CN101268185B - 因子ⅶ多肽的疏水作用色谱纯化 - Google Patents
因子ⅶ多肽的疏水作用色谱纯化 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101268185B CN101268185B CN200680031951.9A CN200680031951A CN101268185B CN 101268185 B CN101268185 B CN 101268185B CN 200680031951 A CN200680031951 A CN 200680031951A CN 101268185 B CN101268185 B CN 101268185B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fvii
- factor vii
- salt
- drug substance
- vii polypeptides
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
Abstract
本发明涉及因子VII多肽的疏水作用色谱(HIC)纯化方法。所述方法利用了疏水作用色谱材料和特定浓度的盐或两性离子或二者的组合。
Description
技术领域
本发明涉及因子VII多肽的疏水作用色谱(HIC)纯化方法。所述方法利用了疏水作用色谱材料和特定浓度的盐或两性离子或二者的组合。
背景技术
在凝血级联中涉及的蛋白质,例如因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和蛋白质C,证实为用于治疗多种病理状态的有用治疗试剂。因此,对含有这些药学上可接受的并表现出统一的预计疗效的蛋白质的制剂存在持续增长的需求。在某些情况下,因子VII多肽药物物质的整体工业规模纯化方法受以下缺点的困扰,即所述药物物质含有相当多量的与产物相关(与因子VII相关)的杂质(例如在后洗脱峰中含有的杂质(包括具有不同水平的N-连接糖基化(”des-N-多糖形式)的糖变体)、氧化形式、蛋白水解降解形式(重链切割形式),或者具有比所关心的因子VII多肽更高的分子量的聚集体)。这当然是所不希望的,并且在一些情况下还是不可接受的。
论文“Amino acid sequence and posttranslational modifications ofhuman因子VIIa from plasma and transfected baby hamster kidney cells”,Biochemistry,1988 Oct 4;27(20):7785-93,报道了一些重链降解产物与完整活化因子VII的共纯化。
论文“FVIIa derivatives obtained by autolytic and controlled cathepsinG mediated cleavage”.FEBS Lett.1993 Feb 15;317(3):245-9,指出在非变性条件下因子VII的重链切割形式不能与因子VII分离。
US 6,777,390(Baxter)关注的是通过AIEX以及随后在苯基-琼脂糖上的疏水色谱从冷冻上清液中纯化因子VII。
就本发明人所知,现有技术仍未解决在工业规模加工处理方法中从FVII多肽药物物质中除去产物相关杂质的问题。
发明内容
本发明提供了用于减少经重组制得的FVII多肽药物物质中的产物相关杂质(product-related impurity)的方法,更具体地为提供了用于纯化因子VII多肽药物物质(a drug substance of a Factor VII polypeptide)的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)在促进一部分所述药物物质与疏水作用色谱材料相结合的条件下,使所述药物物质与所述疏水作用色谱材料相接触,所述药物物质含有盐和/或两性离子,其浓度为0.0M~0.1M或0.5M至相应盐的85%饱和浓度;
(b)可选地用淋洗缓冲液淋洗所述疏水作用色谱材料;和
(c)用洗脱缓冲液洗脱所述疏水作用色谱材料,并收集作为洗出液的经纯化的因子VII药物物质;
因此,与在步骤(a)中加入的药物物质相比,由此处所限定的方法所确定的产物相关杂质含量减少至少50%(w/w)。
附图说明
图1是在TSK-凝胶苯基5PW上进行rhFVII分离的色谱图,参见实施例1。
图2是在TSK苯基5PW上进行FVIIa类似物分离的色谱图,参见实施例3。
图3描述了贯穿整个产物峰的杂质洗脱,参见实施例3。
图4是在TSK苯基5PW上进行FVIIa类似物分离的色谱图,参见实施例4。
图5描述了HIC上样样品的SDS-PAGE,显示出在185、140和90kDa处的高分子量化合物。
图6描述了HIC收集液的SDS-PAGE,显示出在185、140和90kDa处的高分子量化合物已基本被清除。
图7是在TSK-凝胶苯基5PW上进行rhFVII分离的色谱图,参见实施例6。
图8是描述GD-FVII的部分移除的SDS-PAGE凝胶。道1:mw标准样,道2:上样样品,道3:前导带,道4:主峰,道5:后缘带,参见实施例6。
图9描述了FVII及其产物相关杂质的HPLC色谱图。
图10描述了通过在20℃下采用TSK苯基5PW对FVIIa的HIC纯化而实现的后洗脱峰(late eluting peaks)和其他产物相关杂质的减少。
具体实施方式
本发明人现在已发现通过进行其中使用盐和/或两性离子的特定疏水作用色谱法,有可能减少或者事实上去除在药物物质中存在的某些产物相关杂质。具体而言,可以减少杂质的存在,所述杂质例如是含有在(人类FVII)的Asn145和/或Asn322位点上没有N-多糖的N-糖变体的“后洗脱峰”。
本发明提供了采用疏水作用色谱进行因子VII多肽药物物质纯化的方法,参见权利要求1。
因此,本发明的方法尤其涉及最初含有可观量的后洗脱峰,即至少占因子VII多肽总量2%(w/w)的后洗脱峰收集液的因子VII多肽药物物质。应当理解,在一些情况下,工业规模的因子VII多肽药物物质甚至可含有更大量的后洗脱峰,例如至少3%,诸如至少4%,或者至少5%,有些时候多至约10%~12%的后洗脱峰,并且,本发明的方法还进一步涉及这些药物物质。该药物物质可直接通过发酵方法获得,但更常见的是作为起始粗产物纯化的结果。
本发明进一步涉及因子VII多肽药物物质,所述因子VII多肽药物物质初始含有可观量的氧化形式、蛋白降解形式和/或具有比所关心的因子VII多肽分子量更高的聚集体,即至少占因子VII多肽总量2%(w/w)的蛋白降解形式和/或至少占因子VII多肽总量1%(w/w)的氧化形式的收集液。
当与因子VII多肽联合使用时,产物相关杂质(例如后洗脱峰)的百分比(%)被表述为总蛋白(产物+产物相关杂质)含量的重量百分比。因此,产物相关杂质(例如后洗脱峰)减少二分之一,例如从2%至1%,等同于相对减少50%;例如从8%减少至2%则表示减少至四分之一,即相对减少75%;从12%减少至6%等同于产物相关杂质的量减少二分之一(即减少了50%),而不是减少了6个百分点。
术语“产物相关杂质”包括但不局限于具有不同水平的N-连接糖基化的糖变体(包括例如在人类FVII的Asn145和/或Asn322位点缺失一个或多个N-连接多糖的因子VII多肽)、氧化形式、蛋白降解形式(所述分子的重链的自催化降解)和具有比所关心的因子VII多肽更高的分子量的聚集体(包括二聚体、寡聚体、聚合物)。
虽然后洗脱峰的准确化学组成部分未知,表述“后洗脱峰”是指具有比所关心的因子VII多肽更长的相对保留时间的因子VII多肽相关结构,可能为不需要的糖形式,例如为其中所述因子VII多肽缺失一个或多个(例如一个或两个)N-连接多糖的形式。
所述“后洗脱峰”的“相对保留时间”(相对于所关心的FVII多肽,例如rFVIIa)采用在下面的一般方法中所描述的RP-HPLC分析进行测定。
为进行定量,这些“后洗脱峰”的相对保留时间(RR)通过RP-RPLC分析方法确定通常为1.040~1.300(所述rFVIIa主要峰为1.000)。
后洗脱峰在因子VII多肽药物物质中的含量可根据以下一般方法中所描述的进行测定。
因子VII多肽的氧化形式、蛋白降解形式和高分子量形式(二聚体、寡聚体、聚集体)在所述多肽药物物质中的含量可根据以下一般方法中所描述的进行测定。
虽然没有另外限制,本发明的方法对于“工业规模”(或“大规模”)因子VII多肽药物物质尤其可行。术语“工业规模”通常是指这样的方法:其中液体因子VII多肽组合物的体积至少为10L,例如至少50L,例如至少500L,或者至少5000L,或者其中所述产物的重量至少为1g(干物质),例如至少10g,例如至少50g,例如1g~1000g。
此处使用的表述“药物物质”指固体物质以及液体物质,例如含有所述因子VII多肽的溶液或悬浮液。表述“药物物质”尤其指“大”体积或质量,即指大规模和工业规模方法中的体积和质量。
术语“因子VII多肽”在下面进一步定义。
此处使用的表述“盐”是指一种或多种能使所述因子VII多肽相对疏水从而将与所述疏水作用色谱材料相结合的盐。盐的优选实例是选自由特别的阳离子和特别的阴离子的组合的那些盐。阳离子组包括铵、钠和钾,阴离子组包括硫酸盐、乙酸盐和氯化物。盐的例子有乙酸铵、硫酸铵、氯化铵、氯化钠、乙酸钠、硫酸钠、乙酸钾、氯化钾和硫酸钾。优选的盐是乙酸铵、硫酸铵、乙酸钠和氯化钠。另一组优选盐包括乙酸铵、硫酸铵和乙酸钠。
下表说明了一系列可用盐在20℃时的溶解度(饱和度)和对应于85%饱和度的摩尔浓度。
表述“两性离子”指同时带有负电荷和正电荷的离子,但其形成中性分子。可用的两性离子的实例是中性氨基酸,例如甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等,尤其是甘氨酸和β-丙氨酸。
步骤(a)-使所述药物物质与疏水作用色谱材料相接触
在所述方法的第一步中,在能促进因子VII多肽药物物质的一部分与疏水作用色谱材料相结合的条件下,使所述药物物质与所述疏水作用色谱材料相接触。所述药物物质应当以该对应盐的0.0M~0.1M或0.5M至85%饱和浓度(在上样溶液的温度下)的浓度含有盐和/或两性离子。目的在于促进一部分所述因子VII多肽药物物质与所述疏水色谱材料的结合。在特别优选的实施方式中,所述药物物质含有浓度为0.5M~85%饱和浓度,例如0.7M~2.2M的盐。
应当理解特定盐的饱和浓度(以及等同于85%饱和浓度的浓度)将随实际采用的温度而变化,例如在5℃时的饱和浓度通常低于在20℃时的饱和浓度。以上列出了具体的可用盐在20℃时的溶解度(饱和度)。其他盐在20℃时的溶解度以及在其他温度(例如5℃)时的溶解度可在普通化学手册中找到,例如CRC化学和物理手册(CRC出版社)(TheCRC Handbook of Chemistry and Physics(CRC Press))。作为另外一种选择,特定固体(盐)在水中溶解的溶解度曲线可便捷地通过以下过程确定,即将已知重量的盐溶解在变化的已知体积的水中,并在每种浓度下冷却所述溶液以确定所述盐开始结晶而从溶液中析出时的温度。即,对于确定重量的盐,水的量逐渐增加,并且测定对于每次增加达到饱和点所需的温度。对于每个饱和温度的盐的重量和水的重量代表在该温度下饱和溶液的浓度,并表示为g盐每100g水的形式。随后通过以g盐每100g水为y轴,饱和温度为x轴绘制出溶解度曲线。同样,固体的溶液度也可以表示为在一升液体中溶解的固体摩尔数,或者表示为所述固体的摩尔分数,或者如同在本试验中一样,表示为溶解在100mL液体中的固体克数。
应当理解术语“浓度为0.5M至对应盐的85%饱和浓度”是指在进行相关方法步骤(上样(a)、淋洗(b)、洗脱(c))的实际温度下,浓度为0.5M至特定盐的85%饱和浓度。
与步骤(a)相关的术语“部分”是指存在于所述因子VII多肽药物物质中的因子VII多肽的质量的至少30%(即30%~100%)。应当理解在大多数情况下,所希望的是结合远超过所述因子VII多肽的质量的30%,例如至少50%,或者至少70%,或者绝大部分。术语“绝大部分”指存在于所述因子VII多肽药物物质中的因子VII多肽的质量的至少90%。优选为甚至更多部分与所述疏水作用色谱材料相结合,例如所述质量的至少95%,或者所述质量的至少98%,或者所述质量的至少99%,乃至在所述因子VII多肽药物物质中存在的因子VII多肽的基本上全部的质量。
所述因子VII多肽的药物物质通常来源于工业规模的生产过程,例如细胞培养、微生物处理、克隆动物(例如牛、猪、绵羊、山羊和鱼)或者昆虫等,尤其是来源于细胞培养。
所述疏水作用色谱材料是用诸如乙基、丁基、苯基或己基(其有可能用于结合蛋白质)等疏水配体取代的基质。优选材料是用丁基和/或苯基配体取代的材料。所述材料最常见为小珠的形式,例如具有0.1μm~1000μm平均直径的微粒材料,或者为小棍、膜、球片、单块等形式。
所述疏水作用色谱材料最常见的装填方式为柱状形式。批量容器(batch container)中的装填形式当然也是可行的。
所述因子VII多肽药物物质通常直接由之前的纯化步骤获得,或者由之前的纯化步骤以及如果需要或者有益的话随后对pH、离子强度、二价金属离子的螯合等进行调节而获得。
所述因子VII多肽药物物质的接触通常根据传统方案进行,即所述药物物质的浓度、温度、离子强度等照常,所述疏水作用色谱材料可照常在使用前进行淋洗和平衡。
因子VII多肽的上样量通常为每升基质(HIC材料)至少250mg,例如为每升基质(湿润形式的疏水作用色谱材料)0.5g~10.0g,例如2.0g~5.0g因子VII多肽,并且所述药物物质通常以每小时1~50个柱体积的流量进行上样。
在加到所述疏水作用色谱材料之前和加到所述疏水作用色谱材料时,所述药物物质的pH对于后洗脱峰的形成似乎起到了相关作用。因此,优选所述药物物质为液体形式,并且在加到所述疏水作用色谱材料时具有3.0~10.0,例如3.0~7.0,或者6.5~10.0的pH。在一些令人感兴趣的实施方式中,所述药物物质具有4.0~7.0,或者7.0~9.0,或者4.5~8.5的pH。优选的pH范围为5.0~6.5。
钙离子的含量可能会对所述因子VII多肽的稳定性起作用。在一些优选实施方式中,在步骤(a)中的药物物质具有至少5mM,例如5mM~100mM的钙离子浓度。在这些情况下,优选的pH范围为5.0~9.5。
通常,电导率为至少40mS/cm,例如至少50mS/cm,例如至少100mS/cm例如至少200mS/cm。
所述药物物质的温度通常为0℃~25℃,例如大约2℃~10℃或2℃~8℃。
具有结合的因子VII多肽的疏水作用色谱材料的温度通常为0℃~25℃,例如大约2℃~10℃或2℃~8℃,例如通过采用受控温度冷却套和溶液将温度保持在特定范围内。
步骤(b)-淋洗步骤(可选)
在将所述因子VII多肽药物物质结合到所述疏水色谱材料上之后,通常可进行淋洗步骤(b)以从所述疏水作用色谱材料中除去所述后洗脱峰的基本部分。通过该步骤,在所述疏水作用色谱材料上的因子VII多肽的剩余(结合)部分将具有丰度大大降低的后洗脱峰。
在所述淋洗缓冲液中含有盐和/或两性离子也提供了某些优点。因此,优选地是,步骤(b)中的淋洗缓冲液以该对应盐的0.0M~0.1M或0.5M至85%饱和浓度的浓度含有盐和/或两性离子。最优选的是,淋洗缓冲液中的盐和/或两性离子的浓度为步骤(a)中的药物物质中的盐的浓度±0.1M的范围之内。在特别优选的实施方式中,所述淋洗缓冲液含有浓度为0.5M~85%饱和浓度,例如0.7M~2.2M的盐。
该淋洗步骤(b)优选为采用pH为2.0~6.9的淋洗缓冲液进行。在一些令人感兴趣的实施方式中,在施用于所述疏水作用色谱材料时,所述淋洗缓冲液具有3.0~10.0,例如3.0~7.0,或者6.5~10.0的pH。在一些令人感兴趣的实施方式中,所述淋洗缓冲液具有4.0~7.0,或者7.0~9.0,或者4.5~8.5的pH。
如同在上述步骤(a)中,钙离子的存在似乎起到某种作用。因此,步骤(b)中的淋洗缓冲液通常具有至少5mM,例如5mM~100mM的钙离子浓度。
所述淋洗步骤(b)通常以每小时1~50个柱体积的流量进行。
所述淋洗缓冲液通常为含有缓冲剂的水溶液,所述缓冲剂通常含有选自由MES、PIPES、ACES、BES、TES、HEPES、TRIS、组氨酸、咪唑、甘氨酸、双甘氨肽、甘氨酰胺、磷酸、乙酸(例如乙酸钠)、乳酸、戊二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、马来酸和琥珀酸的酸和盐组成的组的至少一种成分。应当理解的是所述缓冲剂可含有两种或两种以上成分的混合物,其中所述混合物能提供在特定范围内的pH值。例子可以举出乙酸和乙酸钠等。
应当理解的是所述淋洗步骤(b)可通过采用一种、两种或几种不同的淋洗缓冲液进行,或者通过采用梯度淋洗缓冲液进行。
还应当注意的是所述淋洗步骤和洗脱步骤不必为分开的步骤,而可以合二为一,尤其是在洗脱步骤中采用梯度洗脱缓冲液时。
步骤(c)-洗脱步骤
在洗脱步骤(c)之后,用洗脱缓冲液对所述疏水作用色谱材料进行洗脱,将经纯化的因子VII多肽药物物质作为洗出液进行收集。
可以对洗脱步骤(c)进行大量变化。关于前述步骤,所述洗脱缓冲液也优选含有盐和/或两性离子。
洗脱类型并非特别关键,因此,例如可以用具有逐步减少的所述盐和/或两性离子的梯度的洗脱缓冲液进行洗脱,或者用具有线性减少的所述盐的梯度(或者梯度-恒定-梯度形式,或者其他变化形式)的洗脱缓冲液进行洗脱,或者采用pH梯度,或者采用温度梯度,或者采用上述方式的组合。作为另外一种选择,钙螯合混合物(例如EDTA、柠檬酸盐、丙二酸盐等)的梯度溶液,或者比水极性更小的溶剂(例如含有乙醇、PEG、2-丙醇等的水溶液)也可用作洗脱缓冲液。
在一个实施方式中,所述洗脱缓冲液含有初始浓度为0.7M~2.2M的盐。
在一个实施方式中,所述洗脱缓冲液不含有钙螯合化合物。在另一个实施方式中,所述洗脱缓冲液不含有EDTA和/或柠檬酸盐。在一个实施方式中,所述洗脱缓冲液含有钙盐;在另一个实施方式中不含有钙盐。在一个实施方式中,本发明的方法在钙盐的存在下进行;在另一实施方式中,本发明的方法在没有钙盐的条件下进行。
因此,在目前最优选的实施方式中,步骤(c)中的洗脱缓冲液是铵盐的梯度缓冲液,其中所述梯度缓冲液的初始铵盐浓度为1.7M~2.2M,所述梯度缓冲液的最终铵盐浓度为0.0M~1.6M。
所述最终洗脱缓冲液的电导率优选低于含有步骤(a)的药物物质的组合物的电导率。
在大多数情况下,步骤(c)中的洗脱缓冲液通常具有如同步骤(a)和(b)中的pH。
还优选的是步骤(c)中的洗脱缓冲液具有至少5mM,例如5mM~100mM的钙离子浓度的实施方式。
洗脱步骤(c)通常以每小时1~50个柱体积的流量进行。
术语“经纯化的药物物质”指所得药物物质,即,在步骤(c)中收集的药物物质具有比在步骤(a)中加入的药物物质更低含量的产物相关杂质,例如后洗脱峰。术语“纯化”指可以得到经纯化的药物物质的方法,即本发明的方法。
通常,相比于-或者相对于药物物质中所述杂质的初始含量,本发明的方法能减少产物相关杂质(包括后洗脱峰)的含量至少50%,然而,更优选的,并且也实际的是该相对减少为至少60%,例如至少70%,乃至至少80%或者至少85%。
在一个实施方式中,所述产物相关杂质是后洗脱峰。在另一实施方式中,所述产物相关杂质是缺失一个或多个N-连接多糖的因子VII多肽。在其他实施方式中,所述产物相关杂质是氧化形式、蛋白降解形式(所述分子的重链的自催化降解)或具有比所关心的因子VII多肽更高的分子量的聚集体(包括二聚体、寡聚体、聚合物)。在另一实施方式中,所述产物相关杂质含有一种或多种以上所述形式、峰和多糖缺失形式的混合物。
此外,已发现本发明的方法非常有效地使其能从因子VII多肽药物物质中除去产物相关杂质,例如后洗脱峰,并且还使其能抑制这些后洗脱峰的形成。
因此,在优选实施方式中,与步骤(a)中的药物物质相比,在步骤(c)中收集的经纯化的因子VII多肽药物物质含有少于50%的后洗脱峰,例如少于40%,或者少于30%。
在一个实施方式中,与步骤(a)中的药物物质相比,在步骤(c)中收集的经纯化的因子VII多肽药物物质中的氧化形式的含量减少至少35%,诸如至少40%或45%。在另一实施方式中,与步骤(a)的药物物质相比,在步骤(c)中收集的经纯化的因子VII多肽药物物质中的蛋白降解形式的含量减少至少30%,诸如至少32%或38%。在另一实施方式中,与步骤(a)的药物物质相比,在步骤(c)中收集的经纯化的因子VII多肽药物物质中的缺失一个或多个N-连接多糖(des-N-多糖形式)的因子VII多肽的含量减少至少40%,诸如至少50%、60%、70%或75%。
更具体而言,所述经纯化的因子VII多肽药物物质含有至多5%,例如至多2%,或者至多1.5%,优选地为至多1.0%,或者至多5%的后洗脱峰。
通常,所述疏水作用色谱材料通过一系列步骤进行再生以用于后续使用。
还应当注意的是所述淋洗步骤和洗脱步骤不必为分开的步骤,而可以合二为一,尤其是当洗脱步骤中采用梯度洗脱缓冲液时。
优选实施方式
本发明的方法对于获得经纯化的因子VII多肽药物物质尤其有用,并且如果恰当选择所述步骤(a)~(c)的pH条件,甚至能减少后洗脱峰的形成并由此提高所述方法的总产率。
因此,本发明的优选实施方式提供了因子VII多肽药物物质的纯化方法,所述药物物质含有至少3%的后洗脱峰,所述方法包括以下步骤:
(a)在促进一部分所述药物物质与疏水作用色谱材料相结合的条件下,使所述药物物质与所述疏水作用色谱材料相接触,所述药物物质含有浓度为1.5M~2.5M的铵盐;
(b)用含有浓度为1.5M~2.5M的铵盐的淋洗缓冲液淋洗所述疏水作用色谱,通常为与步骤(a)基本相同的浓度;和
(c)用含有铵盐的洗脱缓冲液洗脱所述疏水作用色谱材料,所述洗脱缓冲液为所述铵盐的梯度缓冲液,并收集作为洗出液的经纯化的因子VII多肽药物物质,
其中步骤(b)和(c)可以合并。
优选为,步骤(c)中的洗脱缓冲液是铵盐的梯度缓冲液,其中所述梯度缓冲液的初始铵盐浓度为1.8M~2.2M,所述梯度缓冲液的最终铵盐浓度为0.0M~0.2M。所述铵盐优选为乙酸铵或硫酸盐(当不存在钙时)。
因子VII多肽
此处所使用的术语“因子VII多肽”包括野生型因子VII(即具有在美国专利第4,784,950号中所公开的氨基酸序列的多肽)、其变种以及因子VII-相关的多肽,因子VII衍生物和因子VII结合物。这包括表现出与野生型人类因子VIIa基本相同或者提高的生物活性的因子FVII变体、因子VII-相关的多肽、因子VII衍生物和因子VII结合物。
术语“因子VII”旨在包括以其未切割(酶原)形式的因子VII多肽,以及那些已经过蛋白处理而生成其相应生物活性形式(可被表示为因子VIIa)的因子VII多肽。通常,因子VII在残基152和153之间被切割以生成因子VIIa。因子VII的这些变种可表现出与人类因子VII不同的性质,包括稳定性、磷脂结合、改变的比活性等。上述定义中的“因子VII”或“因子VIIa”也包括由一个个体至另一个个体而存在和发生的天然等位变种。并且,糖基化的程度和位置或者其他翻译后修饰可根据所选择的宿主细胞和所述宿主细胞环境的性质而变化。
术语“因子多肽”也包括多肽,其包括这样的变种:其中所述因子VIIa的生物活性相对于野生型因子VIIa的活性已基本被改变或者稍微被降低。这些多肽包括而不限于其中已引入特定氨基酸序列变化以改变或破坏所述多肽的生物活性的因子VII或因子VIIa。
在血液凝结中的因子VIIa的生物活性源自其如下能力,(i)与组织因子(TF)结合和(ii)催化因子IX或因子X的蛋白水解切割以生成活化的因子IX或X(分别为因子IXa或Xa)。
对于本发明来说,因子VII多肽的生物活性(“因子VII生物活性”)可通过测定制剂促进血液凝结的能力而量化,参见此处描述的分析4。在此分析中,生物活性表示为相对于参比样品的凝结时间的减少,并通过与所收集的含有1个单位/mL因子VII活性的人类血清标准进行比较而换算为“因子VII单位”。作为另外一种选择,因子VIIa生物活性可通过以下方法进行量化:(i)测定因子VIIa或因子VII相关多肽在含有包埋在脂膜中的TF和因子X的体系中生成活化因子X(因子Xa)的能力(Persson等,J.Biol.Chem.272:19919-19924,1997);(ii)测定因子X在水性系统中的水解(“体外蛋白水解分析”,参见以下分析2);(iii)采用基于表面等离子共振的仪器测量因子VIIa或因子VII相关多肽与TF的物理结合(Persson,FEBS Letts.413:359-363,1997);(iv)测定因子VIIa和/或因子VII相关多肽对合成底物的水解(“体外蛋白水解分析”,参见以下分析1);或(v)测定在不依赖于TF的体外系统中凝血酶的生成(参见以下分析3)。
具有与野生型因子VIIa相比基本相同或者提高的生物活性的因子VII变体包括在以上所描述的凝结分析(分析4)、蛋白水解分析(分析2)或TF结合分析中的一项或多项分析中进行测试时,表现出在相同细胞类型中制造的因子VIIa的比活性的至少约25%,优选至少约50%,更优选至少约75%和最优选至少约90%的比活性的那些因子VII变体。具有与野生型因子VIIa相比基本降低的生物活性的因子VII变体包括在以上所描述的凝结分析(分析4)、蛋白水解分析(分析2)或TF结合分析中的一项或多项分析中进行测试时,表现出低于在相同细胞类型中制造的因子VIIa的比活性约25%,优选低于约10%,更优选低于约5%和最优选低于约1%的那些因子VII变体。具有相对于野生型因子VII基本改变的生物活性的因子VII变体包括但不限于表现出非TF依赖性因子X蛋白水解活性的因子VII变体以及能与TF结合但不切割因子X的那些因子VII变体。
因子VII的变体,无论是表现出与野生型因子VII基本相同,或者更好的生物活性,或者另一种情况,表现出相对于野生型因子VII基本改变,或者降低的生物活性,均包括但不限于具有由于插入、删除或者取代一个或多个氨基酸从而与野生型因子VII的氨基酸序列不同的氨基酸序列的多肽。
具有与野生型因子VII基本相同的生物活性的因子VII的非限制性实例包括S52A-FVIIa、S60A-FVIIa(Lino等,Arch.Biochem.Biophys.352:182-192,1998);如美国专利第5,580,560号所公开的表现出提高的蛋白水解稳定性的FVIIa变体;在残基290和291之间或者在残基315或316之间被蛋白水解切割的因子VIIa(Mollerup等,Biotechnol.Bioeng.48:501-505,1995);因子VIIa氧化形式(Kornfelt等,Arch.Biochem.Biophys.363:43-54,1999);在PCT/DK02/00189中公开的FVII变体;如WO 02/38162所公开的表现出提高的蛋白水解稳定性的FVII变体(Scripps Research Institute);如在WO 99/20767中所公开的具有经修饰的Gla-区域并显示提高的膜结合的FVII变体(University of Minnesota);以及在WO 01/58935中公开的FVII变体(Maxygen ApS)。
具有与野生型FVIIa相比提高的生物活性的因子VII变体的非限制性实例包括在WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、WO03/27147、WO 03/37932;WO 02/38162(Scripps Research Institute)中公开的FVII变体;以及在JP 2001061479中公开的具有提高的活性的FVIIa变体(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)。
术语“因子VII多肽”也包括以下多肽及变体,即其中所述因子VIIa生物活性相对于野生型因子VIIa的活性基本被改变或者稍微被降低,但通常还保持明显水平的与因子VII的氨基酸序列同序性,例如至少约70%,至少约75%,至少约80%,至少约85%,至少约90%,至少约93%,至少约95%,或者更高(例如,约97、98或99%的同序性)。这些多肽包括但不限于其中已引入特定氨基酸序列变化以改变或破坏所述多肽的生物活性的因子VII或因子VIIa(此处进一步举例说明)。
此处使用的术语“因子VII衍生物”用于指表现出相对于野生型因子VII基本相同或者提高的生物活性的FVII多肽,其中一个或多个亲代肽的氨基酸已被基因地和/或化学地和/或酶促地改变,例如烷基化、糖基化、PEG化、酰化、成酯或成酰胺等。这包括但不限于PEG化的人类因子VIIa,半胱氨酸-PEG化的人类因子VIIa及其变体。因子VII衍生物的非限制性实例包括在WO 03/31464和美国专利申请US20040043446、US 20040063911、US 20040142856、US 20040137557和US 20040132640中公开的GlycoPegylated FVII derivatives(NeoseTechnologies,Inc.);WO 01/04287、US专利申请20030165996、WO01/58935、WO 03/93465(Maxygen ApS)和WO 02/02764、美国专利申请20030211094(University of Minnesota)中公开的FVII结合物;在WO01/58935、美国专利US 6806063、美国专利申请20030096338(MaxygenApS)、WO 03/93465(Maxygen ApS)、WO 04/029091(Maxygen ApS)、WO 04/083361(Maxygen ApS)和WO 04/111242(Maxygen ApS),以及在WO 04/108763(Canadian Blood Services)中公开的FVII变体。
术语“提高的-”或者“改善的生物活性”指以下的FVII多肽,i)具有与重组野生型人类因子VIIa相比基本相同或者提高的蛋白水解活性的FVII多肽,或者ii)具有与重组野生型人类因子VIIa相比基本相同或者提高的TF结合活性的FVII多肽,或者iii)具有与重组野生型人类因子VIIa相比基本相同或者提高的在血浆中的半衰期的FVII多肽。术语“PEG化的人类因子VIIa”指具有与人类因子VIIa多肽连接的PEG分子的人类因子VIIa。应当理解,所述PEG分子可连接于所述因子VIIa多肽的任何部分,包括所述因子VIIa多肽的任何氨基酸残基或糖部分。术语“半胱氨酸-PEG化的人类因子VIIa”指在引入人类因子VIIa的半胱氨酸的巯基上连接有PEG分子的因子VIIa。
具有相对于野生型因子VII基本降低或者改变的生物活性的因子VII变体的非限制性实例包括R152E-FVIIa(Wildgoose等,Biochem29:3413-3420,1990)、S344A-FVIIa(Kazama等,J.Biol.Chem.270:66-72,1995)、FFR-FVIIa(Holst等,Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.15:515-520,1998)和缺失Gla区域的因子VIIa(Nicolaisen等,FEBS Letts.317:245-249,1993)。
因子VII多肽的实例包括但不限于野生型因子VII、L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII和S336G-FVII、L305V/K337A-FVII、L305V/V158D-FVII、L305V/E296V-FVII、L305V/M298Q-FVII、L305V/V158T-FVII、L305V/K337A/V158T-FVII、L305V/K337A/M298Q-FVII、L305V/K337A/E296V-FVII、L305V/K337A/V158D-FVII、L305V/V158D/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V-FVII、L305V/V158T/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V-FVII、L305V/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/K316H-FVII、S314E/K316Q-FVII、S314E/L305V-FVII、S314E/K337A-FVII、S314E/V158D-FVII、S314E/E296V-FVII、S314E/M298Q-FVII、S314E/V158T-FVII、K316H/L305V-FVII、K316H/K337A-FVII、K316H/V158D-FVII、K316H/E296V-FVII、K316H/M298Q-FVII、K316H/V158T-FVII、K316Q/L305V-FVII、K316Q/K337A-FVII、K316Q/V158D-FVII、K316Q/E296V-FVII、K316Q/M298Q-FVII、K316Q/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D-FVII、S314E/L305V/E296V-FVII、S314E/L305V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/K337A/E296V-FVII、S314E/L305V/K337A/V158D-FVII、S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V-FVII、S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V-FVII、S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D-FVII、K316H/L305V/E296V-FVII、K316H/L305V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/K337A/E296V-FVII、K316H/L305V/K337A/V158D-FVII、K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V-FVII、K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V-FVII、K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D-FVII、K316Q/L305V/E296V-FVII、K316Q/L305V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII、K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII、K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII、K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/K337A-FVII、F374Y/V158D-FVII、F374Y/E296V-FVII、F374Y/M298Q-FVII、F374Y/V158T-FVII、F374Y/S314E-FVII、F374Y/L305V-FVII、F374Y/L305V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D-FVII、F374Y/L305V/E296V-FVII、F374Y/L305V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T-FVII、F374Y/L305V/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E-FVII、F374Y/K337A/V158T-FVII、F374Y/K337A/M298Q-FVII、F374Y/K337A/E296V-FVII、F374Y/K337A/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q-FVII、F374Y/V158D/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q-FVII、F374Y/V158T/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E-FVII、F374Y/S314E/M298Q-FVII、F374Y/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII、F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII、F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII、F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII、F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII、F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII、F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII、F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII、F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337AFVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/F296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-因子VII、S60A-因子VII;R152E-因子VII、S344A-因子VII、缺失Gla区域的因子;和P11Q/K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、K143N/N145T/R315N/V317T-FVII;以及在氨基酸序列233Thr~240Asn中进行取代、添加或删除的FVII,在氨基酸序列304Arg~329Cys中进行取代、添加或删除的FVII,以及在氨基酸序列Ile153~Arg223中进行取代、添加或删除的FVII。
因此,因子VII多肽中的取代变体包括但不限于在位点P10、K32、L305、M306、D309、L305、L305、F374、V158、M298、V158、E296、K337、M298、M298、S336、S314、K316、K316、F374、S52、S60、R152、S344、T106、K143、N145、V253、R290、A292、G291、R315、V317的取代,在氨基酸序列T233~N240或R304~C329;或I153~R223或其组合中的取代、添加或删除,尤其为变体诸如P10Q、K32E、L305V、M306D、D309S、L305I、L305T、F374P、V158T、M298Q、V158D、E296V、K337A、M298Q、M298K、S336G、S314E、K316H、K316Q、F374Y、S52A、S60A、R152E、S344A、T106N、K143N、N145T、V253N、R290N、A292T、G291N、R315N、V317T,以及在氨基酸序列T233~N240或R304~C329或I153~R223或其组合中的取代、添加和删除。
在一些实施方式中,所述因子VII多肽是经重组得到的人类因子VIIa(rhVIIa)。
在其他实施方式中,所述因子VII多肽是因子VII序列变体。
在一些实施方式中,所述因子VII多肽具有不同于野生型人类因子VII的糖基化。
在不同实施方式,例如所述因子VII多肽是因子VII相关多肽或因子VII序列变体的实施方式中,当根据本说明书所描述的“体外蛋白水解分析”(分析2)进行测试时,所述因子VII多肽的活性与天然人类因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之间的比率至少为约1.25、优选至少约2.0,或4.0,最优选至少约8.0。
在一些实施方式中,所述因子VII多肽是因子VII相关多肽,尤其是变体,其中当在“体外水解分析”(参见以下分析1)中进行测试时,所述因子VII多肽的活性和天然人类因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之间的比率至少为约1.25。在其他实施方式中,所述比率至少为约2.0;在更多实施方式中,所述比率至少为约4.0。
经纯化的因子VII多肽药物物质的用途
在收集对应于所述经纯化的因子VII多肽药物物质的洗脱部分之后,可将其配制成溶液,可分装到小瓶中并冻干或者直接保存。作为相当于市售品的最终产品的描述例可以举出经重组制得的FVII多肽组合物NovoSeven(Novo Nordisk A/S,Denmark),小瓶(1.2mg)中装有1.2mg重组人类因子VIIa、5.84mg NaCl、2.94mg CaCl2、2H2O、2.64mgGlyGly、0.14mg聚山梨醇酯80和60.0mg甘露醇。该产品在使用前通过注入2.0mL水(WFI)重新配制成pH 5.5。当重新配制后,所述蛋白质溶液能稳定达24小时以供使用。
重组活化因子VII(rFVIIa)的整个制造过程由Jurlander等在研讨会,Thrombosis and Hemostasis,Vol.27,No.4,2001中进行了描述。
试验
一般方法
适用于测定因子VII多肽生物活性的分析
本发明可用的因子VII多肽可通过合适的分析进行选择,所述分析可在体外测试中简单初步地进行。因此,本说明书公开了用于测试因子VII多肽活性的简单测试(称为“体外水解分析”)。
第一代凝结分析
可采用基本如WO 92/15686或US 5,997,864中所描述的一步凝结分析测定所述因子VII多肽的活性。简言之,待测样品在50mM Tris(pH7.5),0.1%BSA中稀释,其100μL与100μL不含有因子VII的血浆和200μL含有10mM Ca2+的促凝血酶原激酶C一起温育。测定凝结时间并与标准曲线进行比较,所述标准曲线采用参考标准或连续稀释的加入了柠檬酸盐的正常人类血浆收集液。
体外水解分析(分析1)
可以对天然(野生型)因子VIIa和因子VII多肽(在下文中均称为“因子VIIa”)的比活性进行分析。也可以对它们进行平行分析以直接比较其比活性。所述分析在微孔板(MaxiSorp,Nunc,Denmark)上进行。将发光底物D-Ile-Pro-Arg-p-硝基苯胺(S-2288,Chromogenix,Sweden),最终浓度为1mM,加入到50mM HEPES,pH 7.4中的因子VIIa(最终浓度100nM)中,其中含有0.1M NaCl、5mM CaCl2和1mg/mL牛血清白蛋白。在SpectraMaxTM 340板读数器(Molecular Devices,USA)上连续测量在405nm的吸光度。在20分钟温育中逐步显示的吸光度在减去不含酶的空白孔的吸光度之后用于计算因子VII多肽的活性和野生型因子VIIa的活性之间的比率:
比率=(A405nm因子VII多肽)/(A405nm因子VIIa野生型)。
基于此,可鉴别出活性低于,相当于或者高于天然因子VIIa活性的因子VII多肽,例如,其中所述因子VII多肽的活性和天然因子VII(野生型FVII)的活性之间的比率为大约1.0比约1.0的因子VII多肽。
因子VII多肽的活性也可使用生理底物诸如因子X进行测定(“体外蛋白水解分析”),底物的浓度适宜为100nM~1000nM,其中所生成的因子Xa在加入合适的发光底物(例如S-2765)后进行测量。此外,所述活性分析在生理温度下进行。
体外蛋白水解分析(分析2)
平行分析天然(野生型)因子VIIa和因子VII多肽(下文中均称为“因子VIIa”)以直接比较其比活性。所述分析在微孔板(MaxiSorp,Nunc,Denmark)上进行。因子VIIa(10nM)和因子X在含有0.1M NaCl、5mMCaCl2和1mg/mL牛血清白蛋白的100μL 50mM HEPES,pH 7.4中温育15分钟。通过加入含有0.1M NaCl、20mM EDTA和1mg/mL牛血清白蛋白的50μL 50mM HEPES,pH 7.4终止因子X的切割。生成的因子Xa的量通过加入发光底物Z-D-Arg-Gly-Arg-p-硝基苯胺(S-2765,Chromogenix,Sweden),最终浓度为0.5mM,进行测定。在SpectraMaxTM340板读数器(Molecular Devices,USA)上连续测量在405nm的吸光度。在10分钟温育中逐步显示的吸光度在减去不含FVIIa的空白孔的吸光度之后用于计算因子VII多肽和野生型因子VIIa的蛋白水解活性之间的比率:
比率=(A405nm因子VII多肽)/(A405nm因子VIIa野生型)。
基于此,可鉴别出活性低于,相当于或者高于天然因子VIIa活性的因子VII多肽,例如,其中所述因子VII多肽的活性和天然因子VII(野生型FVII)的活性之间的比率为大约1.0比约1.0的因子VII多肽。
凝血酶生成分析(分析3)
在包括所有生理浓度下的相关凝血因子和抑制剂(在模拟血友病A状况时去掉因子VIII)和活化血小板的分析(分析3)中测定因子VII多肽生成凝血酶的能力(如在Monroe等(1997)Brit.J.Haematol.99,542-547的p.543中所描述,在此引入作为参考)。
一步凝结分析(凝血分析)(分析4)
通过一步凝结分析(分析4)可分析因子VII多肽的比活性(“凝血活性”)。为此目的,将待测样品在50mM PIPES-缓冲液(pH 7.2),1%BSA中稀释,其中的40μl与40μl不含因子VII的血浆和80μl含有10mM Ca2+的人类重组组织因子和合成磷脂一同温育。测定凝结时间(凝血时间)并与使用平行线性分析中的参考标准的标准曲线进行比较。
适于测量“相对保留时间”和氧化FVII含量,重链降解FVII和“后洗脱峰”的RP-HPLC分析
“后洗脱峰”是在RP-HPLC分析中相对于所关心的因子VII多肽具有更长的保留时间的洗脱流出的物质,所述RP-HPLC分析例如描述如下:
柱温:70℃。A-缓冲液:0.1%v/v三氟乙酸。B-缓冲液:0.09%v/v三氟乙酸,80%v/v乙腈。
在30分钟内以由X变至(X+13)%B的线性梯度洗脱所述柱。调整X使得FVIIa洗脱,其保留时间为约26分钟。
流速:1.0mL/min。检测波长:214nm。上样量:25μg FVIIa。
图9描述了FVII及其产物相关杂质的HPLC色谱图。
聚集体含量
聚集体含量由非变性尺寸排除HPLC(SEHPLC)测定。非变性尺寸排除色谱在Waters Protein Pak 300SW柱,7.5×300mm上,采用0.2M硫酸铵,5%2-丙醇pH 7.0作为流动相进行。流速:0.5mL/min。检测波长:215nm。上样量:25μg FVIIa。
desGla-因子VII多肽结构体含量的测定
desGla-因子VII多肽结构体相对于完整长度的因子VII多肽结构体的含量由SDS-PAGE测定。将150μl的样品加到50μl样品缓冲液中(非还原,NuPAGE)并煮沸5分钟。在12%BisTris NuPAGE胶(Invitrogen)上上样10μl。在200伏特,120mA下跑胶55分钟。所述胶用考马斯亮蓝溶液染色、脱色并干燥。通过将desGla-因子VII多肽带的面积除以在大约50kDa处的因子VII多肽带和在大约45kDa处的desGla-因子VII多肽带的面积从而计算得到所述相对desGla-因子VII多肽含量。
作为另外一种选择,可通过阴离子交换HPLC测定所述desGla-因子VII多肽结构体的含量。所述方法将含有较少Gla-区域的因子VII多肽与完整的因子VII多肽分开。含有较少Gla-区域的因子VII多肽表示为因子VII多肽相关峰面积的%。分析柱采用DNAPac PA-100,250×4mm(Dionex Corp.)。超过30分钟,采用pH 9.0的0M~0.5M乙酸铵线性梯度以1.0mL/min的流速洗脱所述柱。检测洗脱液在280nm的吸光度。
缺失一个或多个N-连接多糖的因子VII多肽结构体的含量测定
缺失一个或多个N-连接多糖的因子VII多肽结构体的含量可采用例如高效液相色谱(HPLC);毛细管电泳(CE);或质谱(MALDI-MS和LC-MS)进行测定。
例如,当使用MALDI-MS时,出现在质量为约50kDa、47.5kDa和45kDa处的峰指认为具有两个N-连接多糖的因子VII和分别缺失一个或两个N-连接多糖的因子VII。
用本领域内任何已知的方法可以测定N-连接寡糖的模式,包括但不局限于:高效液相色谱(HPLC);毛细管电泳(CE);核磁共振(NMR);采用离子化技术的质谱(MS)诸如快原子轰击、电喷雾或基质辅助激光解吸(MALDI);气相色谱(GC);以及与阴离子交换(AIE)-HPLC、尺寸排除色谱(SEC)或MS相联用的外切酶处理,参见例如Weber等,Anal.Biochem.225:135(1995);Klausen等,J.Chromatog.718:195(1995);Morris等,in Mass Spectrometry of Biological Materials,McEwen等,eds.,Marcel Dekker,(1990),pp 137-167;Conboy等,Biol.Mass Spectrom.21:397,1992;Hellerqvist,Meth.Enzymol.193:554(1990);Sutton等,Anal.Biohcem.318:34(1994);Harvey等,Organic Mass Spectrometry 29:752(1994)。
因子VII糖型(glycoforms)的以下解析采用任何一种上述方法,所解析出的物种指定为不同组(i)~(iii)。通过计算指定给每组的糖型的总和相对于样品中糖型的总含量得到每组(i)~(iii)的相对含量。
实施例
以下实施例描述了本发明。所包括的实施例仅为描述目的,并非旨在以任何形式限制所主张的本发明的范围。
实施例1-通过在pH 6使用TSK苯基5PW的rhFVIIa的HIC纯化
实现重链降解和氧化的rhFVII的减少
在5mg高纯rhFVIIa中加入乙酸铵(NH4-acetate)至最终浓度1.8M,CaCl2至最终浓度10mM,甲硫氨酸至最终浓度10mM。将pH调节至pH 6.0。将该样品加到用Toso Haas TSK-凝胶苯基5PW装填,用5 CV 1.8M NH4Ac、10mM CaCl2,10mM甲硫氨酸平衡,pH 6.0的柱(内径0.5cm×长10.0cm=2ml柱容(CV))上(上样量1.6g/L)。用3CV 1.8MNH4Ac、10mM CaCl2、10mM甲硫氨酸,pH 6.0淋洗所述柱子。用含有10mM CaCl2、10mM甲硫氨酸,pH 6.0的缓冲液中的1.8M NH4Ac至50mM NH4Ac的18CV线性梯度进行洗脱。通过收集在所述前导带上大约65%最大吸收(280nm)和在后缘带上大约20%最大吸收的峰,采集收集样,色谱图如图1。
在5℃温度下,以6~12CV/h的流速进行纯化。所述柱子用50mM柠檬酸盐,pH 7.0和0.5M NaOH再生。
收集样和上样样品通过RP-HPLC分析显示重链降解和氧化的rhFVII的减少,如表1所示。
表1
由于与未改变的rhFVII相比而言具有相对较短的保留时间,因此主要减少的是重链降解的和氧化的rhFVII,并由此通过切掉前导带而减少。
实施例2-进行疏水作用色谱
在rhFVII样品中加入(NH4)2SO4至最终浓度1M。用20mM Tris将pH调节至pH 8.6。将该样品加到用Toyopearl butyl 650S装填,用5CV1M(NH4)2SO4、20mM Tris,pH 8.6进行平衡的柱上。所述柱用5CV 1M(NH4)2SO4、20mM Tris,pH 8.6进行淋洗。用含有20mM Tris,pH 8.6的缓冲液中的1.0M(NH4)2SO4至0M(NH4)2SO4的20CV线性梯度进行洗脱。通过峰收集选择含FVII的收集样。重链降解的和氧化的rhFVII由于相比天然rhFVII具有较短的保留时间而减少。后洗脱峰1、2和3由于相比天然rhFVII具有相对较长的保留时间而减少。
实施例3-通过在pH 6使用TSK苯基5PW的rhFVIIa类似物的
HIC纯化实现后洗脱峰的减少
4.7ml的柱子用TSK Phenyl 5PW(20μm)树脂进行装填,并用20CV的含有20M乙酸铵、10mM CaCl2、10mM组氨酸,pH 6.0的缓冲液进行平衡。
将由15毫升的在2.0M乙酸铵中的0.25mg/ml FVIIa类似物,10mM CaCl2,10mM组氨酸,pH 6.0构成的上样样品在所述柱上加样,对应于0.8mg/ml树脂的比上样量。用5CV的平衡缓冲液对所述柱子进行淋洗。用超过10CV的由淋洗和平衡缓冲液至10mM CaCl2、10mM组氨酸,pH 6.0的线性梯度,以及随后保持5CV进行洗脱。收集通过洗脱峰的5ml部分。色谱图描述在图3中。
用5CV的50mM柠檬酸三钠,pH 7.5以及随后5CV的1.0M氢氧化钠对柱子进行再生。纯化中保持6CV/h的流速和5℃的恒定温度。
如图2所描述实现了相对保留时间(RR)>1000的后洗脱峰的分离。总计,后洗脱峰(RR1045、RR1066、RR1119、RR1148、RR1192和RR1247)减少2.5倍。所述峰的保留时间指在分析RP-HPLC系统中所述相应峰相对于主产物峰的相对保留时间。收集部分12~17得到62%的产率。
实施例4-高分子量化合物的减少
2.0L的柱子用TSK苯基5PW(20μm)树脂装填,用20CV的2.0M乙酸铵、10mM CaCl2、10mM组氨酸,pH 6.0进行平衡。将5.3L含有2.0M乙酸铵中的0.751mg/ml FVIIa类似物、10mM CaCl2、10mM组氨酸,pH 6.0的溶液进行上样,对应于2.0mg/ml树脂的比上样量。用10CV的平衡缓冲液进行淋洗。用超过10CV的由淋洗和平衡缓冲液至10mM CaCl2、10mM组氨酸,pH 6.0的线性梯度,以及随后保持5CV进行洗脱。从所述前导带上的100mAu(5mm光路)至后缘带上的65mAu(5mm光路)收集得到收集样部分。色谱图在图4中描述。收集样体积为9.0L。
用5CV的50mM柠檬酸三钠,pH 7.5以及随后5CV的1.0M氢氧化钠对柱子进行再生。纯化中保持6CV/h的流速和5℃的恒定温度。
根据SDS-PAGE,上样样品含有多种分子量大于所述产物的成分。所描述的纯化步骤减少所有这些成分至低于其一半浓度(参见表2和图5和6)。
表2
实施例5-后洗脱峰的减少
按照以上一般方法中的描述对上样样品和收集样样品进行分析。可以看到氧化形式和后洗脱峰(LE峰)均减少(参见表3)。
表3
实施例6-通过在pH 6使用TSK苯基5PW的FVIIa类似物的HIC
纯化实现GD-FVII的减少
向6mg的重组hFVIIa中加入NH4Ac至最终浓度1.8M和CaCl2至最终浓度10mM。调节pH至pH 6.0。将该样品加到用Toso Haas TSK-Gel苯基5PW装填,用5CV 1.8M NH4Ac、10mM CaCl2,pH 6.0进行平衡的柱子(0.5cm内径×10.5cm长=2ml柱容(CV))上,(上样量1.6g/L)。所述柱子用3CV 1.8M NH4Ac、10mM CaCl2,pH 6.0进行淋洗。用18CV的pH 6.0的含有10mM CaCl2的缓冲液中的1.8M NH4Ac至50mM NH4Ac线性梯度进行洗脱。收集三份样品:前导带、主要峰、结束后缘带。通过收集在前导带的大约50%最大吸收(280nm)和后缘带的大约20%最大吸收的峰来收集所述主峰。色谱图在图7之中。
在6~12CV/h的流速和5℃的温度下进行纯化。用5CV的50mM柠檬酸盐,pH7.0和5CV的0.5M NaOH再生所述柱子。
在三个收集样和上样样品中的mw大约为43kDA的GD-FVII相比于mw大约为48kDA的FVII的相对含量通过图8的非还原SDS-PAGE和所述胶的扫描图进行分析。可以看到在主峰中GD-FVII的减少量,表5。
表5
实施例7-通过在20℃使用TSK苯基5PW的FVIIa的HIC纯化实现
后洗脱峰和其他产物相关杂质的减少
向6mg的重组hFVIIa中加入NH4Ac至最终浓度1.8M和CaCl2至最终浓度10mM。将pH调节至pH 6.0。将该样品加到用Toso Haas TSK-Gel苯基5PW装填,用5CV 1.8M NH4Ac、10mM CaCl2,pH 6.0进行平衡的柱子(0.5cm内径×10.0cm长=2ml柱容(CV))上。
所述柱子用3CV 1.8M NH4Ac、10mM CaCl2,pH 6.0进行淋洗。用18CV的在pH 6.0的含有10mM CaCl2的缓冲液中的1.8M NH4Ac至50mM NH4Ac的线性梯度进行洗脱。
通过收集在所述前导带上大约65%最大吸收(280nm)和在后缘带上大约20%最大吸收的峰来收集样品,色谱图如图10。
在6~12CV/h的流速和20℃的温度下进行纯化。用50mM柠檬酸盐,pH 7.0和0.5M NaOH再生所述柱子。
氧化的和重链降解的FVII的含量和后洗脱峰的含量减少,如表6所示。
表6
Claims (10)
1.减少缺乏一个或多个N-连接多糖的因子VII形式在重组制得的有生物活性的因子VII多肽药物物质中的含量的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)在促进一部分所述药物物质与疏水作用色谱材料相结合的条件下,使所述药物物质与所述疏水作用色谱材料相接触,所述药物物质包含浓度为0.0M~0.1M或0.5M至在实施步骤(a)的温度下相应盐饱和浓度的85%的盐和/或两性离子,其中所述盐选自:乙酸铵、硫酸铵、氯化铵、氯化钠、乙酸钠、硫酸钠、乙酸钾、氯化钾和硫酸钾,所述两性离子选自:甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;
(b)可选地用淋洗缓冲液淋洗所述疏水作用色谱材料;和
(c)用洗脱缓冲液洗脱所述疏水作用色谱材料,并收集作为洗出液的经纯化的有生物活性的因子VII多肽药物物质;
其中,与在步骤(a)中加入的药物物质相比,由此处所限定的方法所确定的在步骤(c)中收集的纯化的药物物质中的缺乏一个或多个N-连接多糖的因子VII形式含量减少至少50%(w/w)。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述疏水作用色谱材料选自由丁基配体和/或苯基配体取代的树脂所组成的组。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中在步骤(a)中,所述药物物质的装填量为每L树脂至少250mg因子VII多肽。
4.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中在步骤(a)中,所述药物物质为液体形式,并具有至少50mS/cm的离子强度。
5.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中在步骤(b)中的淋洗缓冲液包含选自如下的盐:乙酸铵、硫酸铵、氯化铵、氯化钠、乙酸钠、硫酸钠、乙酸钾、氯化钾和硫酸钾;和/或选自如下的两性离子:甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸,所述盐和两性离子的浓度为0.0M~0.1M或0.5M至在实施步骤(b)的温度下相应盐饱和浓度的85%。
6.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中在步骤(b)中的淋洗缓冲液中含有浓度为0.7M~2.2M的盐。
7.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中在步骤(c)中的洗脱缓冲液中含有初始浓度为0.7M~2.2M的盐。
8.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中在步骤(c)中的洗脱缓冲液是所述盐的梯度缓冲液。
9.如权利要求8所述的方法,其中所述梯度缓冲液的初始盐浓度为1.7M~2.2M,所述梯度缓冲液的最终盐浓度为0.0M~1.6M。
10.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中所述盐选自由乙酸铵、硫酸铵、氯化钠和乙酸钠组成的组。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP05107990 | 2005-09-01 | ||
EP05107990.3 | 2005-09-01 | ||
PCT/EP2006/065930 WO2007026021A1 (en) | 2005-09-01 | 2006-09-01 | Hydrophobic interaction chromatography purification of factor vii polypeptides |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101268185A CN101268185A (zh) | 2008-09-17 |
CN101268185B true CN101268185B (zh) | 2013-03-27 |
Family
ID=35431893
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200680031951.9A Expired - Fee Related CN101268185B (zh) | 2005-09-01 | 2006-09-01 | 因子ⅶ多肽的疏水作用色谱纯化 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1924689B1 (zh) |
JP (2) | JP5894722B2 (zh) |
CN (1) | CN101268185B (zh) |
ES (1) | ES2515915T3 (zh) |
WO (1) | WO2007026021A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE455861T1 (de) | 2004-05-04 | 2010-02-15 | Novo Nordisk Healthcare Ag | O-verknüpfte glykoformen von faktor vii und verfahren zu deren herstellung |
CA2798240A1 (en) * | 2010-05-19 | 2011-11-24 | Roberto Falkenstein | Hydrophobic interaction chromatography method |
CN112630347B (zh) * | 2020-12-24 | 2023-06-23 | 杭州华东医药集团浙江华义制药有限公司 | 一种4-硝基苯乙胺的hplc分析方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6777390B1 (en) * | 1998-06-17 | 2004-08-17 | Baxter Aktiengesellschaft | Stable blood coagulation inhibitor-free factor vii preparation and method for preparing same |
Family Cites Families (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GR860984B (en) | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
US5580560A (en) | 1989-11-13 | 1996-12-03 | Novo Nordisk A/S | Modified factor VII/VIIa |
CA2103546C (en) | 1991-02-28 | 2002-10-01 | Kathleen L. Berkner | Modified factor vii |
US5997864A (en) | 1995-06-07 | 1999-12-07 | Novo Nordisk A/S | Modified factor VII |
US6017882A (en) | 1997-10-23 | 2000-01-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
EP1198565A1 (en) | 1999-07-07 | 2002-04-24 | Maxygen Aps | A method for preparing modified polypeptides |
JP4451514B2 (ja) | 1999-08-24 | 2010-04-14 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 血液凝固第vii因子改変体 |
RU2278123C2 (ru) | 2000-02-11 | 2006-06-20 | Максиджен Холдингз Лтд. | Молекулы, подобные фактору vii или viia |
JP4455802B2 (ja) | 2000-05-03 | 2010-04-21 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | ヒト第vii凝固因子変異型 |
US20030211094A1 (en) | 2001-06-26 | 2003-11-13 | Nelsestuen Gary L. | High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides |
US6423826B1 (en) | 2000-06-30 | 2002-07-23 | Regents Of The University Of Minnesota | High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides |
AU2001287550B2 (en) | 2000-09-13 | 2007-03-22 | Novo Nordisk Health Care Ag | Human coagulation factor VII variants |
AU2002218029A1 (en) | 2000-11-09 | 2002-05-21 | The Scripps Research Institute | Modified factor viia |
HUP0401124A3 (en) | 2001-03-22 | 2006-01-30 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Coagulation factor vii derivatives |
CA2461003A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-03 | Novo Nordisk Health Care Ag | Human coagulation factor vii polypeptides |
US7265084B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-09-04 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7265085B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-09-04 | Neose Technologies, Inc. | Glycoconjugation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7125843B2 (en) | 2001-10-19 | 2006-10-24 | Neose Technologies, Inc. | Glycoconjugates including more than one peptide |
US7795210B2 (en) | 2001-10-10 | 2010-09-14 | Novo Nordisk A/S | Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods |
PT2279753E (pt) | 2001-10-10 | 2016-01-15 | Novo Nordisk As | Remodelação e glicoconjugação de péptidos |
EP1451315B1 (en) | 2001-11-02 | 2014-05-21 | Novo Nordisk Health Care AG | Human coagulation factor vii polypeptides |
DK1499719T3 (da) | 2002-04-30 | 2011-02-28 | Bayer Healthcare Llc | Faktor VII- eller VIIa-polypeptidvarianter |
AU2003266931B2 (en) | 2002-09-30 | 2010-01-21 | Bayer Healthcare Llc | FVII or FVIIa variants having increased clotting activity |
EP2085470B1 (en) | 2003-03-20 | 2012-05-16 | Bayer HealthCare LLC | FVII or FVIIa variants |
CA2528239A1 (en) | 2003-06-05 | 2004-12-16 | Canadian Blood Services | Mutants of the factor vii epidermal growth factor domain |
BRPI0411650A (pt) | 2003-06-19 | 2006-08-08 | Maxygen Holdings Ltd | variante polipeptìdica do fator vii (fvii) ou do fator viia (fviia), sequencia de nucleotìdeos , vetor de expressão, célula hospedeira, composição, uso de uma variante, e, método para tratar de um mamìfero tendo uma doença ou um distúrbio em que a formação de coágulo seja desejável |
GB0327522D0 (en) * | 2003-11-26 | 2003-12-31 | Money Controls Ltd | Packaging device and container for sheet objects |
ATE455861T1 (de) * | 2004-05-04 | 2010-02-15 | Novo Nordisk Healthcare Ag | O-verknüpfte glykoformen von faktor vii und verfahren zu deren herstellung |
-
2006
- 2006-09-01 ES ES06806746.1T patent/ES2515915T3/es active Active
- 2006-09-01 EP EP06806746.1A patent/EP1924689B1/en active Active
- 2006-09-01 CN CN200680031951.9A patent/CN101268185B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-01 WO PCT/EP2006/065930 patent/WO2007026021A1/en active Application Filing
- 2006-09-01 JP JP2008528532A patent/JP5894722B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-05-07 JP JP2014096002A patent/JP2014193883A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6777390B1 (en) * | 1998-06-17 | 2004-08-17 | Baxter Aktiengesellschaft | Stable blood coagulation inhibitor-free factor vii preparation and method for preparing same |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
> * |
< * |
.2003,第790卷183-197. * |
JOSIC D ET AL.Preparation of vitamin K-dependent proteins,such as clotting factor II,IX and X and clotting inhibitor protein C.< * |
JOSIC D ET AL.Preparation of vitamin K-dependent proteins,such as clotting factor II,IX and X and clotting inhibitor protein C.<<JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B:BIOMEDICAL>>.2003,第790卷183-197. |
JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B:BIOMEDICAL> * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2009506764A (ja) | 2009-02-19 |
ES2515915T3 (es) | 2014-10-30 |
WO2007026021A1 (en) | 2007-03-08 |
CN101268185A (zh) | 2008-09-17 |
EP1924689A1 (en) | 2008-05-28 |
JP5894722B2 (ja) | 2016-03-30 |
JP2014193883A (ja) | 2014-10-09 |
EP1924689B1 (en) | 2014-08-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9023992B2 (en) | Hydrophobic interaction chromatography purification of factor VII polypeptides | |
US20070037966A1 (en) | Hydrophobic interaction chromatography purification of factor VII polypeptides | |
US9187549B2 (en) | Reduction of the content of protein contaminants in compositions comprising a vitamin K-dependent protein of interest | |
JP5836910B2 (ja) | 陰イオン交換物質からの分画溶出によるvii因子ポリペプチドのバルクの精製 | |
US20080268521A1 (en) | Purification of Coagulation Factor VII Polypeptides | |
CN101268185B (zh) | 因子ⅶ多肽的疏水作用色谱纯化 | |
WO2007071767A1 (en) | Purification of vitamin k-dependent polypeptides using preparative reverse phase chromatography (rpc) | |
CN101802187B (zh) | 通过热处理降低因子vii多肽组合物中的二聚体含量 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130327 Termination date: 20210901 |