CN114763369A - 脂肪肽链及Fab-脂肪链偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了脂肪肽链和Fab片段类似物，还提供了Fab‑脂肪链偶联物及其制备方法和应用。本发明通过SortaseA酶将脂肪肽链定点修饰至Fab片段上，获得Fab‑脂肪链偶联物。本发明的Fab‑脂肪链偶联物保留有Fab片段特异性的抗原结合作用，且具有白蛋白结合能力，体内半衰期得到了延长。

Description

脂肪肽链及Fab-脂肪链偶联物
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种长效生物药物开发领域，具体涉及一类脂肪肽链、Fab-脂肪链偶联物和Fab片段类似物，以及利用脂肪肽链和Fab片段类似物制备Fab-脂肪链偶联物的方法和Fab-脂肪链偶联物的应用。
背景技术
自身免疫性疾病是指机体免疫异常，免疫系统攻击自身抗原，最终介导组织发炎、损伤。其中类风湿性关节炎(RA)、克罗恩病(CD)、强直性脊柱炎(AS)等这些炎症性疾病均属于自身免疫性疾病。研究表明，这些炎症性疾病具有相同的发病机制，TNF-α(tumornecrosis factorα，肿瘤坏死因子α)作为一种促炎因子，在RA、CD、AS等疾病的病变过程中介导着关键核心作用。TNF-α在机体中过量表达时，会导致机体免疫功能紊乱，继而促进多种炎症性因子产生，通过炎症级联反应最终导致机体产生多种病理损伤，例如RA、CD等疾病的产生。
通过特异性地阻断TNF-α的信号传导通路，抑制其生物学活性，可以有效地治疗此类慢性炎症疾病。据此，TNF-α拮抗剂相继诞生，包括Centocor公司的
Figure BDA0003464960350000011
(infliximab)、
Figure BDA0003464960350000012
(golimumab)，Amgen公司的
Figure BDA0003464960350000013
(etanercept)，Abbott公司的
Figure BDA0003464960350000014
(adalimumab)，UCB公司的
Figure BDA0003464960350000015
(certolizumab pegol)。其中golimumab以及adalimumab均为完全人源化抗体，infliximab为人鼠嵌合抗体，certolizumab为人源化PEG修饰Fab片段，etanercept为TNFR2(肿瘤坏死因子受体2)与hIgG1 Fc片段融合蛋白。这5种TNF-α蛋白抑制剂能够直接与TNF-α结合而阻止其与TNFR的结合，通过阻断TNF-α下游信号传导通路，最终缓解炎症。针对TNF-α的抑制剂成为迄今为止最为成功的自身免疫性疾病治疗药物。
完整的单克隆抗体药物分子量大，且Fc段可补充细胞毒效应分子功能，并可延长在血清中半衰期。但完整的单克隆抗体具有以下缺陷，使其临床应用受到限制：1、分子量过大，并且其恒定区存在糖基化修饰位点，因此主要通过哺乳动物细胞进行发酵表达，对发酵技术水平要求较高；2、发酵周期长，生产成本高，药物价格昂贵；3、Fc片段分子量大，不易穿透细胞；4、天然Fc段具有的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)以及补体依赖性细胞毒性(CDC)等生物学活性会介导副反应的产生。近年来，由于抗体高度确定的结构完整性和功能多样性，Fab片段分子已经成为完整单克隆抗体改造的首选分子形式，可取代完整单抗发挥高效抗原特异性结合作用。Fab片段具备以下优势：1、分子量小，结构中无糖基化修饰，可在原核表达系统中生产，发酵周期短，发酵成本大大降低；2、不含有Fc段，在体内表现出更好的组织穿透能力；3、内效应因子缺乏，同时保留有全长抗体的亲和性和特异性。但是由于Fab分子结构中不含有Fc片段，不能特异性结合细胞表面FcRn，无法参与FcRn介导的体内循环转运途径，并且其较小的分子量容易被肾小球过滤清除，导致Fab片段在体内代谢加快，半衰期大大降低。
针对Fab片段较短的半衰期，目前已经报道且发展比较成熟的延长Fab半衰期的策略是PEG修饰。比利时的UCB制药公司和Nektar公司合作开发，将PEG-MAL(40kDa)定点修饰至人源抗TNF-α的Fab片段重链铰链区游离的半胱氨酸，不仅降低了其免疫源性，增加了Fab片段的稳定性，而且将PEG修饰Fab片段(certolizumab pegol)的体内血浆半衰期提高至14天(参见Rosa J,Sabelli M,Soriano E R.Medical Devices Evidence&Research,2010,3(1):25-31.)。但以PEG修饰技术作为基础的长效策略存在修饰过程复杂、修饰产物分离困难和修饰后蛋白活性降低等问题。
人血清白蛋白(HSA)是血液中最丰富的蛋白质，在人体内半衰期为19天。HSA的长半衰期及高稳定性为长效药物的设计提供了一种理想的载体。通过融合表达或化学修饰能够与白蛋白结合的分子，在体内通过特异性结合白蛋白，减少肾小球过滤率，并利用白蛋白内源性FcRn介导的体内循环转运途径来实现药物的长效。通常期望修饰了白蛋白结合分子的药物具有更高的白蛋白亲和力，以期获得更长的体内半衰期。
发明内容
本发明提供了脂肪肽链和Fab片段类似物。本发明还提供了Fab-脂肪链偶联物及其制备方法和应用，所述Fab-脂肪链偶联物具有白蛋白结合能力，延长了半衰期。
为此，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种脂肪肽链，其具有式1、式2或式3所示的结构式：
Figure BDA0003464960350000021
其中，-NH-Xaa-CO-为D-丙氨酸(D-Ala)残基、β-丙氨酸(β-Ala)残基、4-氨基丁酸(GABA)残基、2-氨基异丁酸(Aib)残基、2-氨基丁酸(Abu)残基、精氨酸(Arg)残基、天冬氨酸(Asp)残基、天冬酰胺(Asn)残基、半胱氨酸(Cys)残基、谷氨酸(Glu)残基、D-谷氨酸(D-Glu)残基、γ-谷氨酸(γ-Glu)残基、谷氨酰胺(Gln)残基、甘氨酸(Gly)残基、组氨酸(His)残基、异亮氨酸(Ile)残基、亮氨酸(Leu)残基、赖氨酸(Lys)残基、脯氨酸(Pro)残基、苯丙氨酸(Phe)残基、丝氨酸(Ser)残基、酪氨酸(Tyr)残基、苏氨酸(Thr)残基、色氨酸(Trp)残基、缬氨酸(Val)残基或甲硫氨酸(Met)残基中的一种或缺失；
a为0、1、2、3、4或5；
b为0、1、2、3、4或5；
c为1、2、3、4或5；
R1为C6-20脂肪族直链或支链的酰基基团；
R2为羟甲酰烷基胺基；
-NH-L1-CO-为第一连接子或缺失。
所述脂肪肽链的N端的寡聚甘氨酸可被SortaseA酶识别，所述脂肪肽链可以与白蛋白非共价结合。
在一些实施方案中，所述-NH-Xaa-CO-为4-氨基丁酸残基、2-氨基异丁酸残基、D-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、天冬氨酸残基、半胱氨酸残基、谷氨酸残基、γ-谷氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基或酪氨酸残基中的一种或缺失；优选为谷氨酸残基。
在一些实施方案中，所述a为1、2或3，优选为2。在一些实施方案中，所述b为0、1或2。在一些实施方案中，所述c为1、2或3。
在一些实施方案中，所述R1为C12-18脂肪族直链或支链的酰基基团，C14-18脂肪族直链或支链的酰基基团，C16-18脂肪族直链或支链的酰基基团，C16脂肪族直链或支链的酰基基团，或C18脂肪族直链或支链的酰基基团。
在一些实施方案中，所述R1为庚酰基、二甲基庚酰基、辛酰基、二甲基辛酰基、壬酰基、二甲基壬酰基、癸酰基、二甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酰基、17-羧基十七烷酰基、15-羧基十五烷酰基、13-羧基十三烷酰基或11-羧基十一烷酰基，优选为月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酰基或17-羧基十七烷酰基，更优选为十八烷酰基或17-羧基十七烷酰基。
在一些实施方案中，所述R2为5-羟甲酰戊烷胺基、7-羟甲酰庚烷胺基、9-羟甲酰壬烷胺基、11-羟甲酰十一烷胺基、13-羟甲酰十三烷胺基、15-羟甲酰十五烷胺基、17-羟甲酰十七烷胺基或19-羟甲酰十九烷胺基，优选为11-羟甲酰十一烷胺基、13-羟甲酰十三烷胺基、15-羟甲酰十五烷胺基或17-羟甲酰十七烷胺基。
在一些实施方案中，所述第一连接子为(G4S)n、(ED)n、(PA)n、A(PA)n、(PGS)n、S(PGS)n或(AEEA)n中的一种或几种的组合；其中n为1-12中的一个整数，优选为1-8中的一个整数，1-7中的一个整数，1-6中的一个整数，或2-6中的一个整数。在一些实施方案中，所述第一连接子为(G4S)n、(ED)n、(PA)n、A(PA)n、(PGS)n、S(PGS)n或(AEEA)n中的一种或几种的组合，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在一些具体的实施方案中，所述第一连接子为A(PA)6。在一些具体的实施方案中，所述第一连接子为S(PGS)4。在一些具体的实施方案中，所述第一连接子为(PA)6。在一些具体的实施方案中，所述第一连接子为(AEEA)2。在一些实施方案中，所述第一连接子的引入可以增加脂肪肽链的水溶性。
在一些实施方案中，本发明的脂肪肽链选自NH2-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)-OH、NH2-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH、NH2-GGG-[(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)]2-OH、NH2-GGG-A(PA)6-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH、NH2-GGG-S(PGS)4-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH、NH2-GGG-(PA)6-12-氨基十二烷酸或NH2-GGG-(AEEA)2-E-12-氨基十二烷酸。
具体的，本发明的脂肪肽链选自如下结构式：
Figure BDA0003464960350000031
生产本发明的脂肪肽链的固相合成方法为本领域的技术人员所熟知。后续可以通过多种已知的方法来进行化合物的纯化，并通过高效液相层析和质谱分析等验证所合成化合物的纯度和分子量。
本发明的第二方面，提供了一种Fab-脂肪链偶联物，其结构通式为Fab-L2-S1-X1；其中，Fab为结合TNF-α的Fab片段，L2为第二连接子或缺失，S1为氨基酸序列LPXaT，Xa为任一天然氨基酸，X1为N端连接有甘氨酸残基的脂肪链；所述S1的C端的羧基与X1的N端甘氨酸的氨基形成肽键连接。
Fab-脂肪链偶联物中，当所述L2为第二连接子时，所述L2连接至Fab片段的C端；或当所述L2缺失时，所述S1连接至Fab片段的C端。在一些实施方案中，当所述L2为第二连接子时，所述L2连接至Fab片段重链的C端和/或Fab片段轻链的C端；或当所述L2缺失时，所述S1连接至Fab片段重链的C端和/或Fab片段轻链的C端。
进一步的，在一些实施方案中，当所述L2为第二连接子时，所述L2连接至Fab片段重链的C端；或当所述L2缺失时，所述S1连接至Fab片段重链的C端。
在另一些实施方案中，当所述L2为第二连接子时，所述L2连接至Fab片段轻链的C端；或当所述L2缺失时，所述S1连接至Fab片段轻链的C端。在另一些实施方案中，当所述L2为第二连接子时，所述L2连接至Fab片段重链的C端和Fab片段轻链的C端；或当所述L2缺失时，所述S1连接至Fab片段重链的C端和Fab片段轻链的C端。
所述Fab片段可以是鼠源的、嵌合的、人源化的或全人的。
在一些实施方案中，所述Fab片段包含选自以下CDR组成的组：
a)英夫利昔单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列；
b)阿达木单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列；
c)戈利木单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列；或
d)赛妥珠单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列。
优选的实施方案，所述Fab片段包含阿达木单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述Fab片段包含英夫利昔单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，阿达木单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，戈利木单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，或赛妥珠单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。优选的实施方案，所述Fab片段包含阿达木单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述Fab片段为英夫利昔单抗的Fab片段、阿达木单抗的Fab片段、戈利木单抗的Fab片段或赛妥珠单抗的Fab片段，优选为阿达木单抗的Fab片段。
英夫利昔单抗(infliximab)，商品名
Figure BDA0003464960350000042
其轻链CDR1-3的氨基酸序列分别如专利申请WO2017102835中SEQ ID NO:24-26所示，重链CDR1-3的氨基酸序列分别如专利申请WO2017102835中SEQ ID NO:27-29所示；其轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如WO2017102835中SEQ ID NO:40和41所示。
戈利木单抗(golimumab)，商品名
Figure BDA0003464960350000043
其轻链CDR1-3的氨基酸序列分别如专利申请WO2017102835中SEQ ID NO:30-32所示，重链CDR1-3的氨基酸序列分别如专利申请WO2017102835中SEQ ID NO:33-35所示；其轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如WO2017102835中SEQ ID NO:42和43所示。
赛妥珠单抗(certolizumab pegol)，商品名
Figure BDA0003464960350000044
其轻链CDR1-3的氨基酸序列分别如专利申请WO2017102835中SEQ ID NO:18-20所示，重链CDR1-3的氨基酸序列分别如专利申请WO2017102835中SEQ ID NO:21-23所示；其轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如WO2017102835中SEQ ID NO:38和39所示。
阿达木单抗(adalimumab)，商品名
Figure BDA0003464960350000045
其轻链CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQID NO:5-7所示，重链CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:8-10所示，轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11和12所示；其Fab片段轻链的氨基酸序列如SEQID NO:1所示，Fab片段重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一些实施方案中，所述N端连接有甘氨酸残基的脂肪链具有式1a、式2a或式3a所示的结构式：
Figure BDA0003464960350000041
其中，-NH-Xaa-CO-为D-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、4-氨基丁酸残基、2-氨基异丁酸残基、2-氨基丁酸残基、精氨酸残基、天冬氨酸残基、天冬酰胺残基、半胱氨酸残基、谷氨酸残基、D-谷氨酸残基、γ-谷氨酸残基、谷氨酰胺残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、脯氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、酪氨酸残基、苏氨酸残基、色氨酸残基、缬氨酸残基或甲硫氨酸残基中的一种或缺失；
a为0、1、2、3、4或5；
b为0、1、2、3、4或5；
c为1、2、3、4或5；
R1为C6-20脂肪族直链或支链的酰基基团；
R2为羟甲酰烷基胺基；
-NH-L1-CO-为第一连接子或缺失。
所述N端连接有甘氨酸残基的脂肪链可以与白蛋白非共价结合。
在一些实施方案中，N端连接有甘氨酸残基的脂肪链中，所述-NH-Xaa-CO-为4-氨基丁酸残基、2-氨基异丁酸残基、D-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、天冬氨酸残基、半胱氨酸残基、谷氨酸残基、γ-谷氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基或酪氨酸残基中的一种或缺失；优选为谷氨酸残基。
在一些实施方案中，N端连接有甘氨酸残基的脂肪链中，所述a为1、2或3，优选为2。在一些实施方案中，N端连接有甘氨酸残基的脂肪链中，所述b为0、1或2。在一些实施方案中，N端连接有甘氨酸残基的脂肪链中，所述c为1、2或3。
在一些实施方案中，N端连接有甘氨酸残基的脂肪链中，所述R1为C12-18脂肪族直链或支链的酰基基团，C14-18脂肪族直链或支链的酰基基团，C16-18脂肪族直链或支链的酰基基团，C16脂肪族直链或支链的酰基基团，或C18脂肪族直链或支链的酰基基团。
在一些实施方案中，N端连接有甘氨酸残基的脂肪链中，所述R1为庚酰基、二甲基庚酰基、辛酰基、二甲基辛酰基、壬酰基、二甲基壬酰基、癸酰基、二甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酰基、17-羧基十七烷酰基、15-羧基十五烷酰基、13-羧基十三烷酰基或11-羧基十一烷酰基，优选为月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酰基或17-羧基十七烷酰基，更优选为十八烷酰基或17-羧基十七烷酰基。
在一些实施方案中，N端连接有甘氨酸残基的脂肪链中，所述R2为5-羟甲酰戊烷胺基、7-羟甲酰庚烷胺基、9-羟甲酰壬烷胺基、11-羟甲酰十一烷胺基、13-羟甲酰十三烷胺基、15-羟甲酰十五烷胺基、17-羟甲酰十七烷胺基或19-羟甲酰十九烷胺基，优选为11-羟甲酰十一烷胺基、13-羟甲酰十三烷胺基、15-羟甲酰十五烷胺基或17-羟甲酰十七烷胺基。
在一些实施方案中，N端连接有甘氨酸残基的脂肪链中，所述第一连接子为(G4S)n、(ED)n、(PA)n、A(PA)n、(PGS)n、S(PGS)n或(AEEA)n中的一种或几种的组合；其中n为1-12中的一个整数，优选为1-8中的一个整数，1-7中的一个整数，1-6中的一个整数，或2-6中的一个整数。在一些实施方案中，N端连接有甘氨酸残基的脂肪链中，所述第一连接子为(G4S)n、(ED)n、(PA)n、A(PA)n、(PGS)n、S(PGS)n或(AEEA)n中的一种或几种的组合，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在一些具体的实施方案中，N端连接有甘氨酸残基的脂肪链中，所述第一连接子为A(PA)6。在一些具体的实施方案中，N端连接有甘氨酸残基的脂肪链中，所述第一连接子为S(PGS)4。在一些具体的实施方案中，N端连接有甘氨酸残基的脂肪链中，所述第一连接子为(PA)6。在一些具体的实施方案中，N端连接有甘氨酸残基的脂肪链中，所述第一连接子为(AEEA)2。在一些实施方案中，N端连接有甘氨酸残基的脂肪链中，所述第一连接子的引入可以增加脂肪肽链的水溶性。
在一些实施方案中，所述N端连接有甘氨酸残基的脂肪链选自如下结构式：
Figure BDA0003464960350000051
Figure BDA0003464960350000061
在一些实施方案中，所述第二连接子为(G4S)n、(ED)n、(PA)n或(GSP)n中的一种，其中n为1-12中的一个整数。在一些实施方案中，所述第二连接子为(G4S)n、(ED)n、(PA)n或(GSP)n中的一种，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
进一步的，在一些实施方案中，所述第二连接子为(G4S)n；其中n为1-12中的一个整数，优选为1-6中的一个整数，更优选为2-4中的一个整数。在一些实施方案中，所述第二连接子为(G4S)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在一些具体的实施方案中，所述第二连接子为(G4S)3。
在一些实施方案中，所述S1的氨基酸序列为LPET。
在一些实施方案中，本发明的Fab-脂肪链偶联物选自Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)-OH、Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH、Fab-(G4S)3-LPET-GGG-[(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)]2-OH、Fab-(G4S)3-LPET-GGG-A(PA)6-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH、Fab-(G4S)3-LPET-GGG-S(PGS)4-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH、Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(PA)6-12-氨基十二烷酸或Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-E-12-氨基十二烷酸。
具体的，本发明的Fab-脂肪链偶联物选自以下结构式：
Figure BDA0003464960350000062
Figure BDA0003464960350000071
以上结构式中，Fab片段重链的C端与(G4S)3的N端连接。
本发明的第三方面，提供一种Fab片段类似物，其结构通式为Fab-L2-S1-GG-P1；其中，Fab为结合TNF-α的Fab片段，L2为第二连接子或缺失，S1为氨基酸序列LPXaT，Xa为任一天然氨基酸，P1为蛋白纯化标签或缺失。
Fab片段类似物中，当所述L2为第二连接子时，所述L2连接至Fab片段的C端；或当所述L2缺失时，所述S1连接至Fab片段的C端。在一些实施方案中，当所述L2为第二连接子时，所述L2连接至Fab片段重链的C端和/或Fab片段轻链的C端；或当所述L2缺失时，所述S1连接至Fab片段重链的C端和/或Fab片段轻链的C端。
进一步的，在一些实施方案中，当所述L2为第二连接子时，所述L2连接至Fab片段重链的C端；或当所述L2缺失时，所述S1连接至Fab片段重链的C端。
在另一些实施方案中，当所述L2为第二连接子时，所述L2连接至Fab片段轻链的C端；或当所述L2缺失时，所述S1连接至Fab片段轻链的C端。在另一些实施方案中，当所述L2为第二连接子时，所述L2连接至Fab片段重链的C端和Fab片段轻链的C端；或当所述L2缺失时，所述S1连接至Fab片段重链的C端和Fab片段轻链的C端。
Fab片段类似物中，所述Fab片段可以是鼠源的、嵌合的、人源化的或全人的。
在一些实施方案中，Fab片段类似物中，所述Fab片段包含选自以下CDR组成的组：
a)英夫利昔单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列；
b)阿达木单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列；
c)戈利木单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列；或
d)赛妥珠单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列。
优选的实施方案，Fab片段类似物中，所述Fab片段包含阿达木单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fab片段类似物中，所述Fab片段包含英夫利昔单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，阿达木单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，戈利木单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，或赛妥珠单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。优选的实施方案，Fab片段类似物中，所述Fab片段包含阿达木单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fab片段类似物中，所述Fab片段为英夫利昔单抗的Fab片段、阿达木单抗的Fab片段、戈利木单抗的Fab片段或赛妥珠单抗的Fab片段，优选为阿达木单抗的Fab片段。
在一些实施方案中，Fab片段类似物中，所述第二连接子为(G4S)n、(ED)n、(PA)n或(GSP)n中的一种，其中n为1-12中的一个整数。在一些实施方案中，Fab片段类似物中，所述第二连接子为(G4S)n、(ED)n、(PA)n或(GSP)n中的一种，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
进一步的，在一些实施方案中，Fab片段类似物中，所述第二连接子为(G4S)n；其中n为1-12中的一个整数，优选为1-6中的一个整数，更优选为2-4中的一个整数。在一些实施方案中，Fab片段类似物中，所述第二连接子为(G4S)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在一些具体的实施方案中，Fab片段类似物中，所述第二连接子为(G4S)3。
在一些实施方案中，Fab片段类似物中，所述S1的氨基酸序列为LPET。
在一些实施方案中，所述蛋白纯化标签为His6、c-Myc或Avi中的一种，优选为His6。
在一些实施方案中，所述Fab片段类似物为Fab-(G4S)3-LPETGG-His6；其中Fab为结合TNF-α的Fab片段，其可以是鼠源的、嵌合的、人源化的或全人的。
在一些实施方案中，所述Fab片段类似物为Fab-(G4S)3-LPETGG-His6；其中Fab为结合TNF-α的Fab片段，其包含选自以下CDR组成的组：
a)英夫利昔单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列；
b)阿达木单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列；
c)戈利木单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列；或
d)赛妥珠单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列。
优选的实施方案，所述Fab片段类似物为Fab-(G4S)3-LPETGG-His6；其中Fab为结合TNF-α的Fab片段，其包含阿达木单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述Fab片段类似物为Fab-(G4S)3-LPETGG-His6；其中Fab为结合TNF-α的Fab片段，其包含英夫利昔单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，阿达木单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，戈利木单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，或赛妥珠单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。优选的实施方案，所述Fab片段类似物为Fab-(G4S)3-LPETGG-His6；其中Fab为结合TNF-α的Fab片段，其包含阿达木单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述Fab片段类似物为Fab-(G4S)3-LPETGG-His6；其中Fab为结合TNF-α的Fab片段，所述Fab片段为英夫利昔单抗的Fab片段、阿达木单抗的Fab片段、戈利木单抗的Fab片段或赛妥珠单抗的Fab片段，优选为阿达木单抗的Fab片段。
在一些实施方案中，所述Fab片段类似物为Fab-(G4S)3-LPETGG-His6，具有两条多肽链，其中一条多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，另一条多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
所述Fab片段类似物可以源于重组方法。具体的，可以在细菌(例如大肠埃希菌(E.coli))、哺乳动物、酵母(例如毕赤酵母(P.pastoris))以及植物表达系统中表达。表达可以通过外源性表达或通过内源性表达来进行。在一些实施方案中，Fab片段类似物在大肠埃希菌中进行表达。进一步的，在一些实施方案中，Fab片段类似物在大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达。
虽然制备蛋白质过程中的基因重组方法不同，但重组方法典型地涉及构建编码所希望的多肽或蛋白的核酸，将核酸克隆到表达载体中，转化宿主细胞，核酸表达产生所希望的多肽或蛋白。用于体外并且在宿主细胞中产生并表达重组蛋白的方法为本领域的技术人员所知。在一些实施方案中，所述表达载体为pET28a。
本发明的第四方面，提供一种制备本发明第二方面任一项所述的Fab-脂肪链偶联物，包括如下步骤：(a)制备本发明第三方面任一项所述的Fab片段类似物和本发明第一方面任一项所述的脂肪肽链；(b)SortaseA酶介导所述的Fab片段类似物与脂肪肽链之间发生转肽反应，得到所述Fab-脂肪链偶联物；和(c)分离纯化所述Fab-脂肪链偶联物。
在一些实施方案中，步骤(c)中所述分离纯化Fab-脂肪链偶联物的方法为离子交换层析、疏水层析、亲和层析、分子排阻层析中的一种或几种的组合；优选为亲和层析；更优选为镍柱亲和层析。
可以通过多种已知的分析方法中的任一种来测定Fab-脂肪链偶联物的纯度，包括凝胶电泳(SDS-PAGE)、高效液相色谱(HPLC)等，并通过质谱验证分子量。
本发明的第五方面，提供本发明第二方面任一项所述的Fab-脂肪链偶联物在制备预防和/或治疗与TNF-α相关疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，本发明提供一种对有需要的受试者预防和/或治疗与TNF-α相关疾病的方法，其中，向所述受试者给予预防和/或治疗有效量的本发明第二方面任一项所述的Fab-脂肪链偶联物。
在一些实施方案中，所述与TNF-α相关疾病为自身免疫性疾病或癌症。在一些实施方案中，所述与TNF-α相关疾病为骨关节炎、贮袋炎、白塞氏病、腰椎炎、化脓性汗腺炎、类风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、克罗恩病、斑片性银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎或青少年特发性关节炎。
本发明的第六方面，提供一种药物组合物，其包含本发明第二方面任一项所述的Fab-脂肪链偶联物，以及药学上可接受的载体。
本发明的第七方面，提供本发明第六方面的药物组合物在制备预防和/或治疗与TNF-α相关疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，本发明提供一种对有需要的受试者预防和/或治疗与TNF-α相关疾病的方法，其中，向所述受试者给予预防和/或治疗有效量的本发明第六方面的药物组合物。
在一些实施方案中，所述与TNF-α相关疾病为自身免疫性疾病或癌症。在一些实施方案中，所述与TNF-α相关疾病为骨关节炎、贮袋炎、白塞氏病、腰椎炎、化脓性汗腺炎、类风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、克罗恩病、斑片性银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎或青少年特发性关节炎。
本发明的Fab-脂肪链偶联物具有白蛋白结合能力，在体内可减少Fab片段被内皮系统吞噬的概率，体内半衰期得到了延长。
本发明的Fab-脂肪链偶联物保留有Fab片段特异性的抗原结合作用，体外能够有效地抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用。
本发明构建了C端含有LPXTG的Fab片段类似物，通过SortaseA酶介导的转肽反应，将脂肪肽链定点修饰至Fab片段的C端得到Fab-脂肪链偶联物，避免了传统的脂酰化修饰反应所导致的产物异质性问题，所获得的Fab-脂肪链偶联物均一性高，反应效率高，纯化简单高效。
附图说明
图1为抗TNF-α的Fab片段的结构示意图。
图2为含有表达Fab片段类似物基因序列的表达载体示意图。
图3为以protein L为配基的亲和层析纯化制备Fab片段类似物的电泳图谱；泳道1：周质蛋白提取液；泳道2：柱流穿液；泳道3：柱洗脱液；泳道4：柱洗脱液(二硫苏糖醇(DTT)还原)；泳道M：marker。
图4为镍柱亲和层析纯化制备Fab-脂肪链偶联物的电泳图谱；泳道1：SortaseA酶催化反应液；泳道2：柱流穿液；泳道3：柱洗脱液；泳道M：marker。
图5为所纯化制备的Fab-脂肪链偶联物的非还原型电泳图谱；泳道1：Fab-(G4S)3-LPETGG-His6；泳道2：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(PA)6-12-氨基十二烷酸；泳道3：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-E-12-氨基十二烷酸；泳道4：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-S(PGS)4-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH；泳道5：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-A(PA)6-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH；泳道6：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH；泳道7：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)-OH；泳道8：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-[(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)]2-OH；泳道M：marker。
图6为所纯化制备的Fab-脂肪链偶联物的还原型电泳图谱；泳道1：Fab-(G4S)3-LPETGG-His6；泳道2：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(PA)6-12-氨基十二烷酸；泳道3：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-E-12-氨基十二烷酸；泳道4：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-S(PGS)4-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH；泳道5：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-A(PA)6-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH；泳道6：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH；泳道7：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)-OH；泳道8：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-[(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)]2-OH；泳道M：marker。
图7为Fab-脂肪链偶联物的白蛋白结合能力测定实验结果图；Fab片段类似物：Fab-(G4S)3-LPETGG-His6；FA1-Fab：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)-OH；FA2-Fab：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH；FA3-Fab：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-[(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)]2-OH；FA4-Fab：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-A(PA)6-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH；FA5-Fab：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-S(PGS)4-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH；FA6-Fab：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(PA)6-12-氨基十二烷酸；FA7-Fab：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-E-12-氨基十二烷酸。
具体实施方式
本发明的具体实施方案
本发明提供以下的具体实施方案。
实施方案[1]：一种脂肪肽链，其特征在于，所述脂肪肽链具有式1、式2或式3所示的结构式：
Figure BDA0003464960350000101
其中，-NH-Xaa-CO-为D-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、4-氨基丁酸残基、2-氨基异丁酸残基、2-氨基丁酸残基、精氨酸残基、天冬氨酸残基、天冬酰胺残基、半胱氨酸残基、谷氨酸残基、D-谷氨酸残基、γ-谷氨酸残基、谷氨酰胺残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、脯氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、酪氨酸残基、苏氨酸残基、色氨酸残基、缬氨酸残基或甲硫氨酸残基中的一种或缺失，
a为0、1、2、3、4或5，
b为0、1、2、3、4或5，
c为1、2、3、4或5，
R1为C6-20脂肪族直链或支链的酰基基团，
R2为羟甲酰烷基胺基，
-NH-L1-CO-为第一连接子或缺失。
实施方案[2]：根据实施方案[1]所述的脂肪肽链，其特征在于，所述-NH-Xaa-CO-为4-氨基丁酸残基、2-氨基异丁酸残基、D-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、天冬氨酸残基、半胱氨酸残基、谷氨酸残基、γ-谷氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基或酪氨酸残基中的一种或缺失。
实施方案[3]：根据实施方案[1]或[2]所述的脂肪肽链，其特征在于，所述a为1、2或3，优选为2。
实施方案[4]：根据实施方案[1]-[3]任一项所述的脂肪肽链，其特征在于，所述b为0、1或2。
实施方案[5]：根据实施方案[1]-[4]任一项所述的脂肪肽链，其特征在于，所述c为1、2或3。
实施方案[6]：根据实施方案[1]-[5]任一项所述的脂肪肽链，其特征在于，所述R1为庚酰基、二甲基庚酰基、辛酰基、二甲基辛酰基、壬酰基、二甲基壬酰基、癸酰基、二甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酰基、17-羧基十七烷酰基、15-羧基十五烷酰基、13-羧基十三烷酰基或11-羧基十一烷酰基，优选为月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酰基或17-羧基十七烷酰基，更优选为十八烷酰基或17-羧基十七烷酰基。
实施方案[7]：根据实施方案[1]-[6]任一项所述的脂肪肽链，其特征在于，所述R2为5-羟甲酰戊烷胺基、7-羟甲酰庚烷胺基、9-羟甲酰壬烷胺基、11-羟甲酰十一烷胺基、13-羟甲酰十三烷胺基、15-羟甲酰十五烷胺基、17-羟甲酰十七烷胺基或19-羟甲酰十九烷胺基，优选为11-羟甲酰十一烷胺基、13-羟甲酰十三烷胺基、15-羟甲酰十五烷胺基或17-羟甲酰十七烷胺基。
实施方案[8]：根据实施方案[1]-[7]任一项所述的脂肪肽链，其特征在于，所述第一连接子为(G4S)n、(ED)n、(PA)n、A(PA)n、(PGS)n、S(PGS)n或(AEEA)n中的一种或几种的组合；其中n为1-12中的一个整数，优选为1-8中的一个整数。
实施方案[9]：根据实施方案[1]所述的脂肪肽链，其特征在于，所述脂肪肽链选自如下结构式：
Figure BDA0003464960350000111
实施方案[10]：一种Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述Fab-脂肪链偶联物的结构通式为Fab-L2-S1-X1；其中，Fab为结合TNF-α的Fab片段，L2为第二连接子或缺失，S1为氨基酸序列LPXaT，Xa为任一天然氨基酸，X1为N端连接有甘氨酸残基的脂肪链；所述S1的C端的羧基与X1的N端甘氨酸的氨基形成肽键连接。
实施方案[11]：根据实施方案[10]所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，当所述L2为第二连接子时，所述L2连接至Fab片段重链的C端；或当所述L2缺失时，所述S1连接至Fab片段重链的C端。
实施方案[12]：根据实施方案[10]或[11]所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述Fab片段包含选自以下CDR组成的组：
a)英夫利昔单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列；
b)阿达木单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列；
c)戈利木单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列；或
d)赛妥珠单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列。
实施方案[13]：根据实施方案[12]所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述Fab片段包含英夫利昔单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，阿达木单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，戈利木单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，或赛妥珠单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。
实施方案[14]：根据实施方案[13]所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述Fab片段为英夫利昔单抗的Fab片段、阿达木单抗的Fab片段、戈利木单抗的Fab片段或赛妥珠单抗的Fab片段，优选为阿达木单抗的Fab片段。
实施方案[15]：根据实施方案[10]-[14]任一项所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述N端连接有甘氨酸残基的脂肪链具有式1a、式2a或式3a所示的结构式：
Figure BDA0003464960350000121
其中，-NH-Xaa-CO-为D-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、4-氨基丁酸残基、2-氨基异丁酸残基、2-氨基丁酸残基、精氨酸残基、天冬氨酸残基、天冬酰胺残基、半胱氨酸残基、谷氨酸残基、D-谷氨酸残基、γ-谷氨酸残基、谷氨酰胺残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、脯氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、酪氨酸残基、苏氨酸残基、色氨酸残基、缬氨酸残基或甲硫氨酸残基中的一种或缺失，
a为0、1、2、3、4或5，
b为0、1、2、3、4或5，
c为1、2、3、4或5，
R1为C6-20脂肪族直链或支链的酰基基团，
R2为羟甲酰烷基胺基，
-NH-L1-CO-为第一连接子或缺失。
实施方案[16]：根据实施方案[15]所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述-NH-Xaa-CO-为4-氨基丁酸残基、2-氨基异丁酸残基、D-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、天冬氨酸残基、半胱氨酸残基、谷氨酸残基、γ-谷氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基或酪氨酸残基中的一种或缺失。
实施方案[17]：根据实施方案[15]或[16]所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述a为1、2或3，优选为2。
实施方案[18]：根据实施方案[15]-[17]任一项所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述b为0、1或2。
实施方案[19]：根据实施方案[15]-[18]任一项所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述c为1、2或3。
实施方案[20]：根据实施方案[15]-[19]任一项所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述R1为庚酰基、二甲基庚酰基、辛酰基、二甲基辛酰基、壬酰基、二甲基壬酰基、癸酰基、二甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酰基、17-羧基十七烷酰基、15-羧基十五烷酰基、13-羧基十三烷酰基或11-羧基十一烷酰基，优选为月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酰基或17-羧基十七烷酰基，更优选为十八烷酰基或17-羧基十七烷酰基。
实施方案[21]：根据实施方案[15]-[20]任一项所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述R2为5-羟甲酰戊烷胺基、7-羟甲酰庚烷胺基、9-羟甲酰壬烷胺基、11-羟甲酰十一烷胺基、13-羟甲酰十三烷胺基、15-羟甲酰十五烷胺基、17-羟甲酰十七烷胺基或19-羟甲酰十九烷胺基，优选为11-羟甲酰十一烷胺基、13-羟甲酰十三烷胺基、15-羟甲酰十五烷胺基或17-羟甲酰十七烷胺基。
实施方案[22]：根据实施方案[15]-[21]任一项所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述第一连接子为(G4S)n、(ED)n、(PA)n、A(PA)n、(PGS)n、S(PGS)n或(AEEA)n中的一种或几种的组合；其中n为1-12中的一个整数，优选为1-8中的一个整数。
实施方案[23]：根据实施方案[15]所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述N端连接有甘氨酸残基的脂肪链选自如下结构式：
Figure BDA0003464960350000131
实施方案[24]：根据实施方案[10]-[23]任一项所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述第二连接子为(G4S)n、(ED)n、(PA)n或(GSP)n中的一种，其中n为1-12中的一个整数。
实施方案[25]：根据实施方案[24]所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述第二连接子为(G4S)n；其中n为1-12中的一个整数，优选为1-6中的一个整数，更优选为2-4中的一个整数。
实施方案[26]：根据实施方案[10]-[25]任一项所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述S1的氨基酸序列为LPET。
实施方案[27]：根据实施方案[10]所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述Fab-脂肪链偶联物选自以下结构式：
Figure BDA0003464960350000132
Figure BDA0003464960350000141
以上结构式中，Fab片段重链的C端与(G4S)3的N端连接。
实施方案[28]：一种Fab片段类似物，其特征在于，所述Fab片段类似物的结构通式为Fab-L2-S1-GG-P1；其中，Fab为结合TNF-α的Fab片段，L2为第二连接子或缺失，S1为氨基酸序列LPXaT，Xa为任一天然氨基酸，P1为蛋白纯化标签或缺失。
实施方案[29]：根据实施方案[28]所述的Fab片段类似物，其特征在于，当所述L2为第二连接子时，所述L2连接至Fab片段重链的C端；或当所述L2缺失时，所述S1连接至Fab片段重链的C端。
实施方案[30]：根据实施方案[28]或[29]所述的Fab片段类似物，其特征在于，所述Fab片段包含选自以下CDR组成的组：
a)英夫利昔单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列；
b)阿达木单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列；
c)戈利木单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列；或
d)赛妥珠单抗的轻链CDR1-3的氨基酸序列和重链CDR1-3的氨基酸序列。
实施方案[31]：根据实施方案[30]所述的Fab片段类似物，其特征在于，所述Fab片段包含英夫利昔单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，阿达木单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，戈利木单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，或赛妥珠单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。
实施方案[32]：根据实施方案[31]所述的Fab片段类似物，其特征在于，所述Fab片段为英夫利昔单抗的Fab片段、阿达木单抗的Fab片段、戈利木单抗的Fab片段或赛妥珠单抗的Fab片段，优选为阿达木单抗的Fab片段。
实施方案[33]：根据实施方案[28]-[32]任一项所述的Fab片段类似物，其特征在于，所述第二连接子为(G4S)n、(ED)n、(PA)n或(GSP)n中的一种，其中n为1-12中的一个整数。
实施方案[34]：根据实施方案[33]所述的Fab片段类似物，其特征在于，所述第二连接子为(G4S)n；其中n为1-12中的一个整数，优选为1-6中的一个整数，更优选为2-4中的一个整数。
实施方案[35]：根据实施方案[28]-[34]任一项所述的Fab片段类似物，其特征在于，所述S1的氨基酸序列为LPET。
实施方案[36]：根据实施方案[28]-[35]任一项所述的Fab片段类似物，其特征在于，所述蛋白纯化标签为His6、c-Myc或Avi中的一种，优选为His6。
实施方案[37]：根据实施方案[28]所述的Fab片段类似物，其特征在于，所述Fab片段类似物为Fab-(G4S)3-LPETGG-His6，具有两条多肽链，其中一条多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，另一条多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
实施方案[38]：一种制备实施方案[10]-[27]任一项所述的Fab-脂肪链偶联物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)制备实施方案[28]-[37]任一项所述的Fab片段类似物和实施方案[1]-[9]任一项所述的脂肪肽链；
b)SortaseA酶介导所述的Fab片段类似物与脂肪肽链之间发生转肽反应，得到所述Fab-脂肪链偶联物；和
c)分离纯化所述Fab-脂肪链偶联物。
实施方案[39]：根据实施方案[38]所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中所述分离纯化Fab-脂肪链偶联物的方法为离子交换层析、疏水层析、亲和层析、分子排阻层析中的一种或几种的组合；优选为亲和层析；更优选为镍柱亲和层析。
实施方案[40]：实施方案[10]-[27]任一项所述的Fab-脂肪链偶联物在制备预防和/或治疗与TNF-α相关疾病的药物中的用途。
实施方案[41]：一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含实施方案[10]-[27]任一项所述的Fab-脂肪链偶联物，以及药学上可接受的载体。
实施方案[42]：实施方案[41]所述的药物组合物在制备预防和/或治疗与TNF-α相关疾病的药物中的用途。
实施方案[43]：根据实施方案[40]或[42]所述的用途，其特征在于，所述与TNF-α相关疾病为自身免疫性疾病或癌症。
实施方案[44]：根据实施方案[43]所述的用途，其特征在于，所述与TNF-α相关疾病为骨关节炎、贮袋炎、白塞氏病、腰椎炎、化脓性汗腺炎、类风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、克罗恩病、斑片性银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎或青少年特发性关节炎。
定义
除非另有说明，本申请中所用的下列术语具有下列含义。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。
术语“Fab片段”是指由免疫球蛋白的重链VH和CH1结构域(“Fab片段重链”)及轻链VL和CL结构域(“Fab片段轻链”)组成的抗体片段。
术语“CDR”(互补决定区)，也称为“高变区(HVR)”，通常是指在序列上高度可变和/或形成结构限定的环的抗体可变区的每个区域。天然四链抗体或Fab片段通常包含六个CDR，三个在重链可变区中(重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3)，三个在轻链可变区中(轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3)。
本文所使用的“Fab-脂肪链偶联物”是指Fab片段与脂肪肽链连接形成的化合物。
术语“SortaseA”，即SortaseA酶(SrtA)，为存在于革兰氏阳性菌细胞膜内的一种转肽酶，能够催化表面蛋白共价连接于细胞壁肽聚糖层，目前源于金黄色葡萄球菌的SortaseA酶(SrtA)研究最为广泛。SrtA能够特异性识别底物中LPXaTG(Xa代表任何天然氨基酸)序列，其活性中心Cys184亲核攻击Thr-Gly(T-G)之间的肽键，释放出C端基团(Gly)，并形成酰基-酶中间体，此中间产物可进一步被另一底物的N端Gly亲核攻击，使得亲核基团与苏氨酸之间形成肽键，而SrtA被重新释放出来，最终完成转肽反应，得到产物。目前常用的SortaseA酶来自金黄色葡萄球菌的酶及其变体，例如SrtA截短体SrtAΔN25以及突变体m5SrtAΔN59、m9SrtAΔN59等(Chen L,Cohen J,Song X,et al.Improved variants of SrtAfor site-specific conjugation on antibodies and proteins with high efficiency[J].Scientific Reports,2016,6:31899.)。本文中SortaseA指的是来源于金黄色葡萄球菌的SortaseA酶或其突变体。
本文所用的“(某基团)n”是指该部分中具有n个该基团。例如，本文所用的(AEEA)n是指该部分中具有n个连接的AEEA基团。
本文所用的“Cm-n”指该部分中具有m-n个碳原子。例如“C1-6”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子。
术语“EC50”是指有效浓度，结合分子(例如抗体、抗体片段或Fab-脂肪链偶联物)的50％最大应答。术语“IC50”是指抑制浓度，结合分子的50％最大应答。“IC50”和“EC50”均可以通过ELISA或FACS分析或本领域已知的任何其他方法进行测量。
术语“TNF-α”是指人肿瘤坏死因子α，是以17kD分泌形式和26kD膜结合形式存在的人细胞因子。其生物学活性形式由非共价键连接的17kD分子的三聚体组成。其结构另外描述于例如Pennica,D.等(1984)Nature 312:724-729；Davis,J.M.等(1987)Biochemistry26:1322-1326；和Jones,E.Y.等(1989)Nature 338:225-228。
术语“AEEA”意指2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸。
术语“载体”是指用于将编码信息转移至表达系统(例如宿主细胞或体外表达系统)的任何分子(例如核酸、质粒或病毒)。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA(dsDNA)分子，可以在其中插入其他DNA片段。载体的另一类型是病毒载体，其中可以将其它DNA片段插入病毒基因组中。某些载体能够在其导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后被整合到该宿主细胞的基因组中，从而与该宿主基因组一起复制。
术语“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽的翻译的载体。
术语“药学上可接受的”指不消除本文所述的化合物的生物学活性或性质的物质，如载体或稀释剂。这类物质被施用于个体不导致不希望的生物学作用或者不以有害方式与包含它的组合物中的任何组分相互作用。
术语“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣材料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料等和其组合，这是本领域技术人员所熟知的(Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack PrintingCompany,1990,pp.1289-1329)。除了与活性成分不相容的载体外，在治疗或药物组合物中考虑使用任何常规载体。
术语“治疗”是指为了以统计学显著的方式治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响疾患(例如疾病)、疾患的症状，或预防或延缓症状、并发症、生化指标的发作，或以其他方式阻滞或抑制疾病、疾患或病症的进一步发展而使用措施。
术语“治疗有效量”是指向受试者提供治疗性和/或预防性益处所必需的Fab-脂肪链偶联物或组合物或其他施用物的量。
术语“受试者”包括任何人类或非人动物。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。优选地，根据本发明的受试者是人。除非标明，术语“患者”或“受试者”可以互换使用。
术语“特异性结合”意为结合对于抗原或白蛋白而言是选择性的并且可以与不需要或非特异性的相互作用区别开。Fab-脂肪链偶联物与抗原结合或与HSA结合的能力可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术测量。
本申请还包括与本文中记载的那些相同的，但一或多个原子被原子量或质量数不同于自然中通常发现的原子量或质量数不同的原子置换的同位素标记的本申请化合物。可结合到本申请化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如分别为2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、31P、32P、35S、18F、123I、125I和36Cl等。
某些同位素标记的本申请化合物(例如用3H及14C标记的那些)可用于化合物和/或底物组织分布分析中。氚化(即3H)和碳-14(即14C)同位素对于由于它们易于制备和可检测性是尤其优选的。此外，用较重同位素(诸如氘(即2H))取代可以提供某些由更高的代谢稳定性产生的治疗优点(例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求)，并且因此在某些情形下可能是优选的。正电子发射同位素，诸如15O、13N、11C和18F可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以测定底物占有率。通常可以通过与公开于下文的方案和/或实施例中的那些类似的下列程序，通过同位素标记试剂取代未经同位素标记的试剂来制备同位素标记的本申请化合物。
蛋白中的氨基酸残基缩写如下：苯丙氨酸是Phe或F；亮氨酸是Leu或L；异亮氨酸是Ile或I；甲硫氨酸是Met或M；缬氨酸是Val或V；丝氨酸是Ser或S；脯氨酸是Pro或P；苏氨酸是Thr或T；丙氨酸是Ala或A；酪氨酸是Tyr或Y；组氨酸是His或H；谷氨酰胺是Gln或Q；天冬酰胺是Asn或N；赖氨酸是Lys或K；天冬氨酸是Asp或D；谷氨酸是Glu或E；半胱氨酸是Cys或C；色氨酸是Trp或W；精氨酸是Arg或R；甘氨酸是Gly或G。
本申请具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本申请的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本申请的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，然而，本发明中这些实施例仅用于阐明而不限制本发明的范围。同样，本发明不限于本文描述的任何具体优选的实施方案。本领域技术人员应该理解，对本发明技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。除特别说明的以外，以下实施例采用的试剂均为市售产品，溶液的配制可以采用本领域常规技术。
除非另外规定，否则本发明的操作将使用本领域技术范围内的有机合成、生物化学、蛋白质纯化等常规技术，或者按照产品说明书进行，所述技术在文献中有充分解释。在以下实例中，已努力确保所使用数字(例如量、温度等)的准确性，但应将一些实验误差和偏差考虑在内。
缩写：
Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；
SDS：十二烷基硫酸钠；
m/z：质荷比；
Alloc：烯丙氧羰基；
Boc：叔丁氧羰基；
Fmoc：9-芴基甲氧基羰基；
DIEA：N,N-二异丙基乙胺；
DCM：二氯甲烷；
DIC：N,N’-二异丙基碳二亚胺；
HOBt：1-羟基苯并三唑；
DMF：N,N-二甲基甲酰胺；
PIP：哌啶；
TFA：三氟乙酸；
Fmoc-Lys(Alloc)-OH：Nα-(9-芴甲氧羰基)-Nε-烯丙氧羰基-L-赖氨酸；
Boc-Gly-Gly-Gly-OH：N-[N-[N-(叔丁氧羰基)甘氨酰]甘氨酰]甘氨酸；
Fmoc-AEEA-OH：[2-[2-(9-芴甲氧羰基-氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸；
Fmoc-Glu(Otbu)-OH：N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-γ-叔丁酯；
Fmoc-Ala-OH：N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸；
Fmoc-Pro-OH：N-芴甲氧羰基-L-脯氨酸；
PBS：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g/L，十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)：2.85g/L，氯化钠(NaCl)：8.5g/L，氯化钾(KCl)：0.2g/L，pH 7.4。
实施例1：表达Fab-(G4S)3-LPETGG-His6的重组大肠埃希菌的构建
Fab片段是Fab片段轻链和Fab片段重链通过链间二硫键形成的异二聚体结构，保留有全长抗体的抗原结合活性。Fab片段的轻、重链在信号肽指引下分泌到大肠埃希菌周质空间，两者在周质空间中能够完成折叠、形成正确的链内以及链间二硫键，成为有生物学活性的Fab蛋白。基于以上理论基础，本实施例得以实现。
Fab-(G4S)3-LPETGG-His6具有两条多肽链，氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQID NO:3所示。
按照大肠埃希菌BL21(DE3)的偏好密码子，将阿达木单抗Fab片段的轻、重链氨基酸序列分别转换成DNA序列(核苷酸序列分别如SEQ ID NO:15和16所示)。在编码阿达木单抗Fab片段轻链的基因的5’端和编码阿达木单抗Fab片段重链的基因的5’端分别添加编码信号肽STII的基因(氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)，信号肽序列指导目标蛋白分泌表达至大肠埃希菌周质空间。另外，在编码含有信号肽STII序列的Fab片段轻链的基因与编码含有信号肽STII序列的Fab片段重链的基因之间添加基因间序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)，在编码含有信号肽STII序列的Fab片段重链的基因的3’端添加SRD序列(SRD序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示)。由此构建得到目的基因序列STII-Ada-SRD，并且序列的5’和3’两端分别添加了限制性酶切位点，为NcoI(C↓CATGG)和BamHI(G↓GATCC)。阿达木单抗Fab片段的轻链和重链在同一个启动子的控制下表达。
人工合成基因序列STII-Ada-SRD，合成后将序列克隆到表达载体pET28a的NcoI-BamHI位点上，构建得到重组表达载体pET28a-STII-Ada-SRD，如图2所示。将pET28a-STII-Ada-SRD转化大肠埃希菌BL21(DE3)中，得到重组大肠埃希菌：BL21(DE3)/pET28a-STII-Ada-SRD，命名为DMR464。
表达来源于其它单克隆抗体Fab片段的工程菌株的构建参照上述方法。
实施例2：Fab-(G4S)3-LPETGG-His6的制备和分离纯化
DMR464的高密度发酵方法参考文献[Newton J M,Vlahopoulou J,ZhouY.Investigating and modelling the effects of cell lysis on the rheologicalproperties of fermentation broths[J].Biochemical Engineering Journal,2017,121:38-48]。挑取DMR464单菌落接种于液体LB培养基中，于37℃、220rpm条件下培养约7h，制备种子液。之后按照10％的接种量将上述种子液接种于3L SM6Gc发酵培养基中，并同时加入终浓度25μg/mL卡那霉素。发酵起始培养温度选择为30℃，空气通量为3L/min，控制pH约为7.0，转速为300rpm。发酵过程中通过调整转速和罐压保持溶氧不低于30％，pH通过2mol/L硫酸溶液和50％(v/v)氨水溶液进行调节，并加消泡剂消泡。当发酵液OD600nm值达到40.0时，发酵培养温度降为25℃，并在发酵罐中及时添加2.1g硫酸镁。当发酵液中溶氧以及pH明显上升时，预示发酵液需要开始补料。此时，按照12mL/h的速度恒流速补加80％(w/w)甘油溶液，并在发酵罐中加入终浓度0.1mmol/L IPTG进行诱导表达，总发酵时间为80h左右。
高密度发酵结束后，取发酵液在室温条件下6000rpm离心处理10min，倾去上清。沉淀所得菌体按质量体积比(w:v)1:10混悬于20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液中进行洗涤，菌体混悬液于4℃、6000rpm条件下离心10min，倾去上清。此洗涤步骤重复两次。
将菌体按质量体积比(w:v)1:5混悬于含60mmol/L柠檬酸以及50mmol/L硫酸镁的缓冲液中(pH4.0)。上述菌体混悬液细纱布过滤除杂后，在4℃条件下，于550bar压力下在细胞破碎仪上(广州聚能纳米生物科技股份有限公司)匀浆三遍。之后所得匀浆液于4℃、10000rpm离心10min，收集上清，并调pH至7.2，即得到周质蛋白提取液。
周质蛋白提取液经0.22μm水相滤膜过滤后通过HiTrap protein L(5mL，GEHealthcare)亲和柱对Fab片段类似物Fab-(G4S)3-LPETGG-His6进行纯化。纯化过程中，首先使用平衡缓冲液(PBS)平衡亲和柱，待基线、pH以及电导稳定后开始进行样品上样。上样结束后，用平衡缓冲液冲洗层析柱，将非特异性结合在层析柱上的杂蛋白被洗脱下来。之后通过洗脱缓冲液(0.1mol/L Gly-HCl溶液，pH 2.7)冲洗层析柱，同时开始收集洗脱液，目的蛋白被洗脱下来，存在于洗脱液中。利用SDS-PAGE分析纯化后的Fab片段类似物，电泳图谱如图3所示。通过以protein L作为配基的亲和层析柱对Fab片段类似物进行纯化，获得纯度达95％以上的抗体蛋白。Fab片段类似物经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝1457.5347[M+34H]+34与理论分子量(49523.12Da)相符。
通过
Figure BDA0003464960350000182
26/10 Desalting(GE Healthcare)脱盐柱将纯化所得Fab片段类似物置换于含50mmol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)和150mmol/L NaCl、pH 7.0溶液中。BCA法测定蛋白浓度，-20℃冻存。
实施例3：NH2-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)-OH的合成
NH2-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)-OH的结构：
Figure BDA0003464960350000181
(1)材料及试剂：
2-氯三苯甲基氯(2-CTC)树脂(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)，取代值(SD)为1.15mmol/g。
材料：Fmoc-Lys(Alloc)-OH(CAS号：146982-27-6)，Fmoc-AEEA-OH(CAS号：166108-71-0)，Fmoc-Glu(Otbu)-OH(CAS号：71989-18-9)，十八烷二酸单叔丁基酯(CAS号：843666-40-0)，Boc-Gly-Gly-Gly-OH(CAS号：28320-73-2)。
合成试剂：HOBt，DIC，DMF，DCM，PIP，DIEA。
(2)合成步骤：
称取2-CTC树脂1.00g，置于多肽合成仪(CS-BIO型多肽合成仪)反应器中，加入10mL DCM，浸泡1h。称取2.3-3.5mmol的Fmoc-Lys(Alloc)-OH及2.3-3.5mmol的DIEA，加入10mL DCM溶解后，投入反应器中，进行反应，室温反应两小时，即第一个氨基酸偶联到了树脂上，DCM洗涤树脂6次，测得此时树脂的取代值SD为0.15mmol/g；随后加入含20％(v/v)PIP的DMF溶液10mL，混合30min脱除Fmoc氨基保护基，DCM洗涤树脂6次，分别称取0.45mmol的Fmoc-AEEA-OH、0.45mmol的HOBt及0.45mmol的DIC，加入10mL DMF/DCM(v:v＝1:1)混合溶剂溶解后，加入反应器中室温进行反应，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，用DCM洗涤树脂6次。而后，即可按照上述偶联的方法依次进行Fmoc-AEEA-OH和Boc-Gly-Gly-Gly-OH的偶联延伸。
称取的四(三苯基膦)钯(0.015mmol)及苯硅烷(1.5mmol)溶解于15mL DCM后加入到反应器中反应30min，脱去Alloc氨基保护基。反应结束后，依次用DCM洗涤树脂6次，含0.02mol/L N,N-二乙基二硫代氨基甲酸的DMF溶液洗涤3次，DMF洗涤6次。依次逐个将Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、十八烷二酸单叔丁基酯按照上述偶联的方法进行偶联延伸。
合成结束后，称树脂湿重，加入裂解试剂(TFA)，室温搅拌反应1小时后过滤至旋蒸瓶，旋蒸后在液体中加入乙醚，-20℃放置2h，离心，所得沉淀干燥后放置于-20℃待用。
将沉淀所得粗肽用水溶解后，通过半制备型高效液相色谱仪(Waters 600E RP-HPLC)，使用反相C4制备层析柱(YMC(日本)park pro C4 30μm粒径，10×250mm，
Figure BDA0003464960350000193
)，采用如表1所示梯度洗脱参数对其进行纯化。流动相A为0.1％TFA(v/v)水溶液，流动相B为0.1％TFA(v/v)乙腈溶液。收集液进行HPLC(Agilent 1260型分析型液相色谱仪)分析，合并纯度大于90％的目标组分，低压旋蒸(BUCHI旋蒸仪)，冷冻干燥。经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝1323.93[M+H]+与理论分子量(1322.25Da)相符。
表1：梯度洗脱参数
时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.00 5.00 80.0 20.0
2.00 5.00 80.0 20.0
8.00 5.00 74.0 26.0
20.00 5.00 68.0 32.0
60.00 5.00 63.0 37.0
实施例4：NH2-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH的合成
NH2-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH的结构：
Figure BDA0003464960350000191
合成和纯化过程参考实施例3中的方法，为本领域技术人员所熟知。经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝904.64[M+H]+与理论分子量(902.80Da)相符。
实施例5：NH2-GGG-[(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)]2-OH的合 成
NH2-GGG-[(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)]2-OH的结构：
Figure BDA0003464960350000192
合成和纯化过程参考实施例3中的方法，为本领域技术人员所熟知。经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝2458.81[M+H]+与理论分子量(2456.93Da)相符。
实施例6：NH2-GGG-A(PA)6-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH的合成
NH2-GGG-A(PA)6-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH的结构：
Figure BDA0003464960350000201
合成和纯化过程参考实施例3中的方法，为本领域技术人员所熟知。经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝1694.76[M+H]+与理论分子量(1692.64Da)相符。
实施例7：NH2-GGG-S(PGS)4-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH的合成
NH2-GGG-S(PGS)4-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH的结构：
Figure BDA0003464960350000202
合成和纯化过程参考实施例3中的方法，为本领域技术人员所熟知。经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝1666.64[M+H]+与理论分子量(1664.44Da)相符。
实施例8：NH2-GGG-(PA)6-12-氨基十二烷酸的合成
NH2-GGG-(PA)6-12-氨基十二烷酸的结构：
Figure BDA0003464960350000203
(1)材料及试剂：
2-CTC树脂(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)，取代值(SD)为1.15mmol/g。
氨基酸为：12-(Fmoc-氨基)十二烷酸(CAS号：128917-74-8)，Fmoc-Ala-OH(CAS号：35661-39-3)，Fmoc-Pro-OH(CAS号：71989-31-6)，Boc-Gly-Gly-Gly-OH(CAS号：28320-73-2)。
合成试剂：HOBt，DIC，DMF，DCM，PIP，DIEA。
(2)合成步骤：
称取2-CTC树脂1.00g，置于多肽合成仪(CS-BIO型多肽合成仪)反应器中，加入10mL DCM，浸泡1h。称取2.3-3.5mmol的12-(Fmoc-氨基)十二烷酸及2.3-3.5mmol的DIEA，加入10mL DCM溶解后，投入反应器中，进行反应，室温反应两小时，即12-(Fmoc-氨基)十二烷酸偶联到了树脂上，DCM洗涤树脂6次，测得此时树脂的取代值SD为0.15mmol/g；随后加入含20％(v/v)PIP的DMF溶液10mL，混合30min脱除Fmoc氨基保护基，DCM洗涤树脂6次，分别称取0.45mmol的Fmoc-Ala-OH、0.45mmol的HOBt及0.45mmol的DIC，加入10mL DMF/DCM(v:v＝1:1)混合溶剂溶解后，加入反应器中室温进行反应，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，用DCM洗涤树脂6次。而后，即可按照上述偶联的方法依次进行剩余氨基酸的偶联延伸，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成。
合成结束后，称树脂湿重，加入裂解试剂(TFA)，室温搅拌反应1小时后过滤至离心管中。滤液中加入乙醚，-20℃放置2h，离心，所得沉淀干燥后放置于-20℃待用。
将沉淀所得粗肽用水溶解后，通过半制备型高效液相色谱仪(Waters 600E RP-HPLC)，使用反相C4制备层析柱(YMC(日本)park pro C4 30μm粒径，10×250mm，
Figure BDA0003464960350000204
)，采用如表1所示梯度洗脱参数对其进行纯化。流动相A为0.1％TFA(v/v)水溶液，流动相B为0.1％TFA(v/v)乙腈溶液。收集液进行HPLC(Agilent 1260型分析型液相色谱仪)分析，合并纯度大于90％的目标组分，低压旋蒸(BUCHI旋蒸仪)，冷冻干燥。经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝1396.58[M+H]+与理论分子量(1395.63Da)相符。
实施例9：NH2-GGG-(AEEA)2-E-12-氨基十二烷酸的合成
NH2-GGG-(AEEA)2-E-12-氨基十二烷酸的结构：
Figure BDA0003464960350000211
合成和纯化过程参考实施例8中的方法。经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝806.78[M+H]+与理论分子量(805.96Da)相符。
实施例10：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰 基)-OH的制备
Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)-OH的结构：
Figure BDA0003464960350000212
SortaseA酶可以特异性地结合Fab片段类似物C末端的LPETG序列，切断苏氨酸(T)和甘氨酸(G)之间的肽键，而后催化苏氨酸与脂肪肽链结构中的N端甘氨酸(G)形成新的肽键，从而最终形成本发明所述的抗TNF-α的Fab-脂肪链偶联物。SortaseA介导的转肽反应过程可逆，并且反应过程中，水分子可作为亲核试剂，干扰Fab片段类似物与脂肪肽链的偶联，导致Fab片段类似物C末端发生水解，产生Fab-(G4S)3-LPET-OH杂质。因此在SortaseA介导的转肽反应过程中，应严格控制反应时间，在取得最大偶联效率的基础上，降低副反应产物的产生，以降低后期纯化难度。反应结束后，反应液只需经过镍柱亲和层析，就能祛除带有His6标签的Fab片段类似物蛋白以及SortaseA，得到高纯度的Fab-脂肪链偶联物。
(1)SortaseA酶m9SrtAΔN59的表达纯化
m9SrtAΔN59的表达纯化具体步骤参考文献：张庆彬,黄宗庆,路建光,等.SortaseA酶突变体的原核表达、纯化及活性测定(英文)[J].中国医药工业杂志,2020(1):37-47.。也可以使用其他来源的SortaseA酶。
(2)SortaseA酶催化的转肽反应
Fab-(G4S)3-LPETGG-His6和脂肪肽链NH2-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)-OH分别按照实施例2和实施例3的方法制备所得。在50mmol/L MES、150mmol/L NaCl、pH 7.0反应体系中分别加入终浓度为10μmol/L的Fab片段类似物、终浓度为400μmol/L的脂肪肽链、终浓度为625nmol/L的m9SrtAΔN59以及终浓度为10mmol/L的CaCl2。上述反应液于37℃条件下温育反应2-4h。
(3)Fab-脂肪链偶联物的分离纯化
反应结束后，上述反应液通过HiTrap excel(5mL，GE Healthcare)亲和柱对Fab-脂肪链偶联物进行纯化。纯化过程中，首先使用平衡缓冲液(20mmol/L MES，150mmol/LNaCl，pH 7.0)平衡亲和柱，待基线、pH以及电导稳定后开始进行样品上样。上样过程中收集柱流穿液，Fab-脂肪链偶联物即存在于柱流穿液中。上样结束后通过洗脱液(20mmol/LMES，150mmol/L NaCl，0.5mol/L咪唑，pH 7.0)冲洗层析柱，带有His6标签的Fab片段类似物以及m9SrtAΔN59被洗脱下来，存在于洗脱液中。通过一步镍柱亲和层析即可对反应产物进行有效纯化，过程简单、方便、高效，且最终纯化得到纯度高于95％的Fab-脂肪链偶联物。利用SDS-PAGE分析Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)-OH纯化过程中各个样品，电泳图谱如图4所示。上述Fab-脂肪链偶联物经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝1426.4779[M+35H]35+与理论分子量(49891.08Da)相符。
所制备Fab-脂肪链偶联物通过10kD超滤膜进行超滤浓缩，并用PBS置换。BCA法测定蛋白浓度，-20℃冻存。
实施例11：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH的制 备
Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH的结构：
Figure BDA0003464960350000221
Fab-(G4S)3-LPETGG-His6和NH2-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH分别按照实施例2和实施例4的方法制备所得。SortaseA酶催化的转肽反应以及Fab-脂肪链偶联物的分离纯化参照实施例10的方法。所制备得到的Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH的电泳图谱如图5(非还原型电泳)和图6(还原型电泳)所示。上述Fab-脂肪链偶联物经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝1456.0513[M+34H]34+与理论分子量(49471.79Da)相符。
实施例12：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-[(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰 基)]2-OH的制备
Fab-(G4S)3-LPET-GGG-[(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)]2-OH的结构：
Figure BDA0003464960350000222
Fab-(G4S)3-LPETGG-His6和NH2-GGG-[(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)]2-OH分别按照实施例2和实施例5的方法制备所得。SortaseA酶催化的转肽反应以及Fab-脂肪链偶联物的分离纯化参照实施例10的方法。所制备得到的Fab-(G4S)3-LPET-GGG-[(AEEA)2-K(ε-NH-(AEEA)2-E-17-羧基十七烷酰基)]2-OH的电泳图谱如图5(非还原型电泳)和图6(还原型电泳)所示。上述Fab-脂肪链偶联物经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝1501.7570[M+34H]34+与理论分子量(51025.96Da)相符。
实施例13：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-A(PA)6-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH的制备
Fab-(G4S)3-LPET-GGG-A(PA)6-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH的结构：
Figure BDA0003464960350000223
Fab-(G4S)3-LPETGG-His6和NH2-GGG-A(PA)6-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH分别按照实施例2和实施例6的方法制备所得。SortaseA酶催化的转肽反应以及Fab-脂肪链偶联物的分离纯化参照实施例10的方法。所制备得到的Fab-(G4S)3-LPET-GGG-A(PA)6-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH的电泳图谱如图5(非还原型电泳)和图6(还原型电泳)所示。上述Fab-脂肪链偶联物经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝1479.2957[M+34H]34+与理论分子量(50261.91Da)相符。
实施例14：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-S(PGS)4-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH的制 备
Fab-(G4S)3-LPET-GGG-S(PGS)4-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH的结构：
Figure BDA0003464960350000231
Fab-(G4S)3-LPETGG-His6和NH2-GGG-S(PGS)4-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH分别按照实施例2和实施例7的方法制备所得。SortaseA酶催化的转肽反应以及Fab-脂肪链偶联物的分离纯化参照实施例10的方法。所制备得到的Fab-(G4S)3-LPET-GGG-S(PGS)4-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH的电泳图谱如图5(非还原型电泳)和图6(还原型电泳)所示。上述Fab-脂肪链偶联物经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝1478.4618[M+34H]34+与理论分子量(50233.79Da)相符。
实施例15：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(PA)6-12-氨基十二烷酸的制备
Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(PA)6-12-氨基十二烷酸的结构：
Figure BDA0003464960350000232
Fab-(G4S)3-LPETGG-His6和NH2-GGG-(PA)6-12-氨基十二烷酸分别按照实施例2和实施例8的方法制备所得。SortaseA酶催化的转肽反应以及Fab-脂肪链偶联物的分离纯化参照实施例10的方法。所制备得到的Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(PA)6-12-氨基十二烷酸的电泳图谱如图5(非还原型电泳)和图6(还原型电泳)所示。上述Fab-脂肪链偶联物经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝1428.5183[M+35H]35+与理论分子量(49963.73Da)相符。
实施例16：Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-E-12-氨基十二烷酸的制备
Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-E-12-氨基十二烷酸的结构：
Figure BDA0003464960350000233
Fab-(G4S)3-LPETGG-His6和NH2-GGG-(AEEA)2-E-12-氨基十二烷酸分别按照实施例2和实施例9的方法制备所得。SortaseA酶催化的转肽反应以及Fab-脂肪链偶联物的分离纯化参照实施例10的方法。所制备得到的Fab-(G4S)3-LPET-GGG-(AEEA)2-E-12-氨基十二烷酸的电泳图谱如图5(非还原型电泳)和图6(还原型电泳)所示。上述Fab-脂肪链偶联物经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝1411.6820[M+35H]35+与理论分子量(49373.93Da)相符。
实施例17：抗TNF-α的Fab-脂肪链偶联物的生物学活性测定
通过间接ELISA法测定Fab-脂肪链偶联物与TNF-α的结合活性，实验步骤如下：
(1)将检测用TNF-α抗原(GenScript，产品目录No.Z01001)用包被缓冲液(碳酸盐缓冲液，pH 9.6)稀释至1μg/mL，加入至MaxiSorp酶标板(Immuno)(100μL/孔)，37℃孵育1h；
(2)包被完成之后，用洗涤液(含0.05％(v/v)Tween-20的PBS/T，pH 7.4)连续洗涤4次。之后每孔加入200μL封闭液(含5％(w/v)脱脂奶粉的PBS，pH 7.4)，37℃孵育1h；
(3)取出96孔板，洗涤液连续洗板4次。加入用封闭液2倍系列稀释的样品(浓度范围为0.018nmol/L至150nmol/L)100μL/孔，同时分别设置阳性以及阴性对照，37℃孵育1h；
(4)取出96孔板，洗涤液连续洗板4次。每孔加入100μL酶标羊抗人Fab显色抗体(Sigma，产品目录No.A0293)溶液，37℃孵育0.5h；
(5)取出96孔板，洗涤液连续洗板4次。每孔加入100μL TMB显色液(Thermo FisherScientific Inc.，产品目录No.34021)，37℃孵育25min；
(6)显色后每孔加入50μL终止液(2mol/L H2SO4溶液)，终止反应，然后在酶标仪上检测OD450 nm吸光值，并计算EC50值。
表2：Fab-脂肪链偶联物与TNF-α的结合活性
样品 EC<sub>50</sub>(nmol/L)
Adalimumab((Fab)<sub>2</sub>-Fc) 0.515
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPETGG-His<sub>6</sub> 1.366
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPET-GGG-(AEEA)<sub>2</sub>-K(ε-NH-(AEEA)<sub>2</sub>-E-17-羧基十七烷酰基)-OH 1.471
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPET-GGG-(AEEA)<sub>2</sub>-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH 2.003
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPET-GGG-[(AEEA)<sub>2</sub>-K(ε-NH-(AEEA)<sub>2</sub>-E-17-羧基十七烷酰基)]<sub>2</sub>-OH 1.705
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPET-GGG-A(PA)<sub>6</sub>-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH 1.309
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPET-GGG-S(PGS)<sub>4</sub>-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH 1.520
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPET-GGG-(PA)<sub>6</sub>-12-氨基十二烷酸 1.403
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPET-GGG-(AEEA)<sub>2</sub>-E-12-氨基十二烷酸 1.707
表2显示了阿达木单抗Fab片段类似物以及Fab-脂肪链偶联物与TNF-α结合的EC50值。实验结果表明，所制备得到的Fab-脂肪链偶联物保留有全长抗体Fab片段的TNF-α特异性结合能力，具有良好的生物学活性。
实施例18：抗TNF-α的Fab-脂肪链偶联物的效应功能：L929细胞保护实验
TNF-α与小鼠L929细胞共同孵育会导致细胞的凋亡，另外放线菌素D能够增强TNF-α的细胞毒作用。而抗TNF-α的抗体通过特异性结合TNF-α，对TNF-α导致的细胞杀伤具有抑制作用，所以可通过Fab-脂肪链偶联物抑制TNF-α对靶细胞L929细胞株的杀伤来检测其生物学活性。实验采用L929细胞作为TNF-α杀伤的靶细胞，通过CCK-8(Dojindo)试剂检测细胞存活率，从而最终反映样品的生物学活性。
实验步骤如下：
(1)将L929细胞培养至对数生长期，PBS清洗细胞后加入胰酶消化细胞层。用MEM培养基(含10％FBS)将细胞稀释至2×105个/mL，加入至96孔细胞培养板(Corning)，100μL/孔。将细胞培养板置于37℃的5％二氧化碳培养箱中培养23-25h；
(2)用含有放线菌素D(2μg/mL)的MEM培养基(含2％FBS)2倍稀释Fab-脂肪链偶联物至不同浓度(浓度范围为0.25nmol/L至256nmol/L)。取96孔细胞培养板，弃上清。向反应孔中加入不同浓度的上述稀释后的Fab-脂肪链偶联物溶液50μL/孔，以及浓度为20ng/mL的TNF-α溶液50μL/孔。同时设置阳性以及阴性对照孔。将96孔细胞培养板置于37℃的5％二氧化碳培养箱中培养16-18h；
(3)取出96孔细胞培养板，加入CCK-8溶液染色2h后，酶标仪测定OD450 nm吸光值，并计算IC50值。
表3：Fab-脂肪链偶联物抑制TNF-α对L929细胞杀伤作用
样品 IC<sub>50</sub>(nmol/L)
Adalimumab((Fab)<sub>2</sub>-Fc) 0.648
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPETGG-His<sub>6</sub> 5.001
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPET-GGG-(AEEA)<sub>2</sub>-K(ε-NH-(AEEA)<sub>2</sub>-E-17-羧基十七烷酰基)-OH 4.735
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPET-GGG-(AEEA)<sub>2</sub>-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH 4.800
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPET-GGG-[(AEEA)<sub>2</sub>-K(ε-NH-(AEEA)<sub>2</sub>-E-17-羧基十七烷酰基)]<sub>2</sub>-OH 4.059
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPET-GGG-A(PA)<sub>6</sub>-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH 4.165
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPET-GGG-S(PGS)<sub>4</sub>-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH 3.935
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPET-GGG-(PA)<sub>6</sub>-12-氨基十二烷酸 4.495
Fab-(G<sub>4</sub>S)<sub>3</sub>-LPET-GGG-(AEEA)<sub>2</sub>-E-12-氨基十二烷酸 5.287
计算结果如表3所示，本发明制备的Fab-脂肪链偶联物能与抗原TNF-α特异性结合且抑制其对L929细胞的杀伤作用。
实施例19：抗TNF-α的Fab-脂肪链偶联物的白蛋白结合能力测定
本发明中，通过SortaseA酶介导的转肽反应将脂肪链定点修饰至Fab片段重链C末端，利用亲脂残基与白蛋白非共价结合特性，最终赋予Fab片段结合白蛋白的能力。在体内Fab-脂肪链偶联物与血浆白蛋白可逆性结合，结合后的复合体在跨膜转运中因分子量过大而受到限制，从而达到延长Fab片段体内半衰期的目的。
通过ELISA试验验证Fab-脂肪链偶联物与HSA的结合效能：
(1)将HSA用包被缓冲液(碳酸盐缓冲液，pH 9.6)稀释至20μg/mL，加入至高吸附酶标板(生工生物工程(上海)股份有限公司)(100μL/孔)，37℃孵育1h；
(2)包被完成之后，用洗涤液(含0.05％(v/v)Tween-20的PBS/T，pH 7.4)连续洗涤4次。之后每孔加入200μL封闭液(含5％(w/v)脱脂奶粉的PBS，pH 7.4)，37℃孵育1h；
(3)取出96孔板，洗涤液连续洗板4次。加入用洗涤液2倍系列稀释的样品(浓度范围为1.953nmol/L至1000nmol/L)100μL/孔，同时分别设置阳性以及阴性对照，37℃孵育1h；
(4)取出96孔板，洗涤液连续洗板4次。每孔加入100μL酶标羊抗人Fab显色抗体(Sigma，产品目录No.A0293)溶液，37℃孵育0.5h；
(5)取出96孔板，洗涤液连续洗板4次。每孔加入100μL TMB显色液(Thermo FisherScientific Inc.，产品目录No.34021)，37℃孵育30min；
(6)显色后每孔加入50μL终止液(2mol/L H2SO4溶液)，终止反应，然后在酶标仪上检测OD450nm吸光值。
检测结果如图7所示，不同类型的Fab-脂肪链偶联物在检测过程中呈现不同程度的信号值的增加，表明Fab-脂肪链偶联物均具有HSA的结合能力，其与HSA的结合活性的强弱依赖于Fab片段重链C末端的脂肪肽链结构。在相同蛋白摩尔浓度条件下，FA3-Fab所呈现出的OD450nm信号值最高，表明其与HSA亲和能力最强，因此脂肪肽链结构中含有两个17-羧基十七烷酰基基团能够增强其与HSA的结合。此外，FA4-Fab、FA5-Fab、FA2-Fab以及FA1-Fab也呈现出较为明显的信号值，而FA6-Fab以及FA7-Fab的信号值较弱，表明脂肪肽链结构中连接子以及脂肪链的类型均对HSA的亲和力产生影响。
实施例20：小鼠体内药代动力学研究
本实施例以Fab-(G4S)3-LPET-GGG-A(PA)6-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH为例，对其进行小鼠体内药代动力学研究，验证Fab-脂肪链偶联物能否通过结合白蛋白而达到延长半衰期的目的。
将约20g的雌性BALB/c小鼠分为A、B两组，每组10只。两组小鼠分别静脉注射5mg/kg的Fab-(G4S)3-LPET-GGG-A(PA)6-K(ε-NH-17-羧基十七烷酰基)-OH(FA4-Fab)以及Fab-(G4S)3-LPETGG-His6(Fab片段类似物)。分别于给药后10min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h和72h从小鼠眼眶采集血液样品，置于内含EDTA-K2的抗凝管内，离心得到血浆样品。采用ELISA方法检测不同时间点血浆样品中FA4-Fab以及Fab片段类似物的浓度，并计算药代动力学参数消除半衰期(t1/2)、表观分布体积(Vd)、清除率(CL)和推测至无穷大的浓度-时间曲线下面积(AUC(0-∞))。
表4：FA4-Fab和Fab在BALB/c小鼠体内的药代动力学参数
FA4-Fab Fab片段类似物
t<sub>1/2</sub>(h) 19.86±3.25 1.31±0.38
V<sub>d</sub>(mL·kg<sup>-1</sup>) 52.3±14.4 59.2±16.5
CL(mL·h<sup>-1</sup>·kg<sup>-1</sup>) 5.3±0.8 177.7±24.1
AUC<sub>(0-∞)</sub>(mg·L<sup>-1</sup>·h) 1114.95±129.48 28.59±3.62
计算结果如表4所示，相较于Fab片段类似物，FA4-Fab表现出15.2倍延长的血浆半衰期(t1/2)，并且其在小鼠体内的清除率(CL)减缓33.5倍、AUC(0-∞)值增大39.0倍。因此，Fab-脂肪链偶联物体内可通过结合血浆白蛋白而显著改善其药代动力学性质。
序列表
<110> 正大天晴药业集团股份有限公司
上海医药工业研究院
上海多米瑞生物技术有限公司
<120> 脂肪肽链及Fab-脂肪链偶联物
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 2
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 3
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu
225 230 235 240
Pro Glu Thr Gly Gly His His His His His His
245 250
<210> 4
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe
1 5 10 15
Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala
20
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
taagaaggag atatacat 18
<210> 14
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttctctgcc ggaaaccggt 60
ggtcatcatc accaccatca t 81
<210> 15
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gacatccaga tgacccagtc tccgtcttct ctgtctgcat ctgttggtga ccgtgttacc 60
atcacctgcc gtgcttctca gggtatccgt aactacctgg cttggtacca gcagaaaccg 120
ggtaaagctc cgaaactgct gatctacgct gcatctaccc tgcagtctgg tgttccgtct 180
cgtttctctg gttcgggttc tggtaccgac ttcacgctga ccatctcgtc tctgcagccg 240
gaagatgtgg ctacctacta ctgccagcgt tacaaccgtg ctccgtatac ctttggtcag 300
ggtaccaaag tggaaatcaa acgtaccgtt gctgctccgt ctgtgttcat ctttccgccg 360
tccgatgaac agctgaaatc tggtaccgct tctgttgttt gcctgctgaa caacttctac 420
ccgcgtgaag cgaaagttca gtggaaagtg gataacgctc tgcagtctgg taactctcag 480
gaatctgtta ccgaacagga ttcgaaagat tccacctatt ccctgtcttc taccctgacc 540
ctgtctaaag ctgattacga aaaacacaaa gtgtatgctt gcgaagttac ccatcagggt 600
ctgtcttctc cggttaccaa atcgttcaac cgtggtgaat gc 642
<210> 16
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaagttcagc tggtggaatc tggtggtggt ctggttcagc cgggtcgttc tctgcgtctg 60
tcttgcgctg cttctggttt caccttcgac gactacgcta tgcattgggt tcgtcaggct 120
ccgggtaaag gtctggaatg ggtttctgct atcacctgga actctggtca catcgactac 180
gctgattctg tggaaggtcg tttcaccatc tctcgtgaca acgcgaaaaa ctctctgtat 240
ctgcagatga actctctgcg tgctgaagat accgctgtgt actattgcgc taaagtgtcc 300
tatctgtcta ccgcttcttc tctggattac tggggtcagg gtaccctggt taccgtttct 360
tctgcttcta ccaaaggtcc gtctgtgttt ccgctggctc cgtcttccaa atctacctct 420
ggtggtaccg ctgctctggg ttgcctggtg aaagactact tcccggaacc ggttaccgtt 480
tcttggaact ctggtgctct gacctctggt gttcatacct ttccggctgt tctgcagtct 540
tctggtctgt attctctgtc ttctgtggtt accgttccgt cttcctctct gggtacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaaaccg tctaacacca aagtggacaa aaaagtggaa 660
ccgaaatctt gc 672

Claims (10)

1.一种脂肪肽链，其特征在于，所述脂肪肽链具有式1、式2或式3所示的结构式：
Figure FDA0003464960340000011
其中，-NH-Xaa-CO-为D-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、4-氨基丁酸残基、2-氨基异丁酸残基、2-氨基丁酸残基、精氨酸残基、天冬氨酸残基、天冬酰胺残基、半胱氨酸残基、谷氨酸残基、D-谷氨酸残基、γ-谷氨酸残基、谷氨酰胺残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、脯氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、酪氨酸残基、苏氨酸残基、色氨酸残基、缬氨酸残基或甲硫氨酸残基中的一种或缺失，
a为0、1、2、3、4或5，
b为0、1、2、3、4或5，
c为1、2、3、4或5，
R1为C6-20脂肪族直链或支链的酰基基团，
R2为羟甲酰烷基胺基，
-NH-L1-CO-为第一连接子或缺失。
2.根据权利要求1所述的脂肪肽链，其特征在于，所述第一连接子为(G4S)n、(ED)n、(PA)n、A(PA)n、(PGS)n、S(PGS)n或(AEEA)n中的一种或几种的组合；其中n为1-12中的一个整数，优选为1-8中的一个整数。
3.根据权利要求1所述的脂肪肽链，其特征在于，所述脂肪肽链选自如下结构式：
Figure FDA0003464960340000021
Figure FDA0003464960340000031
4.一种Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述Fab-脂肪链偶联物的结构通式为Fab-L2-S1-X1；其中，Fab为结合TNF-α的Fab片段，L2为第二连接子或缺失，S1为氨基酸序列LPXaT，Xa为任一天然氨基酸，X1为N端连接有甘氨酸残基的脂肪链；所述S1的C端的羧基与X1的N端甘氨酸的氨基形成肽键连接。
5.根据权利要求4所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，当所述L2为第二连接子时，所述L2连接至Fab片段重链的C端；或当所述L2缺失时，所述S1连接至Fab片段重链的C端。
6.根据权利要求4或5所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述Fab片段为英夫利昔单抗的Fab片段、阿达木单抗的Fab片段、戈利木单抗的Fab片段或赛妥珠单抗的Fab片段，优选为阿达木单抗的Fab片段。
7.根据权利要求4所述的Fab-脂肪链偶联物，其特征在于，所述Fab-脂肪链偶联物选自以下结构式：
Figure FDA0003464960340000032
Figure FDA0003464960340000041
Figure FDA0003464960340000051
以上结构式中，Fab片段重链的C端与(G4S)3的N端连接。
8.权利要求4-7任一项所述的Fab-脂肪链偶联物在制备预防和/或治疗与TNF-α相关疾病的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述与TNF-α相关疾病为自身免疫性疾病或癌症。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述与TNF-α相关疾病为骨关节炎、贮袋炎、白塞氏病、腰椎炎、化脓性汗腺炎、类风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、克罗恩病、斑片性银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎或青少年特发性关节炎。
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