KR20130020789A - 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법 - Google Patents

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KR20130020789A
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로베르토 팔켄슈타인
니콜레 퓌를러
마리아 스미다
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본원에는 하기 단계를 포함하는, 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드의 정제 방법이 보고되어 있다: i) 히스티딘-태그를 가진 폴리펩티드를 포함하는 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계, 및 ii) 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 용액으로 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 회수하여 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 단계, 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용된 폴리펩티드를 포함하는 용액에는 이미다졸 또는 이미다졸-유도체가 없고, 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 흡착된 폴리펩티드는 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 용액으로 회수됨.

Description

소수성 상호작용 크로마토그래피 방법 {HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY METHOD}
본원에는 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 용액으로의 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩티드의 용리에 의해 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드의 정제를 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법이 보고되어 있다.
단백질은 오늘날의 의료적 포트폴리오에서 중요한 역할을 한다. 재조합 폴리펩티드의 제조를 위한 발현 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다. 약학 적용에서 사용하기 위한 폴리펩티드는 주로 원핵세포, 예컨대 E.콜라이 (E.coli), 및 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, COS 세포, HEK 세포, BHK 세포, PER.C6? 세포 등에서 생성된다.
인간 적용을 위해, 모든 약학 성분은 뚜렷한 기준을 충족해야만 한다. 인간에 대한 생물약제의 안정성을 확보하기 위해, 심각한 해를 가할 수 있는 예를 들어, 핵산, 바이러스, 및 숙주 세포 단백질이 제거되어야만 한다. 규제 사항을 충족하기 위해, 1 이상의 정제 단계가 제조 방법에 후속되어야만 한다. 이 중에서도, 순도, 처리량, 및 수율이 적합한 정제 방법의 측정에 있어 중요한 역할을 한다.
예컨대 미생물 단백질로의 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 양이온 교환 (술포프로필 또는 카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합-방식 이온 교환), 친황성 (thiophilic) 흡착 (예를 들어, 베타-메르캅토에탄올 및 기타 SH 리간드로의), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어, 페닐-세파로오스, 아자-친아레노성 (arenophilic) 수지, 또는 m-아미노페닐보론산으로의), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질로의), 크기 배제 크로마토그래피, 및 전기영동 방법 (예컨대 젤 전기영동, 모세관 전기영동) (예를 들어, Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102 참조) 과 같은 상이한 방법이 단백질 정제에 대해 잘 성립되고 널리 사용된다.
Mateo, C., et al. 에는 폴리히스티딘-태그 효소의 친화성 크로마토그래피에 대해 보고되어 있다 (J. Chrom. 915 (2001) 97-106). WO 02/37100 에는 니켈 니트릴로트리아세트산 (NI-NTA) 수지의 신규 적용이 보고되어 있다. his-태그 단백질을 정제하기 위한 방법 및 키트는 WO 2005/035092 에 보고되어 있다. WO 98/06739 에는 재조합 단백질의 정제 방법이 보고되어 있다.
용리제로서 아미노산 모방체를 비롯한 친화성 정제 방법이 WO 94/07912 에 보고되어 있다. US 2004/0152076 에는 고정된 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하는 핵산 분리가 보고되어 있다. 인자 VIII 의 정제 방법이 US 6,005,082 에 보고되어 있다. US 2007/0037966 에는 인자 VII 폴리펩티드의 소수성 상호작용 크로마토그래피 정제가 보고되어 있다.
히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드는 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 용액으로의 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터 회수될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 본원에 보고된 방법으로 2-프로판올과 같은 유기 용매를 포함하는 용액을 회수하는 것은 선택도 및 수율의 손실 없이 회피될 수 있다.
그러므로, 본원에는 하기 단계를 포함하는, 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드의 수득 또는 정제 방법이 보고된다:
- 히스티딘-태그를 가진 폴리펩티드를 포함하는 제 1 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계, 및
- 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 제 2 용액을 적용함으로써 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 회수하여 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 수득 또는 정제하는 단계.
본원에는 또한 하기 단계를 포함하는, 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법이 보고된다:
- 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 배양하는 단계,
- 임의로 봉입체의 형태로, 세포 또는/및 배양 배지로부터 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 회수하는 단계,
- 임의로 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 가용화하는 및/또는 재폴딩하는 단계,
- 히스티딘-태그를 포함하는 가용화된 및/또는 재폴딩된 폴리펩티드를 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법으로 정제하여 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 단계.
하나의 구현예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질은 소수성 리간드가 부착된 아가로오스의 매트릭스를 포함한다. 또다른 구현예에서, 리간드는 n-, 이소- 또는 네오-지방족 또는 올리고 알킬렌 글리콜로부터 선택된다. 추가의 구현예에서, 리간드는 프로필-, 부틸-, 펜틸-, 헥실-, 헵틸-, 옥틸-, 폴리(에틸렌 글리콜)-, 및 폴리(프로필렌 글리콜)-기로부터 선택된다. 추가의 구현예에서, 리간드는 페닐-리간드이고, 회수 단계 중의 제 2 용액은 이미다졸 또는 이미다졸-유도체 외에 2-프로판올을 포함한다.
발명의 상세한 설명
본원에는 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터의 폴리펩티드의 회수가 히스티딘과 같은 이미다졸 또는 이미다졸 유도체를 포함하는 용액으로 실시되는 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드의 정제를 위한 결합-및-용리 방식으로 조작되는 측정가능한 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법이 보고된다. 상기 용리 시스템을 사용함으로써, 2-프로판올과 같은 유기 용매를 함유하는 용리 완충액의 실행이 선택도 및 수율의 손실 없이 회피될 수 있다.
"~ 에 적용하는" 이라는 용어 및 이의 문법적 등가물은 정제되어야 할 관심의 성분을 함유하는 용액이 정지상과 접촉되는 정제 방법의 일부 단계를 나타낸다. 이것은 a) 용액을 정지상이 위치하는 크로마토그래피 장치에 첨가하는 것, 또는 b) 정지상을 관심의 성분을 포함하는 용액에 첨가하는 것을 나타낸다. 경우 a) 에서 정제되어야 할 관심의 성분을 함유하는 용액은 정지상을 통과하여 정지상과 용액 중의 성분 사이의 상호작용을 가능하게 한다. 예를 들어, pH, 전도도, 염 농도, 온도, 및/또는 유속과 같은 조건에 따라, 용액의 일부 성분은 정지상에 결합되고, 그러므로 용액으로부터 제거된다. 다른 성분은 용액에 남아있다. 용액에 남아있는 성분은 관류에서 발견될 수 있다. "관류 (flow-through)" 는 그 기원과 상관없이 크로마토그래피 장치의 통과 후 수득된 용액을 나타낸다. 이것은 관심의 성분 또는 완충액을 함유하는 적용된 용액일 수 있고, 이것은 컬럼을 플러쉬하는데 사용되거나 정지상에 결합된 하나 이상의 성분의 용리를 야기하는데 사용된다. 하나의 구현예에서, 크로마토그래피 장치는 컬럼, 또는 카세트이다. 관심의 성분은 정제된 또는 심지어 실질적으로 균질한 형태로 관심의 성분을 수득하기 위한 예를 들어 침전, 염석, 한외여과, 정용여과, 동결건조, 친화성 크로마토그래피, 또는 용매 부피 감소와 같은 당업자에게 친숙한 방법에 의해 정제 단계 후에 용액으로부터 회수될 수 있다. 경우 b) 에서, 정지상은 예를 들어 고체로서, 정지상과 용액 중의 성분 사이의 상호작용을 가능하게 하는 정제되어야 할 관심의 성분을 함유하는 용액에 첨가된다. 상호작용 후, 정지상은 예를 들어, 여과에 의해 제거되고, 관심의 성분은 정지상에 결합되어 이와 함께 용액으로부터 제거되거나 관심의 성분은 정지상에 결합되지 않고 용액 내에 남아있다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 "완충된" 이라는 용어는 산성 또는 염기성 성분의 첨가 또는 방출로 인한 pH 의 변화가 완충제 성분에 의해 대등해지는 용액을 나타낸다. 이러한 효과를 야기하는 임의의 완충제 성분이 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 완충제 성분은 인산 또는 이의 염, 아세트산 또는 이의 염, 시트르산 또는 이의 염, 모르폴린, 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 또는 이의 염, 이미다졸 또는 이의 염, 히스티딘 또는 이의 염, 글리신 또는 이의 염, 또는 트리스 (히드록시메틸) 아미노메탄 (TRIS) 또는 이의 염으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 완충제 성분은 이미다졸 또는 이의 염 또는 히스티딘 또는 이의 염으로부터 선택된다. 임의로 완충액은 또한 부가적인 무기 염을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 무기 염은 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 시트르산나트륨 및 시트르산칼륨으로부터 선택된다.
"폴리펩티드" 는 자연적으로 또는 합성적으로 제조되든 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 이루어진 중합체이다. 약 20 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩티드는 "펩티드" 로서 언급될 수 있는 반면, 2 개 이상의 폴리펩티드로 이루어지는 또는 100 개 초과의 아미노산 잔기의 하나의 폴리펩티드를 포함하는 분자는 "단백질" 로서 언급될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 비-아미노산 성분, 예컨대 탄수화물 기, 금속 이온, 또는 카르복실산 에스테르를 포함할 수 있다. 비-아미노산 성분은 폴리펩티드가 발현되는 세포에 의해 첨가될 수 있고, 세포의 유형에 따라 가변될 수 있다. 폴리펩티드는 이들의 아미노산 골격 구조 또는 이를 코딩하는 핵산에 관련해 본원에 정의된다. 탄수화물 기와 같은 부가는 일반적으로 구체화되지 않으나, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
"결합-및-용리 방식" 이라는 용어는 크로마토그래피 정제 방법을 수행하기 위한 방식을 나타낸다. 정제되어야 할 관심의 폴리펩티드를 함유하는 용액은 정지상, 특히 고체상에 적용되어, 이에 의해 관심의 폴리펩티드는 정지상과 상호작용하고, 그곳에 보유된다. 관심이 없는 성분은 관류 또는 상청액 각각과 함께 제거된다. 관심의 폴리펩티드는 이후 용리액을 적용함으로써 제 2 단계에서 정지상으로부터 회수된다.
"단량체 형태의 폴리펩티드" 라는 용어는 두번째 폴리펩티드 분자와 연합되지 않은, 즉, 동일한 종류의 또는 상이한 종류의 또다른 폴리펩티드 분자에 공유적으로 또는 비-공유적으로도 결합되지 않은 폴리펩티드를 나타낸다. "응집된 형태의 폴리펩티드" 라는 용어는 하나 이상의 부가적인 폴리펩티드와 공유적으로 또는 비-공유적으로 연합되고, 크기 배제 크로마토그래피 컬럼으로부터 단일 피크로 용리되는 폴리펩티드를 나타낸다. "단량체 형태의" 라는 용어는 반드시 폴리펩티드의 100% (크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되는 바와 같이) 가 단량체 형태로 존재하는 것을 나타낼 필요는 없다. 이것은 게다가 폴리펩티드가 본질적으로 단량체 형태인, 즉, 폴리펩티드의 적어도 90% (크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되는 바와 같이) 가 단량체 형태인, 또는 폴리펩티드의 95% 이상이 단량체 형태인, 또는 폴리펩티드의 98% 이상이 단량체 형태인, 또는 폴리펩티드의 99% 이상이 단량체 형태인, 또는 특히 폴리펩티드의 99% 초과 (크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되는 바와 같이) 가 단량체 형태인 것을 나타낸다. "단량체 및 응집된 형태" 라는 용어는 다른 폴리펩티드 분자와 연합되지 않은 폴리펩티드 분자 및 다른 폴리펩티드 분자와 연합된 폴리펩티드 분자의 혼합물을 나타낸다. 상기 혼합물에는 단량체 형태 또는 응집된 형태만이 존재한다.
"봉입체" 라는 용어는 진핵 세포의 모든 세포 성분을 포함하는 총 세포 단백질의 상당한 부분을 구성하는 응집된 관심의 폴리펩티드의 밀집된 세포내 덩어리를 나타낸다.
"변성된" 이라는 용어는 이들이 고유의 것이 아닌 이차, 삼차 및/또는 사차 구조를 갖는 폴리펩티드의 형태를 나타낸다. 상기 비-고유 형태의 폴리펩티드는 가용성이나 부수적으로 생물학적으로 비활성인 형태일 수 있다. 또는 폴리펩티드는 불용성이고 예를 들어, 미스매치된 또는 제대로 형성되지 않은 디술피드 결합을 갖는 생물학적으로 비활성인 형태일 수 있다. 상기 불용성 폴리펩티드는 봉입체에 함유될 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없다.
"재폴딩된" 이라는 용어는 변성된 형태로부터 수득된 폴리펩티드를 말한다. 전형적으로, 재폴딩의 목적은 재폴딩 단계 없이 생성되는 경우 단백질이 가질 것보다 높은 수준의 활성을 갖는 단백질을 제조하는 것이다. 폴딩된 단백질 분자는 최소 자유 에너지를 갖는 형태에서 가장 안정하다. 대부분의 수용성 단백질은 대부분의 소수성 아미노산이 물과 떨어져 분자의 내부에 있는 방식으로 폴딩된다. 단백질을 함께 유지시키는 약한 결합은 폴리펩티드가 비폴딩되게 하는, 즉, 변성되게 하는 다수의 처리에 의해 방해될 수 있다. 융합된 단백질은 이온 결합, 반 데르 발스 (Van der Waals) 상호작용, 수소 결합, 디술피드 결합 및 공유 결합을 비롯한, 아미노산 그 자체와 이들의 환경 사이의 여러 종류의 상호작용의 생성물이다.
본원에서 사용되는 "변성된 (denatured/denaturized)" 이라는 용어는 고유의 또는 재폴딩된 상태로 분자 내에 존재하는 이온 및 공유 결합 및 반 데르 발스 (Van der Waals) 상호작용이 방해를 받은 폴리펩티드를 말한다. 폴리펩티드의 변성은 예를 들어, 8 M 우레아, 메르캅토에탄올과 같은 환원제, 열, pH, 온도 및 다른 화학약품으로의 처리에 의해 달성될 수 있다. 8 M 우레아와 같은 시약은 수소 결합 및 소수성 결합 모두를 방해하며, 메르캅토에탄올이 또한 첨가되는 경우, 시스테인 사이에 형성된 디술피드 가교 (S-S) 는 2 개의 -S-H 기로 환원된다. 디술피드 연결을 이들의 고유의 또는 재폴딩된 상태로 함유하는 폴리펩티드의 재폴딩은 또한 단백질에 대해 디술피드 결합을 재형성하도록 하는 시스테인 잔기 상에 존재하는 -S-H 기의 산화를 포함할 수 있다.
일반적으로, 소수성 상호작용 크로마토그래피의 위치는 폴리펩티드의 다단계 정제 순서로 가변적이다.
폴리펩티드의 정제 방법은 잘 성립되어 있고 널리 사용된다. 이들은 단독 또는 조합으로 사용된다. 이러한 방법은 예를 들어, 복합체 금속 이온이 있는 티올 리간드 (예를 들어, Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질로의) 또는 미생물-유래 단백질 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피) 을 사용하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 양이온 교환 (카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합 방식 교환 크로마토그래피), 친황성 흡착 (예를 들어, 베타-메르캅토에탄올 및 기타 SH 리간드로의), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어, 페닐-세파로오스, 아자-친아레노성 수지, 또는 m-아미노페닐보론산으로의), 크기 배제 크로마토그래피, 및 분취용 전기영동 방법 (예컨대 젤 전기영동, 모세관 전기영동) 이다.
면역글로불린의 정제 방법은 일반적으로 다단계 크로마토그래피 부분을 포함한다. 제 1 단계에서 비-면역글로불린 폴리펩티드 및 단백질은 예를 들어, 단백질 A 로의 친화성 크로마토그래피에 의해 면역글로불린 분획으로부터 분리된다. 이후 이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 개별 면역글로불린 계열을 분열시키고 제 1 컬럼으로부터 함께 용리된 미량의 단백질 A 를 제거할 수 있다. 최종적으로 제 3 크로마토그래피 단계는 면역글로불린 단량체를 동일한 계열의 다량체 및 절편으로부터 분리하는데 필요하다. 종종 응집물의 양은 많고 (5% 이상), 제 3 정제 단계에서 이들을 효과적으로 분리하는 것은 가능하지 않아 추가 정제 단계를 필요로 한다.
히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드가 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 용액으로 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터 회수될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 상기 발견은 이미다졸 또는 이미다졸-유도체가 일반적으로 금속 친화성 크로마토그래피 물질으로부터 히스티딘-태그를 가진 폴리펩티드를 회수하는데 사용되나 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터는 아닌 것이므로 매우 놀라웠다. 금속 친화성 크로마토그래피 물질을 사용함으로써 모든 상기 상이한 형태가 히스티딘-태그를 포함하고 금속 친화성 크로마토그래피 물질에 결합되므로 올바르게 폴딩된, 응집된, 부분적으로 폴딩된, 및 비폴딩된 폴리펩티드 형태 사이를 구별하는 것은 가능하지 않다. 그러나, 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질을 사용함으로써 상기 가깝게 관련된 폴리펩티드 형태를 분해하는 것이 가능하다는 것이 밝혀졌다. 동시에 상기 크로마토그래피 물질은 산업적 제조 규모 분리를 위해 충분한 결합 용량을 갖는다.
그러므로, 본원에는 제 1 양상으로서 하기 단계를 포함하는, 히스티딘-태그를 가진 폴리펩티드의 정제 방법이 보고된다:
- 히스티딘-태그를 가진 폴리펩티드를 포함하는 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계, 및
- 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 용액으로 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 회수하여 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 단계.
이미다졸 또는 이미다졸-유도체가 결합된 폴리펩티드의 회수에 사용되므로 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용된 폴리펩티드를 포함하는 용액에는 이미다졸 및 임의의 이미다졸-유도체가 없다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질 상에 보유된 폴리펩티드는 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 용액으로 회수된다. 상기 방법은 결합-및-용리 방식으로 작동되며, 즉, 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드는 먼저 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 결합되고 이후 추가의 단계에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터 회수된다. 간헐적 세정 단계가 본원에 보고된 방법에 포함될 수 있다. 상기 세정 단계에서, 적용된 용액(들) 에는 이미다졸 및 이미다졸 유도체가 없다.
본원에 보고된 방법에서 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 회수하기 위한 용액을 제외하고는, 모든 용액은 이미다졸 또는 이미다졸-유도체가 없다, 즉 이를 함유하지 않는다. 하나의 구현예에서, 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 용액은 수용액이다. 추가의 구현예에서, 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 용액은 유기 용매 및/또는 지방족 알콜을 포함하지 않는다, 즉 유기 용매 및/또는 지방족 알콜이 없다. 추가의 구현예에서, 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 용액은 물, 이미다졸 또는 이미다졸-유도체, 완충제 성분, 및 임의로 1 또는 2 또는 3 개의 무기 염으로 이루어진다.
"이미다졸 또는 이미다졸-유도체" 라는 용어는 이미다졸, 치환된 이미다졸, 히스티딘, 및 히스티딘-유도체로부터 선택되는 화합물을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 이미다졸 또는 이미다졸-유도체는 이미다졸 및 히스티딘으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질은 소수성 리간드가 공유 연결된 아가로오스의 매트릭스를 포함한다. 추가의 구현예에서 리간드는 n-, 이소- 또는 네오-지방족 리간드, 또는 올리고 (알킬렌 글리콜)-리간드이다. 추가의 구현예에서, 리간드는 프로필-, 부틸-, 펜틸-, 헥실-, 헵틸-, 옥틸-, 폴리 (에틸렌 글리콜)-, 또는 폴리 (프로필렌 글리콜)-리간드이다. 하나의 구현예에서, 리간드는 폴리 (프로필렌 글리콜)-리간드이다. 또다른 구현예에서, 리간드는 페닐-리간드이고, 회수 단계 중의 용액은 부가적으로 2-프로판올을 포함한다.
"히스티딘-태그를 포함하는" 또는 "히스티딘-태그를 가진" 이라는 용어는 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 히스티딘 잔기의 연속 서열의 존재를 나타낸다. 히스티딘-태그는 각각의 말단에 직접적으로 또는 최대로 각각의 말단의 10 개 이하의 잔기일 수 있다. 히스티딘-태그 중의 히스티딘 잔기의 수는 3 개의 잔기 내지 10 개 이하의 잔기, 즉, 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10 개의 잔기이다. 하나의 구현예에서, 히스티딘 잔기의 수는 4 개의 잔기 내지 8 개 이하의 잔기이다.
본원에 보고된 양상의 하나의 구현예에서, 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드의 정제 또는 수득 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 제 1 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용하여 조건화된 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질을 제조하는 단계,
- 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 제 2 용액을 조건화된 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계,
- 임의로 제 3 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계,
- 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 제 4 용액으로 폴리펩티드를 회수하여 정제 또는 수득하는 단계.
제 1 내지 제 3 용액은 이미다졸 및 임의의 이미다졸-유도체가 없다.
히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드는 진핵 및 원핵 세포, 예컨대 CHO 세포, HEK 세포 및 E.콜라이 (E.coli) 에서 재조합적으로 제조될 수 있다. 폴리펩티드가 원핵 세포에서 생성되는 경우, 이것은 일반적으로 불용성 봉입체의 형태로 수득된다. 봉입체는 원핵 세포 및 배양 배지로부터 쉽게 회수될 수 있다. 봉입체 중의 불용성 형태로 수득된 폴리펩티드는 정제 및/또는 재폴딩 절차가 실시될 수 있기 전 가용화되어야만 한다. 일반적으로 금속 친화성 크로마토그래피는 예를 들어, 가용화 및/또는 재폴딩 후 수득되는 용액에 함유된 올바르게 폴딩된, 응집된, 부분적으로 폴딩된 및 비폴딩된 폴리펩티드 형태 사이를 구별할 수 없다. 이것은 상이한 폴리펩티드 형태 모두가 금속 친화성 크로마토그래피 물질과의 상호작용을 담당하는 히스티딘-태그를 포함한다는 사실로 인한 것이다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질이 이미다졸 또는 이미다졸-유도체 함유 용액이 회수에 사용되는 경우 상기 상이한 그러나 가깝게 관련된 폴리펩티드 형태를 분리할 수 있다는 것이 발견되었다. 상기 발견은 이미다졸 및 이미다졸-유도체가 일반적으로 킬레이팅 크로마토그래피 물질로부터 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 회수하는데 사용되므로, 절대적으로 예상치 못했다. 히스티딘-태그가 결핍된 폴리펩티드로의 대조군은 이미다졸 유도 회수의 효과가 히스티딘 태그를 포함하는 폴리펩티드에 특이적이었다는 것을 보여주었다.
그러므로, 본원에 보고된 제 2 양상은 하기 단계를 포함하는, 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법이다:
- 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 배양하는 단계,
- 원핵세포의 경우 임의로 봉입체의 형태로, 원핵 또는 진핵 세포 또는/및 배양 배지로부터 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 회수하는 단계,
- 임의로 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 가용화하는 및/또는 재폴딩하는 단계,
- 본원에 보고된 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법으로 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 정제하여 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 단계.
하나의 구현예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 제 1 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용하여 조건화된 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질을 제조하는 단계,
- 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 제 2 용액을 조건화된 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계,
- 임의로 제 3 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계,
- 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 제 4 용액으로 폴리펩티드를 회수하여 수득하는 단계,
제 1 내지 제 3 용액은 이미다졸 및 이미다졸-유도체가 없다.
하기 상이한 구현예에서, 이전에 보고된 모든 양상이 제시된다.
하나의 구현예에서, 제 1 용액은 제 1 완충제 성분을 포함하고, 제 2 용액은 제 2 완충제 성분을 포함하고, 제 3 용액은 제 3 완충제 성분을 포함하고, 제 4 용액은 제 4 완충제 성분을 포함하고, 제 4 완충제 성분은 이미다졸 또는 이미다졸 유도체이며, 단, 적어도 제 2 완충제 성분 및 제 3 완충제 성분 및 제 4 완충제 성분은 모두 상이한 완충제 성분이다. 하나의 구현예에서, 제 1 용액 및/또는 제 2 용액 및/또는 제 3 용액에는 이미다졸 및 이미다졸-유도체가 없다. 또다른 구현예에서 제 1 용액을 적용하는 것은 3 내지 20 컬럼 부피에 대한 것이다. 또다른 구현예에서 제 1 용액을 적용하는 것은 3 내지 10 컬럼 부피에 대한 것이다. 하나의 구현예에서 제 2 용액을 적용하는 것은 1 내지 10 컬럼 부피에 대한 것이다. 또다른 구현예에서 제 3 용액을 적용하는 것은 1 내지 10 컬럼 부피에 대한 것이다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 물질은 완충액으로 조건화된 제 1 단계에 있다. 상기 용액은 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하지 않는다. 조건화의 완충제 성분인 제 1 완충액은 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 제 2 용액의 완충제 성분과 동일 또는 상이할 수 있다.
이후 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 제 2 용액을 조건화된 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용한다. 본 단계에서, 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드는 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질 상에 보유된다. 상기 용액은 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하지 않는다. 로딩의 완충제 성분, 즉 제 2, 완충액은 제 3 용액의 완충제 성분과 동일 또는 상이할 수 있다.
히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드로의 크로마토그래피 물질의 로딩 후 임의로 세정, 즉, 제 3, 용액을 로딩된 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용할 수 있다. 상기 용액은 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하지 않는다.
최종적으로 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터의 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드의 회수를 위해 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 회수, 즉 제 4 용액을 크로마토그래피 물질에 적용한다.
하나의 구현예에서, 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드의 정제 또는 수득 방법은 컬럼 크로마토그래피 방법이다.
상이한 단계 중의 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용된 부피는 서로 독립적으로 3 내지 20 컬럼 부피이고, 하나의 구현예에서는 4 내지 10 컬럼 부피이다. 하나의 구현예에서 제 1 용액의 전도도는 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 제 2 용액의 전도도보다 및/또는 제 3 용액의 전도도 및/또는 제 4 용액의 전도도보다 높거나 또는 동일하다.
본원에 보고된 방법에서 용액의 pH 값은 pH 5 내지 pH 8 이다. 본원에 보고된 방법은 인슐린-유사 성장 인자-1 과 히스티딘-태그의 공액체로 실시예에서 예시된다. 이의 제조는 예를 들어, WO 2008/025527 (본원에 참조로서 인용됨) 에 보고된다. 상기 데이터는 단지 본 발명을 예시하기 위해 제시되며, 본 발명의 제한으로서 취급되어서는 안된다.
하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되고, 이의 참 범주는 특허청구범위에 언급된다. 본 발명의 취지에서 벗어남 없이 언급된 절차를 변경할 수 있는 것으로 이해된다.
도 1 10 컬럼 부피 중의 100 % 용리-완충액 까지의 선형 구배에 의해 20 mM 이미다졸로의 용리로 본원에 보고된 방법에 대한 총 소수성 상호작용 물질 (폴리 (프로필렌 글리콜) 리간드) 용리 크로마토그램; 작은 이미지: 조합 피크 분획의 분석 HPLC 크로마토그램.
도 2 10 컬럼 부피 중의 50 % 용리-완충액 까지의 선형 구배에 의해 20 mM 이미다졸로의 용리로 본원에 보고된 방법에 대한 총 소수성 상호작용 물질 (폴리 (프로필렌 글리콜) 리간드) 용리 크로마토그램; 작은 이미지: 조합 피크 분획의 분석 HPLC 크로마토그램.
도 3 100 % 용리-완충액 까지의 단계 용리에 의해 20 mM 이미다졸로의 용리로 본원에 보고된 방법에 대한 총 소수성 상호작용 물질 (폴리 (프로필렌 글리콜) 리간드) 용리 크로마토그램; 작은 이미지: 조합 피크 분획의 분석 HPLC.
도 4 20 컬럼 부피 중의 100 % 용리-완충액 까지의 선형 구배에 의한 100 mM 히스티딘으로의 용리로 본원에 보고된 방법에 대한 총 소수성 상호작용 물질 (폴리 (프로필렌 글리콜) 리간드) 용리 크로마토그램; 작은 이미지: 조합 피크 분획의 분석 HPLC 크로마토그램.
도 5 20 컬럼 부피 중의 100 % 용리-완충액 까지의 선형 구배에 의한 20 mM 히스티딘으로의 용리로 본원에 보고된 방법에 대한 총 소수성 상호작용 물질 (폴리 (프로필렌 글리콜) 리간드) 용리 크로마토그램; 작은 이미지: 조합 피크 분획의 분석 HPLC.
도 6 10 컬럼 부피 중의 50 % 용리-완충액 까지의 선형 구배에 의한 20 mM 이미다졸로의 용리로의 본원에 보고된 방법에 대한 총 소수성 상호작용 물질 (부틸 리간드) 용리 크로마토그램; 작은 이미지: 피크 분획의 분석 HPLC 크로마토그램.
도 7 10 컬럼 부피 중의 50 % 용리-완충액 까지의 선형 구배에 의한 20 mM 인산칼륨 완충액으로의 용리로의 총 소수성 상호작용 물질 (폴리 (프로필렌 글리콜) 리간드) 용리 크로마토그램; 작은 이미지: 관류 분획의 분석 HPLC 크로마토그램.
도 8 10 컬럼 부피 중의 50 % 용리-완충액 까지의 선형 구배에 의한 5 mM 이미다졸으로의 용리로의 본원에 보고된 방법에 대한 총 소수성 상호작용 물질 (페닐 리간드) 용리 크로마토그램; 작은 이미지: 피크 분획의 분석 HPLC 크로마토그램.
도 9 30 컬럼 부피 중의 100 % 용리-완충액 까지의 선형 구배에 의한 1.5 M 염화나트륨으로의 용리로의 본원에 보고된 방법에 대한 총 소수성 상호작용 물질 (폴리 (프로필렌 글리콜) 리간드) 용리 크로마토그램; 작은 이미지: 조합 피크 분획의 분석 HPLC 크로마토그램.
도 10 10 컬럼 부피 중의 50 % 용리-완충액 까지의 선형 구배에 의한 20 mM 이미다졸으로의 용리로의 본원에 보고된 방법에 대한 총 소수성 상호작용 물질 (폴리 (프로필렌 글리콜) 리간드) 용리 크로마토그램.
도 11 20 컬럼 부피 중의 100 % 용리-완충액 까지의 선형 구배에 의한 20 mM 인산칼륨 완충액으로의 용리로의 본원에 보고된 방법에 대한 총 소수성 상호작용 물질 (폴리 (프로필렌 글리콜) 리간드) 용리 크로마토그램.
실시예 1
물질 및 방법:
다르게 표시되지 않으면 상이한 크로마토그래피 방법은 크로마토그래피 물질 제조자의 매뉴얼에 따라 수행되었다.
재조합 DNA 기술:
표준 방법을 문헌 [Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 에 기재된 바와 같이 DNA 를 조작하는데 사용하였다. 분자 생물학 시약이 제조자의 지침에 따라 사용되었다.
단백질 측정:
단백질 농도는 아미노산 서열에 근거하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 320 nm 의 참조 파장으로 280 nm 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 측정되었다.
크기-배제- HPLC :
크로마토그래피를 ASI-100 HPLC 시스템 (Dionex, Idstein, Germany) 상의 Tosoh Haas TSK 3000 SWXL 컬럼으로 실행하였다. 용리 피크를 UV 다이오드 어레이 검출기 (Dionex) 에 의해 280 nm 에서 모니터링하였다. 1 mg/ml 로 농축된 샘플의 용해 후 컬럼을 안정한 기준선이 달성될 때까지 200 mM 인산이수소칼륨 및 250 mM 염화칼륨으로 이루어지는 완충액 (pH 7.0) 으로 세정하였다. 분석 실행을 30 분에 걸쳐 실온에서 0.5 ml/분의 유속을 사용하는 등용매 조건 하에서 수행하였다. 크로마토그램을 Chromeleon (Dionex, Idstein, Germany) 으로 수동으로 통합하였다.
역상 HPLC ( RP - HPLC ):
순도를 RP-HPLC 에 의해 분석하였다. 어세이를 아세토니트릴/수성 TFA 구배를 사용하는 Phenomenex C18 컬럼 상에서 수행한다. 용리 프로파일을 215 nm 에서의 UV 흡광도로서 모니터링한다. 용리된 성분의 백분율을 용리된 단백질의 총 피크 면적에 대해 계산한다 .
DNA -역치-시스템:
예를 들어, Merrick, H., and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403 을 참조한다.
숙주 세포 단백질 측정:
마이크로 타이터 플레이트의 웰의 벽을 혈청 알부민과 스트렙타비딘 (Streptavidin) 의 혼합물로 코팅한다. HCP 에 대항하는 염소 유래 폴리클론 항체를 마이크로 타이터 플레이트의 웰의 벽에 결합시킨다. 세정 단계 후, 마이크로 타이터 플레이트의 상이한 웰을 샘플 용액 및 상이한 농도의 HCP 보정 순서와 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 후 결합되지 않은 샘플 물질을 완충액으로의 세정에 의해 제거한다. 검출을 위해 웰을 결합된 숙주 세포 단백질을 검출하기 위한 항체 퍼옥시다아제 공액체와 인큐베이션한다. 고정된 퍼옥시다아제 활성을 ABTS 로의 인큐베이션 및 405 nm 에서의 검출에 의해 검출한다.
DNA 측정:
비오틴을 마이크로타이터 플레이트에 결합시켰다. 스트렙타비딘, 단일-가닥 DNA 및 비오티닐화 단일-가닥 DNA 결합 단백질의 반응 혼합물을 첨가하였다. 결합 단백질은 DNA 에 결합될 수 있고 비오티닐화되었다. 상기 방식으로 샘플 혼합물로부터 DNA 를 특이적으로 제거하는 것이 가능하였다. 스트렙타비딘은 마이크로타이터 플레이트 상의 비오틴 뿐 아니라 단일-가닥 DNA 결합 단백질에 커플링된 비오틴에 결합되었다. 우레아제에 커플링된 DNA-특이적 항체를 상기 총 착물에 첨가하였다. 우레아의 첨가는 pH 의 국부적 변화를 일으키는 우레아의 가수분해를 야기하였다. 상기 변화는 변경된 표면 전위로서 검출될 수 있다. 표면 전위의 변화는 결합된 DNA 의 양에 비례하였다. 단일 가닥 DNA 는 프로테이나아제 K 소화 및 SDS 로의 변성에 의해 수득되었다.
봉입체로부터 폴리펩티드의 단리, 가용화 및 재폴딩을 위한 일반적인 방법:
언급된 문헌에 수행된 방법 외에 봉입체의 제조는 예를 들어, Rudolph et al. (Rudolph, R., et al., Folding Proteins, In: T.E. Creighton (ed.): Protein function: A Practical Approach, 57-99 (1997)) 에 의한 방법에 따라 수행될 수 있다. 봉입체를 -70℃ 에 저장하였다. 봉입체의 가용화는 마찬가지로 Rudolph et al. (Rudolph, R., et al., Folding Proteins, In: T.E. Creighton (ed.): Protein function: A Practical Approach (1997) 57-99) 에 의한 방법에 따라 수행될 수 있다.
실시예 2
이미다졸 용리로의 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 상의 히스티딘-태그를 가진- IGF - I 의 정제
수지: TOYOPEARL? 폴리프로필렌글리콜-600; TOYOPEARL? PPG-600M (Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany)
로딩: a) 118 mg 폴리펩티드
b) 1034 mg 폴리펩티드
c) 1034 mg 폴리펩티드
컬럼 치수: a) 13 cm 높이, 11 ml 층 부피
b) 22 cm 높이, 108 ml 층 부피
c) 22 cm 높이, 108 ml 층 부피
평형-완충액/제 1 용액: 20 mM KH2PO4, 0.8 M NaCl, pH 3.5
세정-완충액 1/제 2 용액: 1 M TRIS-HCl, 0.15 M NaCl, pH 3.5
세정-완충액 2/제 3 용액: 20 mM KH2PO4, 0.8 M NaCl, pH 3.5
용리-완충액/제 4 용액: 20 mM 이미다졸, pH 9.7
용리-방법: a) 20 컬럼 부피 중의 100 % 용리-완충액으로의 선형 구배
b) 10 컬럼 부피 중의 50 % 용리 완충액 까지의 선형 구배
c) 100 % 용리 완충액 까지의 단계 용리
결과:
도 1 내지 3 으로부터 볼 수 있듯이, 3 가지 사용된 용리 방법 중 임의의 것으로 히스티딘-태그를 가진-IGF-I 분자는 폴리 (프로필렌 글리콜) 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터 회수될 수 있다.
실시예 3
히스티딘 용리로의 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼에 대한 히스티딘-태그를 가진- IGF - I 의 정제
수지: TOYOPEARL? 폴리프로필렌글리콜-600; TOYOPEARL? PPG-600M (Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany)
로딩: 123 mg 폴리펩티드
컬럼 치수: 13 cm 높이, 11 ml 층 부피
평형-완충액/제 1 용액: 20 mM KH2PO4, 0.8 M NaCl, pH 3.5
세정-완충액 1/제 2 용액: 1 M TRIS-HCl, 0.15 M NaCl, pH 3.5
세정-완충액 2/제 3 용액: 20 mM KH2PO4, 0.8 M NaCl, pH 3.5
용리-완충액/제 4 용액: a) 100 mM 히스티딘, pH 9.7
b) 20 mM 히스티딘, pH 9.7
용리-방법: 20 컬럼 부피 중의 100 % 용리-완충액으로의 선형 구배
결과:
도 4 및 5 로부터 볼 수 있듯이, 2 가지 사용된 용리액 중 임의의 것으로 히스티딘-태그를 가진-IGF-I 분자는 폴리 (프로필렌 글리콜) 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터 회수될 수 있다.
실시예 4
이미다졸 용리로의 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 상의 히스티딘-태그를 가진- IGF - I 의 정제
수지: Capto™ 부틸 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)
로딩: 104 mg 폴리펩티드
컬럼 치수: 13.5 cm 높이, 10.7 ml 층 부피
평형-완충액/제 1 용액: 20 mM KH2PO4, 0.8 M NaCl, pH 3.5
세정-완충액 1/제 2 용액: 1 M TRIS-HCl, 0.35 M NaCl, 20 mM 시트르산, pH 3.5
세정-완충액 2/제 3 용액: 20 mM KH2PO4, 0.8 M NaCl, pH 3.5
용리-완충액/제 4 용액: 20 mM 이미다졸, pH 9.7
용리-방법: 10 컬럼 부피 중의 50 % 용리-완충액 까지의 선형 구배
결과:
도 6 으로부터 볼 수 있듯이, 히스티딘-태그를 가진-IGF-I 은 부틸 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터의 용리 완충액으로 회수될 수 있다.
실시예 5
비교예 - 인산염 용리로의 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 상의 히스티딘-태그를 가진- IGF - I 의 정제
수지: TOYOPEARL? 에테르-650M (Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany)
로딩: 102 mg 폴리펩티드
평형-완충액/제 1 용액: 20 mM KH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.0
세정-완충액 1/제 2 용액: 20 mM KH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.0
용리-완충액/제 4 용액: 20 mM KH2PO4, pH 7.0
용리-방법: 100 % 용리 완충액 까지의 단계 용리
결과:
도 7 로부터 볼 수 있듯이, 히스티딘-태그를 가진-IGF-I 분자는 인산염 함유 완충액으로 에테르 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질 단독으로부터 회수될 수 없다.
실시예 6
비교예 - 상이한 용리로의 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 상의 히스티딘-태그를 가진- IGF - I 의 정제
수지: a) 페닐 세파로오스™ (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)
b) TOYOPEARL? PPG-600M (Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany)
로딩: 80 mg 폴리펩티드
컬럼 치수: 14 cm 높이, 11 ml 층 부피
평형-완충액/제 1 용액: a) 20 mM KH2PO4, 0.8 M NaCl, pH 3.5
b) 20 mM KH2PO4, 1.5 M NaCl, pH 3.5
세정-완충액 1/제 2 용액: a) 1 M TRIS-HCl, 0.35 M NaCl, 20 mM 시트르산, pH 3.5
b) -
세정-완충액 2/제 3 용액: a) 20 mM KH2PO4, 0.8 M NaCl, pH 3.5
b) 20 mM KH2PO4, 1.5 M NaCl, pH 3.5
용리-완충액/제 4 용액: a) 5 mM 이미다졸, 20 % (v/v) 2-프로판올, pH 7.0
b) 1.5 M NaCl, 20 % (v/v) 2-프로판올, pH 3.5
용리-방법: a) 10 컬럼 부피 중의 50 % 용리-완충액 까지의 선형 구배
b) 30 컬럼 부피 중의 100 % 용리 완충액 까지의 선형 구배
결과:
도 8 에서 볼 수 있듯이 히스티딘-태그를 가진-IGF-I 은 페닐 세파로오스™ 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터 이미다졸 및 2-프로판올 함유 용리 완충액으로 급격한 피크로 회수될 수 있다. 이것은 이미다졸이 없는 용리 완충액으로 달성될 수 없다 (도 9 참조).
실시예 7
비교예 - 이미다졸 용리로의 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 상의 히스티딘-태그를 가진- IGF - I 의 정제
수지: Capto™ 페닐 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)
로딩: 117 mg 폴리펩티드
컬럼 치수: 13.5 cm 높이, 10.7 ml 층 부피
평형-완충액/제 1 용액: 20 mM KH2PO4, 0.8 M NaCl, pH 3.5
세정-완충액 1/제 2 용액: 1 M TRIS-HCl, 0.35 M NaCl, 20 mM 시트르산, pH 3.5
세정-완충액 2/제 3 용액: 20 mM KH2PO4, 0.8 M NaCl, pH 3.5
용리-완충액/제 4 용액: 20 mM 이미다졸, pH 9.7
용리-방법: 10 컬럼 부피 중의 50 % 용리-완충액 까지의 선형 구배
결과:
도 10 으로부터 볼 수 있듯이, 히스티딘-태그를 가진-IGF-I 은 페닐 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터 용리 완충액으로 회수될 수 없다.
실시예 8
비교예 - 이미다졸 용리로의 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 상의 Herceptin? 의 정제
배양 상청액을 pH 3.5 및 0.8 mol/l 의 NaCl 농도로 조정하고 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용하기 전에 Sartobran P 필터를 통해 여과한다.
수지: TOYOPEARL? 폴리프로필렌글리콜-600; TOYOPEARL? PPG-600M (Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany)
로딩: 189 mg 폴리펩티드
컬럼 치수: 16 cm 높이, 12.6 ml 층 부피
평형-완충액/제 1 용액: 20 mM KH2PO4, 0.8 M NaCl, pH 3.5
세정-완충액 1/제 2 용액: 1 M TRIS-HCl, 0.35 M NaCl, 20 mM 시트르산, pH 3.5
용리-완충액/제 4 용액: a) 20 mM 이미다졸, pH 9.7
b) 20 mM KH2PO4, pH 8.9
용리-방법: a) 10 컬럼 부피 중의 50 % 용리-완충액 까지의 선형 구배
b) 20 컬럼 부피 중의 100 % 용리 완충액 까지의 선형 구배
결과:
Herceptin? 의 분획은 이미다졸 용리에 의한 관류에서 발견될 수 있다. 추가 분획은 용리 시작 시 작은 피크로서 컬럼으로부터 회수될 수 있다. 이와 반대로, 도 11 에 제시되는 바와 같이, 인산염 완충액으로의 용리에 의해 Herceptin? 은 급격한 피크로서 수득될 수 있다.

Claims (7)

  1. 하기 단계를 포함하는, 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드의 정제 방법:
    - 히스티딘-태그를 가진 폴리펩티드를 포함하는 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계, 및
    - 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 용액으로 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 회수하여 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 단계.
  2. 하기 단계를 포함하는, 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법:
    - 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 배양하는 단계,
    - 세포 또는/및 배양 배지로부터 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 회수하는 단계,
    - 하기 단계를 포함하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법으로 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 단계:
    - 히스티딘-태그를 가진 폴리펩티드를 포함하는 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계, 및
    - 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질로부터 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 용액으로 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 회수하여 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 단계.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질이 소수성 리간드가 부착된 아가로오스의 매트릭스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 리간드가 프로필-, 부틸-, 펜틸-, 헥실-, 헵틸-, 옥틸-, 폴리(에틸렌 글리콜)- 또는 폴리(프로필렌 글리콜)-리간드인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 리간드가 페닐-리간드이고, 회수 단계 중의 용액이 2-프로판올을 부가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    - 제 1 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계,
    - 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 제 2 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계, 및
    - 이미다졸 또는 이미다졸-유도체를 포함하는 제 4 용액으로 히스티딘-태그를 포함하는 폴리펩티드를 회수함으로써 제조 또는 정제하는 단계,
    제 1 용액은 제 1 완충제 성분을 포함하고, 제 2 용액은 제 2 완충제 성분을 포함하고, 제 4 용액은 제 4 완충제 성분을 포함하고, 제 4 완충제 성분은 이미다졸 또는 이미다졸 유도체이고, 제 2 완충제 성분 및 제 4 완충제 성분은 상이한 완충제 성분임.
  7. 제 6 항에 있어서, 제 2 용액의 적용 후 및 회수 전에 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    - 제 3 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계,
    제 3 용액은 제 3 완충제 성분을 포함하고, 제 2 완충제 성분, 및 제 3 완충제 성분, 및 제 4 완충제 성분은 모두 상이한 완충제 성분임.
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