质、例如单克隆抗体至互补结合物质、例如亲和性配体，所述亲和性配体固定在固体支撑材料并包装在亲和性柱中。
亲和性柱经常含有固体支撑材料，通常为多孔的聚合物基质，适合的配体与之直接或者借助连接体共价连接。含有具有配体亲和性的生物物质的样品能够在适合的结合条件下与共价固定于固体支撑材料的亲和性配体接触，促进配体与具有配体亲和性的生物物质之间的特异性结合。柱子随后可以用缓冲液洗涤，以除去未键合的材料，在进一步的步骤中可以洗脱具有配体亲和性的生物物质，得到纯化或分离的形式。因此，配体应当优选地表现特异性和可逆性与生物物质、例如抗体结合的特征，这是纯化或分离所需要的。
抗体具有一个或多个Y-形单元副本，由四个多肽链组成。每个Y含有两个相同的“重链”副本和两个相同的“轻链”副本，根据它们的相对分子量如此命名。
基于Y单元的数量和重链的类型，抗体可以分为五类：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重链决定了每种抗体的亚类。IgG、IgM、IgA、IgD和IgE的重链分别被称为γ、μ、α、δ和ε。任何抗体的轻链都可以分为κ或λ类型(多肽分子特征的说明)。就药物应用而言，最常用的抗体是IgG，它可以被蛋白水解酶木瓜蛋白酶裂解为三个部分，两个F(ab)区和一个Fc区，或者被蛋白水解酶胃蛋白酶裂解胃两个部分，一个F(ab’)2区和一个Fc区。
F(ab)区包含抗体的“臂”，它们是抗原结合的关键。Fc区包含抗体的“尾”，在免疫应答中扮演角色，以及充当可用于在一些免疫化学程序中操控抗体的“柄”。抗体上F(ab)区的数量与其亚类一致，决定了抗体的“效价”(大致规定为抗体可以结合其抗原的“臂”的数量)。
术语“抗体”表示免疫球蛋白，无论天然还是完全或部分合成产生的。在该术语中也包括其所有保持特异性结合能力的片段和衍生物。典型的片段是FC、FAB、重链和轻链。该术语也涵盖任何具有结合结构域的多肽，在比较氨基酸序列和免疫球蛋白结合结构域时，该结构域是同源的或大半同源的，例如至少95％同一性。这些多肽可以从天然来源衍生或者部分或完全合成产生。抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可以是任何免疫球蛋白类的成员，包括任何人类球蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。不过，在本发明的一种实施方式中，IgG类衍生物是优选的。
术语“抗体片段”表示抗体任何小于全长的衍生物。优选地，抗体片段保留全长抗体的至少显著比例的特异性结合能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv二体(diabody)和Fd片段。抗体片段可以借助任何手段产生。例如，抗体片段可以是借助完整抗体的片段化作用由酶促或化学过程产生的，或者它可以是从编码部分抗体序列的基因重组产生的。作为替代选择，抗体片段可以是完全或部分合成产生的。抗体片段可以任选地是单链抗体片段。作为替代选择，片段可以包含多条链，它们通过例如二硫键连接在一起。片段也可以任选地是多分子复合体。功能性抗体片段将通常包含至少约50个氨基酸，更通常将包含至少约200个氨基酸。
“单链Fvs”(scFvs)是仅由可变轻链(VL)和可变重链(VH)通过多肽连接体彼此共价连接而成的重组抗体片段。VL或VH都可以是氨基-末端结构域。多肽连接体可以是可变长度和组成的，只要两个可变结构域没有严重空间干扰地桥连即可。通常，连接体主要由甘氨酸和丝氨酸残基延伸构成，散置(intersperse)一些谷氨酸或赖氨酸残基有助于溶解性。“二体”是二聚的scFvs。二体的组分通常具有比大多数scFvs更短的肽连接体，并且它们显示缔合成二聚体的优先性。“Fv”片段是由一个VH和一个VL结构域组成的抗体片段，被非共价相互作用结合在一起。术语“dsFv”在本文中用于表示分子间二硫键经过加工使VH-VL对稳定的Fv。“F(ab’)2”片段是本质上等价于在pH 4.0-4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白(通常为IgG)所得的抗体片段。该片段可以是重组产生的。“Fab’”片段是本质上等价于还原连接F(ab’)2片段中两个重链段的二硫桥所得的抗体片段。Fab’片段可以是重组产生的。“Fab”片段是本质上等价于用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白(通常为IgG)所得的抗体片段。Fab片段可以是重组产生的。Fab片段的重链区段(segment)是Fd段。“Fc”区是特定抗体种类的恒定区。
抗原与抗体之间的结合依赖于氢键、疏水性键、静电力和范德华力。这些都是弱的非共价属性的键，而有些抗原与抗体之间的缔合作用可以是相当强的。因此，抗体-抗原结合的亲和性常数可以跨越宽泛的范围，从低于105mol-1至大于1012mol-1。亲和性常数受温度、pH和溶剂的影响。除了抗体对配体的亲和性以外，抗体-配体复合体的总体稳定性也取决于抗原与抗体的效价和相互作用部分的结构排列。
仅能测定单克隆抗体的精确亲和性常数，它们是遗传上相同的识别抗原上一个单一表位的分子，而就多克隆抗体而言，亲和性的广泛分布可能对表观亲和性常数有贡献。表观亲和性常数也可以由如下事实所致，多克隆抗体可以识别相同抗原上一个以上单一表位。由于抗体在正常情况下每分子容纳一个以上结合结构域，在抗体与它们的抗原之间发生协同性键合；这种效应被称为亲合力(avidity)。由于单克隆抗体仅与抗原上一个单一表位反应，它们比多克隆抗体更容易通过抗原的化学处理而丢失表位。通过汇集两个或多个单克隆抗体于同一抗原可以抵消这一点。
B淋巴细胞与无限增殖细胞系培养物的融合可以增加单克隆抗体，产生杂交瘤。杂交瘤将产生完全相同抗体的很多副本——这是抗体开发供治疗或诊断应用的本质特性。
目前，最多开发用于纯化和分离生物分子、例如单克隆抗体的亲和性配体是蛋白A。蛋白A是一种普遍使用的配体，不过该配体可能面临若干缺点，例如涉及不稳定性的问题，伴有从柱子上浸滤，需要从终产物中除去，或者色谱树脂的净化不足，而且蛋白A是相当昂贵的。
因此，对于新颖的、稳定的、便宜的配体存在需求，所述配体可用于分离抗体，特别是单克隆抗体，或者其类似物、衍生物、片段和前体，无论来自天然或重组来源。
发明概述
在本发明的一个方面，提供了固体支撑材料，其上共价固定有亲和性配体，所述配体包含一个或多个疏水性官能团和一个或多个阳离子官能团，
其中至少一个疏水性官能团与至少一个阳离子官能团被5至20的直达键距所分开，
其中所述配体具有120Da至5,000Da的分子量。
在本发明的另一方面，提供了固体支撑材料，其上共价固定有亲和性配体，所述配体包含一个或多个疏水性官能团和一个或多个杂芳族官能团，
其中至少一个疏水性官能团与至少一个杂芳族官能团被5至20的直达键距所分开，并且
其中所述配体具有120Da至5,000Da的分子量。
在本发明的另一方面，提供了分离生物分子的方法，例如蛋白质，例如抗体，特别是单克隆抗体，或其衍生物，该方法包含如下步骤：
(i)提供固体支撑材料，其上共价固定有如本文所定义的亲和性配体，
(ii)提供推定含有抗体的样品，该抗体对所述配体具有亲和性，
(iii)使所述配体与所述推定含有所述抗体的样品接触，
(iv)当在所述样品中含有所述抗体时，选择性结合所述抗体，和
(v)当在所述样品中含有所述抗体时，选择性分离所述抗体。
附图的简要说明
图1：树脂B2选择性分析。1＝发酵上清液，2＝流程(flowthrough)(循环1)，3＝洗脱(循环1)，4＝再生/净化(循环1)，5＝洗涤(循环2)，6＝洗脱(循环2)，7＝没有蛋白质，8＝mAb参照样品。
图2：树脂B3选择性分析。1＝发酵上清液，2＝流程(循环1)，3＝洗脱(循环1)，4＝再生/净化(循环1)，5＝洗涤(循环2)，6＝洗脱(循环2)，7＝再生/净化(循环2)，8＝mAb参照样品。
图3：树脂D1选择性分析。1＝mAb参照样品，2＝发酵上清液，3＝流程(循环1)，4＝洗脱(循环1)，5＝再生/净化(循环1)，6＝洗涤(循环2)，7＝洗脱(循环2)，8＝再生/净化(循环2)。
图4：树脂D2选择性分析。1＝mAb参照样品，2＝发酵上清液，3＝流程(循环1)，4＝洗脱(循环1)，5＝再生/净化(循环1)，6＝洗涤(循环2)，7＝洗脱(循环2)，8＝再生/净化(循环2)。
本发明的详细公开
正如上文提到的，本发明涉及新颖的固体支撑材料，其上共价固定有亲和性配体，其中该配体包含一组特定的官能团。这类材料特别可用于纯化和分离生物分子，例如蛋白质，例如抗体，特别是单克隆抗体，或者其衍生物。
配体
本文所用的术语“配体”表示能够与靶化合物结合的分子，该靶化合物例如抗体，特别是单克隆抗体。配体优选地至少以基本上特异性的方式结合它们的结合伴侣(“特异性结合”)。
“特异性结合”表示配体的如下性质：(1)与结合伴侣、例如单克隆抗体结合，(2)优先结合，以便所结合的结合伴侣、例如单克隆抗体的相对质量为至少两倍、例如50-倍、例如100-倍、例如1000-倍，或相对于结合伴侣、例如单克隆抗体而言，大于其他所结合的品种的相对质量。所结合的化合物的相对质量表示所结合的化合物的质量减去未结合的化合物的质量除以结合伴侣的总质量，也就是：所结合的化合物的相对质量＝(所结合的化合物的质量-未结合的化合物的质量)/(所结合的化合物的质量+未结合的化合物的质量)，化合物是结合伴侣或其他品种。
术语“结合伴侣”表示任何被特定配体结合的生物分子，优选地以基本上特异性的方式。结合伴侣可以被一个以上配体所共享。优选的结合伴侣是抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。进一步优选的结合伴侣是来自单克隆抗体或多克隆抗体的抗体片段。
根据本发明的配体包括所富集或拆分的关于任何或全部不对称原子的旋光异构体，这从本文的说明或叙述是显而易见的。可以分离或合成外消旋的和非对映体的混合物，以及个别的旋光异构体，以便基本上不含它们的对映体或非对映体伴侣，这些都在本发明的范围内。
实验已经惊人地显示，某些亲和性配体种类、也就是其中配体包含一个或多个疏水性官能团和一个或多个阳离子官能团者选择性地与mAb结合。另一有希望的亲和性配体种类是其中配体包含一个或多个疏水性官能团和一个或多个杂芳族官能团者。
进一步发现，至少一个疏水性官能团优选地应当与至少一个阳离子官能团被5至30的直达键距所分开，例如直达键距5至20，例如直达键距5至19，例如直达键距5至18，例如直达键距5至17，例如直达键距5至16，例如直达键距5至15，例如直达键距5至14，例如直达键距5至13，例如直达键距5至12，例如直达键距5至11，例如直达键距5至10，例如直达键距6至14，或者例如直达键距7至20，例如直达键距7至19，例如直达键距7至18，例如直达键距7至17，例如直达键距7至16，例如直达键距7至15，例如直达键距7至14，例如直达键距7至13，例如直达键距7至12，例如直达键距7至11，例如直达键距7至10，例如直达键距8至12，或者例如直达键距9至20，例如直达键距9至18，例如直达键距9至16，例如直达键距9至14，例如直达键距9至12，例如直达键距9至11，例如直达键距约10。
直达键距是共价连接的化学实体之间沿化学键的最短分子内直达键距。它由个别原子-原子键距沿最短分子内路径的加和计算而来的。典型的原子-原子键距为1.2至1.4。
配体的至少一个疏水性官能团与至少一个阳离子官能团之间的空间距离(distance through space)优选地小于30，例如小于28，例如小于26，例如小于24，例如小于22，例如小于20，例如小于18，例如大约或小于16，例如小于15，例如大约或小于14，例如小于13，例如大约或小于12，例如小于11，例如大约或小于10，例如大约或小于8，例如约6，例如在5至20的范围内，例如空间距离5至19，例如空间距离5至18，例如空间距离5至17，例如空间距离5至16，例如空间距离5至15，例如空间距离5至14，例如空间距离5至13，例如空间距离5至12，例如空间距离5至11，例如空间距离5至10，例如空间距离7至20，例如空间距离7至19，例如空间距离7至18，例如空间距离7至17，例如空间距离7至16，例如空间距离7至15，例如空间距离7至14，例如空间距离7至13，例如空间距离7至12，例如空间距离7至11，例如空间距离7至10，例如空间距离9至20，例如空间距离9至18，例如空间距离9至16，例如空间距离9至14，例如空间距离9至12，例如空间距离9至11。
直达键距和空间距离可以由本领域技术人员按照本领域技术现状加以计算或测定。也可以利用分子建模来测定不同配体官能团原子之间的最小距离。分子建模可以如下进行，例如使用Sybyl/Mendyl 5.4(Tripos Associates，St.Louis，Mo.)，利用配有立体照片观察器的Evans and Sutherland PS 390图形计算机。经由Concord程序构造或者文库能量最小化，可以提供适合的配体的结构。利用Sybyl/Mendyl力场和氢的1.2范德华参数，可以进行能量计算。利用包括σ-键合和π-键合的Gasteigner-Huckel方法可以计算电荷。
配体优选地具有小于5,000Da的分子量，例如小于4,000Da，例如小于3,500Da，例如小于3,000Da，例如小于2,500Da，例如小于2,000Da，例如小于1,800Da，例如小于1,600Da，例如小于1,500Da，例如小于1,400Da，例如小于1,300Da，例如小于1,200Da，例如小于1,100Da，例如小于1,000Da。
另外，配体优选地具有大于120Da的分子量，例如大于140Da，例如大于160Da，例如大于180Da，例如大于200Da，例如大于220Da，例如分子量大于240Da。
为了减少与阳离子基团非特异性结合的程度，配体可以进一步包含一个或多个阴离子基团，目的是补偿配体上的一些正电荷。阴离子基团包括但不限于羧酸根、磺酸根、硫酸根、磷酸根和其他带负电的可电离基团，例如可以布置在配体的分支基团上。
配体官能团
在一组主要的适合的配体中，每一配体包含一个或多个疏水性官能团和一个或多个阳离子官能团。
在另一组主要的适合的配体中，每一配体包含一个或多个疏水性官能团和一个或多个杂芳族官能团。
本文所用的阳离子官能团是在pH 3-7范围内具有正电荷的有机基团。伯、仲和叔胺是阳离子基团的典型实例。胍是进一步相关的实例。在以下章节“阳离子官能团”中给出阳离子官能团的进一步实例。
疏水性官能团是能够主要通过疏水性相互作用与生物分子表面结合的有机基团。疏水性官能团是以本质上非极性和在正常生理条件下不带电为特征的。当配体处于水性介质中时，疏水性残基被水性溶液所排斥，以便寻求在配体构型中的内部位置。而且，当配体在正常生理条件下与结合伴侣缔合时，疏水性残基将寻求配体结合伴侣的疏水性袋或沟。
本文所用的术语“正常生理条件”表示活的生物体或细胞内部的典型条件。尽管公认有些器官或生物体提供极端的条件，不过器官内和细胞内环境在正常情况下在pH 7左右(也就是从pH 6.5至pH 7.5)，含有水作为主导溶剂，并且在0℃以上、50℃以下的温度下存在。将被认识到，各种盐的浓度依赖于用作参照的器官、生物体、细胞或细胞隔室。
有机疏水性基团一般具有高碳原子含量。疏水性基团的典型实例是直链与支链烷烃、环状烃、芳族化合物和直链与支链烷烃、环状烃与芳族化合物的组合。而且，这类基团的取代变体也被视为疏水性的，只要碳的相对含量在某一限度以上。不过，碳原子的百分比不是唯一影响疏水性的参数。而且，其他原子的位置和属性也扮演重要角色。例如，醚通常比具有相同碳原子和氧原子数的醇更具疏水性，酯比具有相同元素组成的二醇更具疏水性。当有机基团的一个或多个可能的非碳与非氢原子位于伯位时，为了使基团疏水，碳原子的相对数量必须高于可能的非碳与非氢原子位于仲、叔或季位。记住这一点，我们把疏水性基团定义为其75％或以上的非氢原子是碳原子的有机基团，例如80％或以上、优选其85％或以上的非氢原子是碳原子。例如，低端值75％适用于醚和酯，中间值80％适用于酰胺和仲与叔胺，而高端值85％适用于醇和伯胺。在下文“配体官能团”一节给出疏水性官能团的实例。
至少一种疏水性官能团可以包含一个或多个基团或者由其组成，选自“烷基”、“环状烷基”、“取代的烷基”、“芳基”、“取代的芳基”、“烯基”、“取代的烯基”、“炔基”、“取代的炔基”、“芳烷基”、“取代的芳烷基”、“杂环基”、“取代的杂环基”、“杂环基烷基”、“取代的杂环基烷基”、“烷基氨基烷基”、“取代的烷基氨基烷基”、“二烷基氨基烷基”、“取代的二烷基氨基烷基”、“杂环氧基烷基”、“取代的杂环氧基烷基”、“芳基氨基烷基”、“取代的芳基氨基烷基”、“杂环基氨基烷基”、“取代的杂环基氨基烷基”、“烷基氨基烷氧基”、“取代的烷基氨基烷氧基”、“二烷基氨基烷氧基”、“取代的二烷基氨基烷氧基”、“杂环氧基”和“取代的杂环氧基”，如下文所定义。
包含脂族残基的疏水性官能团
至少一种疏水性官能团可以包含任选被取代的脂族残基和/或任选被取代的芳族残基或者由其组成。脂族残基一般表示烃，例如烷基、烯基和炔基残基，它们可以是取代或未取代的。
本文所用的“烷基”包括直链烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。“烷基”也包括直链烷基的支链异构体，包括但不限于下列作为实例提供的基团：-CH(CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)3、-C(CH2CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH2C(CH3)3、-CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH2CH3)2、-CH2CH2C(CH3)3、-CH2CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)2、-CH(CH2CH3)CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)和其它。
脂族残基可以是任选被取代的直链脂族残基或任选被取代的支链脂族残基。脂族残基也可以是任选被取代的环状烷基。“环状烷基”包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基等基团，和被如上所定义的直链与支链烷基取代的这类环，也包括多环烷基，例如但不限于金刚烷基、降冰片基和双环[2.2.2]辛基，和被如上所定义的直链与支链烷基取代的这类环。因而，未取代的烷基包括伯烷基、仲烷基和叔烷基。未取代的烷基可以键合于配体中的一个或多个碳原子、氧原子、氮原子和/或硫原子。
环状脂族残基例如可以包含C5-C16环烷基。通常当环烷基被芳基或杂芳基残基取代时，也可以存在更短的链长。
“取代的烷基”表示如上所定义的未取代的烷基，其中一个或多个与碳或氢连接的键被与非氢与非碳原子连接的键所代替，例如但不限于卤化物中的卤原子，例如F、Cl、Br和I；和羟基、烷氧基、芳氧基和酯基团等基团中的氧原子；硫醇基团、烷基与芳基硫化物基团、砜基团、磺酰基和亚砜基团等基团中的硫原子；胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、酰亚胺和烯胺等基团中的氮原子；三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基中的硅原子；和各种其他基团中的其他杂原子。
取代的烷基也包括其中一个或多个与碳或氢原子连接的键被与杂原子连接的键所代替，杂原子例如羰基、羧基和酯基团中的氧；亚胺、肟、腙和腈等基团中的氮。取代的烷基尤其也包括其中一个或多个与碳或氢原子连接的键被一个或多个与卤原子连接的键所代替的烷基。其他取代的烷基包括其中一个或多个与碳或氢原子连接的键被与氧原子连接的键所代替的那些，以便取代的烷基含有羟基、烷氧基、芳氧基或杂环氧基。进而，其他烷基包括具有胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、(烷基)(芳基)胺、二芳基胺、杂环基胺、(烷基)(杂环基)胺、(芳基)(杂环基)胺或二杂环基胺基团的烷基。
在一种实施方式中，脂族官能团优选地被芳基取代，例如下文提到的(C6-C12)芳基，它们可以继而也被取代，也如本文所述。取代的芳基的实例包括“芳烷基”，它可以是取代或未取代的。
因此，“芳烷基”表示如上所定义的未取代的烷基，其中该未取代的烷基的氢或碳键被与如上所定义的芳基连接的键所代替。例如，甲基(-CH3)是未取代的烷基。如果甲基的氢原子被与苯基连接的键所代替，例如如果甲基的碳键合于苯的碳，那么该化合物是未取代的芳烷基(即苄基)。因而包括但不限于苄基、二苯基甲基、1-苯基乙基(-CH(C6H5)(CH3))、2-苯基乙基、2-萘基乙基等基团。
“取代的芳烷基”具有关于未取代的芳烷基相同的含义，如同取代的芳基相对于未取代的芳基。不过，取代的芳烷基也包括其中该基团的烷基部分的碳或氢键被与非碳或非氢原子连接的键所代替的基团。取代的芳烷基的实例尤其包括但不限于-CH2C(＝O)(C6H5)和-CH2(2-甲基苯基)。
在一种实施方式中，任选被取代的脂族残基包含C5-C20烷基或者由其组成。通常当烷基被芳基或杂芳基残基取代时，也可以存在更短的链长。被芳基或杂芳基取代的烷基的进一步实例包括例如直链(C1-C10)、支链(C4-C10)或环状(C5-C10)基团，例如甲基、乙基、丙基(例如正丙基和异丙基)、丁基(例如正丁基、异丁基、叔丁基)、正戊基、戊基(例如新戊基)、环戊基、己基(例如正己基、环己基)、庚基、辛基(例如正辛基)、壬基(例如正壬基)、癸基(例如正癸基)、十一烷基、十二烷基、
Figure A20058004840000171
基(mentyl)、2，3，4-三甲基-3-戊基、2，4-二甲基-3-戊基等。
在一种实施方式中，C5-C20烷基也可以是取代的，例如被卤原子、烷氧基、芳氧基、烷硫基或芳硫基取代。卤原子的实例是氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。烷氧基的实例包括例如(C1-C4)烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、叔丁氧基等。烷硫基的实例包括例如由上述(C1-C10)烷基和硫代基团构成的那些，其具体实例包括例如正丙硫基、叔丁硫基等。芳硫基的实例包括例如由上述(C6-C12)芳基和硫代基团构成的那些，其具体实例包括例如苯硫基等。芳氧基可以存在于芳基、杂芳基和饱和烃基团上，例如由上述(C6-C12)芳基和氧基构成的那些，其具体实例包括例如苯氧基等。
上文所述烷基可以含有一个或多个碳-碳双键(烯基)或者一个或多个碳-碳叁键(炔基)。
“烯基”表示直链与支链和环状基团，例如关于如上所定义的未取代的烷基所述那些，除了至少一个双键存在于两个碳原子之间。实例尤其包括但不限于乙烯基、-CH＝C(H)(CH3)、-CH＝C(CH3)2、-C(CH3)＝C(H)2、-C(CH3)＝C(H)(CH3)、-C(CH2CH3)＝CH2、环己烯基、环戊烯基、环己二烯基、丁二烯基、戊二烯基和己二烯基。
“取代的烯基”具有关于未取代的烯基相同的含义，如同取代的烷基相对于未取代的烷基。取代的烯基包括其中非碳或非氢原子键合于双重键合于另一碳的碳的烯基，和其中非碳或非氢原子之一键合于不参与与另一碳连接的双键的碳的那些。
“炔基”表示直链与支链基团，例如关于如上所定义的烷基所述那些，除了至少一个叁键存在于两个碳原子之间。实例尤其包括但不限于-C≡C(H)、-C≡C(CH3)、-C≡C(CH2CH3)、-C(H2)C≡C(H)、-C(H)2C≡C(CH3)和-C(H)2C≡C(CH2CH3)。
“取代的炔基”具有关于未取代的炔基相同的含义，如同取代的烷基相对于未取代的烷基。取代的炔基包括其中非碳或非氢原子键合于三重键合于另一碳的碳的炔基，和其中非碳或非氢原子之一键合于不参与与另一碳连接的叁键的碳的那些。
取代的烷基的进一步实例如下文所述。
“烷基氨基烷基”表示如上所定义的未取代的烷基，其中碳或氢键被与氮原子连接的键所代替，该氮原子键合于氢原子和如上所定义的未取代的烷基。例如，甲基(-CH3)是未取代的烷基。如果甲基的氢原子被与氮原子连接的键所代替，该氮原子键合于氢原子和乙基，那么所得化合物是-CH2-N(H)(CH2CH3)，它是未取代的烷基氨基烷基。
“取代的烷基氨基烷基”表示如上所定义的未取代的烷基氨基烷基，除了其中一个或两个烷基中一个或多个与碳或氢原子连接的键被与非碳或非氢原子连接的键所代替，如上关于取代的烷基所述，除了与全部烷基氨基烷基中的氮原子连接的键本身不限定全部烷基氨基烷基为被取代的以外。不过，取代的烷基氨基烷基的确包括其中键合于该基团氮原子的氢被非碳与非氢原子所代替的基团。
“二烷基氨基烷基”表示如上所定义的未取代的烷基，其中碳键或氢键被与氮原子连接的键所代替，该氮原子键合于两个其他相似或不同的如上所定义的未取代的烷基。
“取代的二烷基氨基烷基”表示如上所定义的未取代的二烷基氨基烷基，其中一个或多个烷基中的一个或多个与碳或氢原子连接的键被与非碳与非氢原子连接的键所代替，如上关于取代的烷基所述。与全部二烷基氨基烷基中的氮原子连接的键本身不限定全部二烷基氨基烷基为被取代的。
“杂环氧基烷基”表示如上所定义的未取代的烷基，其中碳键或氢键被与氧原子连接的键所代替，该氧原子键合于如上所定义的未取代的杂环基。
“取代的杂环氧基烷基”表示如上所定义的未取代的杂环氧基烷基，其中与杂环氧基烷基的烷基的碳或氢基团连接的键键合于非碳与非氢原子，如上关于取代的烷基所述，或者其中杂环氧基烷基的杂环基是如上所定义的取代的杂环基。
“芳基氨基烷基”表示如上所定义的未取代的烷基，其中碳键或氢键被与氮原子连接的键所代替，该氮原子键合于至少一个如上所定义的未取代的芳基。
“取代的芳基氨基烷基”表示如上所定义的未取代的芳基氨基烷基，除了其中芳基氨基烷基的烷基是如上所定义的取代的烷基或者芳基氨基烷基的芳基是取代的芳基以外，除了与全部芳基氨基烷基中的氮原子连接的键本身不限定全部芳基氨基烷基为被取代的以外。不过，取代的芳基氨基烷基的确包括其中键合于该基团氮原子的氢被非碳与非氢原子所代替的基团。
“杂环基氨基烷基”表示如上所定义的未取代的烷基，其中碳或氢键被与氮原子连接的键所代替，该氮原子键合于至少一个如上所定义的未取代的杂环基。
“取代的杂环基氨基烷基”表示如上所定义的未取代的杂环基氨基烷基，其中杂环基是如上所定义的取代的杂环基和/或烷基是如上所定义的取代的烷基。与全部杂环基氨基烷基中的氮原子连接的键本身不限定全部杂环基氨基烷基为被取代的。不过，取代的杂环基氨基烷基的确包括其中键合于该基团氮原子的氢被非碳与非氢原子所代替的基团。
“烷基氨基烷氧基”表示如上所定义的未取代的烷基，其中碳或氢键被与氧原子连接的键所代替，该氧原子键合于母体化合物，并且其中未取代的烷基的另一碳或氢键键合于氮原子，该氮原子键合于氢原子和如上所定义的未取代的烷基。
“取代的烷基氨基烷氧基”表示如上所定义的未取代的烷基氨基烷氧基，其中与键合于氧原子(该氧原子键合于母体化合物)的烷基的碳或氢原子连接的键被一个或多个与非碳与非氢原子连接的键所代替，如上关于取代的烷基所讨论，和/或如果键合于氨基的氢键合于非碳与非氢原子和/或如果键合于胺氮的烷基键合于非碳与非氢原子，如上关于取代的烷基所述。胺和烷氧基官能度在全部烷基氨基烷氧基中的存在本身不限定全部这类基团为取代的烷基氨基烷氧基。
“未取代的二烷基氨基烷氧基”表示如上所定义的未取代的烷基，其中碳或氢键被与氧原子连接的键所代替，该氧原子键合于母体化合物，并且其中未取代的烷基的另一碳或氢键键合于氮原子，该氮原子键合于两个相似或不同的如上所定义的未取代的烷基。
“取代的二烷基氨基烷氧基”表示如上所定义的未取代的二烷基氨基烷氧基，其中与键合于氧原子(该氧原子键合于母体化合物)的烷基的碳或氢原子连接的键被一个或多个与非碳与非氢原子连接的键所代替，如上关于取代的烷基所讨论的，和/或如果一个或多个键合于胺氮的烷基键合于非碳与非氢原子，如上关于取代的烷基所述。胺和烷氧基官能度在全部二烷基氨基烷氧基中的存在本身不限定全部这类基团为取代的二烷基氨基烷氧基。
“杂环氧基”表示羟基(-OH)，其中与氢原子连接的键被与如上所定义的未取代的杂环基的环原子连接的键所代替。
“取代的杂环氧基”表示羟基(-OH)，其中与氢原子连接的键被与如上所定义的取代的杂环基的环原子连接的键所代替。
包含芳族残基的疏水性官能团
芳族残基可以是任选被取代的芳基或杂芳基残基。“芳基”包括但不限于如下基团，以苯基、联苯、蒽基、萘基为例。尽管“芳基”包括含有稠合环的基团，例如萘，不过它不包括其他基团、例如烷基或卤代基团键合于环成员之一的芳基，因为诸如甲苯基等芳基在本文中被视为如下所述的取代的芳基。芳基可以键合于配体中的一个或多个碳原子、氧原子、氮原子和/或硫原子。
“取代的芳基”具有关于未取代的芳基相同的含义，如同取代的烷基相对于未取代的烷基。不过，取代的芳基也包括其中芳族碳之一键合于上述非碳或非氢原子之一的芳基，也包括其中芳基的一个或多个芳族碳键合于如本文所定义的取代和/或未取代的烷基、烯基或炔基的芳基。这包括其中芳基的两个碳原子键合于烷基、烯基或炔基的两个原子的键合排列，以限定稠合的环系(例如二氢萘基或四氢萘基)。
芳基和杂芳基的实例包括例如(C6-C12)芳基，例如苯基、甲苯基、萘基、联苯基等，和(C4-C5)杂芳基，或者吡啶基，等等。
而且，当至少一个疏水性官能团包含任选被取代的芳族残基或者由其组成时，芳族残基可以选自由如下芳族残基组成的组，包含芴基、吡咯基、呋喃基、噻吩基(thienyl)、噻吩基(thiophenyl)、噻唑基、异吲哚基、喹啉基、异喹啉基、唑基和嘌呤基或由其组成：进一步的实例包括但不限于四氢噻吩基、硫氧化的四氢噻吩基、四唑基、苯并呋喃基、硫杂萘基、indolenyl、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、azocinyl、三嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并吡喃基、呫吨基、phenoxathiinyl、2H-吡咯基、异噻唑基、异唑基、吡嗪基、哒嗪基、中氮茚基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、4H-喹嗪基(quinolizynyl)、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、吩嗪基、异苯并二氢吡喃基、苯并二氢吡喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、唑烷基、苯并三唑基、苯并异唑基、oxindolyl、苯并唑啉基和isatinoyl。
作为非限制性的实例，碳键合杂环可以键合在吡啶的2、3、4、5或6位，哒嗪的3、4、5或6位，嘧啶的2、4、5或6位，吡嗪的2、3、5或6位，呋喃、四氢呋喃、噻喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位，唑、咪唑或噻唑的2、4或5位，异唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位，氮杂环丙烷的2或3位，氮杂环丁烷的2、3或4位，喹啉的2、3、4、5、6、7或8位，或者异喹啉的1、3、4、5、6、7或8位。进而更典型地，碳键合杂环包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。
作为非限制性的实例，氮键合杂环键合在氮杂环丙烷、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、1H-吲唑的1位，异吲哚或异二氢吲哚的2位，吗啉的4位，和咔唑或β-咔啉的9位。通常，氮键合杂环包括1-氮杂环丙烷基、1-氮杂环丁烷基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基和1-哌啶基。
将从上文清楚地看出，杂芳族基团也可以选自由如下杂芳族基团组成的组，包含任选被取代的稠合杂芳族化合物或者由其组成。实例包括例如吲哚、苯并噻吩、苯并三嗪和喹啉。
在一种实施方式中，芳族残基可以被一个或多个任选被取代的脂族基团取代，例如本文刚才提到的任选被取代的脂族基团，例如直链、支链或环状(C1-C10)烷基，例如甲基、乙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、正己基等。
芳族残基可以被一个或多个杂原子取代，或者被一个或多个芳族基团取代，或者被一个或多个杂芳族基团取代。
而且，芳族残基可以例如被取代的烷基或芳基或杂芳基取代，其中该芳族残基或者该烷基或芳基或杂芳基被选自O、N、S和卤素的杂原子取代，或者被一个或多个选自羟基、氨基、巯基、卤素、羰基、羧酸、醚和酯的基团取代。
芳基和杂芳基也可以例如被卤原子、烷氧基、芳氧基、烷硫基或芳硫基取代。卤原子的实例是氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。烷氧基的实例包括例如(C1-C4)烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、叔丁氧基等。烷硫基的实例包括例如由上述(C1-C10)烷基和硫代基团构成的那些，其具体实例包括例如正丙硫基、叔丁硫基等。芳硫基的实例包括例如由上述(C5-C12)芳基和硫代基团构成的那些，其具体实例包括例如苯硫基等。芳氧基可以存在于芳基、杂芳基和饱和烃基团上，例如由上述(C6-C12)芳基和氧基构成的那些，其具体实例包括例如苯氧基等。
本文所用的术语“杂环基”表示芳族和非芳族环化合物，包括单环、双环和多环化合物，例如但不限于奎宁环基，含有3个或以上环成员，其中一个或多个是杂原子，例如但不限于N、O和S。尽管“杂环基”包括稠合的杂环，例如苯并咪唑基，不过它不包括其它基团、例如烷基或卤代基团键合于环成员之一的杂环基，因为诸如2-甲基苯并咪唑基等化合物是取代的杂环基。杂环基的实例包括但不限于：不饱和的3至8元环，含有1至4个氮原子，例如但不限于吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、二氢吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基(例如4H-1，2，4-三唑基、1H-1，2，3-三唑基、2H-1，2，3-三唑基等)、四唑基(例如1H-四唑基、2H-四唑基等)；饱和的3至8元环，其含有1至4个氮原子，例如但不限于吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基；稠合的不饱和的杂环基团，其含有1至4个氮原子，例如但不限于吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、吲嗪基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、苯并三唑基；不饱和的3至8元环，其含有1至2个氧原子和1至3个氮原子，例如但不限于唑基、异唑基、二唑基(例如1，2，4-二唑基、1，3，4-二唑基、1，2，5-二唑基等)；饱和的3至8元环，其含有1至2个氧原子和1至3个氮原子，例如但不限于吗啉基；不饱和的稠合的杂环基团，其含有1至2个氧原子和1至3个氮原子，例如苯并唑基、苯并二唑基、苯并嗪基(例如2H-1，4-苯并嗪基等)；不饱和的3至8元环，其含有1至3个硫原子和1至3个氮原子，例如但不限于噻唑基、异噻唑基、噻二唑基(例如1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基等)；饱和的3至8元环，其含有1至2个硫原子和1至3个氮原子，例如但不限于噻唑烷基；饱和和不饱和的3至8元环，其含有1至2个硫原子，例如但不限于噻吩基、dihydrodithiinyl、dihydrodithionyl、四氢噻吩、四氢噻喃；不饱和的稠合的杂环，其含有1至2个硫原子和1至3个氮原子，例如但不限于苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噻嗪基(例如2H-1，4-苯并噻嗪基等)、二氢苯并噻嗪基(例如2H-3，4-二氢苯并噻嗪基等)、不饱和的3至8元环，其含有氧原子，例如但不限于呋喃基；不饱和的稠合的杂环，其含有1至2个氧原子，例如苯并二氧杂环戊烯基(例如1，3-苯并二氧杂环戊烯基等)；不饱和的3至8元环，其含有氧原子和1至2个硫原子，例如但不限于dihydrooxathiinyl；饱和的3至8元环，其含有1至2个氧原子和1至2个硫原子，例如1，4-噻烷；不饱和的稠合的环，其含有1至2个硫原子，例如苯并噻吩基、benzodithiinyl；和不饱和的稠合的杂环，其含有氧原子和1至2个氧原子，例如benzoxathiinyl。杂环基也包括上述那些，其中环中一个或多个S原子双重键合于一个或两个氧原子(亚砜和砜)。例如，杂环基包括四氢噻吩、四氢噻吩氧化物和四氢噻吩1，1-二氧化物。优选的杂环基含有5或6个环成员。更优选的杂环基包括吗啉、哌嗪、哌啶、吡咯烷、咪唑、吡唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、四唑、硫吗啉、其中S原子键合于一个或多个O原子的硫吗啉、吡咯、高哌嗪、唑烷-2-酮、吡咯烷-2-酮、唑、奎宁环、噻唑、异唑、呋喃和四氢呋喃。
“取代的杂环基”表示如上所定义的未取代的杂环基，其中环成员之一键合于非氢原子，例如上文关于取代的烷基和取代的芳基所述。实例尤其包括但不限于2-甲基苯并咪唑基、5-甲基苯并咪唑基、5-氯苯并噻唑基、1-甲基哌嗪基和2-氯吡啶基。
“杂环基烷基”表示如上所定义的未取代的烷基，其中未取代的烷基的氢或碳键被与如上所定义的杂环基连接的键所代替。例如，甲基(-CH3)是未取代的烷基。如果甲基的氢原子被与杂环基连接的键所代替，例如如果甲基的碳键合于吡啶的碳2(碳之一键合于吡啶的N)或者吡啶的碳3或4，那么化合物是未取代的杂环基烷基。
“取代的杂环基烷基”具有关于未取代的杂环基烷基相同的含义，如同取代的芳烷基相对于未取代的芳烷基。不过，取代的杂环基烷基也包括其中非氢原子键合于杂环基烷基的杂环基中的杂原子的基团，例如但不限于哌啶基烷基的哌啶环中的氮原子。
在一种特定的实施方式中，任选被取代的芳族残基可以选自由如下芳族和杂芳族残基组成的组，包含苯基、萘基、芴基、吡啶、呋喃、噻吩、吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、唑、嘧啶和嘌呤或者由其组成。
取代的芳族残基也可以被一个或多个脂族基团取代，或者被一个或多个杂原子取代，或者被一个或多个芳族基团取代，或者被一个或多个杂芳族基团取代。
至少一个疏水性官能团也可以包含任选被取代的杂芳族残基或者由其组成，例如杂芳族残基选自由如下杂芳族残基组成的组，包含呋喃、吡咯和噻吩或者由其组成，或者杂芳族残基选自由如下杂芳族残基组成的组，包含稠合的杂芳族化合物或者由其组成，例如稠合的杂芳族化合物选自由吲哚、苯并噻吩、苯并三嗪和喹啉组成的组。
在上述实施方式中，芳族残基可以被烷基或芳基或杂芳基取代。
而且，该芳族残基或者烷基或芳基或杂芳基可以被选自O、N、S和卤素的杂原子取代，和/或该芳族残基或者烷基或芳基或杂芳基可以被一个或多个选自羟基、氨基、巯基、卤素、羰基、羧酸、醚和酯的基团取代。
在一种实施方式中，配体包含至少一个氨基酸残基，其包含疏水性基团，例如包含芳族基团或由其组成的疏水性基团，或者包含脂族基团或由其组成的疏水性基团。
阳离子官能团
阳离子官能团是带正电的，这由于永久的正电荷或者由于在正常生理条件下与H离子的缔合作用。当配体在正常生理条件下处于水性介质中时，阳离子官能团被水性溶液吸引，以寻求配体构型中的表面位置。当配体在正常生理条件下与结合伴侣缔合时，阳离子官能团将寻求配体结合伴侣的阴离子基团。
阳离子官能团优选地选自如下阳离子基团，包含一个或多个带正电的氮、一个或多个磷原子和/或一个或多个硫原子。
优选的阳离子基团包含永久的带正电的氮，来自例如烷基铵，例如三甲基铵、或三乙基铵、或二甲基铵、或苄基二甲基铵、或胍，或者带正电的氮，其来自带正电的杂环，例如咪唑、哌啶和吡咯烷。胍是特别优选的。
其他优选的阳离子基团是单-与二-取代的胺，例如单烷基胺、二烷基胺、杂环胺和芳族胺，它们在pH 3-8、特别是pH 3-7的水性溶液中带有部分正电荷。
带正电的氮也可以是由氨基酸残基提供的，例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、二氨基戊酸、二氨基己酸、二氨基庚二酸、高精氨酸、高瓜氨酸、对-氨基苯丙氨酸和3-氨基酪氨酸。精氨酸是特别优选的。
氨基酸的侧链可以提供一个或多个疏水性官能团和一个或多个阳离子官能团。在正常情况下，当氨基酸提供两个所述官能团时，至少一个疏水性官能团和至少一个阳离子官能团是由配体的不同氨基酸所提供的。除了氨基酸以外，配体还可以包含其他配体残基，正如下文详细的描述。
在本发明范围内的术语“氨基酸”在其最广泛的意义上使用，包括天然存在的L-氨基酸或其残基。本文使用天然存在氨基酸常用的单字母和三字母缩写(Lehninger，Biochemistry，2d ed.，pp.71-92，(Worth Publishers：New York，1975))。该术语也包括D-氨基酸(及其残基)以及经过化学修饰的氨基酸，例如氨基酸类似物，包括通常不结合成蛋白质的天然存在氨基酸，例如正亮氨酸，以及化学合成的化合物，具有本领域已知是氨基酸特征的性质。
例如，苯丙氨酸或脯氨酸的类似物或模拟物允许配体的构型限制与天然的Phe或Pro相同，它们包括在氨基酸的定义内。这类类似物和模拟物在本文中被称为氨基酸的“功能等价物”。氨基酸的其他实例参见Roberts and Vellaccio，The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology，Eds.Gross and Meiehofer，Vol.5，p.341(AcademicPress，Inc.：N.Y.1983)。
氨基酸通常通过酰胺键连接，但是其它键也可以连接根据本发明的配体的氨基酸残基，例如任何一个或多个选自如下的键：-NHN(R)CO-、-NHC(R)CO-、-NHC(RR′)CO-、-NHC(＝CHR)CO-、-NHC6H4CO-、-NHCH2CHRCO-、-NHCHRCH2CO-、-COCH2-、-COS-、-CONR-、-COO-、-CSNH-、-CH2NH-、-CH2CH2-、-CH2S-、-CH2SO-、-CH2SO2-、-CH(CH3)S-、-CH＝CH-、-NHCO-、-NHCONH-、-CONHO-、-C(＝CH2)CH2-、-PO2 -NH-、-PO2 -CH2-、-PO2 -CH2N+-、-SO2NH-。R(和R’)表示官能团，例如疏水性官能团或阳离子官能团，或者另一种连接上述基团的结构实体。目前最优选的“氨基酸”之间的键是酰胺键。
下文列举一般能够结合成根据本发明的配体的氨基酸的实例：
甘氨酰基；氨基多羧酸，例如天冬氨酸、对-羟基天冬氨酸、谷氨酸、β-羟基谷氨酸、β-甲基天冬氨酸、β-甲基谷氨酸、β，β-二甲基天冬氨酸、γ-羟基谷氨酸、β，γ-二羟基谷氨酸、β-苯基谷氨酸、γ-亚甲基谷氨酸、3-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、2-氨基辛二酸和2-氨基癸二酸残基；氨基酸酰胺，例如谷氨酰基和天冬氨酰基；多氨基-或多碱价-单羧酸，例如精氨酸、赖氨酸、β-氨基丙氨酸、γ-氨基丁酸、鸟氨酸、瓜氨酸、高精氨酸、高瓜氨酸、5-羟基-2，6-二氨基己酸(俗称羟基赖氨酸，包括别羟基赖氨酸)和二氨基丁酸残基；其他碱性氨基酸残基，例如组氨酰基；二氨基二羧酸，例如α，α′-二氨基琥珀酸、α，α′-二氨基戊二酸、α，α′-二氨基己二酸、α，α′-二氨基庚二酸、α，α′-二氨基-β-羟基庚二酸、α，α′-二氨基辛二酸、αα，α′-二氨基壬二酸和α，α′-二氨基癸二酸残基；亚氨基酸，例如脯氨酸、4-或3-羟基-2-吡咯烷-羧酸(俗称羟基脯氨酸，包括别羟基脯氨酸)、γ-甲基脯氨酸、哌可酸、5-羟基哌可酸、-N([CH2]nCOORPR)2(其中n是1、2、3、4、5或6，RPR是-H或保护基团)和氮杂环丁烷-2-羧酸残基；单-或二-烷基(通常C1-C25支链或正)氨基酸，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、烯丙基甘氨酸、α-氨基丁酸、正缬氨酸、正亮氨酸、氨基庚酸(heptyline)、α-甲基丝氨酸、α-氨基-α-甲基-γ-羟基戊酸、α-氨基-α-甲基-6-羟基戊酸、α-氨基-α-甲基-ε-羟基己酸、异缬氨酸、α-甲基谷氨酸、α-氨基异丁酸、α-氨基二乙基乙酸、α-氨基二异丙基乙酸、α-氨基二正丙基乙酸、α-氨基二异丙基乙酸、α-氨基二正丁基乙酸、α-氨基乙基异丙基乙酸、α-氨基-正丙基乙酸、α-氨基二异戊基乙酸、α-甲基天冬氨酸、α-甲基谷氨酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸；异亮氨酸、别异亮氨酸、叔亮氨酸、β-甲基色氨酸和α-氨基-α-乙基-β-苯基丙酸残基；β-苯基丝氨酰基；脂族α-氨基-β-羟基酸，例如丝氨酸、β-羟基亮氨酸、β-羟基正亮氨酸、β-羟基正缬氨酸和α-氨基-α-羟基硬脂酸残基；α-氨基，α-，γ-，δ-或ε-羟基酸，例如高丝氨酸、γ-羟基正缬氨酸、δ-羟基正缬氨酸和ε-羟基正亮氨酸残基；canavinyl和刀豆氨酰基；γ-羟基鸟氨酰基；2-己糖氨酸，例如D-葡糖氨酸或D-半乳糖氨酸残基；α-氨基-β-硫醇，例如青霉胺、β-巯基正缬氨酸或β-巯基氨基丁酸残基；其他含硫氨基酸残基，包括半胱氨酸；高胱氨酸；β-苯基甲硫氨酸；甲硫氨酸；S-烯丙基-(L)-半胱氨酸亚砜；2-巯基组氨酸；胱硫醚；半胱氨酸或高半胱氨酸的硫醇醚；苯丙氨酸、色氨酸和环-取代的氨基酸，例如苯基-或环己基-氨基酸、α-氨基苯基乙酸、α-氨基环己基乙酸和α-氨基-β-环己基丙酸；苯丙氨酸类似物和衍生物，包含芳基、低级烷基(C1-C6)、羟基、胍基、氧基烷基醚、硝基、硫或卤代基-取代的苯基(例如酪氨酸、甲基酪氨酸、邻-氯-、对-氯-、3，4-二氯-、邻-、间-或对-甲基-、2，4，6-三甲基-、2-乙氧基-5-硝基-、2-羟基-5-硝基-和对-硝基-苯丙氨酸)；呋喃基-、噻吩基-、吡啶基-、嘧啶基-、嘌呤基-或萘基-丙氨酸；色氨酸类似物和衍生物，包括犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸、2-羟基色氨酸和4-羧基色氨酸残基；α-氨基取代的氨基酸残基，包括肌氨酸(N-甲基甘氨酸)、N-苄基甘氨酸、N-甲基丙氨酸、N-苄基丙氨酸、N-甲基苯基丙氨酸、N-苄基苯基丙氨酸、N-甲基缬氨酸和N-苄基缬氨酸；和α-羟基与取代的α-羟基氨基酸残基，包括丝氨酸、苏氨酸、别苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸残基。疏水性氨基酸也是令人感兴趣的，例如单-或二-烷基或芳基氨基酸、环烷基氨基酸等。
优选的配体
下文选择引用的配体残基如下所示：
PPC：4-苯基哌啶-4-羧酸
Dap：二氨基丙酸
L-Orn：L-鸟氨酸
DPPAA：2，4-二叔戊基苯氧基乙酸
DMBA：3，5-二甲氧基苯甲酸
TMPPA：3-(3，4，5-三甲氧基苯基)丙酸
DBHPA：3-(3，5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸
1H2NA：1-羟基-2-萘甲酸
DPPA：3，3-二苯基丙酸
SAA：水杨酸
DBBA：3，5-二叔丁基苯甲酸
DPPBA：4-(2，4-二叔戊基苯氧基)丁酸
TEBA：3，4，5-三乙氧基苯甲酸
PCAA：α-苯基环戊烷乙酸
MDCA：3，4-(亚甲二氧基)肉桂酸
Gly：甘氨酸
L-Phe：L-苯丙氨酸
L-Arg：L-精氨酸
L-His：L-组氨酸
L-Trp：L-色氨酸
L-Pro：L-脯氨酸
L-Asn：L-天冬酰胺
L-Lys：L-赖氨酸
L-Asp：L-天冬氨酸
D-Phe：D-苯丙氨酸
D-Arg：D-精氨酸
D-Tyr：D-酪氨酸
D-Ser：D-丝氨酸
D-Trp：D-色氨酸
D-Pro：D-脯氨酸
D-Leu：D-亮氨酸
Ahx：6-氨基己酸
Aib：α-氨基异丁酸
DBHBA：3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲酸
INA：六氢异烟酸(isonipectoic acid)
NIe：L-正亮氨酸
PPC：4-苯基-哌啶-4-羧酸
SAA：水杨酸
3HBA：3-羟基苯甲酸
4HBA：4-羟基苯甲酸
在优选的主要种类的亲和性配体中，每种配体包含一个或多个疏水性官能团和一个或多个阳离子官能团，其中至少一个疏水性官能团与至少一个阳离子官能团被5至20的直达键距所分开，其中所述配体具有120Da至1,500Da的分子量。
在一种优选的实施方式中，亲和性配体包含共价连接的残基X1-X2-X3或者由其组成，其中任选地X1、X2和/或X3、特别是X1和/或X3与连接体L缔合。
优选地，X1、X2、X3和任选的连接体残基优选地是高度稳定的分子，它们能够抵抗反复暴露于严格的化学条件(例如1M强酸或1M强碱)和生物学条件(例如高蛋白酶活性)。同样，每一X1、X2、X3和任选的连接体残基之间各自的键是高度稳定的，并能够抵抗严格的化学和生物学条件。
残基X1优选地选自由Arg、Phe、PPC、DBHBA、SAA、DAP、DAB、(DBHBA)2-DAP、(MDCA)2-DAP、DPBBA、DBBA、PCAA、DPPAA、Trp、TMPPA、DBHPA组成的组，其中每一成员任选地进一步选自分离的和任选活性的残基和包含同一残基的两种旋光活性异构体的外消旋混合物。在一种优选的变化中，X1选自由L-Arg、D-Lys、D-Phe、D-Pro、INA、PPC、DBHBA、3HBA、4HBA和SAA组成的组。
残基X2优选地选自由Arg、Asn、Leu、Lys、Phe、Pro、PPC、DAP、DAB、His、Trp、Tyr、Ser组成的组，其中每一成员任选地进一步选自分离的和任选活性的残基和包含同一残基的两种旋光活性异构体的外消旋混合物。在一种优选的变化中，X2选自由L-Arg、L-Asn、D-Leu、D-Lys、D-Phe、D-Pro、L-Pro、AIB、AHX、INA、NIe和PPC组成的组。
残基X3优选地选自由Arg、Asn、Pro、PPC、Asp、Orn、(1H2NA)Dap组成的组，其中每一成员任选地进一步选自分离的和任选活性的残基和包含同一残基的两种旋光活性异构体的外消旋混合物。在一种优选的变化中，X3选自由L-Arg、L-Asn、D-Lys、D-Phe、D-Pro、L-Pro和PPC组成的组。
一组目前有希望的对抗体、例如单克隆抗体具有亲和性的配体是包含一组或多组如下或者由其组成的配体(对应于X1-X2-X3)：
D-Phe-(L)Arg-(L)Arg
L-Arg-D-Phe-(L)Arg
PPC-D-Pro-(L)Arg
PPC-D-Leu-PPC
INA-D-Phe-PPC
PPC-Aib-PPC
D-Phe-(L)Arg-(L)Arg
L-Arg-D-Phe-(L)Arg
L-Arg-(L)Arg-D-Phe
PPC-(L)Arg-D-Pro
D-Pro-PPC-(L)Arg
L-Arg-D-Pro-PPC
L-Arg-D-Lys-(L)Arg
L-Arg-(L)Arg-D-Lys
D-Lys-INA-(L)Arg
INA-(L)Arg-D-Lys
PPC-Ahx-PPC
PPC-NIe-PPC
SAA-(L)Arg-(L)Pro
SAA-(L)Pro-(L)Arg
DBHBA-(L)Arg-(L)Asn
DBHBA-(L)Asn-(L)Arg
3HBA-(L)Arg-(L)Pro
3HBA-(L)Pro-(L)Arg
4HBA-(L)Arg-(L)Pro
4HBA-(L)Pro-(L)Arg
在另一种目前有希望的实施方式中，配体包含小于5个、例如小于4个、例如3个残基或者由其组成，选自由D-Leu、D-Lys、D-Phe、D-Pro、L-Arg、L-Asn、L-Pro、Ahx、Aib、DBHBA、INA、NIe、PPC、SAA、3HBA和4HBA组成的组。配体因而可以由3个残基X1-X2-X3组成，各自选自由D-Leu、D-Lys、D-Phe、D-Pro、L-Arg、L-Asn、L-Pro、Ahx、Aib、DBHBA、INA、NIe、PPC、SAA、3HBA和4HBA组成的组。
当配体包含3个残基X1-X2-X3或者由其组成时，
X1优选地选自由D-Lys、D-Phe、D-Pro、L-Arg、DBHBA、INA、PPC、SAA、3HBA和4HBA组成的组，
X2优选地选自由D-Leu、D-Lys、D-Phe、D-Pro、L-Arg、L-Asn、L-Pro、Ahx、AIB、INA、NIe、PPC组成的组，
X3优选地选自由D-Lys、D-Phe、D-Pro、L-Arg、L-Asn、L-Pro、PPC组成的组。
在进一步的实施方式中，配体包含3个共价连接的残基X1-X2-X3或者由其组成，
其中所述共价连接的残基进一步共价连接于实体L-PM的连接体残基L，其中PM是固体支撑材料，优选聚合物基质，任选为交联和/或珠粒形式，
其中X1是D-和/或L-构型的天然或非天然氨基酸，或者包含任选被取代的芳族基团的羧酸残基，
其中X2是D-和/或L-构型的天然或非天然氨基酸，或者包含任选被取代的芳族基团的羧酸残基，其条件是X2不是苏氨酸残基，并且
其中X3是D-和/或L-构型的天然或非天然氨基酸，或者包含任选被取代的芳族基团的羧酸残基，
其中X1、X2和X3中的至少一个包含阳离子官能团，并且
其中X1、X2和X3中的至少一个包含疏水性官能团，
其中X1选自L-Arg、D-Lys、D-Phe、D-Pro、INA、PPC、DBHBA、3HBA、4HBA和SAA；
其中X2选自L-Arg、L-Asn、D-Leu、D-Lys、D-Phe、D-Pro、L-Pro、AIB、AHX、INA、NLE和PPC；并且
其中X3选自L-Arg、L-Asn、D-Lys、D-Phe、D-Pro、L-Pro和PPC。
在更进一步有希望的实施方式中，配体包含3个共价连接的残基X1-X2-X3或者由其组成，
其中所述共价连接的残基共价连接于实体L-PM的连接体L，
其中X1是D-和/或L-构型的天然或非天然氨基酸，或者包含任选被取代的芳族基团的羧酸残基，
其中X2是D-和/或L-构型的天然或非天然氨基酸，或者包含任选被取代的芳族基团的羧酸残基，其条件是X2不是苏氨酸残基，并且
其中X3是D-和/或L-构型的天然或非天然氨基酸，或者包含任选被取代的芳族基团的羧酸残基，
其中X1、X2和X3中的至少一个包含阳离子官能团，并且
其中X1、X2和X3中的至少一个包含疏水性官能团，
其中X1选自L-Arg、D-Lys、D-Phe、D-Pro、INA、PPC、DBHBA、3HBA、4HBA和SAA；
其中X2选自L-Arg、L-Asn、D-Leu、D-Lys、D-Phe、D-Pro、L-Pro、AIB、AHX、INA、NLE和PPC；
其中X3选自L-Arg、L-Asn、D-Lys、D-Phe、D-Pro、L-Pro和PPC。
在一种实施方式中，连接于聚合物基质的连接体残基L可被酸、碱、温度、光线或者与化学试剂接触所裂解。如上所述，连接于聚合物基质的连接体可以选自(3-甲酰基吲哚-1-基)乙酸、2，4-二甲氧基-4′-羟基-二苯甲酮、HMPA、HMPB、HMPPA、Rink酸、Rink酰胺、Knorr连接体、PAL连接体、DCHD连接体、Wang连接体和Trityl连接体。经由可裂解连接体与聚合物基质连接的配体能够用于分析目的，例如诊断应用。
在本发明的一种实施方式中，X1、X2和X3选自天然氨基酸和它们的立体异构体。
已经发现，包括至少一种包含侧链胍基或氨基、特别是胍基的氨基酸通常提供就结合能力而言的有利性质。因此，包括在配体中的特别相关的氨基酸是精氨酸、高精氨酸、赖氨酸、高赖氨酸和鸟氨酸，特别是精氨酸和高精氨酸。
特别有希望的配体亚类是其中配体包含两个精氨酸片段者。因此，在这种实施方式内特别优选(favoured)的配体是
H2N-(D)Phe-(L)Arg-(L)Arg-Gly-OH
和
H2N-(L)Arg-(D)Phe-(L)Arg-Gly-OH.
在进一步的实施方式中，X1、X2和X3选自天然和非天然氨基酸。
因此，就更进一步有希望的配体亚类而言，
X1选自由Ar g、Phe、PPC、DBHBA、SAA、DAP、DAB、(DBHBA)2-DAP、(MDCA)2-DAP、DPBBA、DBBA、PCAA、DPPAA、Trp、TMPPA和DBHPA组成的组，
X2选自由Arg、Asn、Leu、Lys、Phe、Pro、PPC、DAP、DAB、His、Trp、Tyr和Ser组成的组，
X3选自由Arg、Asn、Pro、PPC、Asp、Orn和(1H2NA)Dap组成的组。
在这种亚类内特别优选的配体是：
Figure A20058004840000351
HN-PPC-(D)Pro-(L)Arg-Gly-OH
和
Figure A20058004840000352
HN-PPC-(D)Leu-PPC-Gly-OH
在更进一步的配体亚类中，每一配体包含一个或多个取代或未取代的苯基或萘基和一个或多个伯胺或胍。
在这种实施方式内特别优选的配体是：
Figure A20058004840000361
DBBA-(L)Hls-(L)Arg-Gly-OH、
DBBA-His-Arg-Gly-OH、
DBBA-His-Arg-Arg-Gly-OH
Figure A20058004840000362
DPPBA-(L)Phe-(L)Arg-Gly-OH、
Figure A20058004840000363
PCAA-(L)Phe-(L)Arg-Gly-OH、
DPPBA-(L)Lys-(L)Arg-Gly-OH
Figure A20058004840000372
SAA-(L)Arg-(L)Pro-Gly-OH
Figure A20058004840000373
SAA-(L)Pro-(L)Arg-Gly-OH
Figure A20058004840000374
DBHBA-(L)Arg-(L)Asn-Gly-OH
Figure A20058004840000381
DBHBA-(L)Asn-(L)Arg-Gly-OH
Figure A20058004840000382
DPPBA-(L)Trp-(L)Arg-Gly-OH
Figure A20058004840000383
(MDCA)2-DAP-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH
Figure A20058004840000384
(MDCA)2-DAP-(L)Arg-(L)Asp-Gly-OH
Figure A20058004840000391
DPPAA-(L)Phe-(L)Arg-Gly-OH
DPPAA-PPC-(L)Arg-Gly-OH
DBHBA-(D)Phe-(D)Arg-Gly-OH
Figure A20058004840000394
DPPAA-(D)tyr-(D)Arg-Gly-OH
Figure A20058004840000401
H2N-(D)Trp-(D)Ser-(1H2NA)DAP-Aib-OH、
Figure A20058004840000402
H2N-(L)His-(D)Ser-(1H2NA)DAP-Aib-OH、
Figure A20058004840000403
(DPPA)2-DAP-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH
Figure A20058004840000404
(DBHBA)2-DAP-(L)Arg-(L)Arg-Gly-OH、
DBHBA-DAP-Arg-Gly-OH、
DBHBA-DAP-Arg-Arg-Gly-OH、
(DBHBA)2-DAP-Arg-Gly-OH、
(DBHBA)3-DAP-Arg-Arg-Gly-OH、
(DBHBA)3-DAP-Arg-Arg-Gly-OH、
Figure A20058004840000411
TMPPA-(L)Trp-(L)Arg-Gly-OH
Figure A20058004840000412
DBHPA-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH
替代的亲和性配体
另一类目前有希望的亲和性配体是其中配体含有一个或多个疏水性基团和一个或多个杂芳族基团者。
因此，在另一大类优选的亲和性配体中，每一配体包含一个或多个疏水性官能团和一个或多个杂芳族官能团，其中至少一个疏水性官能团与至少一个杂芳族官能团被5至20的直达键距(through bonddistance)所分开，其中所述配体具有120Da至5,000Da的分子量。
优选地，其上固定有这样一种亲和性配体的亲和性树脂具有大于5mg单克隆抗体/mL亲和性树脂的结合能力。
术语“杂芳族官能团”旨在涵盖在上文“包含芳族残基的疏水性官能团”和“阳离子官能团”下所定义的杂芳族品种。
上文就主要种类的亲和性配体而言所给出的关于直达键距、直达空间距离(through space distance)、分子量等的说明和优选也适用于这类亲和性配体，不过应当理解“距离”是指疏水性官能团与杂芳族官能团之间。
这类配体的实例是：
Figure A20058004840000421
(TEBA)2-DAP-(L)Trp-(L)Trp-Gly-OH.
固体支撑材料
根据本发明的配体被共价固定于固体支撑材料，例如聚合物树脂、聚合材料的表面、玻璃表面等，并可以用于纯化和/或分离抗体，例如单克隆抗体。
固体支撑材料通常包含聚合物基质，例如交联的聚合物基质。最常见地，聚合物基质是珠粒化的，作为替代选择，聚合物基质被制成整体单元。优选地，至少珠粒化聚合物基质的表面包含亲水性片段。
因此，固体支撑材料通常为树脂、整体、滤器、平板(例如微型矩阵)、纤维、传感器(例如悬臂(cantelever))、表面胞质基因组共振传感器或者石英晶体微量天平。
树脂是多孔的固体材料，用于在液体中分离化合物。树脂可以是交联的聚合物，陶瓷材料，例如无机氧化物，例如氧化铝、氧化硅。树脂以颗粒形式提供，例如球形颗粒或不规则颗粒。
配体是以结合能力为特征的，它优选地大于5mg抗体/mL湿树脂，例如大于6mg抗体/mL树脂，例如大于7mg抗体/mL树脂，例如大于8mg抗体/mL树脂，例如大于9mg抗体/mL树脂，例如大于10mg抗体/mL树脂，例如大于12mg抗体/mL树脂，例如大于14mg抗体/mL树脂，例如大于16mg抗体/mL树脂，例如大于18mg抗体/mL树脂，例如大于20mg抗体/mL树脂，例如大于22mg抗体/mL树脂，例如大于24mg抗体/mL树脂，例如大于26mg抗体/mL树脂，例如大于28mg抗体/mL树脂，例如大于30mg抗体/mL树脂，例如大于35mg抗体/mL树脂，例如大于40mg抗体/mL树脂，例如大于45mg抗体/mL树脂，例如大于50mg抗体/mL树脂，例如最多500mg抗体/mL树脂。
措辞“结合能力”表示树脂结合靶标化合物、例如抗体的能力。结合能力以mg靶标(例如抗体)/mL树脂(或其他形式的珠粒材料)给出，可以如下测量，使浓度已知的纯靶标溶液通过树脂，测量直到靶标化合物突破(breakthrough)的体积。然后计算结合能力，为突破体积乘以浓度再除以床体积。本文所用的结合能力表示树脂结合抗体的能力。结合能力以mg抗体/毫升树脂给出，可以如下计算，使浓度已知的纯抗体的水性缓冲溶液(50mM Na-磷酸盐，pH＝7.0)穿过树脂，记录从树脂中流出的溶液的UV吸收(280nm)的显色。突破体积是当UV吸收达到其终端值的5％时从树脂中已经流出的溶液体积。然后计算结合能力，为突破体积乘以进料溶液中抗体的浓度再除以床体积。
当配体连接于本质上非多孔材料的表面时，例如矩阵表面或传感器表面，配体的结合能力被测量为每表面积结合的蛋白质质量。配体是以结合能力为特征的，它优选地大于1ng抗体/cm2，例如大于5ng抗体/cm2，例如大于10ng抗体/cm2，例如大于50ng抗体/cm2，例如大于100ng抗体/cm2。
下文更详细地讨论适合的树脂实例。
聚合物基质
配体能够与固体支撑材料共价缔合，例如多孔的无机基质或聚合物基质，任选地为交联和/或珠粒形式或者在整体多孔的实体中。优选地，聚合物基质的孔之宽足够靶标蛋白质通过所述孔扩散和与孔内表面上的配体相互作用。就摩尔质量大约150kDa的单克隆抗体而言，平均孔径50-200nm是优选的，例如大约100nm。一些商业上可获得的适合的聚合物树脂是可用的，例如SepharoseTM、FractogelTM、CIMGELTM、Toyopearl。
珠粒的和任选交联的聚合物基质在一种实施方式中包含大量亲水性部分。亲水性部分可以是聚合物链，它们在交联时生成交联的聚合物基质。实例包括例如聚乙二醇部分、聚胺部分、聚乙烯胺部分和多元醇部分。
在有些实施方式中，珠粒化聚合物基质的核心和/或表面包含聚合材料，选自由聚乙烯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚酯和聚酰胺组成的组。
珠粒化聚合物基质也可以选自由PS、POEPS、POEPOP、SPOCC、PEGA、CLEAR、Expansin、Polyamide、Jandagel、PS-BDODMA、PS-HDODA、PS-TTEGDA、PS-TEGDA、GDMA-PMMA、PS-TRPGDA、ArgoGel、Argopore树脂、ULTRAMINE、交联LUPAMINE、高能PEGA、Silica、Fractogel、Sephadex、Sepharose、玻璃珠粒、交联聚丙烯酸酯和上述的衍生物组成的组；确切而言，聚合物基质选自由SPOCC、PEGA、HYDRA、POEPOP、PEG-聚丙烯酸酯共聚物、聚醚-聚胺共聚物和交联聚亚乙基二胺组成的组。
除了上述实例以外，任何能够形成聚合物基质的材料在原则上都能够用于生产本发明的珠粒。优选地，珠粒的核心材料是聚合性的。在有些实施方式中，核心包含亲水性聚合材料或者由其组成。在其他实施方式中，核心包含疏水性聚合材料或者由其组成。在有些实施方式中，珠粒的表面包含与核心相同的材料或者由其组成。
可用于大规模应用的树脂可以是上文提到的之一或者其他商用树脂，例如SephadexTM、SepharoseTM、FractogelTM、CIMGELTM、Toyopearl、交联琼脂糖和大孔聚苯乙烯或聚丙烯酸酯。基质也可以是主要无机属性的，例如大孔玻璃或粘土矿，或者树脂与无机物的组合，例如Ceramic HyperDTM。
根据本发明的聚合物珠粒可以从多种可聚合的单体制备，包括苯乙烯、丙烯酸酯和不饱和的氯化物、酯、乙酸酯、酰胺和醇，包括但不限于聚苯乙烯(包括高密度聚苯乙烯胶乳，例如溴化聚苯乙烯)、聚甲基异丁烯酸酯与其它聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚丙烯酰胺、聚丙烯醛、聚二甲基硅氧烷、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚尿烷、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯基吡啶、聚乙烯基苄基氯、聚乙烯基甲苯、聚偏1，1-二氯乙烯和聚二乙烯基苯。在其它实施方式中，珠粒是从苯乙烯单体或PEG类大分子单体制备的。聚合物在优选的实施方式中选自由聚醚、聚乙烯、聚丙烯酸酯、聚异丁烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚尿烷、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚酯、聚酰胺及其组合组成的组。高度优选的表面和核心部分包括交联的PEG部分、聚胺部分、聚乙烯胺部分和多元醇部分。
优选用于生产本发明组合物的珠粒的疏水性聚合物是PS-DVB(聚苯乙烯二乙烯基苯)。PS-DVB已经广泛用于固相肽合成(SPPS)，最近已经证明在特定有机分子的聚合物-承载制备中的实用性(Adams et al.(1998)J.Org.Chem.63：3706-3716)。在正确制备时(Grotli et al.(2000)J.Combi.Chem.2：108-119)，PS-DVB支撑材料显示优异的化学合成性质，例如高加载、在有机溶剂中合理的溶胀和物理稳定性。
在本发明的一种实施方式中，配体与传感器或矩阵平板的表面缔合，用于检测和/或量化生物样品中的抗体。
本文所用的术语“生物样品”包括天然样品或者从工业过程、例如重组过程得到的样品，包括“体液”，也就是任何从生物体或生物体组织提取、排泄或分泌的液体物质。体液并不需要一定含有细胞。与本发明相关的体液包括但不限于全血、血清、尿液、血浆、脑脊液、泪水、乳汁、滑液和羊水。
在进一步的实施方式中，大量配体与矩阵平板的表面缔合，排列成大量的点，每个点代表一个配体。这样一种功能化矩阵能够用于检测溶液中抗体的存在。这样一种矩阵能够用于诊断性应用，以检测生物样品中某些抗体的存在。
在进一步的实施方式中，大量配体与悬臂传感器的结合表面缔合，供检测和任选地量化抗体。大量亲和性配体能够与大量悬臂缔合，每一悬臂代表一个配体。这样一种功能化矩阵能够用于检测溶液中各种抗体的存在。这样一种多重传感器能够用于诊断性应用，以检测生物样品中某些抗体的存在。
连接体
上述配体被共价固定于固体支撑材料，也许通过连接体。在优选的实施方式中，配体被共价连接于连接体，后者被共价连接于聚合物基质。用于将亲和性配体与固体支撑材料连接的一般技术可以参见Hermanson，Krishna Mallia and Smith，Immobilized AffinityLigand Techniques″，Academic Press，1992。
连接体用于连接配体与固体支撑材料，例如聚合物基质或无机载体。优选地，连接体在配体与固体载体之间生成强大和持久的键。当本发明的固体支撑材料被用于单克隆抗体或其片段的反复纯化时，这是特别重要的。
不过，在本发明的一种实施方式中，连接体可以被选择性裂解。当固体载体被用于分析目的时，这可以是有用的。
氨基酸和多肽是典型连接体的实例。其它可能的连接体包括碳水化合物和核酸。
在一种实施方式中，连接于聚合物基质的连接体残基L被酸、碱、温度、光线或者与化学试剂接触所裂解。确切而言，连接于聚合物基质的连接体可以是(3-甲酰基吲哚-1-基)乙酸、2，4-二甲氧基-4′-羟基-二苯甲酮、HMPA、HMPB、HMPPA、Rink酸、Rink酰胺、Knorr连接体、PAL连接体、DCHD连接体、Wang连接体和Trityl连接体。
配体可以与固体载体通过连接体缔合，所述连接体的长度优选地小于50，例如长度为3至30，例如长度为3至20，例如长度为3至10。
连接体可以连接于疏水性官能团或阳离子官能团或者连接疏水性官能团的配体与阳离子官能团的结构实体。在一种实施方式中，连接体连接于阳离子官能团。不过优选地，连接体经由羧酸基团或氨基连接于亲和性配体，特别是经由羧酸基团。
连接体也可以包含大量共价连接的亚单元，例如这些亚单元选自相同和不相同的连接体亚单元。在一种变化中，连接体是柔性的，包含3至优选小于50个相同或不相同的共价连接的亚单元。
在本发明的优选实施方式中，连接体L选自由甘氨酸、丙氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸和HMBA组成的组。
连接体也可以选自下组：多分散的聚乙二醇；单分散的聚乙二醇，例如三甘醇、四甘醇、五甘醇、六甘醇、七甘醇；氨基酸；二肽；三肽；四肽；五肽；六肽；七肽；八肽；九肽；十肽；聚丙氨酸；聚甘氨酸；聚赖氨酸；聚精氨酸，包括其任意组合。
优选的实施方式
一种优选的实施方式涉及固体支撑材料，其上共价固定有亲和性配体，所述配体包含一个或多个疏水性官能团和一个或多个阳离子官能团，
其中至少一个疏水性官能团与至少一个阳离子官能团被5至20的直达键距所分开，
其中所述配体具有120Da至1,500Da的分子量；
其中该配体包含一个或多个具有侧链胍基的氨基酸和一个或多个具有侧链取代的苯基或萘基的氨基酸。
鉴于上述，已经发现特别有关的配体选自由DBBA-(L)His-(L)Arg-Gly-OH和(DBHBA)2-DAP-(L)Arg-(L)Arg-GIy-OH组成的组。
组合物
本发明也提供固体支撑材料，其上共价固定有大量不同的亲和性配体。这样一种组合物能够用于从生物样品中分离各种抗体。
抗体分离方法
本发明的另一方面涉及分离生物分子的方法，例如蛋白质，例如抗体，特别是单克隆抗体，该方法包含如下步骤：
(i)提供固体支撑材料，其上共价固定有如本文所定义的亲和性配体，
(ii)提供推定含有抗体的样品，该抗体对所述配体具有亲和性，
(iii)使所述配体与所述推定含有所述抗体的样品接触，
(iv)当在所述样品中含有所述抗体时，选择性结合所述抗体，和
(v)当在所述样品中含有所述抗体时，选择性分离所述抗体。
在一种变化中，该方法包含如下步骤，提供如本文所定义的配体，将所述配体与固体载体，例如珠粒和/或交联的聚合物基质连接，提供推定含有抗体的样品，该抗体对所述配体具有亲和性，使所述配体与所述推定含有所述抗体的样品接触，当在所述样品中含有所述抗体时，选择性结合所述抗体，和当在所述样品中含有所述抗体时，选择性分离所述抗体。
优选地，配体的结合能力大于5mg抗体/mL树脂或者以上，如上“固体支撑材料”项下所述。
应当理解，固体支撑材料的处理和工艺本质上遵循常规的亲和性色谱技术。
实施例
下列非限制性实施例进一步阐述本发明。实施例描述如何能够设计大型文库和测试它们针对单克隆抗体的亲和性。
材料和方法
全部试剂和溶剂均从供应商获得，无需纯化即可使用。全部所用溶剂均为HPLC级，保存在分子筛上。Fmoc-保护的氨基酸和HMBA连接体从Bachem AG，Bubendorf，Switzerland获得。PPC和ACC从Neosystem，Strasbourg，France购买。SepharoseTM从Sterogene购买，FractogelTM从Merck购买。全部配体均在PEGA1900(VersabeadsTMA)树脂上合成。使用20孔多柱肽合成仪供组合文库合成。在CDCl3溶液中记录1H NMR光谱，使用Varian Unity Inova 500MHz分光计。以相对于四甲基硅烷的δ值报告化学漂移。在Waters Global Ultima质谱计上记录ESI-质谱，在Bruker Reflex III质谱计上记录MALDI-TOF光谱，使用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质。在Waters HPLC系统上进行分析型和制备型反相HPLC分离，使用分析型Zorbax300SB-C18(4.5×50mm)和Delta PAK(25×300mm)C18柱，流速分别为1cm3min-1和10cm3min-1。在215nm下、用于分析目的的多波长检测器(Waters 490E)进行检测，使用光电二极管矩阵检测器(WatersM991)用于制备分离。溶剂系统由A：0.1％TFA的水溶液和B：0.1％TFA的90∶10乙腈/水溶液组成。
Fc片段的标记
在碳酸氢盐缓冲液(pH 8)中通过透析纯化抗体的Fc片段。将经过纯化的Fc片段用Oregon Green染剂(50x)的DMF溶液处理，在室温下保持1小时。加入羟胺(1.5M，pH 8.5)终止反应。在碳酸氢盐缓冲液(pH 8)中通过透析纯化所标记的多肽。
实施例1：配体的合成
固相合成遵循下列方案：
全部化合物均在聚乙二醇-丙烯酰胺类氨基官能树脂PEGA1900上合成。经由碱不稳定性对-羟甲基苯甲酸HMBA连接体使配体与甘氨酸衍生化树脂连接。
将结构单元(building block)(酸/氨基酸；3equiv)溶于DMF，加入N-乙基吗啉(4equiv)和TBTU(2.88equiv)。将反应混合物保持5min，加入到在DMF中溶胀的树脂中达2h。将树脂用DMF、EtOH-DMF和DCM洗涤。
在标记的Fc片段中温育所合成的化合物
将珠粒(10mg)用水(10x)、碳酸氢盐缓冲液(pH 8，10x)洗涤，悬浮在碳酸氢盐缓冲液中达1h。然后向树脂加入标记的多肽，在室温下保持过夜。将树脂用碳酸氢盐缓冲液(pH 8)和水洗涤。
利用荧光显微镜和数字照相机记录珠粒上的荧光。配有发射滤光器的汞灯提供可见蓝光范围内的激发。在水中记录珠粒的图像。
下式阐述用于合成的结构单元。
下表列举配体和对应的表观荧光水平，其通过观察样品并且比较样品之间的表观颜色强度来确定。在0至3的任意规模上，0表示没有荧光，3表示所观察到的最强荧光水平。
编号   组合物                       得分
L1#16  D-Phe-(L)Arg-(L)Arg-Gly     3
LI#17  L-Arg-D-Phe-(L)Arg-Gly      3
LI#19  PPC-D-Pro-(L)Arg-Gly        3
L1#50  PPC-D-Leu-PPC-Gly           3
LI#12  INA-D-Phe-PPC-Gly           2
LI#14  PPC-Aib-PPC-Gly             2
LI#16  D-Phe-(L)Arg-(L)Arg-Gly     2
LI#17  L-Arg-D-Phe-(L)Am-Gly       2
LI#18  L-Arg-(L)Arg-D-Phe-Gly      2
LI#20  PPC-(L)Arg-D-Pm-Gly         2
LI#21  D-Pro-PPC-(L)Arg-Gly        2
LI#24  L-Arg-D-Pro-PPC-Gly         2
LI#26  L-Arg-D-Lys-(L)Arg-Gly      2
LI#27  L-Am-(L)Arg-D-Lys-Gly       2
LI#41  D-Lys-INA-(L)Arg-Gly        2
LI#44  INA-(L)Arg-D-Lys-Gly        2
LI#53  PPC-Ahx-PPC-Gly             2
LI#56  PPC-Nle-PPC-Gly             2
LⅡ#48 SAA-(L)Am-(L)Pm-Gly        3
LⅡ#49 SAA-(L)Pro-(L)Arg-Gly      3
LⅡ#54 DBHBA-(L)Arg-(L)Asn-Gly    3
LⅡ#55 DBHBA-(L)Asn-(L)Arg-Gly    3
LⅡ#44 3HBA-(L)Arg-(L)Pro-Gly     2
LⅡ#45 3HBA-(L)Pro-(L)Arg-Gly     2
LII#46 4HBA-(L)Arg-(L)Pro-Gly     2
LII#47 4HBA-(L)Pro-(L)Arg-Gly     2
实施例2：配体(来自实施例1)的色谱评价
准备色谱柱
以包装模式评估新的树脂。应用标准条件，将1mL每种树脂装入HR5色谱柱(GE Healthcare)。
包装后，柱子的床高度为3.9cm，总容量为0.76mL。
平衡，加载，洗脱
在用单克隆抗体加载基质之前，将柱子用6倍柱容量的平衡缓冲液平衡，其中含有50mM磷酸钠(pH 7.0；cond.9mS cm-1)。平衡后，向柱子加载单克隆抗体在平衡缓冲液中的溶液(蛋白质浓度1.14mg/mL)。随后，将柱子用6倍柱容量的平衡缓冲液洗涤，并用6倍柱容量的洗脱缓冲液1(25mM乙酸钠pH 5.5；cond.1.8mS cm-1)和6倍柱容量的洗脱缓冲液2(25mM乙酸钠pH 3.8；cond.0.5mS cm-1)洗脱。将柱子贮存在20％乙醇中。然后，将基质用40mM磷酸和20mM氢氧化钠再生。平衡、加载和洗涤的流速为60cm/h，进行洗脱和再生的流速为30cm/h。
偶联在Fractogel上的配体55的结果
  过程步骤   体积   mAb含量
  [mL]   [mg/mL]   [mg]   步骤收率[％]
  加载   6.6   1.10   7.26   100
  流程(flow through)   6.5   0.19   1.24   17.0
  洗涤   4.5   0.02   0.09   1.20
  洗脱1   4.5   0.19   0.86   11.8
  洗脱2   4.0   1.05   4.2   57.9
  再生   1.5   0.49   0.74   10.1
  回收   98
偶联在Fractogel上的配体16的结果
  过程步骤   体积   mAb含量
  [mL]   [mg/mL]   [mg]   步骤收率[％]
  加载   7.0   1.10   7.70   100
  流程   7.0   0.01   0.07   0.9
  洗涤   4.5   0.00   0.00   0.0
  洗脱1   5.0   1.13   5.65   73.4
  洗脱2   4.5   0.35   1.58   20.5
  再生   1.5   0.11   0.17   2.1
  回收   97
总结和结果
用两种配体显示mAb的结合和洗脱，没有应用优化操作条件。就配体55而言，只有有限的材料进入流程，而在配体16的流程中没有检测到。
实施例3
在氨基活化的Toyopearl树脂(由Tosoh供应)上合成配体TMPPA-(L)Trp-(L)Arg-Gly-OH、DBHPA-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH、(DPPA)2-DAP-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH和(DBHBA)2-DAP-(L)Arg-(L)Arg-Gly-OH。通过进行下列步骤顺序两次(循环1和循环2)来评价每种所得亲和性树脂(分别为B2、B3、D1和D2)针对mAb的结合能力：
1)使mAb的含水溶液(50mM磷酸钠，pH＝7.0)穿过装有树脂的柱子，同时记录渗透物的UV吸收显色，并收集从柱子流出的液体样品(流程)，
2)使水性洗脱缓冲液(25mM乙酸盐，pH＝3.7)穿过柱子，收集从柱子流出的液体样品(洗脱)，
3)使含水净化缓冲液(1M乙酸)穿过柱子，收集从柱子流出的液体样品(再生/净化)。
然后测定每一循环中每种样品的mAb质量mi，i＝1、2、3。
“结合能力”被计算为向柱子加入mAb的总质量m0乘以在UV吸收已经达到其终端值的5％时向柱子加入缓冲液的体积V5％，除以所用缓冲液的总体积V0，再除以湿树脂的体积V树脂。
Figure A20058004840000531
下表给出B2、B3、D1和D2的结果(流程＝m1/m0，洗脱＝m2/m0，洗涤＝m3/m0)。
  树脂   B2   B3   D1   D2
  循环   1   2   1   2   1   2   1   2
  结合能力(mg/mL)   17   15   12   12   8   7   17   16
  流程(％)   20   22   19   20   31   32   10   12
  洗脱(％)   23   26   47   47   60   63   47   49
  再生(％)   43   48   33   30   8   5   26   27
从表格清楚看出，全部所测试的配体均具有大于5mg/mL的结合能力。
为了测定树脂B2和B3针对mAb的选择性，重复该实验，但是这次在步骤1中使用粗发酵上清液。实验后，用SDS Page测定样品的纯度。B2、B3、D1和D2的结果分别如图1、2、3和4所示。
从图1-4可以看出，全部四种所测试的配体均显示针对mAb的选择性，其中在给定条件下B2和D1尤其具有选择性。

Claims (14)

1.固体支撑材料，其上共价固定有亲和性配体，所述配体包含一个或多个疏水性官能团和一个或多个阳离子官能团，
其中至少一个疏水性官能团与至少一个阳离子官能团被5至20的直达键距所分开，
其中所述配体具有120Da至5,000Da的分子量。
2.根据权利要求1的固体支撑材料，其中所述亲和性树脂具有大于5mg单克隆抗体/mL亲和性树脂的结合能力。
3.根据在先权利要求任意一项的固体支撑材料，其中该亲和性配体包含一个或多个疏水性官能团和一个或多个阳离子官能团，其中至少一个疏水性官能团与至少一个阳离子官能团被5至20的直达键距所分开，并且其中所述配体具有120Da至1,500Da的分子量。
4.根据在先权利要求任意一项的固体支撑材料，其中该亲和性配体包含共价连接的残基X1-X2-X3或者由其组成，其中任选地X1、X2和/或X3与连接体残基缔合。
5.根据权利要求4的固体支撑材料，其中残基X1选自由Arg、Phe、PPC、DBHBA、SAA、DAP、DAB、(DBHBA)2-DAP、(MDCA)2-DAP、DPBBA、DBBA、PCAA、DPPAA、Trp、TMPPA和DBHPA组成的组。
6.根据权利要求4-5任意一项的固体支撑材料，其中残基X2选自由Arg、Asn、Leu、Lys、Phe、Pro、PPC、DAP、DAB、His、Trp、Tyr和Ser组成的组。
7.根据权利要求4-6任意一项的固体支撑材料，其中残基X3选自由Arg、Asn、Pro、PPC、Asp、Orn和(1H2NA)Dap组成的组。
8.根据权利要求4-7任意一项的固体支撑材料，其中该配体包含3个共价连接的残基X1-X2-X3或者由其组成，
其中所述共价连接的残基进一步共价连接于实体L-PM的连接体L，其中L是连接体，并且PM是固体支撑材料，优选聚合物基质，任选为交联和/或珠粒形式，
其中X1是D-和/或L-构型的天然或非天然氨基酸，或者包含任选被取代的芳族基团的羧酸残基，
其中X2是D-和/或L-构型的天然或非天然氨基酸，或者包含任选被取代的芳族基团的羧酸残基，其条件是X2不是苏氨酸残基，
其中X3是D-和/或L-构型的天然或非天然氨基酸，或者包含任选被取代的芳族基团的羧酸残基，
其中X1、X2和X3中的至少一个包含阳离子官能团，并且
其中X1、X2和X3中的至少一个包含疏水性官能团，
其中X1选自L-Arg、D-Lys、D-Phe、D-Pro、INA、PPC、DBHBA、3HBA、4HBA和SAA；
其中X2选自L-Arg、L-Asn、D-Leu、D-Lys、D-Phe、D-Pro、L-Pro、AIB、AHX、INA、NLE和PPC；并且
其中X3选自L-Arg、L-Asn、D-Lys、D-Phe、D-Pro、L-Pro和PPC。
9.根据在先权利要求任意一项的固体支撑材料，其中该配体选自下组之一：
H2N-(D)Phe-(L)Arg-(L)Arg-Gly-OH，
H2N-(L)Arg-(D)Phe-(L)Arg-Gly-OH，
HN-PPC-(D)Pro-(L)Arg-Gly-OH，
HN-PPC-(D)Leu-PPC-Gly-OH，
DBBA-(L)His-(L)Arg-Gly-OH，
DBBA-His-Arg-Gly-OH，
DBBA-His-Arg-Arg-Gly-OH，
DPPBA-(L)Phe-(L)Arg-Gly-OH，
PCAA-(L)Phe-(L)Arg-Gly-OH，
DPPBA-(L)Lys-(L)Arg-Gly-OH，
SAA-(L)Arg-(L)Pro-Gly-OH，
SAA-(L)Pro-(L)Arg-Gly-OH，
DBHBA-(L)Arg-(L)Asn-Gly-OH，
DBHBA-(L)Asn-(L)Arg-Gly-OH，
DPPBA-(L)Trp-(L)Arg-Gly-OH，
(MDCA)2-DAP-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH，
(MDCA)2-DAP-(L)Arg-(L)Asp-Gly-OH，
DPPAA-(L)Phe-(L)Arg-Gly-OH，
DPPAA-PPC-(L)Arg-Gly-OH，
DBHBA-(D)Phe-(D)Arg-Gly-OH，
DPPAA-(D)tyr-(D)Arg-Gly-OH，
H2N-(D)Trp-(D)Ser-(1H2NA)DAP-Aib-OH，
H2N-(L)His-(D)Ser-(1H2NA)DAP-Aib-OH，
(DPPA)2-DAP-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH，
(DBHBA)2-DAP-(L)Arg-(L)Arg-Gly-OH，
DBHBA-DAP-Arg-Gly-OH，
DBHBA-DAP-Arg-Arg-Gly-OH，
(DBHBA)2-DAP-Arg-Gly-OH，
(DBHBA)3-DAP-Arg-Arg-Gly-OH，
(DBHBA)3-DAP-Arg-Arg-Gly-OH，
TMPPA-(L)Trp-(L)Arg-Gly-OH，和
DBHPA-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH。
10.根据在先权利要求任意一项的固体支撑材料，其中该配体选自由DBBA-(L)His-(L)Arg-Gly-OH和(DBHBA)2-DAP-(L)Arg-(L)Arg-GIy-OH组成的组。
11.固体支撑材料，其上共价固定有亲和性配体，所述配体包含一个或多个疏水性官能团和一个或多个杂芳族官能团，
其中至少一个疏水性官能团与至少一个杂芳族官能团被5至20的直达键距所分开，并且
其中所述配体具有120Da至5,000Da的分子量。
12.根据权利要求11的固体支撑材料，其中所述亲和性树脂具有大于5mg单克隆抗体/mL亲和性树脂的结合能力。
13.根据权利要求11-12任意一项的固体支撑材料，其中该配体是(TEBA)2-DAP-(L)Trp-(L)Trp-Gly-OH。
14.分离抗体或其衍生物的方法，该方法包含如下步骤：
(i)提供固体支撑材料，其上共价固定有如权利要求1-13任意一项所定义的亲和性配体，
(ii)提供含有抗体的样品，该抗体对所述配体具有亲和性，
(iii)使所述配体与所述含有所述抗体的样品接触，
(iv)当在所述样品中含有所述抗体时，选择性结合所述抗体，和
(v)当在所述样品中含有所述抗体时，选择性分离所述抗体。
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