JP2013527851A - 疎水性相互作用クロマトグラフィー法 - Google Patents
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Abstract
Description
タンパク質は、今日の医学的ポートフォリオにおいて重要な役割を果たす。組み換えポリペプチドの生産のための発現系は、最先端技術において周知である。薬学的応用における使用のためのポリペプチドは、主に、大腸菌(E.coli)などの原核細胞、および、CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、BHK細胞、PER.C6(登録商標)細胞などのような哺乳動物細胞において生産される。
‐ヒスチジンタグを有するポリペプチドを含む第1の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、ならびに
‐イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む第2の溶液をアプライすることにより、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収し、それによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを取得または精製する段階。
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞または真核細胞を培養する段階、
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを、細胞または/および培養培地から、任意で封入体の形態で、回収する段階、
‐任意で、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを可溶化および/またはリフォールディングする段階、
‐ヒスチジンタグを含む可溶化および/またはリフォールディングされたポリペプチドを、疎水性相互作用クロマトグラフィー法で精製し、それによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産する段階。
本明細書において、ヒスチジンタグを含むポリペプチドの精製のために結合・溶出モードで操作される拡大縮小可能な疎水性相互作用クロマトグラフィー法が報告され、本方法では、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料からのポリペプチドの回収が、イミダゾール、またはヒスチジンなどのイミダゾール誘導体を含む溶液を伴う。この溶出系を用いることにより、選択性および収率を失わずに、2-プロパノールのような有機溶媒を含有する溶出緩衝液の実施が回避され得る。
‐ヒスチジンタグを有するポリペプチドを含む溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、ならびに
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液で回収し、それによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製する段階。
‐調整された疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を生じるように、第1の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の溶液を、調整された疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、
‐任意で、第3の溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、
‐イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む第4の溶液で、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収し、それによりポリペプチドを精製または取得する段階。
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞または真核細胞を培養する段階、
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを、原核細胞もしくは真核細胞または/および培養培地から、原核細胞の場合は任意で封入体の形態で、回収する段階、
‐任意で、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを可溶化および/またはリフォールディングする段階、
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを、本明細書において報告される疎水性相互作用クロマトグラフィー法で精製し、それによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産する段階。
‐調整された疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を生じるように、第1の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の溶液を、調整された疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、
‐任意で、第3の溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、
‐イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む第4の溶液で、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収し、それによりポリペプチドを取得する段階
を含み、ここで、第1〜第3の溶液は、イミダゾールおよびイミダゾール誘導体が無い状態である。
材料および方法:
他の方法で示されない場合、クロマトグラフィー材料製造業者の取扱説明書に従って、様々なクロマトグラフィー法が行われた。
Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているような標準的な方法を使用して、DNAを操作した。製造業者の指示書に従って、分子生物学用試薬を使用した。
アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、320 nmの参照波長と共に280 nmの光学密度(OD)を測定することにより、タンパク質濃度を測定した。
クロマトグラフィーを、ASI-100 HPLCシステム(Dionex, Idstein, Germany)上でTosoh Haas TSK 3000 SWXLカラムを用いて行った。溶出ピークを、UVダイオードアレイ検出器(Dionex)により280 nmでモニタリングした。濃い試料を1 mg/mlに溶解した後、安定なベースラインが達成されるまで、200 mMリン酸二水素カリウムおよび250 mM塩化カリウム pH 7.0からなる緩衝液でカラムを洗浄した。分析ランを、アイソクラティック条件下で0.5 ml/分の流速を用いて、30分間室温で行った。クロマトグラムを、手動でChromeleon(Dionex, Idstein, Germany)に取り込んだ。
純度を、RP-HPLCにより分析する。アッセイを、アセトニトリル/水性TFA勾配を用いてPhenomenex C18カラム上で行う。溶出プロファイルを、215 nmでのUV吸光度としてモニタリングする。溶出された物質のパーセンテージを、溶出されたタンパク質のピーク領域全体に基づいて計算する。
例えば、Merrick, H., and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403を参照されたい。
マイクロタイタープレートのウェルの壁を、血清アルブミンおよびストレプトアビジンの混合物でコーティングする。HCPに対するヤギ由来のポリクローナル抗体を、マイクロタイタープレートのウェルの壁に結合させる。洗浄段階の後、マイクロタイタープレートの異なるウェルを、異なる濃度のHCP較正配列および試料溶液と共にインキュベーションする。インキュベーションの後、緩衝溶液での洗浄により、結合していない試料材料を除去する。検出のために、ウェルを抗体ペルオキシダーゼ結合体と共にインキュベーションし、結合した宿主細胞タンパク質を検出する。固定したペルオキシダーゼ活性を、ABTSとのインキュベーションおよび405 nmでの検出により検出する。
ビオチンをマイクロタイタープレートに結合させた。ストレプトアビジン、一本鎖DNA、およびビオチン化一本鎖DNA結合タンパク質の反応混合物を添加した。結合タンパク質はDNAに結合することができ、かつビオチン化されていた。この様式において、試料混合物からDNAを特異的に除去することができた。ストレプトアビジンは、マイクロタイタープレート上のビオチン、および一本鎖DNA結合タンパク質に連結したビオチンに結合した。ウレアーゼに連結したDNA特異的抗体を、この複合体全体に添加した。尿素の添加が尿素の加水分解をもたらし、pHの局所的な変化を引き起こした。この変化を、変化した表面電位として検出することができる。表面電位における変化は、結合したDNAの量に比例していた。一本鎖DNAは、プロテイナーゼK消化およびSDSでの変性により取得した。
封入体の調製は、引用された文献において行われている方法に加えて、例えば、Rudolphらによる方法に従って行われ得る(Rudolph, R., et al., Folding Proteins, In: T.E. Creighton (ed.): Protein function: A Practical Approach, 57-99 (1997))。封入体を-70℃で保存した。封入体の可溶化は同様に、Rudolphらによる方法に従って行われ得る(Rudolph, R., et al., Folding Proteins, In: T.E. Creighton (ed.): Protein function: A Practical Approach (1997) 57-99)。
イミダゾール溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iの精製
樹脂: TOYOPEARL(登録商標)Polypropylenglycol-600;TOYOPEARL(登録商標)PPG-600M(Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany)
ローディング: a)118 mgポリペプチド
b)1034 mgポリペプチド
c)1034 mgポリペプチド
カラム寸法: a)高さ13 cm、総容積11 ml
b)高さ22 cm、総容積108 ml
c)高さ22 cm、総容積108 ml
平衡化緩衝液/第1の溶液: 20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液1/第2の溶液: 1 M TRIS-HCl、0.15 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液2/第3の溶液: 20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
溶出緩衝液/第4の溶液: 20 mMイミダゾール、pH 9.7
溶出法: a)20カラム容積における100%溶出緩衝液への直線勾配
b)10カラム容積における50%溶出緩衝液への直線勾配
c)100%溶出緩衝液への段階溶出
結果:
図1〜3より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGF-I分子は、3種類の使用された溶出法のうち任意のもので、ポリ(プロピレングリコール)疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収され得る。
ヒスチジン溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iの精製
樹脂: TOYOPEARL(登録商標)Polypropylenglycol-600;TOYOPEARL(登録商標)PPG-600M(Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany)
ローディング: 123 mgポリペプチド
カラム寸法: 高さ13 cm、総容積11 ml
平衡化緩衝液/第1の溶液: 20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液1/第2の溶液: 1 M TRIS-HCl、0.15 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液2/第3の溶液: 20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
溶出緩衝液/第4の溶液: a)100 mMヒスチジン、pH 9.7
b)20 mMヒスチジン、pH 9.7
溶出法: 20カラム容積における100%溶出緩衝液への直線勾配
結果:
図4および5より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGF-I分子は、2種類の使用された溶出溶液のうち任意のもので、ポリ(プロピレングリコール)疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収され得る。
イミダゾール溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iの精製
樹脂: Capto(商標)Butyl(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)
ローディング: 104 mgポリペプチド
カラム寸法: 高さ13.5 cm、総容積10.7 ml
平衡化緩衝液/第1の溶液: 20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液1/第2の溶液: 1 M TRIS-HCl、0.35 M NaCl、20 mMクエン酸、pH 3.5
洗浄緩衝液2/第3の溶液: 20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
溶出緩衝液/第4の溶液: 20 mMイミダゾール、pH 9.7
溶出法: 10カラム容積における50%溶出緩衝液への直線勾配
結果:
図6より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iは、溶出緩衝液でブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収され得る。
比較実施例‐リン酸溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iの精製
樹脂: TOYOPEARL(登録商標)Ether-650M(Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany)
ローディング: 102 mgポリペプチド
平衡化緩衝液/第1の溶液: 20 mM KH2PO4、1 M NaCl、pH 7.0
洗浄緩衝液1/第2の溶液: 20 mM KH2PO4、1 M NaCl、pH 7.0
溶出緩衝液/第4の溶液: 20 mM KH2PO4、pH 7.0
溶出法: 100%溶出緩衝液への段階溶出
結果:
図7より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGF-I分子は、リン酸を含有する緩衝液単独では、エーテル疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収できない。
比較実施例‐異なる溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iの精製
樹脂: a)Phenyl Sepharose(商標)(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)
b)TOYOPEARL(登録商標)PPG-600M(Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany)
ローディング: 80 mgポリペプチド
カラム寸法: 高さ14 cm、総容積11 ml
平衡化緩衝液/第1の溶液: a)20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
b)20 mM KH2PO4、1.5 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液1/第2の溶液: a)1 M TRIS-HCl、0.35 M NaCl、20 mMクエン酸、pH 3.5
b)-
洗浄緩衝液2/第3の溶液: a)20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
b)20 mM KH2PO4、1.5 M NaCl、pH 3.5
溶出緩衝液/第4の溶液: a)5 mMイミダゾール、20%(v/v)2-プロパノール、pH 7.0
b)1.5 M NaCl、20%(v/v)2-プロパノール、pH 3.5
溶出法: a)10カラム容積における50%溶出緩衝液への直線勾配
b)30カラム容積における100%溶出緩衝液への直線勾配
結果:
図8より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iは、イミダゾールおよび2-プロパノールを含有する溶出緩衝液で、Phenyl Sepharose(商標)疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から急なピークで回収され得る。これは、イミダゾールを含まない溶出緩衝液では達成できない(図9を参照されたい)。
比較実施例‐イミダゾール溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iの精製
樹脂: Capto(商標)Phenyl(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)
ローディング: 117 mgポリペプチド
カラム寸法: 高さ13.5 cm、総容積10.7 ml
平衡化緩衝液/第1の溶液: 20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液1/第2の溶液: 1 M TRIS-HCl、0.35 M NaCl、20 mMクエン酸、pH 3.5
洗浄緩衝液2/第3の溶液: 20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
溶出緩衝液/第4の溶液: 20 mMイミダゾール、pH 9.7
溶出法: 10カラム容積における50%溶出緩衝液への直線勾配
結果:
図10より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iは、溶出緩衝液でフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収できない。
比較実施例‐イミダゾール溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、Herceptin(登録商標)の精製
培養上清を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする前に、pH 3.5および0.8モル/lのNaCl濃度に調整し、かつSartobran Pフィルターで濾過する。
樹脂: TOYOPEARL(登録商標)Polypropylenglycol-600;TOYOPEARL(登録商標)PPG-600M(Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany)
ローディング: 189 mgポリペプチド
カラム寸法: 高さ16 cm、総容積12.6 ml
平衡化緩衝液/第1の溶液: 20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液1/第2の溶液: 1 M TRIS-HCl、0.35 M NaCl、20 mMクエン酸、pH 3.5
溶出緩衝液/第4の溶液: a)20 mMイミダゾール、pH 9.7
b)20 mM KH2PO4、pH 8.9
溶出法: a)10カラム容積における50%溶出緩衝液への直線勾配
b)20カラム容積における100%溶出緩衝液への直線勾配
結果:
Herceptin(登録商標)の画分は、イミダゾール溶出によりフロースルーにおいて見出され得る。さらなる画分が、溶出の初めに小さなピークとしてカラムから回収され得る。それと対照的に、図11に示されるように、リン酸緩衝溶液での溶出により、Herceptin(登録商標)は急なピークとして取得され得る。
Claims (7)
- ヒスチジンタグを有するポリペプチドを含む溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、ならびに
イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液で、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを回収する段階、およびそれによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製する段階
を含む、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製するための方法。 - ヒスチジンタグを含むポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞または真核細胞を培養する段階、
ヒスチジンタグを含むポリペプチドを、細胞または/および培養培地から回収する段階、
以下の工程:
ヒスチジンタグを有するポリペプチドを含む溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする工程と、
イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液で、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを回収する工程、およびそれによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産する工程と
を含む疎水性相互作用クロマトグラフィー法でヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製する段階
を含む、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産するための方法。 - 疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、疎水性リガンドが付加されているアガロースのマトリクスを含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- リガンドが、プロピル-、ブチル-、ペンチル-、ヘキシル-、ヘプチル-、オクチル-、ポリ(エチレングリコール)-、またはポリ(プロピレングリコール)-リガンドであることを特徴とする、請求項3記載の方法。
- リガンドがフェニル-リガンドであり、かつ回収段階における溶液がさらに2-プロパノールを含むことを特徴とする、請求項3記載の方法。
- 第1の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、
ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、ならびに
イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む第4の溶液で、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを回収する段階、およびそれにより該ポリペプチドを生産または精製する段階
を含む前記請求項のいずれか一項記載の方法であって、
第1の溶液が第1の緩衝物質を含み、第2の溶液が第2の緩衝物質を含み、かつ第4の溶液が、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体である第4の緩衝物質を含み、かつ、第2の緩衝物質および第4の緩衝物質が、異なる緩衝物質である、前記方法。 - 第2の溶液をアプライする段階の後および回収する段階の前に、
第3の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階
を含むことを特徴とする請求項6記載の方法であって、第3の溶液が第3の緩衝物質を含み、第2の緩衝物質および第3の緩衝物質および第4の緩衝物質が、すべて異なる緩衝物質である、前記方法。
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