WO2006059727A1 - タンパク質アレイ用検出および解析システム - Google Patents

タンパク質アレイ用検出および解析システム Download PDF

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WO2006059727A1
WO2006059727A1 PCT/JP2005/022213 JP2005022213W WO2006059727A1 WO 2006059727 A1 WO2006059727 A1 WO 2006059727A1 JP 2005022213 W JP2005022213 W JP 2005022213W WO 2006059727 A1 WO2006059727 A1 WO 2006059727A1
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proteins
light
array
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Masahiro Iwakura
Kiyonori Hirota
Hisashi Takahashi
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements

Definitions

  • the present invention relates to the interaction of a protein on a protein array in which proteins are aligned and fixed at high density, and the protein with other proteins and compounds other than Z or proteins, by the ultraviolet, visible or infrared of the protein.
  • the present invention relates to a system that detects and analyzes the absorption at Kojo using a spectrophotometer.
  • Protein arrays offer new possibilities as a means of exploring the functions of unknown proteins encoded by genes and analyzing complex interactions of many proteins at once Technology.
  • Protein arrays consist of proteins and peptides arranged on a substrate, and various protein arrays have been reported (see Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Documents 1 and 2 In the protein array technology, a protein is immobilized on an appropriate substrate, and other proteins are allowed to interact with the immobilized protein, and spots on the interacted array are detected.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 a detection method using a surface plasmon resonance (SPR) imaging method.
  • This method irradiates a protein array with a polarized light beam, obtains the reflected light as an SPR image, and analyzes the reflected light intensity of the SPR image to obtain a fixed protein on the array.
  • It is a method of detection.
  • the method has the advantage that it does not require a label and can be detected in real time.
  • the method cannot be used for analyzing the interaction between a protein and a low-molecular substance, and the method has a problem that the dynamic range is narrow.
  • the equipment used for SPR imaging is extremely expensive, and it is not easy to construct a detection system.
  • Patent Document 1 JP-T 2002-520618
  • Patent Document 2 Japanese Translation of Special Publication 2002-502038
  • Patent Document 3 JP 2004-45390 A
  • Non-Patent Document 1 Nelson, B. P. et al, Anal Chem. 71 (18) 3928-3934 (1999)
  • Non-patent document 2 Brockman, JM et al., Annu. Rev. Phys. Chem, 51, 41-63 (2000))
  • Non-patent document 3 Y. Okahata, et al. J. Am, Chem. Soc, 114 , 8299-8300 (1992) Disclosure of the Invention
  • the inventor of the present invention uses a protein array and a detection method using a protein array 'analysis system that solves the above-mentioned problems, and controls the orientation of proteins on an array substrate to fix the protein at a high density. Then, ultraviolet light, visible light, or infrared light is irradiated onto the immobilized protein, and the protein on the substrate is detected by measuring the light that is not absorbed by the protein. It is an object to provide a method and apparatus for analyzing the interaction with other proteins and compounds other than Z or a protein, and a protein array suitable for the system.
  • an ultraviolet light transmissive substrate is used as the array substrate, and the substrate on which the protein is immobilized is irradiated with ultraviolet light to measure the powerful ultraviolet light that is not absorbed by the protein and detect the protein on the substrate.
  • a method and apparatus for analyzing the interaction between a protein on the substrate and another protein or a compound other than protein, in particular, a low molecular weight compound capable of interacting with protein is to provide a protein array suitable for the system.
  • the present invention provides a protein, protein, and Z or other protein using a protein array using an inexpensive and available device that does not require protein labeling with a fluorescent dye or the like.
  • a detection / analysis system for the interaction with other substances we conducted intensive studies.
  • proteins are immobilized from a femtomole (p moles) order to a picomoles (p moles) order on an array substrate that supports detection of minute amounts, and minute amounts of protein are detected.
  • p moles femtomole
  • p moles picomoles
  • minute amounts of protein are detected.
  • the present inventor has previously completed a method of fixing proteins at a high density by controlling the orientation of proteins on an array substrate (Japanese Patent No. 2517861, Japanese Patent No. 2990271, Japanese Patent No. 3047029, According to this method, a protein can be immobilized on a substrate at an order of ole / cm 2 that is 1 to 2 orders higher than that of the prior art.
  • the present inventor is widely used without labeling with fluorescent dyes or using expensive equipment, and can be obtained at a relatively low cost. It has been found that using a photometer, the proteins on the array can be measured by measuring the optical activity of the protein. That is, since proteins are immobilized on a substrate in high density and in large quantities, irradiation is performed by irradiating the immobilized protein with light having a wavelength that is absorbed by the protein or a substance that interacts with the immobilized protein. The absorbed light is absorbed by the protein on the array or the substance that interacts with the protein.
  • the absorption by the immobilized protein or the substance that interacts with the protein can be measured, and the protein on the array substrate or the substance that interacts with the protein. It was found that can be directly measured using optical activity.
  • proteins absorb ultraviolet light, but by using an ultraviolet light transmissive substrate such as quartz glass, strong ultraviolet light that is not absorbed by the protein is transmitted as light passing through the array substrate on which the protein is immobilized. It was possible to measure.
  • a CCD or the like The power that is desired to use a two-dimensional photodetector A two-dimensional photodetector that can detect ultraviolet light is extremely expensive, and cannot easily be built into a system. Accordingly, the present inventors have obtained a CCD that can be obtained at low cost by converting the ultraviolet light transmitted through the substrate on which the protein is immobilized to visible light using an ultraviolet-visible light conversion device such as fluorescent glass. As a result, the present invention was completed.
  • Proteins on protein arrays and proteins that interact with Z or immobilized proteins including protein arrays and spectrophotometers where proteins are aligned and immobilized at high density on a light transmissive substrate
  • [0012] Interacts with proteins on protein arrays and Z or immobilized proteins, including protein arrays with high-density alignment and fixation on light-transmitting substrates, light irradiation means, and light detection means
  • This is a system for detecting and analyzing other compounds other than proteins, and irradiating the protein array with light by light irradiation means and measuring the light transmitted through the protein array with the light detection means and A system that measures the absorption of light by compounds other than proteins that interact with Z or fixed proteins, and detects and analyzes proteins on protein arrays and other compounds other than Z or proteins.
  • the protein is immobilized at a density of 0.01 g / mm 2 or more per spot of the protein array! /, [1] to [3] !, any of the proteins on the protein array and Detect and analyze other compounds other than proteins that interact with Z or immobilized proteins Stem.
  • the protein is fixed at a density such that the absorbance at one spot of the protein array is 0.001 or more, [1] to [3] !, any protein on the protein array and Z or A system that detects and analyzes compounds other than proteins that interact with immobilized proteins.
  • R and R each represent an arbitrary amino acid sequence, and Y represents a substrate.
  • a system that detects and analyzes proteins on any protein array and other compounds other than proteins that interact with z or immobilized proteins.
  • [0017] [7] The protein was aligned and immobilized by covalently bonding the C-terminal carboxy group of the amino acid sequence of the protein and the carrier containing the primary amine cast on the surface of the light-transmitting glass. [1] A system that detects and analyzes proteins on the protein array of any one of [6] and other compounds other than proteins that interact with Z or immobilized proteins.
  • the photodetection means is a CCD or a photodiode array, other than a protein that interacts with the protein on the protein array according to any one of [1] to [7] and Z or immobilized protein.
  • the light irradiated to the protein array is ultraviolet light
  • the light-transmitting substrate is an ultraviolet light-transmitting substrate [1] to [8]
  • [0020] [10] Detects compounds other than proteins that interact with proteins and Z or immobilized proteins on the protein array of [9], where the UV light transparent substrate is a quartz glass substrate ⁇ System to analyze.
  • the UV-visible light conversion device is irradiated with ultraviolet light that has passed through the protein array, and light converted from ultraviolet light to visible light is detected. [9 on the protein array in [10] System to detect and analyze other proteins other than proteins that interact with proteins and Z or immobilized proteins.
  • the ultraviolet-visible light conversion device is fluorescent glass. A system that detects and analyzes proteins and other compounds other than proteins that interact with z or immobilized proteins.
  • the protein immobilized on the protein array is brought into contact with the specimen, and the light of the compound on the protein array before and after contact and other compounds other than the protein interacting with Z or immobilized protein By measuring absorption, it detects proteins in the sample that interact with the immobilized protein and other compounds other than those that interact with Z or immobilized protein.
  • a system that detects and analyzes proteins on any protein array and other compounds other than proteins that interact with Z or immobilized proteins.
  • the protein immobilized on the protein array is brought into contact with another protein and other compounds other than the protein that interacts with Z or the immobilized protein, and the protein on the protein array Analyze the interaction of immobilized protein with protein or other compounds other than proteins by measuring the absorption of light by compounds other than proteins that interact with Z or immobilized proteins.
  • the light-transmitting substrate is a flow channel cell or a microphone chip in which a flow path is formed, a protein is immobilized in the flow path, and the specimen is passed through the flow path.
  • [0026] A protein array in which proteins are arranged and fixed at high density on a light-transmitting substrate is irradiated with light using a spectrophotometer, and the light transmitted through the protein array is measured. Measure light absorption by proteins and other compounds other than proteins that interact with Z or immobilized proteins, and identify proteins on proteins arrays and other compounds that interact with Z or immobilized proteins How to detect and analyze. [0027] [17] Proteins are immobilized at a density of 0.01 / zg / mm 2 or more per spot in the protein array [16] Proteins on the protein array and Z or immobilized proteins A method to detect and analyze other compounds other than interacting proteins.
  • the protein is immobilized at a density such that the absorbance at one spot of the protein array is 0.001 or more.
  • [0030] [20] The protein was aligned and immobilized by covalently bonding the C-terminal carboxy group of the amino acid sequence of the protein to the carrier containing the primary amine cast on the surface of the light-transmitting glass. [16] A method for detecting and analyzing the protein on the protein array according to any one of [19] and other compounds other than the protein that interacts with Z or an immobilized protein.
  • the light detection means is a CCD or a photodiode array, other than the protein on the protein array of any one of [16] to [20] and a protein that interacts with Z or immobilized protein. To detect and analyze any compound.
  • the light irradiated to the protein array is ultraviolet light
  • the light-transmitting substrate is an ultraviolet light-transmitting substrate. Is a method to detect and analyze other compounds than proteins that interact with immobilized proteins.
  • the UV light-transmitting substrate is a quartz glass substrate. Detects proteins on the protein array of [22] and other compounds other than proteins that interact with Z or immobilized proteins. 'How to parse.
  • the UV-visible light conversion device is irradiated with ultraviolet light that has passed through the protein array, and the light converted from ultraviolet light to visible light is detected. [22] or [23] on the protein array A method to detect and analyze proteins and other compounds that interact with Z or immobilized proteins. [0035] [25] The UV-visible light conversion device is fluorescent glass. Detects proteins on the protein array of [24] and other compounds other than proteins that interact with Z or immobilized proteins. How to analyze.
  • the protein immobilized on the protein array is brought into contact with another compound or other compound other than the protein that interacts with the immobilized protein, and the protein on the protein array is contacted before and after the contact.
  • Analyze the interaction of proteins with proteins or other compounds other than proteins by measuring the absorption of light by proteins and / or other compounds that interact with immobilized proteins.
  • the light-transmitting substrate is a flow channel cell or a microphone chip in which a flow path is formed, a protein is immobilized in the flow path, and the sample passes through the flow path.
  • [0041] [31] The protein array according to [30], wherein the ultraviolet light-transmitting glass is quartz glass. [0042] [32] The protein array according to any one of [29] to [31], wherein the protein is immobilized at a density of 0.01 / zg / mm 2 or more per spot of the protein array.
  • the protein array used in the present invention is fixed at a high density by controlling the orientation of proteins on a light-transmitting substrate, so that the light transmitted through the substrate is measured by irradiating light.
  • the absorption of light by the protein can be determined, and the amount of protein on the protein array can also be measured by the light absorption. Therefore, as in the conventional method, the amount of protein on the substrate that does not need to be used for detection can be directly measured by measuring the optical activity of the protein. .
  • the present invention measures ultraviolet light, visible light, and infrared light, the amount of protein on the protein array can be easily measured using a widely used spectrophotometer.
  • the protein quantification means it is widely used as a protein quantification means, and it is possible to accurately measure proteins on a protein array using ultraviolet light absorption. Furthermore, by using a two-dimensional light detection means such as a CCD as the light detection means, the protein at each spot on the protein array can be rapidly measured at a time. In addition, by using an ultraviolet-visible conversion device such as a substrate that can transmit ultraviolet light and fluorescent glass that can convert ultraviolet light into visible light, CCDs for digital cameras that can be easily obtained at low cost can be used. The cost for system construction can be reduced.
  • the interaction such as binding between a protein and another protein or a non-protein compound can be analyzed by measuring a change in absorbance of the protein on the array or an absorbance of a compound other than the protein. .
  • FIG. 1 is a diagram showing a system of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of a flow system. Mounted at the position of the protein-immobilized and light-transmitting substrate 3 in FIG.
  • FIG. 3 An image of an array substrate with green fluorescent protein immobilized under natural light.
  • FIG. 4 is a diagram showing an optical system diagram (optical path) of an observation system used in Examples.
  • FIG. 5 is a diagram showing an optical system diagram when a spectrophotometer AVIV ATF104 is used.
  • FIG. 6 is a view showing a combination of a protein-immobilized substrate and fluorescent glass.
  • FIG. 7 A diagram showing an image of fluorescence emitted from fluorescent glass by combining DHFR-fixed slide glass and fluorescent glass and irradiating ultraviolet light with a wavelength of 280nm.
  • the right figure in Fig. 7 shows the amount of protein used in each spot.
  • Figure 8 A combination of a slide glass and a fluorescent glass with DHFR fixed at 0.5 to 4 g / spot, and irradiating UV light with a wavelength of 280 nm, and imaging the fluorescence emitted from the fluorescent glass with high-resolution CDD It is.
  • the right figure in Fig. 8 shows the amount of protein used for each spot.
  • FIG. 9 shows the absorbance, that is, the absorption spectrum in each spot, measured by irradiating ultraviolet rays every 5 nm in the wavelength range from 280 nm to 310 nm.
  • X, ⁇ , ⁇ , and ⁇ ⁇ indicate the average values (4 spots each) at 0.5, 1, 2, and 4 g / spot, respectively.
  • Each point has an error bar.
  • 0.7 / z M (Spectrum indicated by curve 1 in the figure)
  • 1.3 ⁇ Spectrum indicated by curve 2 in the figure
  • 2.5 ⁇ Spectrum indicated by curve 3 in the figure
  • the spectrum in the solution shown by 4.4-mm AS-DHFR is shown.
  • Video capture board 7 Data processing means
  • the protein array detection and analysis system of the present invention uses a substrate on which protein is immobilized at a high density, irradiates the protein on the substrate with light (ultraviolet light, visible light, or infrared light), and the substrate. Detect and analyze the protein by directly measuring the absorption of the protein above.
  • a substrate capable of transmitting ultraviolet light is used as the substrate, and the protein is detected and analyzed using absorption of ultraviolet light of the protein.
  • detection analysis refers to protein qualification, quantification, measurement of protein interaction with protein or non-protein compound, measurement of protein-ligand interaction by change in absorbance of immobilized protein, Monitoring structural changes of the protein itself, qualitative and quantitative analysis of compounds other than proteins that interact with immobilized proteins.
  • the protein includes peptides and polypeptides.
  • the “protein on the array” when detecting proteins on the array refers to other proteins that are bound by the interaction with the immobilized protein that is not just the immobilized protein that is bound to the array via the NH group. Also includes protein.
  • detection of proteins on the array analysis refers to the fixed protein on the array and other proteins that interacted with the fixed protein. When protein is immobilized on an array that is detected and analyzed, it interacts with compounds other than proteins, such as low-molecular compounds, and the absorbance changes due to changes in protein structure due to the interaction. It also includes detecting and analyzing structural changes of the protein by measuring changes in absorbance.
  • detection of other compounds that interact with proteins on the array 'analysis refers to the detection and analysis of other compounds other than proteins that interact with proteins immobilized on the array. This means that a compound having absorption of light of a wavelength is measured using light of that wavelength.
  • Fig. 1 shows the configuration of the protein array detection and analysis system of the present invention.
  • the system includes a system control unit including a light irradiation means (optical system) 2, a light detection means 5 such as a CCD digital camera, and a measurement unit including a video data processing means 6 such as a video capture board if necessary.
  • the data processing unit 7 is composed of a substrate 3 capable of transmitting light on which proteins are immobilized at high density.
  • the measurement unit may include an ultraviolet-visible light conversion device 4.
  • a lens or a slit 8 may be included on the optical path from the optical system 2 to the substrate 3.
  • the data processing means can control the operation of the system control unit by means of communication means 9 such as RS232C.
  • the part including light irradiating means and light detecting means for generating light, diffusing, irradiating the protein array, and measuring transmitted light is the spectrophotometer 1, and the present invention is It is also a system that uses a spectrophotometer to detect proteins on a substrate that can transmit light with a high density of immobilized proteins.
  • the spectrophotometer is an apparatus for measuring infrared, visible, and ultraviolet spectrums. In the present invention, preferably, the ultraviolet spectrum is measured. Therefore, in the present invention, a UV-visible spectrophotometer which is widely used can be used.
  • the substrate since the protein immobilized on the substrate is irradiated with light to directly measure the absorbance of the immobilized protein, the substrate needs to be light transmissive.
  • Light transmissivity refers to the property of transmitting ultraviolet light, visible light or infrared light, that is, the property of not absorbing such light.
  • transparent glass such as stone glass or pyrex glass
  • transparent plastic or the like which is desirably used as a transparent substrate, may be used.
  • the substrate when measuring using ultraviolet light, the substrate needs to transmit ultraviolet light.
  • Ultraviolet light measurement cell used in spectrophotometers such as ultraviolet light transmission glass as a substrate that transmits ultraviolet light
  • a glass substrate made of the same material as that of the uvette may be used.
  • a synthetic quartz glass for example, manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.
  • a slide glass made of quartz glass such as synthetic quartz glass or fused silica glass is preferable.
  • a flow system for measuring the interaction between a protein immobilized on a substrate and another protein or another compound other than a protein in a liquid can be constructed. An overview is shown in Figure 2.
  • the glass substrate (array substrate 10) on which protein 11 is immobilized is sandwiched between the glass substrate (cover 12) to be covered with an appropriate spacer, and the inlet of the solution is introduced into one spacer. (Inlet 13), create a flow system easily by creating a solution outlet (exhaust port 14) in the spacer on the opposite side and allowing the solution to flow from the outside. Can do.
  • the flow system is mounted on the protein-immobilized / light-transmitting substrate 3 of the apparatus shown in FIG.
  • the flow system can also be constructed by immobilizing proteins on the glass in the flow channel using a microchip with a micron-order high-precision flow channel formed on a flow channel cell or glass substrate. it can.
  • a flow path substrate and a cover plate in which a flow path is formed are prepared, proteins are immobilized on a portion of the cover plate that contacts the flow path, and then the flow path substrate and the cover plate are joined together to form a microchip.
  • a chip may be manufactured.
  • Commercially available products such as Epi gem's Fluence microchannel tool kit can also be used.
  • the absorbance of the protein on the substrate is directly measured without labeling the protein with a probe such as a fluorescent dye or a reporter, it is necessary to immobilize the protein on the substrate with high density.
  • “Immobilizing at high density” means immobilizing so that the number of protein molecules immobilized per unit area of the substrate increases.
  • the amount of immobilization is not limited, but it is 0.5 nmole or more, preferably 1 nmole or more, more preferably 5 nmole or more, per one type of protein immobilized on the substrate, that is, per spot of area l m 2 , or 0.01 nm mu g / mm 2 or more, 0.05 ⁇ g / mm 2 or more, 0.1 ⁇ g / mm 2 or more, a force is 0. 25 ⁇ g / mm 2 or more, 0.5 ⁇ g / mm 2 or more, preferably 1 mu g / mm 2 or more. If the fixed amount per spot is less than this, it is difficult to measure the direct light absorption using a spectrophotometer.
  • the immobilization density can also be specified by the degree of light absorption on the protein array, and the absorbance at the immobilized protein spot is 0.0005. More than 0.001, more than 0.002, more than 0.003, more than 0.004, more than 0.005, more than 0.006, more than 0.007, more than 0.008, more than 0.009 or more than 0.01, or other proteins or proteins on fixed protein
  • the density at which the change in absorbance when other compounds are bound is 0.0005 or more, 0.001 or more, 0.002 or more, 0.003 or more, 0.004 or more, 0.005 or more, 0.006 or more, 0.007 or more, 0.008 or more, 0.009 or more, or 0.01 or more is desirable.
  • the area of the spot where the protein is fixed is not limited, but it is about 0.1 mm 2 or more and about 10 mm 2 , for example, lmm 2 to 10 mm 2 .
  • the area of the spot where the protein is fixed is not limited, but it is about 0.1 mm 2 or more and about 10 mm 2 , for example, lmm 2 to 10 mm 2 .
  • how to determine the absorbance of the immobilized protein spot will be described later.
  • the orientation-controlled protein immobilization means immobilization of a protein on a substrate at one end of the peptide chain of the protein, for example, immobilization at the carboxy terminal or amino terminal of the peptide chain.
  • Examples of the method for immobilizing proteins by controlling the orientation include the methods described in Japanese Patent No. 2517861, Japanese Patent No. 2990271, Japanese Patent No. 3047029, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-344396.
  • the modified protein After preparing a modified protein by introducing an amino acid sequence consisting of several amino acid residues having a carboxy terminus as a carboxy terminus, the modified protein is immobilized via a mercapto group in the cysteine residue at the carboxy terminus. Can be combined. In this case, NH -R -CO
  • R and R are arbitrary amino acid sequences, Y is a primary amine functional group
  • Protein immobilization can be performed, for example, as follows.
  • the protein array adsorbed on the substrate can be obtained by adsorption binding by ionic bond. Furthermore, the adsorbed protein represented by this formula is treated with a cyanating reagent.
  • a protein array aligned and immobilized on a substrate can be obtained by 2 1 2 1 combination.
  • R and R are arbitrary amino acid sequences, R is strongly negatively charged near neutrality, and the formula (1) NH ⁇
  • R is optional and its amino acid
  • Gly-Gly-Gly-Gly-Gly or the like can be used.
  • a sequence containing a lot of aspartic acid and glutamic acid is preferable.
  • the isoelectric point of a protein depends on the type and number of amino acids. For example, when many basic amino acids such as lysine and arginine are contained, aspartate or glutamate exceeding the total number of basic amino acids is required. A person skilled in the art can easily estimate the isoelectric point of a protein by calculation.
  • a sequence rich in aspartic acid and glutamic acid should be designed so that the isoelectric point of the substance represented by the above formula (1) has a value between 4 and 5.
  • a preferred sequence is alanyl-polyaspartic acid.
  • any solution can be used as long as it is a solvent that guarantees the above-described electrostatic interaction and can dissolve the protein represented by the formula (1) and can adjust the pH. Is possible.
  • various buffers such as phosphate buffer and borate buffer, alcohols such as methanol and ethanol, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and the like can be used.
  • the reaction temperature is a force that can provide high reaction efficiency at room temperature.
  • the solvent used does not freeze or boil, and the protein represented by the above formula (1) does not aggregate as a result of denaturation. be able to.
  • the cyanation reaction can be performed using a cyanation reagent.
  • a cyanating reagent 2-nitro-5-thiocyanobennzoic acid (NTCB) (Y. Degani, A. Ptchornik, Biochemistry, 13,1—1 ⁇ (1 974 ))
  • NTCB 2-nitro-5-thiocyanobennzoic acid
  • CDAP 1-cyan-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate
  • NTCB and CDAP can be used as they are.
  • the SH group can also be cyanated according to the method described in the document O. Wood & Catsipoolas, J. Biol. Chem. 233, 2887 (1963)).
  • the cyanide by cyanogen reagent is expressed on the immobilization substrate by the formula (1) NH-R -CO-NH-R-CO- NH- CH (CH-SH)-CO- NH
  • the protein represented by the above formula (1) and the cyanating reagent may be applied simultaneously to the fixed substrate.
  • the cyanation treatment can be performed by adding a cyanating agent to the surface of the substrate on which the protein is adsorbed.
  • cyanation can be performed by means such as immersing the substrate on which the protein is adsorbed in a cyanating agent.
  • a cyanating reagent may be applied to the portion on the substrate where the protein is adsorbed using the same aligning means.
  • the drugs may be applied simultaneously.
  • a spotter (array machine) can be used for the immobilization of the protein of the present invention.
  • a spotter is a container that contains a protein sample such as a microtiter plate by moving the tip of a pin or a substrate for spotting a protein sample by a high-performance motor under the control of a computer in the XYZ direction. It is a device that carries protein samples to the substrate surface.
  • a commercially available thing can be used as a spotter. Examples of commercially available spotters include SPBIO2000 from Hitachi Software Engineering, GMS417Arrayer from Takara Shuzo, Gene Tip Stamping from Nippon Laser Electronics, and a piezo biochip spotting system from PerkinElmer.
  • a protein array can be prepared by using inkjet printing technology for immobilizing the protein of the present invention.
  • Formula (1) NH—R—CO—NH—R—CO—NH—CH (CH—SH) —CO—NH—R—COOH
  • the amino group represented by NH-Y is introduced into the protein by inkjet printing technology.
  • Ink jet printers used for printing use an element that deforms when a voltage is applied (piezo element) due to differences in the ink ejection method, and the deformation reduces the ink storage space in the head.
  • piezo element There is a piezo method that ejects ink and a thermal ink jet method that generates bubbles by heating the heater in the nozzle and pushes ink by the bubbles.
  • a linter can also be used.
  • a piezo printer is preferable in consideration of denaturation of protein by heat.
  • the ink jet printer a commercially available printer can be used, for example, a commercially available EPSON PM series printer or Canon PIXUS series ink jet printer.
  • a protein solution represented by the above formula (1) may be filled in an ink cartridge of a printer and installed in the printer.
  • the printing pattern of the printer can be set freely by using appropriate software such as drawing software. Even if a line pattern that is fixed in a linear shape is adopted, an arbitrary number of dots (spots) can be formed on a certain area. A fixed dot pattern may be used. At this time, the amount of the protein solution discharged at one time can be freely set. For example, when a line pattern is adopted, a force of several tens of meters may be fixed in a line shape of several millimeters.
  • a line pattern of an arbitrary width can be fixed within this range.
  • one drop of protein solution can be ejected per dot to fix the protein as a circular dot with a diameter of several meters or several millimeters, By adjusting the patterning during printing, dots can be formed in a rectangular shape with a side of several meters to several millimeters.
  • the discharge amount and discharge speed of the protein solution may be appropriately set according to the desired dot pattern.
  • One dot The amount of protein immobilized on one line is as described above. At this time, the concentration of the protein solution used for immobilization is ImM ⁇ : The amount of protein solution to be immobilized as desired by LM. Is preferably about 0.11 to 1001, but is not limited, and the concentration of the protein solution and the amount of the protein solution to be immobilized can be appropriately changed according to the mass of the protein to be immobilized.
  • the number of types or spots of proteins immobilized on one substrate is at least 1, preferably 5 or more, more preferably 10 or more, more preferably 50 or more, particularly preferably 100. That's it.
  • a protein when a protein is immobilized on a substrate, an amino group is introduced onto the substrate, and the amino group is bound to the carboxy terminus of the protein peptide.
  • a matrix capable of polymerizing a primary amine having an amino group on the substrate examples include polyamine, arylamine, and polylysine. These primary amine polymers may be mixed with an appropriate carrier, cast on a substrate, and a film may be formed on the substrate.
  • a carrier for example, a nozzle mouth gel can be used.
  • “Hide mouth gel” refers to a gel containing at least a crosslinked or network structure made of a polymer and water supported or held in the structure (dispersed liquid).
  • the water-soluble or hydrophilic polymer compounds that should give a gel-like gel include methylcellulose, dextran, polyethylene oxide, polypropylene oxide, polybutyl alcohol, poly (vinyl pyrrolidone), poly (vinyl) -bulucacetamide, Butylpyridine, polyacrylamide, polymethacrylamide, poly ⁇ -methyl acrylamide, polyhydroxymethyl acrylate, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyvinyl sulfonic acid, polystyrene sulfonic acid and their salts, poly ⁇ , ⁇ -dimethylamino Examples thereof include ethyl methacrylate, poly ⁇ , ⁇ -jetylaminoethyl methacrylate, poly ⁇ , ⁇ -dimethylaminopropyl acrylamide,
  • Amino-Serrophine (sold by Seikagaku Corporation), AF-Aminotopearl (sold by TOSOH), ⁇ -Sepharose 4 ⁇ and lysine-Sepharose 4 ⁇ (sold by Amersham Almacia), Affigel 102 ( Commercially available carriers having primary amino groups, such as sold by Biorad) and Porous 20 mm (sold by Boehringer Mannheim) may be used.
  • the primary amine polymer and the polyacrylamid For bonding with a carrier such as a metal, it is necessary to polymerize the carrier. For example, ultraviolet irradiation treatment is effective.
  • a silane coupling agent for the bonding between the matrix and the substrate such as glass, for example, a silane coupling agent may be used.
  • the silane coupling agent is a substance capable of forming a covalent bond with both the glass surface and the matrix such as polyacrylamide. Inorganic substances and organic substances can be combined.
  • a silane coupling agent is generally a compound having a structure of R-Si-X3, where X is an alkoxy group such as a methoxy group (-OC H3), which is hydrolyzed to produce a silanol group (Si-OH )become .
  • This silanol group reacts with the silanol group present on the substrate surface, such as hydrogen bonding and dehydration condensation, to form a stable siloxane bond (S-to-O-Si) to form a hydrophobic R- film on the substrate surface.
  • silane coupling agent commercially available ones such as Amersham's nodidosilane (Bind-silane; 3-Methacryloxypropyltrimethylhoxysilane) can be used.
  • the protein immobilized on the substrate is irradiated with light, and the absorption of light by the protein is measured.
  • the absorption of ultraviolet light by the protein is preferably measured by irradiating the protein immobilized on the ultraviolet transparent substrate with ultraviolet light.
  • a spectroscope may be used as the light irradiation means.
  • the spectrometer any of a spectrometer using an optical filter, a dispersion spectrometer, and a Fourier transform spectrometer can be used.
  • ultraviolet light is used as irradiation light, a dispersive spectrometer is desirable.
  • the light to be used any of ultraviolet light, visible light, and infrared light can be used.
  • the wavelength is 200 to 310 nm.
  • ultraviolet light having a wavelength of about 280 nm, 224 to 236 nm, or 205 nm that is absorbed by the protein is desirable.
  • light having a characteristic absorption wavelength of the compound may be used.
  • the wavelength of light to be irradiated may be fixed to a fixed wavelength, or may be measured at a plurality of wavelengths after fixing the wavelength. Also, the wavelength may be changed. By measuring while changing the wavelength, the absorption spectrum of the protein on the protein array or a compound other than the protein interacting with the protein can be measured.
  • a commercially available spectrophotometer can be used for measurement by mounting a substrate on which the protein of the present invention is immobilized in a cell chamber in which the spectrophotometer cell is mounted.
  • a substrate on which the protein of the present invention is immobilized in a cell chamber in which the spectrophotometer cell is mounted Tampa
  • the surface on which the quality is fixed may be directed to the light irradiation means side or the opposite light detection means side.
  • a lens or slit can be provided on the optical path for irradiating the substrate with light from the light irradiating means to adjust the width of the optical path, etc., so that light can be applied to the necessary part of the substrate.
  • the transmitted light at each spot is measured at once by irradiating the entire fixed protein spotted on the substrate with light.
  • a one-dimensional photodetector it is only necessary to move the light irradiation means so that only a specific spot on the substrate is irradiated with light and irradiate all spots with light. . In this case, the photodetector is moved simultaneously with the movement of the light irradiation portion.
  • the light When light is irradiated onto a substrate on which a protein is immobilized, the light is absorbed by a compound other than the protein bound to the immobilized protein, the protein bound to the immobilized protein, and the protein bound to z or the immobilized protein.
  • the In the present invention light transmitted through the substrate without being absorbed is measured.
  • a light detection means is used for the measurement of transmitted light.
  • the light detection means is a means for outputting the light intensity as an electric signal, and either an internal photoelectric effect type photodetector or an external photoelectric effect type photodetector can be used.
  • the internal photoelectric effect detector is a detector that uses charge separation in semiconductors by light, and detects a potential difference from a photoconductive detector that detects changes in electrical conductivity due to carriers generated by charge separation.
  • Photoconductive detectors include charge coupled devices (CCD), photodiodes (PD), and photodiode arrays (PDA).
  • External photoelectric effect photodetectors include phototubes and photomultipliers that detect photoelectron-powered electrons in a vacuum using incident photons and detect the electrons directly or after amplification.
  • a force multi-channel detector PDA or CCD that can use any of these light detection means is more desirable, and a two-dimensional multi-channel detector CCD is more desirable. It is also possible to use IPDA or ICCD, which is a PDA or CCD with an electron multiplication function using a microchannel plate. In the present invention, IPD A and ICCD are included in PDA and CCD, respectively.
  • the CCD When measuring transmitted ultraviolet light using ultraviolet light as irradiation light, the CCD must be compatible with ultraviolet light.
  • Texas Instruments For example, IMPACTR ON TM CCD elements such as TC253SPD-30 / TC253SPD-B0 TC285SPD-30 / TC285SPD-BO manufactured by HORIBA Joban Yvon can be used. A commercially available CCD camera using these elements may also be used.
  • IMPACTROM TM CCD digital cameras such as MC681SPD MC285SPD-LOBO manufactured by Texas Instruments.
  • the CCD for ultraviolet light is very expensive. When used in commercially available CCD digital cameras and corresponding to UV light!
  • an ultraviolet-visible light conversion device which is a nonlinear optical material, may be used.
  • An ultraviolet-visible light conversion device is a device that converts ultraviolet light into visible light, such as wavelength conversion glass such as fluorescent glass, fluorescent materials such as fluorescent pigments, silver salt sensitizers and non-silver salt sensitizers. Agents.
  • fluorescent glass is desirable, and fluorescent glass contains rare earth ions that become fluorescently active ions, and is converted to visible light of 400 nm or more by irradiating 200 400 ultraviolet light.
  • Fluorescent glass for example, Lumilas-G9, Lumilus-R7, Lumilus-B, etc.
  • the fluorescent glass may be placed between the ultraviolet light transmissive substrate on which the protein is immobilized and the light detection means.
  • the fluorescent pigment or sensitizer may be applied to a glass plate and placed between the ultraviolet light transmissive substrate on which the protein is immobilized and the light detection means. It may be applied to the opposite side of the hazy UV light transmissive substrate. In the latter case, the surface on which the protein is immobilized is irradiated with ultraviolet light.
  • the ultraviolet light transmitting substrate on which the protein is immobilized is irradiated with ultraviolet light, and the ultraviolet light that is not absorbed by the fixed protein or the visible light in which the ultraviolet light power is also converted is detected. Detect with.
  • a signal is output as image data or video data from the light detection means, and the signal is processed by the analysis means, and the absorbance of the protein on the substrate is measured.
  • the type of image data is not limited.
  • image data can be obtained as a BMP image and processed.
  • the light intensity of each spot on the substrate is determined.
  • processing data can be displayed in different colors for each spot depending on the difference in absorption. It corresponds to the 2D coordinates on the substrate by displaying the 3D coordinates with the absorbance displayed in height.
  • Video data can be obtained by imaging a substrate on which a protein is immobilized with a video camera having a CCD. By obtaining video data, protein absorption on the substrate can be analyzed in real time. To process video data in real time, you can use a video capture board and commercially available software, such as Direct X (manufactured by Windows)!
  • the protein on the substrate was immobilized, and the intensity of light transmitted through the site and the intensity of light transmitted through the site immobilized on the protein were measured to fix the protein. Then, the transmittance of the light transmitted through the portion where the protein is immobilized is calculated as 100% transmitted light that is not absorbed by the light transmitted through the portion.
  • the data obtained by the light detection means is structured as pixels. When the protein is immobilized, the data on the light intensity for a plurality of pixels is obtained and averaged at any site (I Furthermore, protein is fixed
  • the light intensity data can be obtained and averaged for multiple pixels, and the light transmittance of each spot can be obtained (1).
  • Absorbance can be determined by -log (1 1 1). In this case, force immobilization density or
  • the immobilization density of the immobilization protein to be measured can be obtained by obtaining the relationship between the immobilization density and the absorbance.
  • the absorbance of a standard protein of density D is As
  • the absorbance of a test protein whose density is unknown is At
  • the density of the test protein can be obtained by the formula D X (At / As).
  • a standard protein of known density may be immobilized on the substrate as a control spot.
  • the ultraviolet light applied to the substrate on which the protein is immobilized may be ultraviolet light fixed at a fixed wavelength, or the lnm force may be scanned at intervals of several tens of nm. Oh ,.
  • Light absorption at a spot on the substrate can be measured by causing a contact reaction between the immobilized protein and another protein interacting with the protein or a compound other than a protein such as a low molecular weight compound.
  • the interaction between the immobilized protein and the ligand protein that binds to the protein can be detected and analyzed.
  • the fixed key tamper The interaction between proteins and ligands other than proteins can be detected and analyzed.
  • an antibody or antigen is immobilized at a constant density, reacted with an antibody or antibody that specifically binds to the antibody or antigen, and then immobilized by measuring the absorption of the protein on the substrate. The amount of antibody or antigen bound to the antigen or antibody can be measured.
  • the absorbance on the protein array is measured before and after the contact reaction between the immobilized protein and another protein or non-protein compound
  • the measured value before the contact reflects the absorbance of the fixed protein only
  • the measured value after contact reflects the complex where the immobilized protein interacts with other proteins or compounds other than proteins. Therefore, by taking the difference in absorbance before and after contact, the amount of other proteins or compounds other than proteins that interact with the immobilized protein can be determined.
  • the amount of protein interacted and the amount of other proteins interacted can be measured.
  • the absorption change in the ultraviolet region derived from the absorption of the amino acid side chain accompanying ligand binding can be used. For example, by changing the concentration of a ligand that does not absorb in the ultraviolet region and measuring the change in absorbance at a specific wavelength in the ultraviolet region or the change in absorption spectrum in the ultraviolet region due to ligand binding, it is an indicator of the strength of ligand binding. The coupling constant can be obtained. In addition, since many proteins do not absorb in the visible region, for ligands that absorb in the visible region, the change in absorbance at a specific wavelength in the visible region or the change in absorption spectrum in the visible region is measured. Then, a binding constant representing the binding of the target ligand or the strength of the binding can be obtained.
  • a protein array base material was produced by forming a polyacrylamide gel thin plate containing a polymer having an amino group on the surface of quartz glass. Since this substrate absorbs almost no light in the visible or ultraviolet wavelength region (is transparent), the optical activity of the protein present in the gel can be directly detected. That is, it is possible to detect and analyze an immobilized protein and a protein that interacts with the immobilized protein without performing a special labeling operation by an optical method.
  • green fluorescent protein SEQ ID NO: 1
  • dihydrofolate reductase SEQ ID NO: 4
  • the green fluorescent protein is green under natural light and can be easily confirmed with the naked eye, it was used to monitor the process of fixation.
  • Dihydrofolate reductase on the other hand, has the property of absorbing UV light around 280, similar to general proteins, so it can be used for testing to detect its optical activity on the array after fixation. Used as a protein.
  • bind silane was processed into quartz glass (7.7cm x 2.6cm x 1mm slide glass size, VIOSIL-SG2AS; purchased from Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) After that, a polyacrylamide gel thin plate (2.4 cm ⁇ 5.0 cm ⁇ about 50 / zm) containing a polymer having an amino group (poly L lysine having a molecular weight of 30,000 to 70,000; purchased from Sigma) was formed.
  • Nodosilane (purchased from Amersham) has a property of forming a covalent bond with both the quartz glass slide and the polyacrylamide molecule, and was used to firmly bond both.
  • bind silane to quartz slide glass Introduced to the surface. Prepare a solution of 8 ml ethanol, 0.2 ml acetic acid, 1.8 ml pure water, and 101 bind silane, drop it on a 0.5 ml quartz glass slide in a fume hood, and use Kimwipe to make a glass. The whole surface was spread and dried for 1.5 hours.
  • a polyacrylamide gel thin plate was formed on the surface of the quartz slide glass into which bound silane had been introduced in the following manner.
  • a 37.5: 1 mixture of acrylamide and methylenebisatarylamide purchased from Bio-Rad
  • poly L lysine poly L lysine with a molecular weight of 30,000 to 70,000; purchased from Sigma
  • the polyacrylamide concentration is 10% and the poly L lysine concentration is 0.5%.
  • a solution was prepared on lml ice.
  • a protein for immobilization (SEQ ID NO: 3) corresponding to COOH was prepared, and the conditions for the immobilization reaction were examined.
  • Recombinant Escherichia coli expressing the green fluorescent protein for immobilization was cultured at 37 ° C in 2 liters of medium (containing 10 g sodium chloride, 10 g yeast extract, 16 g tryptone, 280 mg ampicillin sodium). After overnight culture, the culture broth was centrifuged at a low speed for 20 minutes (5000 rotations per minute) to obtain cells having a wet weight of about 5 g. This was suspended in a 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 30 ml of ImM ethylenediamine 4 acetic acid (EDTA), and the cells were disrupted using a French press device to obtain a cell-free extract.
  • medium containing 10 g sodium chloride, 10 g yeast extract, 16 g tryptone, 280 mg ampicillin sodium. After overnight culture, the culture broth was centrifuged at a low speed for 20 minutes (5000 rotations per minute) to obtain cells having a wet weight of about 5 g. This was suspended in a 10
  • Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp as a sequence for immobilization at the carboxy terminus of the dihydrofolate reductase mutant enzyme (abbreviated as AS-DHFR) (SEQ ID NO: 4)
  • AS-DHFR dihydrofolate reductase mutant enzyme
  • SEQ ID NO: 2 The sequence (SEQ ID NO: 2) is attached and the formula (1) NH-R -CO-NH-R-CO- NH- CH (CH-SH)-CO- NH
  • Optical activity in the outside line region was used for detection on the array.
  • a DNA sequence obtained by adding the ribosome binding sequence necessary for gene expression and the restriction enzyme cleavage site necessary for vector integration to the DNA sequence encoding SEQ ID NO: 5 was synthesized, and expressed in the EcoRI and Hindlll sites of the expression vector PUC18. Integration and recombinant plasmids were made. This was introduced into Escherichia coli JM109 and expressed as described below, followed by separation and purification. [0089] Recombinant Escherichia coli expressing AS-DHFR for fixed yeast was cultured in 2 liters of medium (containing 10 g of sodium chloride, 10 g of yeast extract, 16 g of tryptone, 280 mg of ampicillin sodium).
  • the culture was centrifuged at a low speed for 20 minutes (5000 rotations per minute) to obtain cells having a wet weight of about 5 g. This was suspended in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 30 ml of ImM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), and the cells were disrupted using a French press device to obtain a cell-free extract.
  • 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 30 ml of ImM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)
  • the green fluorescent protein for immobilization or the AS-DHFR for immobilization was adsorbed and aligned as follows. Attach a microload pipette tip (purchased from QSP) with a tip opening radius of approximately 0.5 mm to a syringe for microphone mouth injection (purchased from Norton Milton) with a capacity of 10 ⁇ 1.
  • a microload pipette tip purchased from QSP
  • a syringe for microphone mouth injection purchased from Norton Milton
  • the holder was moved in three directions, up, down, left, right, and back, to make a protein spot device. Using this device, it was possible to control protein spotting in units of 0 • 5 mm for position and 0.1 ⁇ 1 for solution volume.
  • protein solutions having concentrations of 10 mg / ml, 20 mg / ml, and 40 mg / ml were spotted 0.21 at a time.
  • 0.5 g, 1 g, 2 g, 4 g, and 8 g of green fluorescent protein were spotted at different strength points.
  • the protein solution formed droplets with a diameter of about 1 mm on the surface of the gel, but was quickly absorbed into the gel.
  • the spot condition was observed by immersing the array substrate in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0). Spot diffusion was observed when 0.5 g, 1 ⁇ g, or 2 g of protein was used.
  • the optical activity of the immobilized protein was measured.
  • the equipment used for the measurement is as follows.
  • Shimadzu UV-1200 or AVIV-ATG14 was used as the light source for light irradiation.
  • the former is characterized by the fact that the slit width cannot be adjusted, and the output is relatively low at about 30W (0.3mA x 100V).
  • the latter uses a Xenon lamp (450W), and the slit width can be adjusted.
  • An observation system was constructed by moving the light path from the light source's diffraction grating power to the outside using a UV mirror placed in front of the cell holder.
  • Figure 4 shows the optical system diagram (light path) of the observation system of Shimadzu UV-1200. In the row optical system diagram of Fig. 4, the wavelength is set on the device control side because the diffraction grating is in the optical system.
  • FIG. 5 shows an optical system diagram when the AVIV ATF104 is used.
  • a light source is installed on the left side of the device, and the light moves as shown by the arrow.
  • the mirror holder 1 (cell holder) was installed in the 1 part, the mirror holder 1 (cell holder) in the 2 part, the mirror 2 in the 3 part, and the CCD camera in the 4 part.
  • the CCD camera used was Logitech Qcam QV-700N from Logitech.
  • the resolution of the CCD was 300,000 pixels.
  • the gain adjustment of the CCD element was performed using the application attached to the CCD camera.
  • the focal length to the CCD camera is also 18cm or more in the mirror force of part 3 in the figure.
  • the protein-immobilized substrate to be mounted on the substrate holder is spotted with DHF R at ⁇ l to 2 mm in the range of 20 mm x 20 mm on the substrate glass made of synthetic quartz glass as described in [1] to [5] above. Immobilized.
  • the amount of protein per spot was 10, 15 and 20 g.
  • As an ultraviolet-visible conversion device Lumilas B manufactured by Sumita Optical Glass Co., Ltd. was used.
  • Figure 6 shows a schematic diagram of a glass substrate on which AS-D HFR is fixed. As shown in Fig. 6, AS-DHFR fixed glass substrate and fluorescent glass were combined.
  • the diameter of the spot was 1 to 2 mm, the size of the light cross section on which the light hit was 20 mm X 20 mm, and the distance between the spots was less than 4 mm.
  • the amount of immobilized protein in each spot was 10, 15 and 20 ⁇ g / spot from the right column, respectively, as shown on the right of FIG.
  • Ultraviolet light with a wavelength of 280 nm was irradiated, and the fluorescent light irradiated from the fluorescent glass was imaged.
  • the imaging conditions were shutter speed 1/30, gain max, and image size 3 20 X 240.
  • Figure 7 shows the image taken on the left.
  • the spot portion where DHFR is fixed is purple due to the fixed DHFR. Since fluorescent light is not emitted from fluorescent glass, which absorbs external light and weakly transmits ultraviolet light, only the spot portion is not illuminated. Under the above conditions, since the immobilization density was too high, the absorption was too large, and the absorbance measurement was saturated.
  • the emission intensity from the glass was defined as I, and it was determined by log (I / 1). Four spots at each concentration
  • Figure 9 shows the results of plotting the average absorbance and the wavelength of the ultraviolet rays irradiated with the error bar. From the absorbance at 280 nm, the linear density of the protein at each point where 0.5, 1, 2 and 4 g were spotted was calculated according to the molecular extinction coefficient of AS-DHFR. Estimates were cm, 2.8 nmoles / cm, and 4.7 nmoles / cm. In addition, by fitting the absorbance value at each wavelength to the spectrum in the AS-DHFR solution, 0.7 M (the spectrum indicated by the curve in Fig. 1) and 1.3 ⁇ (the curve in Fig. 2), respectively.
  • the measurement of the present invention showed that the absorption spectrum of the immobilized protein closely matched that in solution.
  • the spectrum strength increased in proportion to the amount of protein required for fixation, and that quantitative analysis of the fixed protein could be performed.
  • the density of proteins spotted and immobilized using 0.5, 1, 2, and 4 g of AS-DHFR is calculated assuming that the molecular weight of AS-DHFR is 18000.
  • the fixed protein is fixed. It is conceivable that the density of 0.01 ⁇ g / mm 2 can be sufficiently accommodated.

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Abstract

【課題】　タンパク質アレイ基板上にタンパク質を配向制御して高密度で固定化し、紫外光、可視光または赤外光を固定化タンパク質に照射し、タンパク質に吸収されなかった光を測定することにより、基板上のタンパク質を検出し、さらに基板上のタンパク質と他のタンパク質および／またはたんぱく質以外の化合物との相互作用を解析する方法および装置の提供、ならびに該システムに適合したタンパク質アレイの提供。 【解決手段】　光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイ、光照射手段、光検出手段を含むタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステムであって、光照射手段によりタンパク質アレイに光を照射し、光検出手段によりタンパク質アレイを透過した光を測定することによりアレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および／またはタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。

Description

明 細 書
タンパク質アレイ用検出および解析システム
技術分野
[0001] 本発明は、タンパク質を高密度で整列固定ィ匕したタンパク質アレイ上のタンパク質 ならびに該タンパク質と他のタンパク質および Zまたはタンパク質以外の化合物の相 互作用を、タンパク質の紫外、可視または赤外光城での吸収を分光光度計を用いて 測定することにより検出 ·解析するシステムに関する。
背景技術
[0002] 遺伝子にコードされている未知のタンパク質の機能を探り、また多数個のタンパク 質の複雑な相互作用を一度に解析する手段としてタンパク質アレイ (タンパク質チッ プ）は新たな可能性を提供する技術である。タンパク質アレイはタンパク質やべプチ ドを基板上に並べたものであり、種々のタンパク質アレイについて報告されている（特 許文献 1および 2参照)。タンパク質アレイ技術において、適当な基板上にタンパク質 を固定ィ匕し、該固定ィ匕タンパク質に他のタンパク質等を相互作用させ、相互作用した アレイ上のスポットを検出していた。
[0003] アレイ上のスポットの検出方法としては、蛍光色素等でラベルした固定化タンパク質 と相互作用し得る化合物を用い、アレイ上に存在する蛍光色素力 発せられる蛍光 を測定していた。しかし、この方法においてはラベル標品を調製する必要があり、また タンパク質をラベルすることにより、タンパク質の活性が低下することがあると!、う問題 点もあった。さらに、蛍光測定機器等でアレイを測定できる機器はそれほど普及して おらず、さらにタンパク質の相互作用をリアルタイムで解析することはできなかた。
[0004] この問題点を解決するために、表面プラズモン共鳴 (Surface Plasmon Resonance; S PR)イメージング法を利用して検出する方法が開発されて 、る（非特許文献 1および 2 参照)。この方法は、タンパク質アレイ上に偏光光束を照射し、その反射光を SPR像と して得て、 SPR像の反射光強度を解析することにより、アレイ上に固定ィ匕されたタンパ ク質を検出する方法である。該方法はラベルを必要とせず、リアルタイムで検出する ことができるという利点があった。し力しながら、 SPRイメージング法によっても、固定ィ匕 したタンパク質と低分子物質との相互作用の解析に用いることはできず、該方法はダ イナミックレンジが狭いという問題もあった。さらに、 SPRイメージングに用いる機器は、 極めて高価であり、検出システムの構築は容易ではないという問題点もあった。
[0005] また、タンパク質アレイに水晶発振子を組込んで、検出する方法も報告されている（ 非特許文献 3参照）が、この方法も上記 SPRイメージング法を利用した方法と同様な 問題点があった。
[0006] さらに、顕微フーリエ変換赤外分光法 (顕微 FT-IR)を利用して、検出する方法も報 告されている（特許文献 3参照）が、測定機器が高価であり、必ずしも定量には適して いなかった。
[0007] 特許文献 1：特表 2002-520618号公報
特許文献 2：特表 2002-502038号公報
特許文献 3：特開 2004-45390号公報
非特許文献 1 : Nelson, B. P. et al, Anal Chem. 71(18)3928-3934(1999)
非特許文献 2 : Brockman, J.M. et al., Annu. Rev. Phys. Chem, 51, 41-63 (2000)) 非特許文献 3 : Y. Okahata, et al. J. Am, Chem. Soc, 114, 8299-8300 (1992) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明者は、従来用いられて 、たタンパク質アレイおよびタンパク質アレイを用い た検出'解析システムの上記問題点を解決すベぐアレイ基板上にタンパク質を配向 制御して高密度で固定ィ匕し、紫外光、可視光または赤外光を固定ィ匕タンパク質に照 射し、タンパク質に吸収されな力つた光を測定することにより、基板上のタンパク質を 検出し、さらに基板上のタンパク質と他のタンパク質および Zまたはタンパク質以外 の化合物との相互作用を解析する方法および装置の提供、ならびに該システムに適 合したタンパク質アレイの提供を目的とする。特に、アレイ基板として紫外光透過性の 基板を用い、タンパク質が固定化された基板に紫外光を照射することにより、タンパク 質により吸収されな力つた紫外光を測定し、基板上のタンパク質を検出し、さらに基 板上のタンパク質と他のタンパク質またはタンパク質以外の化合物、特にタンパク質 と相互作用し得る低分子化合物との相互作用を解析する方法および装置の提供、な らびに該システムに適合したタンパク質アレイの提供を目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明は、従来技術の問題点に鑑み、蛍光色素等によるタンパク質のラベリングの 必要がなぐなおかつ安価で入手可能な機器を利用したタンパク質アレイを用いたタ ンパク質とタンパク質および Zまたは他の物質との相互作用の検出 ·解析システムを 開発すべく鋭意検討を行った。
[0010] 従来法においては、微小量の検出に対応すベぐアレイ基板上へタンパク質をフエ ムトモル (f moles)オーダーからピコモル (p moles)オーダーで固定化しており、微小量 のタンパク質を検出するために、蛍光色素等でラベリングを行ったり、 SPRのような特 別な機器を要するシステムを用いていることに着目した。本発明者は先に、アレイ基 板上にタンパク質を配向制御させて高密度で固定ィ匕する方法を完成させており（特 許第 2517861号公報、特許第 2990271号公報、特許第 3047029号、特開 2003-34439 6号公報等）、この方法によれば従来より 1オーダーから、 2オーダー上回る應 ole/cm 2オーダーで基板上にタンパク質を固定ィ匕することができる。本発明者は、この高密 度でタンパク質を固定ィ匕したタンパク質アレイを用いることにより、蛍光色素でラベリ ングしたり、高価な機器を用いることなぐ一般に普及しており比較的安価で入手でき る分光光度計を用いて、アレイ上のタンパク質をタンパク質の光学的活性を測定する ことにより測定し得ることを見出した。すなわち、基板上にタンパク質が高密度で大量 に固定ィ匕されているので、該固定ィ匕タンパク質にタンパク質または固定ィ匕タンパク質 と相互作用する物質が吸収する波長の光を照射することにより、照射した光がアレイ 上のタンパク質またはタンパク質と相互作用する物質に吸収される。そして、吸収さ れずに透過した光の強度を測定することにより、固定ィ匕タンパク質またはタンパク質と 相互作用する物質による吸収を測定することができ、アレイ基板上のタンパク質また はタンパク質と相互作用する物質を光学的活性を利用して直接測定し得ることを見 出した。特に、タンパク質は紫外光を吸収するが、石英ガラス等の紫外光透過性の 基板を用いることにより、タンパク質に吸収されな力つた紫外光をタンパク質が固定ィ匕 されたアレイ基板を通る透過光として測定することができた。ここで、アレイ上に固定 化された各タンパク質スポットにおける光透過を一度に測定するためには、 CCD等の 2次元光検出器の使用が望まれる力 紫外光を検出し得る 2次元光検出器は、極め て高価であり、容易にシステムを構築することはできな力つた。そこで、本発明者らは 、タンパク質を固定ィ匕した基板を透過した紫外光を、蛍光ガラス等の紫外-可視光変 換デバイスを用いて可視光に変換することにより、安価で入手し得る CCDを用いるこ とをできるよう〖こし、本発明を完成させるに至った。
[0011] すなわち、本発明の態様は以下のとおりである。
[1] 光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定ィ匕したタンパク質アレイおよ び分光光度計を含む、タンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパ ク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析するシステムであって 、分光光度計を用いて前記タンパク質アレイに光を照射し、タンパク質アレイを透過 した光を測定することによりアレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と 相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定し、タンパク質ァレ ィ上のタンパク質および Zまたはタンパク質以外の他の化合物を検出 ·解析するシス テム。
[0012] [2] 光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定ィ匕したタンパク質アレイ、光 照射手段、光検出手段を含む、タンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定 化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析するシステム であって、光照射手段によりタンパク質アレイに光を照射し、光検出手段によりタンパ ク質アレイを透過した光を測定することによりアレイ上のタンパク質および Zまたは固 定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定 し、タンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたはタンパク質以外の他の化合物を 検出'解析するシステム。
[0013] [3] さらに、データ処理手段を含む、 [2]のタンパク質アレイ上のタンパク質および Z または固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析 するシステム。
[0014] [4] タンパク質がタンパク質アレイの 1スポット当たり 0.01 g/mm2以上の密度で固定 化されて!/、る [1]〜[3]の!、ずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは 固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析するシ ステム。
[0015] [5] タンパク質がタンパク質アレイの 1スポットにおける吸光度が 0.001以上となる密度 で固定されて 、る [1]〜[3]の!、ずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および Zま たは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析す るシステム。
[0016] [6] 高密度で整列固定化したタンパク質力 式 NH - R - CO-NH-R - CO-NH-Y [
2 1 2
式中、 Rおよび Rは任意のアミノ酸配列を表し、 Yは基板を表す]で示される、 [1]〜[5
1 2
]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および zまたは固定化タンパク質と相 互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析するシステム。
[0017] [7] 光透過性ガラスの表面にキャストされた一級アミンを含む担体とタンパク質のアミ ノ酸配列の C末端のカルボキシ基が共有結合してタンパク質が整列固定化された、 [ 1]〜[6]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定化タンパ ク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析するシステム。
[0018] [8] 光検出手段が CCDまたはフォトダイオードアレイである、 [1]〜[7]のいずれかの タンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタ ンパク質以外の他の化合物を検出'解析するシステム。
[0019] [9] タンパク質アレイに照射される光が紫外光であり、光透過性基板が紫外光透過 性基板である [1]〜[8]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは 固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析するシ ステム。
[0020] [10] 紫外光透過性基板が石英ガラス製基板である [9]のタンパク質アレイ上のタン ノ^質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合 物を検出 ·解析するシステム。
[0021] [11] タンパク質アレイを透過した紫外光を紫外-可視光変換デバイスに照射し、紫 外光から可視光に変換された光を検出する [9ほたは [10]のタンパク質アレイ上のタ ンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化 合物を検出'解析するシステム。
[0022] [12] 紫外-可視光変換デバイスが蛍光ガラスである [11]のタンパク質アレイ上のタ ンパク質および zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化 合物を検出'解析するシステム。
[0023] [13] タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と検体を接触させ、接触前後に おけるタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用 するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、固定化タン ノ^質と相互作用する検体中のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互 作用するタンパク質以外の他の化合物を検出する、 [1]〜[12]のいずれかのタンパク 質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質 以外の他の化合物を検出'解析するシステム。
[0024] [14] タンパク質アレイ上に固定ィ匕されたタンパク質と他のタンパク質および Zまたは 固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を接触させ、接触前 後にわたってタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相 互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、固定 化タンパク質とタンパク質またはタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析す る、 [1]〜[12]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定化タ ンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析するシステム。
[0025] [15] 光透過性基板が、内部に流路が形成されたフローチャンネルセルまたはマイク 口チップであり、該流路内にタンパク質が固定化されており、検体を該流路を通すこと により、固定ィ匕タンパク質と検体中のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と 相互作用するタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、 [1]〜[12]の いずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定化タンパク質と相互 作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析するシステム。
[0026] [16] 光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定ィ匕したタンパク質アレイに 分光光度計を用いて光を照射し、タンパク質アレイを透過した光を測定することにより アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以 外の他の化合物による光の吸収を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および Z または固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析 する方法。 [0027] [17] タンパク質がタンパク質アレイの 1スポット当たり 0.01 /z g/mm2以上の密度で固 定ィ匕されている [16]のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパ ク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析する方法。
[0028] [18] タンパク質がタンパク質アレイの 1スポットにおける吸光度が 0.001以上となる密 度で固定されている [16]のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タ ンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析する方法。
[0029] [19] 高密度で整列固定化したタンパク質力 式 NH - R - CO-NH-R - CO-NH-Y
2 1 2
[式中、 Rおよび Rは任意のアミノ酸配列を表し、 Yは基板を表す]で示される、 [16]〜
1 2
[18]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定化タンパク質 と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析する方法。
[0030] [20] 光透過性ガラスの表面にキャストされた一級アミンを含む担体とタンパク質のァ ミノ酸配列の C末端のカルボキシ基が共有結合してタンパク質が整列固定化された、 [16]〜[19]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定化タン パク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析する方法。
[0031] [21] 光検出手段が CCDまたはフォトダイオードアレイである、 [16]〜[20]のいずれ かのタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用す るタンパク質以外の他の化合物を検出 ·解析する方法。
[0032] [22] タンパク質アレイに照射される光が紫外光であり、光透過性基板が紫外光透過 性基板である [16]〜[21]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまた は固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析する 方法。
[0033] [23] 紫外光透過性基板が石英ガラス製基板である [22]のタンパク質アレイ上のタ ンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化 合物を検出 '解析する方法。
[0034] [24] タンパク質アレイを透過した紫外光を紫外-可視光変換デバイスに照射し、紫 外光から可視光に変換された光を検出する [22]または [23]のタンパク質アレイ上の タンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の 化合物を検出 ·解析する方法。 [0035] [25] 紫外-可視光変換デバイスが蛍光ガラスである [24]のタンパク質アレイ上のタ ンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化 合物を検出 '解析する方法。
[0036] [26] タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と検体を接触させ、接触前後に おけるタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用 するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、固定化タン ノ^質と相互作用する検体中のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互 作用するタンパク質以外の他の化合物を検出する、 [16]〜[25]の 、ずれかのタンパ ク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク 質以外の他の化合物を検出'解析する方法。
[0037] [27] タンパク質アレイ上に固定ィ匕されたタンパク質と他のタンパク質または固定ィ匕タ ンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を接触させ、接触前後にわた つてタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定ィ匕タンパク質と相互作用す るタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、タンパク質とタ ンパク質またはタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、 [16]〜[25] のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定化タンパク質と相 互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析する方法。
[0038] [28] 光透過性基板が、内部に流路が形成されたフローチャンネルセルまたはマイク 口チップであり、該流路内にタンパク質が固定化されており、検体を該流路を通すこと により、固定ィ匕タンパク質と検体中のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と 相互作用するタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、 [16]〜[25]の いずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定化タンパク質と相互 作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析する方法。
[0039] [29] 式 NH - R - CO- NH- R - CO- NH- Y [式中、 Rおよび Rは任意のアミノ酸配列
2 1 2 1 2 を表す]で示されるタンパク質が高密度で整列固定ィ匕したタンパク質アレイであって、
Yで表される固定ィ匕基板が光透過性ガラス製であるタンパク質アレイ。
[0040] [30] 光透過性ガラスが紫外光透過性ガラスである [29]のタンパク質アレイ。
[0041] [31] 紫外光透過性ガラスが石英ガラスである [30]のタンパク質アレイ。 [0042] [32] タンパク質がタンパク質アレイの 1スポット当たり 0.01 /z g/mm2以上の密度で固 定化されて 、る [29]〜[31]の!、ずれかのタンパク質アレイ。
[0043] [33] タンパク質がタンパク質アレイの 1スポットにおける吸光度が 0.001以上となる密 度で固定されて 、る [29]〜[31]の!、ずれかのタンパク質アレイ。
[0044] [34] 光透過性ガラスの表面にキャストされた一級アミンを含む担体とタンパク質のァ ミノ酸配列の C末端のカルボキシ基が共有結合してタンパク質が整列固定化された [
29]〜[33]の!、ずれかのタンパク質アレイ。
発明の効果
[0045] 本発明にお 、て用いるタンパク質アレイは、光透過性の基板上にタンパク質を配向 制御して高密度で固定ィ匕してあるため、光を照射して基板を透過した光を測定する ことにより、タンパク質による光の吸収を求めることができ、光の吸収力もタンパク質ァ レイ上のタンパク質の量を測定することができる。このため、従来法のように、蛍光色 素等でラベルしたィ匕合物等を検出に用いる必要がなぐ基板上のタンパク質の量を タンパク質の光学活性を測定することにより直接測定することができる。さらに、本発 明は、紫外光、可視光、赤外光を測定するため、広く普及している分光光度計を用 いて容易にタンパク質アレイ上のタンパク質量を測定することができる。特に、タンパ ク質の定量手段として広く行われて 、る、紫外光吸収を用いてタンパク質アレイ上の タンパク質を正確に測定することができる。さらに、光検出手段として CCD等の 2次元 光検出手段を用いることにより、タンパク質アレイ上の各スポットのタンパク質を一度 に迅速に測定することができる。また、紫外光を透過し得る基板と紫外光を可視光に 転換しえる蛍光ガラス等の紫外-可視変換デバイスを用いることにより、容易に安価 で入手できるデジタルカメラ用の CCDを使用することができ、システム構築にかかる 費用も少なくてすむ。
[0046] また、タンパク質と他のタンパク質もしくはタンパク質以外の化合物との結合等の相 互作用をアレイ上のタンパク質の吸光の変化あるいはタンパク質以外の化合物の吸 光を測定することにより解析することもできる。
図面の簡単な説明
[0047] [図 1]本発明のシステムを示す図である。 [図 2]フローシステムの概要を示す図である。図 1のタンパク質固定ィ匕光透過性基板 3 の位置に装着される。
[図 3]緑色蛍光タンパク質を固定ィ匕したアレイ用基材を自然光下で撮影した図である
[図 4]実施例で用いた観測系の光学系統図 (光路)を示す図である。
[図 5]分光光度計 AVIV ATF104を用いた場合の光学系統図を示す図である。
[図 6]タンパク質固定ィ匕基板と蛍光ガラスを組み合せたものを示す図である。
[図 7]DHFR固定化スライドガラスと蛍光ガラスを組合せ、 280nmの波長の紫外光を照 射し、蛍光ガラスから照射される蛍光を撮像した図である。図 7右図は、各スポットに 用いられたタンパク質量を示して 、る。
[図 8]0.5 〜 4 g/スポットで DHFRを固定ィ匕したスライドガラスと蛍光ガラスを組合せ 、 280nmの波長の紫外光を照射し、蛍光ガラスから照射される蛍光を高解像度 CDD で撮像した図である。図 8右図は、各スポットに用いられたタンパク質量を示している
[図 9]280nmから 310nmまでの波長範囲で 5nmおきに紫外線を照射して測定した各ス ポットにおける吸光度すなわち、吸収スペクトルを示す。図中 X、▲、〇及び參は、そ れぞれ 0.5、 1、 2および 4 g/スポットでの平均値 (各々 4スポット)を示す。また、各点に は、それぞれエラーバーを示している。比較のために、各々、 0.7 /z M (図中 1の曲線 で示すスペクトル)、 1.3 μ Μ (図中 2の曲線で示すスペクトル)、 2.5 μ Μ (図中 3の曲線 で示すスペクトル)、および 4.4 Μの AS-DHFRが示す溶液中でのスペクトルを示して いる。
符号の説明
1 分光光度計
2 光学系 (光照射手段）
3 タンパク質固定ィ匕光透過性基板
4 紫外-可視光変換デバイス
5 CCDカメラ (光検出手段）
6 ビデオキヤプチャボード 7 データ処理手段
8 レンズまたはスリット
9 通信手段
10 アレイ基板
11 固定ィ匕したタンパク質
12 カノく一
13 流入口
14 排出口
15 合成石英ガラス。
16 マトリックス
17 蛍光ガラス
18 スポット
19 光断面
発明を実施するための最良の形態
[0049] 本発明のタンパク質アレイ用検出および解析システムは高密度でタンパク質を固定 化した基板を用い、該基板上のタンパク質に光 (紫外光、可視光または赤外光)を照 射し、基板上のタンパク質の吸収を直接測定することにより、タンパク質を検出'解析 する。また、本発明のシステムにおいては、上記基板として紫外光を透過し得る基板 を用い、タンパク質の紫外光の吸収を利用してタンパク質を検出 ·解析する。ここで、 「検出'解析」とは、タンパク質の定性、定量、タンパク質とタンパク質またはタンパク 質以外の化合物との相互作用の測定、固定化タンパク質の吸光度変化によるタンパ ク質-リガンド相互作用の測定、タンパク質自体の構造変化のモニタリング、固定化タ ンパク質と相互作用するタンパク質以外の化合物の定性、定量等を 、う。
[0050] 本発明にお 、て、タンパク質は、ペプチド、ポリペプチドも含まれる。また、アレイ上 のタンパク質を検出する際の「アレイ上のタンパク質」とは、アレイ上に NH基を介して 結合した固定ィ匕タンパク質だけではなぐ固定ィ匕タンパク質との相互作用により結合 した他のタンパク質も含む。また、「アレイ上のタンパク質の検出'解析」とは、アレイ上 の固定ィ匕したタンパク質および該固定ィ匕タンパク質と相互作用した他のタンパク質の 検出 ·解析ば力りでなぐアレイ上に固定ィ匕したタンパク質力タンパク質以外の化合 物、例えば低分子化合物と相互作用し、該相互作用によりタンパク質の構造等の変 化により吸光が変化した場合に、吸光の変化を測定することにより、前記タンパク質 の構造変化等を検出'解析することも含む。さらに、「アレイ上のタンパク質と相互作 用した他の化合物の検出'解析」とは、アレイ上に固定化されたタンパク質と相互作 用するタンパク質以外の他の化合物の検出 ·解析をいい、特定の波長の光に吸収を 有する化合物をその波長の光を利用して測定することをいう。
[0051] 本発明のタンパク質アレイ用検出および解析システムの構成を図 1に示す。システ ムは、光照射手段 (光学系） 2を含むシステム制御部、 CCDデジタルカメラ等の光検 出手段 5や必要ならばビデオキヤプチャボード等のビデオデータ処理手段 6等を含 む測定部およびデータ処理部 7、タンパク質を高密度で固定化した光を透過し得る 基板 3から構成される。また測定部には紫外-可視光変換デバイス 4を含んでいても よい。さらに光学系 2から基板 3への光路上には、レンズまたはスリット 8を含んでいて もよい。また、データ処理手段は RS232C等の通信手段 9により、システム制御部の作 動を制御することができる。なお、該システムにおいて、光照射手段および光検出手 段を含む、光を発生させ、分光させ、タンパク質アレイに照射し、透過光を測定する 部分は、分光光度計 1であり、本発明は、タンパク質を高密度で固定ィヒした光を透過 し得る基板上のタンパク質を分光光度計を利用して検出するシステムでもある。ここ で、分光光度計とは、赤外、可視、紫外部のスペクトルを測定するための装置であり、 本発明においては、望ましくは紫外部のスペクトルが測定される。従って、本発明で は、広く普及して 、る紫外可視分光光度計を用いることができる。
[0052] 本発明において、基板上に固定ィ匕されたタンパク質に光を照射し固定ィ匕タンパク 質の吸光を直接測定するため、基板は光透過性である必要がある。「光透過性」とは 、紫外光、可視光または赤外光を透過する性質、すなわちこれらの光を吸収しない 性質をいう。このためには、基板は透明なものを用いることが望ましぐ透明ガラス (石 英ガラス、パイレックスガラス等）、透明プラスチック等を用いればよい。また、紫外光 を用いて測定する場合は、基板は紫外光を透過する必要がある。紫外光を透過する 基板として、紫外光透過ガラス等の分光光度計に使用される紫外光測定用セル (キ ュベット）と同一素材でできたガラス基板を用いればよい。紫外光を透過し得る基板と して、合成石英ガラスや溶融石英ガラス等の石英ガラスでできたスライドガラスを用い ればよぐ合成石英ガラス (例えば、信越ィ匕学工業社製)が好ましい。また、本発明に おいて、基板に固定ィ匕したタンパク質と他のタンパク質またはタンパク質以外の他の 化合物との相互作用を液中で測定するフローシステムも構築することができ、そのフ ローシステムの概要は、図 2で示される。タンパク質 11を固定ィ匕したガラス基板 (ァレ ィ基板 10)を、適当なスぺーサーを用いて、カバーするガラス基材 (カバー 12)では さみ、片方のスぺーサ一に溶液の入り口を (流入口 13)、反対側のスぺーサ一部分 に、溶液の出口部分 (排出口 14)を作り、外部より溶液を流すことが出来るようにする ことにより、フローシステムを簡便に作製することができる。該フローシステムは、図 1 に示す装置のタンパク質固定ィ匕光透過性基板 3の位置に装着される。フローシステ ムは、フローチャンネルセルやガラス基板上にミクロンオーダーの高精度の流路を形 成したマイクロチップ等を用いて、流路内のガラス上にタンパク質を固定ィ匕することに よっても構築できる。マイクロチップを用いる場合、流路を形成した流路基板とカバー プレートを作製し、カバープレートの流路と接する部分にタンパク質を固定ィ匕した後 に、流路基板とカバープレートを接合してマイクロチップを作製すればよい。また、 Epi gem社の Fluenceマイクロ流路ツールキット等の市販のものを用いることもできる。
本発明においては、タンパク質を蛍光色素等のプローブやレポーターで標識する ことなく直接基板上のタンパク質の吸光を測定するため、基板上にタンパク質を高密 度で固定ィ匕する必要がある。高密度で固定ィ匕するとは、基板の単位面積あたりに固 定化されたタンパク質分子の数が大きくなるように固定ィ匕することをいう。固定化量は 限定されないが、基板上に固定化された 1種類のタンパク質当たり、すなわち面積 lc m2のスポット当たり、 0.5nmole以上、好ましくは lnmole以上、さらに好ましくは 5nmole 以上であるか、あるいは 0.01 μ g/mm2以上、 0.05 μ g/mm2以上、 0.1 μ g/mm2以上、 0. 25 μ g/mm2以上である力、0.5 μ g/mm2以上、好ましくは 1 μ g/mm2以上である。 1スポッ ト当りの固定ィ匕量がこれ以下では、分光光度計を用いて直接光の吸収を測定するこ とは困難である。また、固定化密度はタンパク質アレイ上の光の吸収の程度によって も、特定することができ、固定ィ匕されたタンパク質のスポットにおける吸光度が 0.0005 以上、 0.001以上、 0.002以上、 0.003以上、 0.004以上、 0.005以上、 0.006以上、 0.007 以上、 0.008以上、 0.009以上または 0.01以上となる密度、または固定ィ匕されたタンパ ク質に他のタンパク質またはタンパク質以外の化合物が結合したときの吸光度変化 が 0.0005以上、 0.001以上、 0.002以上、 0.003以上、 0.004以上、 0.005以上、 0.006以 上、 0.007以上、 0.008以上、 0.009以上または 0.01以上になる密度が望ましい。タンパ ク質を固定ィ匕したスポットの面積は、限定されないが、 0.1mm2程度カゝら十数 mm2、例 えば lmm2から 10mm2程度である。ここで、固定化されたタンパク質のスポットにおける 吸光度の求め方は、後述する。
[0054] タンパク質を高密度で基板上に固定ィ匕するためには、タンパク質を基板上に配向 制御して固定ィ匕することが望ましい。配向制御したタンパク質の固定ィ匕とは、タンパク 質をタンパク質のペプチド鎖の一端で基板上に固定ィヒすることをいい、例えばぺプ チド鎖のカルボキシ末端またはァミノ末端で固定ィ匕する。配向制御してタンパク質を 固定化する方法として、例えば特許第 2517861号公報、特許第 2990271号公報、特 許第 3047029号、特開 2003-344396号公報に記載の方法が挙げられる。
[0055] 例えば、式 NH - R -COOHで表されるタンパク質のカルボキシ末端側に、システィ
2 1
ン残基をカルボキシ末端とする数個のアミノ酸残基力 成るアミノ酸配列を導入して 改変タンパク質を調製したのち、これをそのカルボキシ末端のシスティン残基におけ るメルカプト基を介して固定ィ匕基板に結合させることができる。この場合、 NH -R -CO
2 1
-NH-R - CO- NH- Y (Rおよび Rは任意のアミノ酸配列を示し、 Yは一級アミンを官能
2 1 2
基として有する固定ィ匕基板を示す。）で示される固定ィ匕タンパク質を得ることができる
[0056] タンパク質の固定ィ匕は、例えば、以下のようにして行うことができる。
[0057] 式 (1) NH— R -CONH-R— CO— NH— CH(CH— SH)— CO— NH— R -COOHで示される
2 1 2 2 3 スルフヒドリル基を有するタンパク質を式 (2)NH -Yで示される固定ィ匕基板上に中性か
2
ら弱アルカリ条件下（pH7〜10)に整列化することにより、タンパク質!？力NH - R -CO
1 2 1
NH— R— C〇— NH— CH(CH— SH)— C〇— NH— R— C〇〇H (―)—— (+)— NH— Yの式（(一)—— (+)は
2 2 3 2
イオン結合で吸着結合して 、る状態を表す）により基板上に吸着したタンパク質ァレ ィが得られる。さらに、この式で表される吸着したタンパク質をシァノ化試薬で処理す ることにより、 NH - R - CO-NH-R - CO- NH-Yの式で示されるタンパク質 Rが共有結
2 1 2 1 合により基板上に整列固定化されたタンパク質アレイを得ることができる。上記式中、
Rおよび Rは任意のアミノ酸配列、 Rは中性付近で強く負に荷電し、且つ式 (1) NH -
1 2 3 2
R -CO-NH-R -CO-NH-CH(CH— SH)— C〇— NH— R— C〇〇Hの等電^;を酸†¾にできる
1 2 2 3
任意のアミノ酸残基の連鎖を表す。 Rは、式 NH - R -COOHで示される固定ィ匕しょう
2 2 1
とするタンパク質と基板との間のリンカ一ペプチドとなる。 Rは任意でありそのアミノ酸
2
の種類、数ともに限られないが、例えば Gly-Gly-Gly-Gly等を用いることができる。 R
3 としては、ァスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列が好適である。タンパク質の 等電点は、構成するアミノ酸の種類と数に依存する。例えば、リジンやアルギニンなど の塩基性アミノ酸を多く含む場合は、塩基性アミノ酸の総数を超える数のァスパラギ ン酸ゃグルタミン酸が必要である。タンパク質の等電点の計算は、当業者であれば容 易に計算により推定できる。好ましくは、上記式 (1)で示される物質の等電点を 4から 5 の間の値になるように、ァスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列をデザインすれ ばよ 、。そのような配列のうち好適な配列としてァラニル-ポリアスパラギン酸をあげる ことができる。なぜならば、シァノシスティンの次のアミノ酸をァラニンにすることにより 、シァノシスティン残基を介したアミド結合形成反応が生じやすいことと、アミノ酸側鎖 の中でァスパラギン酸のカルボキシル基が最も酸性であるからである。吸着反応を行 う溶液としては、上記静電相互作用を保証し、且つ、式（1)で示されるタンパク質が溶 解し得る溶媒で且つ pHを調整できる溶媒であれば 、かなる溶液も利用可能である。 リン酸緩衝液、硼酸緩衝液などの種々の緩衝液、メタノール、エタノールなどのアル コール類の他、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホオキサイドなどが利用可能であ る。反応温度は、室温で高い反応効率が得られる力 用いる溶媒が凍結もしくは沸騰 しな 、範囲、及び上記式 (1)で示されるタンパク質が変性の結果凝集しな 、温度範囲 であれば問題なく用いることができる。シァノ化反応は、シァノ化試薬を用いて行うこ とができる。シァノ化試薬としては、通常、 2-ニトロ- 5-チオシァノ安息香酸 (2-nitro-5 -thiocyanobennzoic acid (NTCB)) (Y.Degani, A.Ptchornik, Biochemistry, 13,1— 1丄 (1 974)参照)または、 1—シァノ -4-ジメチルァミノピリジ-ゥムテトラフルォロ硼酸 (1- cyan o-4dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate(CDAP))などを用いる方法が簡便であ る。 NTCBおよび CDAPは市販のものをそのまま用いることができる。 NTCBを用いた シァノ化は、 pH7 9の間で効率よく行うことができ、且つ遊離するチォニトロ安息香 酸の 412 の吸光度の増加（分子吸光係数 =13,600M— m— で反応効率を調べるこ とができる。また、 SH基のシァノ化は文献 O.Wood & Catsipoolas, J.Biol.Chem. 233, 2887(1963)参照)の記載の方法に従っても行うことができる。シァノ化試薬によるシァ ノィ匕は、固定化基板上に式 (1) NH - R -CO-NH-R - CO- NH- CH(CH - SH)- CO- NH
2 1 2 2
- R -COOHで示されるタンパク質を吸着固定ィ匕した後に行っても、吸着固定化と同
3
時に行ってもよい。後者の場合、上記式 (1)で示されるタンパク質とシァノ化試薬を同 時に固定ィ匕基板上に適用すればよい。シァノ化処理は、基板のタンパク質が吸着し た表面にシァノ化剤を添加すれば行える。また、タンパク質が吸着した基板ごとシァ ノ化剤中に浸漬する等の手段によってシァノ化することもできる。また、上述の整列化 手段によりタンパク質を吸着した後、同様の整列化手段を用いて基板上のタンパク質 が吸着した部分にシァノ化試薬を適用してもよい。例えば、ピンを用いてタンパク質 を一定のドットパターンで基板上に吸着整列化した後に、ピンを用いてタンパク質の 代わりにシァノ化試薬溶液をタンパク質に重ねるようにしてスポットすれば、シァノィ匕 反応が起こりタンパク質が固定化される。また、固定ィ匕基板に式 (1) NH -R -CONH-
2 1
R - CO-NH-CH(CH - SH)-CO-NH-R -COOHで示されるタンパク質と、シァノ化試
2 2 3
薬を同時に適用してもよい。
[0058] 本発明のタンパク質の固定ィ匕には、スポッター（アレイ機）を用いることができる。ス ポッターとは、コンピュータの制御下で高性能モーターによりタンパク質試料をスポッ トするためのピンのピン先あるいは基板を XYZ軸方向に作動させ、マイクロタイタープ レート等のタンパク質試料を含む容器カゝら基板表面にタンパク質試料を運ぶ装置で ある。スポッターとしては、市販のものを用いることができる。市販のスポッターとして、 例えば、 日立ソフトウェアエンジニアリング社の SPBIO2000、宝酒造社の GMS417Arra yer、 日本レーザ電子社の Gene Tip Stamping, PerkinElmer社のピエゾ方式バイオチ ップ'スポッティングシステム等がある。
[0059] さらに、本発明のタンパク質の固定化に、インクジェットプリンティング技術を利用し て、タンパク質アレイを作製することができる。本発明のタンパク質の固定ィ匕工程中、 式 (1) NH— R -CO-NH-R— CO— NH— CH(CH— SH)— CO— NH— R— COOHで示されるタ
2 1 2 2 3
ンパク質をインクジェットプリンティング技術により NH -Yで示されるアミノ基を導入し
2
た適当な基板に吸着固定ィ匕し、次 、で該タンパク質のシスティン残基のスルフヒドリ ル基をシァノ化し、シァノシスティン残基に変換させることにより、式 NH - R -CO-NH
2 1
- R -CO-NH-Yで示される固定ィ匕タンパク質を有するタンパク質アレイを作製すること
2
ができる。
[0060] プリンティングに用いるインクジェットプリンタには、インクの射出方法の違いにより、 電圧を加えることにより変形する素子 (ピエゾ素子)を用いてその変形によりヘッド内 のインク収納スペースを減少させ、この圧力によりインクを吐出するピエゾ方式のもの と、ノズル中のヒータを加熱することにより泡を生成し、この泡によりインクを押し出す サーマルインクジェット方式のものがある力 本発明の固定化にはいずれの方式のプ リンタも用いることができる。但し、タンパク質の熱による変性を考慮すると、ピエゾ方 式のプリンタが好ましい。インクジェットプリンタとしては、巿販のプリンタを用いること ができ、例えば、市販の EPSON社の PMシリーズや Canon社の PIXUSシリーズのインク ジェットプリンタが挙げられる。
[0061] プリンタのインクカートリッジに上記式 (1)で示されるタンパク質溶液を充填し、プリン タに設置すればよい。プリンタのプリンティングパターンは描画ソフト等の適当なソフト ウェアを利用すれば自由に設定でき、線状に固定ィ匕するラインパターンを採用しても 、一定面積上に任意の数のドット (スポット）として固定ィ匕するドットパターンを採用し てもよい。また、この際 1回に吐出されるタンパク質溶液の量も自由に設定できる。例 えば、ラインパターンを採用する場合、幅数十 m力も数 mmのライン状に固定ィ匕す ればよい。
吐出量、吐出速度を適宜設定すればこの範囲で任意の幅のラインパターンで固定 化することができる。また、ドットパターンを採用する場合、ドット一つに対して 1滴分 のタンパク質溶液を吐出して直径数 m力ゝら数 mmの円状のドットとしてタンパク質を 固定ィ匕することもできるし、プリンティング時のパターユングを調整し、一辺が数 mか ら数 mmの矩形状にドットを形成させることもできる。この際も、所望のドットパターンに よりタンパク質溶液の吐出量や吐出速度を適宜設定すればよい。なお、 1ドットあるい は 1ライン上に固定ィ匕するタンパク質の量は上記のとおりであり、この際の、固定化に 用いるタンパク質溶液の濃度は ImM〜： LM程度が望ましぐ固定ィ匕するタンパク質溶 液の量は、 0.1 1〜100 1程度が望ましいが、限定されず固定ィ匕しょうとするタンパク 質量に応じて、タンパク質溶液の濃度および固定ィ匕するタンパク質溶液の量を適宜 変更することができる。
[0062] 1つの基板上に固定ィ匕されるタンパク質の種類数またはスポット数は、少なくとも 1 であり、好ましくは 5以上、さらに好ましくは 10以上、さらに好ましくは 50以上、特に好 ましくは 100以上である。
[0063] 上記のように、タンパク質を基板上に固定ィ匕する際、基板上にアミノ基を導入し、該 ァミノ基とタンパク質のペプチドのカルボキシ末端を結合させる。基板上にアミノ基を 導入するためには、例えば、基板上にアミノ基を有する一級ァミンのポリマー力 でき たマトリックスを結合させる必要がある。一級ァミンのポリマーとして、例えばポリアミン 、ァリルァミン、ポリリジン等が挙げられる。これらの一級ァミンのポリマーを適当な担 体と混合し、基板上にキャストし、基板上で膜を形成させればよい。担体としては、例 えばノヽイド口ゲルを用いることができる。「ハイド口ゲル」とは、高分子からなる架橋な いし網目構造と、該構造中に支持ないし保持された (分散液体たる)水とを少なくとも 含むゲルを 、う。ノ、イド口ゲルを与えるべき水溶性または親水性高分子化合物として は、メチルセルロース、デキストラン、ポリエチレンオキサイド、ポリプロピレンォキサイ ド、ポリビュルアルコール、ポリ Ν—ビュルピロリドン、ポリ Ν—ビュルァセトアミド、ポリ ビュルピリジン、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリ Ν—メチルアクリルアミド 、ポリヒドロキシメチルアタリレート、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルスルホ ン酸、ポリスチレンスルホン酸およびそれらの塩、ポリ Ν, Ν—ジメチルアミノエチルメ タクリレート、ポリ Ν, Ν—ジェチルアミノエチルメタタリレート、ポリ Ν, Ν—ジメチルアミ ノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられる。また、アミノーセルロフアイ ン（生化学工業で販売）、 AF-アミノトョパール (TOSOHで販売）、 ΕΑΗ-セファローズ 4Β及びリジン-セファローズ 4Β (アマシャムフアルマシアで販売）、ァフィゲル 102 (バ ィォラッドで販売）、ポラス 20ΝΗ (ベーリンガーマンノヽィムで販売）などの一級アミノ基 を有する市販の担体を用いてもよい。この際、一級ァミンのポリマーとポリアクリルアミ ド等の担体との結合には、担体を重合させる必要があり、例えば、紫外線照射処理が 有効である。
[0064] マトリックスとガラス等の基板との結合は、例えばシランカップリング剤を用いればよ い、シランカップリング剤は、ガラス表面とポリアクリルアミド等のマトリックスの両方と共 有結合を形成し得る物質であり、無機物質と有機物質を結合させることができる。シラ ンカップリング剤は一般的に R-Si-X3の構造をもつ化合物であり、 Xはメトキシ基 (-OC H3)などのアルコキシ基で、これを加水分解することによりシラノール基 (Si-OH)になる 。このシラノール基が基板表面に存在するシラノール基と水素結合や脱水縮合など の反応を起こして、安定なシロキサン結合 (Sト O-Si)を形成して基板表面に疎水性の R-の被膜を形成する。一方 R-はマトリックスと結合可能な有機官能グループ (たとえ ば H2C=C(CH3)C(=0)0- (CH2)3-など)である。シランカップリング剤として、市販のも の、 ί列えは、 Amersham社のノインドシラン (Bind— silane; 3-Methacryloxypropyltrimet hoxysilane)等を用いることができる。
[0065] 基板上に固定ィ匕したタンパク質に光を照射してタンパク質による光の吸収を測定す る。この際、好ましくは紫外線透過性基板上に固定ィ匕したタンパク質に紫外光を照射 してタンパク質による紫外光の吸収を測定する。光照射手段としては、分光器を用い ればよい。分光器としては、光学フィルターを用いた分光器、分散型分光器、フーリ ェ変換型分光器のいずれも用いることができる。照射光として紫外光を用いる場合は 、分散型分光器が望ましい。用いる光は紫外光、可視光、赤外光いずれも用いること ができる。紫外光を用いる場合の波長は、 200〜310nmであり、タンパク質を測定する 場合はタンパク質が吸収する 280nm、 224〜236nmまたは 205nm付近の波長の紫外光 が望ましい。タンパク質以外の化合物を測定する場合は、その化合物の特有の吸収 波長の光を用いればよい。また、照射する光の波長は一定の波長に固定してもよい し、波長を固定した上で複数の波長で測定してもよい。また、波長を変化させてもよ い。波長を変化させて測定することにより、タンパク質アレイ上のタンパク質または該 タンパク質と相互作用したタンパク質以外の化合物の吸収スペクトルを測定すること ができる。例えば、市販の分光光度計を用いて、分光光度計のセルを装着するセル 室に本発明のタンパク質を固定ィ匕した基板を装着して測定することができる。タンパ ク質を固定ィ匕した面は、光照射手段側に向けても反対側の光検出手段側に向けても よい。また、光照射手段から、基板に光を照射する光路上には、レンズやスリットを設 けて光路の幅等を調整し、基板の必要な部分に光が照射するようにすることができる
[0066] また、 CCD等の 2次元の光検出器を用いる場合、基板上にスポットされた固定ィ匕タ ンパク質全体に光を照射することにより、個々のスポットにおける透過光を一度に測 定することができるが、一次元の光検出器を用いる場合は、基板上の特定のスポット のみに光が照射するように光の照射手段を移動させ、すべてのスポットに光を照射す ればよい。この場合、光照射部分の移動と同時に光検出器も移動させる。
[0067] 光をタンパク質を固定ィ匕した基板に照射すると光が固定ィ匕したタンパク質、固定ィ匕 タンパク質に結合したタンパク質および zまたは固定ィ匕タンパク質に結合したタンパ ク質以外の化合物に吸収される。本発明においては、吸収されずに基板を透過した 光を測定する。透過した光の測定は、光検出手段を用いる。光検出手段は、光強度 を電気信号として出力する手段であり、内部光電効果型光検出器および外部光電効 果型光検出器のいずれも用いることができる。内部光電効果型光検出器は、光によ る半導体中の電荷分離を利用する検出器であり、電荷分離により生じた担体による 電気伝導度の変化を検出する光導電型検出器と電位差を検出す光起電力型検出 器がある。光導電型検出器として電荷結合素子（charge coupled device, CCD)、フォ トダイオード (PD)、フォトダイオードアレイ (PDA)がある。外部光電効果型光検出器は 、入射光子によって光電面力 電子を真空中に放出させ、その電子を直接あるいは 増幅した後に検出する光電管や光電子増倍管（フォトマル、 photomultiplier)がある。
[0068] 本発明の装置において、これらのいずれの光検出手段を用いることができる力 マ ルチチャンネル検出器である PDAや CCDが望ましぐ 2次元のマルチチャンネル検出 器である CCDがさらに望ましい。また、 PDA、 CCDにマイクロチャンネルプレートによ る電子増倍機能を付与した IPDAや ICCDを用いることもできる。本発明において、 IPD A、 ICCDはそれぞれ PDA、 CCDに包含される。
[0069] 照射光として紫外光を用いて、透過紫外光を測定する場合、 CCDは紫外光に対応 している必要がある。紫外光対応の CCDとして、例えば、テキサスインスツルメンッ社 製の TC253SPD- 30/TC253SPD- B0 TC285SPD- 30/TC285SPD- BO等の IMPACTR ON™CCD素子ゃホリバジョバンイボン社製の CCD素子を用いることができる。またこ れらの素子を利用した巿販の CCDカメラを用いてもよい。例えば、テキサスインスツル メンッ社製の MC681SPD MC285SPD- LOBO等の IMPACTROM™CCDデジタルカメ ラ等がある。し力しながら紫外光対応の CCDは、非常に高価であるという問題がある 。入手容易な市販の CCDデジタルカメラに使用されて 、る紫外光に対応して!/、な!/ヽ CCDを用いる場合は、非線形光学材料である紫外-可視光変換デバイスを用いれば よい。紫外-可視光変換デバイスとは紫外光を可視光に変換するデバイスであり、例 えば蛍光ガラス等の波長変換ガラス、蛍光顔料等の蛍光材料、銀塩感剤ゃ非銀塩 感剤等の感剤が挙げられる。この中でも蛍光ガラスが望ましく蛍光ガラスはガラスに 蛍光活性イオンとなる希土類イオンを含有させたものであり、 200 400 の紫外光を 照射することにより、 400nm以上の可視光に変換する。蛍光ガラスとして、例えば住田 光学ガラス社製のルミラス- G9、ルミラス- R7、ルミラス- B等力 Sあり、それぞれ 200 400 nmの紫外光を照射することにより、 540nmの緑色の蛍光、 610nmの赤色の蛍光、 410η mの青色の蛍光を発する。蛍光ガラスは、本発明の装置において、タンパク質を固定 化した紫外光透過性の基板と光検出手段の間に設置すればよい。また、蛍光顔料 ゃ感剤は、ガラス板に塗布して、該ガラス板をタンパク質を固定ィ匕した紫外光透過性 の基板と光検出手段の間に設置してもよぐまたタンパク質を固定ィ匕した紫外光透過 性の基板の反対側に塗布してもよい。後者の場合、タンパク質を固定ィ匕した面に紫 外光を照射する。
[0070] 上記のように、タンパク質を固定ィ匕した紫外光透過性の基板に紫外光を照射し、固 定ィ匕タンパク質に吸収されない紫外光または紫外光力も変換された可視光を光検出 手段で検出する。
[0071] 光検出手段から、画像データまたはビデオデータとして信号が出力され、解析手段 で該信号を処理し、基板上のタンパク質の吸光を測定する。画像データの種類は限 定されず、例えば画像データを BMP画像として得て、処理することができる。画像デ ータまたはビデオデータを処理する際、基板上の各スポットの光強度を求める。処理 データは例えば、各スポットにおいて、吸収の違いにより色分けして表示することも、 基板上の 2次元座標に対応して、吸光度を高さで表示する 3次元座標で表示するこ とちでさる。
[0072] ビデオデータは、 CCDを有するビデオカメラでタンパク質を固定ィ匕した基板を撮像 すること〖こより得られる。ビデオデータを得ることにより、基板上のタンパク質の吸収を リアルタイムで解析することができる。リアルタイムでビデオデータを処理するには、ビ デォキヤプチャボードおよび市販のソフトウェアを用いることができ、例えば Direct X ( Windows社製）を用いて処理すればよ!、。
[0073] この際、基板上のタンパク質を固定ィ匕して 、な 、部位を透過した光の強度とタンパ ク質を固定ィ匕した部位を透過した光の強度を測定し、タンパク質を固定ィ匕して 、な 、 部分を透過した光を吸収されていない 100%透過光として、タンパク質を固定ィ匕した 部位を透過した光の透過率を計算する。光検出手段により得られたデータはピクセ ルとして構成されており、タンパク質を固定ィ匕して 、な 、任意の部位にっ 、て複数の ピクセルについての光強度に関するデータを得て平均し (I さらにタンパク質を固定
0
化したそれぞれの部位 (スポットまたはドット）につ ヽても複数のピクセルにつ 、て光 強度に関するデータを得て平均し、各スポットの光の透過率を求めることができる (1)。 吸光度は- log(1 1 1 )により求めることができる。この際、あら力じめ固定化密度、あるい
0
は 1スポット中のタンパク質量のわかっている標準タンパク質について、固定化密度と 吸光度の関係を求めておくことにより、測定しょうとする固定ィ匕タンパク質の固定化密 度を求めることができる。例えば、密度 Dの標準タンパク質の吸光度が Asであり、密度 未知の被験タンパク質の吸光度が Atである場合、被験タンパク質の密度は、式 D X ( At/As)により求めることができる。この際、基板上に密度既知の標準タンパク質をコン トロールスポットとして固定化してぉ 、てもよ 、。
[0074] 光照射手段力 タンパク質を固定ィ匕した基板に照射する紫外光は一定の波長に固 定ィ匕した紫外光でもよ 、し、 lnm力も数十 nmの間隔で波長スキャンを行ってもょ 、。
[0075] 固定ィ匕したタンパク質と該タンパク質と相互作用する他のタンパク質または低分子 化合物等のタンパク質以外の化合物とを接触反応させ、基板上のスポットにおける光 の吸収を測定することができる。例えば、固定ィ匕タンパク質とそのタンパク質と結合す るリガンドタンパク質との相互作用を検出'解析することができる。また、固定ィ匕タンパ ク質とタンパク質以外のリガンドとの相互作用を検出 ·解析することができる。例えば、 抗体または抗原を一定密度で固定ィ匕し、該抗体または抗原と特異的に結合する抗 原または抗体と反応させた後に、基板上のタンパク質の吸収を測定することにより、 固定ィ匕した抗原または抗体と結合した抗体または抗原の量を測定することができる。 この場合、固定ィ匕タンパク質と他のタンパク質またはタンパク質以外の化合物を接触 反応させる前後にタンパク質アレイ上の吸光を測定した場合、接触前の測定値は固 定ィ匕タンパク質のみの吸光を反映し、接触後の測定値は固定ィ匕タンパク質と他のタ ンパク質またはタンパク質以外の化合物が相互作用した複合体を反映する。従って 、接触前後の吸光の差をとることにより、固定ィ匕タンパク質と相互作用した他のタンパ ク質またはタンパク質以外の化合物の量を決定することができる。基板上に固定化し たタンパク質の吸収をあら力じめ求めておき、他のタンパク質を相互作用させた後に 、再度吸収を測定し、相互作用前後の吸収の変化を求めることにより、固定ィ匕タンパ ク質が相互作用したことおよび相互作用した他のタンパク質の量を測定することがで きる。この際、固定ィ匕タンパク質と相互作用したタンパク質ィ匕合物に特有の吸収波長 の光を用いることにより、固定ィ匕タンパク質と相互作用した化合物のみを測定すること ができる。また、基板としてフローセルまたは液体の流路を有するマイクロチップを用 いフローシステムを構築することにより、接触の前後にわたって接触中のタンパク質ァ レイ上の吸光の変化をリアルタイムで測定することができ、相互作用を経時的にモ- タすることがでさる。
また、固定ィ匕したタンパク質と低分子リガンドとの測定においても、リガンド結合に伴 ぅァロマティックなアミノ酸側鎖の吸収に由来する紫外部の吸収変化を利用すること が出来る。例えば、紫外部に吸収が無いリガンドの濃度を変化させ、リガンド結合に 伴う紫外部の特定波長の吸光度変化もしくは紫外部の吸収スペクトル変化を測定す ることにより、リガンド結合の強さの指標である結合定数を求めることが出来る。また、 多くのタンパク質は可視部に吸収を持たない場合が多いことから、可視部に吸収を 持つリガンドに関しては、可視部の特定波長の吸光度変化もしくは可視部の吸収ス ベクトル変化を測定することにより、対象リガンドに関する結合もしくはその結合の強 さを表す結合定数を求めることが出来る。 実施例
[0077] 本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に よって限定されるものではない。
[0078] 本実施例においては、石英ガラスの表面に、アミノ基を有するポリマーを含むポリア クリルアミドゲルの薄板を形成させることにより、タンパク質アレイ用基材を作製した。 この基材は、可視光線及び紫外線の波長領域の光をほとんど吸収しな!ヽ (透明であ る）ので、ゲル内に存在しているタンパク質の光学的活性を直接検出できる。即ち、 特別な標識操作を行うことなぐ固定化されたタンパク質、及びそれと相互作用するタ ンパク質を光学的手法により検出'解析することが可能である。
[0079] 本実施例では、緑色蛍光タンパク質 (配列番号 1)及び、ジヒドロ葉酸還元酵素（配 列番号 4)をこのタンパク質アレイ用基材に固定ィ匕した。緑色蛍光タンパク質は自然 光の下で緑色を呈し容易に肉眼で確認できるので、固定ィ匕操作の過程をモニターす るために用いた。一方、ジヒドロ葉酸還元酵素は、一般のタンパク質と同様に 280應 近辺の紫外線を吸収する性質を持っているので、固定ィ匕した後、アレイ上でその光 学的活性を検出するためのテスト用のタンパク質として用いた。
[0080] 以下、タンパク質アレイ用基材の作製過程〔1〕、固定化用緑色蛍光タンパク質の調 製〔2〕、固定ィ匕用ジヒドロ葉酸還元酵素の調製〔3〕、タンパク質のアレイ用基材への 吸着整列化〔4〕、吸着させたタンパク質の固定ィ匕〔5〕、アレイに固定ィ匕したタンパク 質の光学的活性の測定〔6〕、について具体的に記述する。
[0081] 〔1〕タンパク質アレイ用基材の作製
アレイ用基材の作製にぉ 、ては、先ずバインドシランを石英ガラス (7.7cm X 2.6cm X 1mmのスライドガラスのサイズに加工したもの、 VIOSIL- SG2AS ;信越化学工業社よ り購入)の表面に導入し、その後、アミノ基を有するポリマー（分子量 30,000〜70,000 のポリ Lリジン；シグマ社より購入）を含むポリアクリルアミドゲルの薄板（2.4cm X 5.0cm X約 50 /z m)を形成させた。
[0082] ノインドシラン (アマシャム社より購入）は、石英スライドガラスとポリアクリルアミド分 子の両方と共有結合を形成する性質を持つものであり、両者を強固に結合させるた めに用いたが、具体的には以下のようにしてバインドシランを石英スライドガラスの表 面に導入した。 8mlのエタノール、 0.2mlの酢酸、 1.8mlの純水、 10 1のバインドシラン を混ぜた溶液を作製し、ドラフトの中でこれを 0.5ml石英スライドガラス上に滴下し、キ ムワイプを用いてガラスの表面全体に塗り広げ 1.5時間乾燥させた。
[0083] このようにしてバインドシランを導入した石英スライドガラスの表面に以下のようにし てポリアクリルアミドゲルの薄板を形成させた。先ず、アクリルアミドとメチレンビスアタリ ルアミドの 37.5： 1の混合物（バイオラッド社より購入）を純水に溶かして 12.5%のポリア クリルアミド溶液を作製した。この溶液にポリ Lリジン（分子量 30,000〜70,000のポリ Lリ ジン;シグマ社より購入)及び純水をカ卩え、最終的にポリアクリルアミドの濃度が 10%、 ポリ Lリジンの濃度が 0.5%である溶液を lml氷上で調製した。次に、ポリアクリルアミドの ゲル化（固化)試薬である TEMED (バイオラッド社より購入）を 1 μ 1、 10%の過硫酸アン モ -ゥム溶液 (ナカライ社より購入)を 7.5 加え、よく混ぜた後、この溶液 0.3mlを、バ インドシランを導入した石英スライドガラス上に滴下した。その後直ちに、その上から ギャップカバーガラス (松浪ガラス社より購入)を気泡が入らな 、ように被せた。以上 の操作においては、不本意なゲルイ匕が進行しないようにするため、溶液の調製は氷 上で行い、操作はできるだけ素早く行う必要がある。この後、室温でー晚静置し、ポリ アクリルアミドをゲルイ匕させた。ゲル化が完了した後、トランスイルミネーター (UVP社よ り購入)を用いて紫外線 (360nm)を 5分間照射し、石英スライドガラス全体をシャーレの 中の純水に浸して 30分間攪拌し、シャーレ力も取り出し、ピンセットを用いてギャップ カバーガラスを取り外した。その後、再びシャーレの中の純水に浸し一晩攪拌した後 、さらに純水で 2回水洗し、数時間風乾させた。
[0084] 〔2〕 固定化用緑色蛍光タンパク質の調製
緑色蛍光タンパク質 (GFP) (配列番号 1)のカルボキシ末端に固定ィ匕用の配列とし て、 Gly- Gly- Gly- Gly- Gly- Gly- Cys- Ala- Asp- Asp- Asp- Asp- Asp- Asp (配列番号 2) なる配列を付カロし、式 (1) NH— R -CO-NH-R— CO— NH— CH(CH— SH)— CO— NH— R -
2 1 2 2 3
COOHに該当する固定ィ匕用タンパク質 (配列番号 3)を作製し、固定化反応の条件等 を検討した。
[0085] 配列番号 2をコードする DNA配列に、遺伝子発現に必要なリボゾーム結合配列及 びベクター組み込みに必要な制限酵素切断部位を加えた DNA配列を合成し、発現 ベクター pUC18の EcoRIと Hindlll部位に組み込み、組み換えプラスミドを作製した。こ れを大腸菌株 JM109株に導入し、以下に述べるようにして、発現させた後、分離精製 した。
[0086] 固定化用緑色蛍光タンパク質を発現する組み換え大腸菌を、 2リツターの培地（10g の塩化ナトリウム、 10gの酵母エキス、 16gのトリプトン、 280mgのアンピシリンナトリウム を含んでいる）で、 37°Cで一晩培養した後、培養液を 20分間低速遠心（毎分 5000回 転）することにより、湿重量約 5gの菌体を得た。これを、 30mlの ImMエチレンジァミン 4 酢酸 (EDTA)を含む 10mM燐酸緩衝液 (pH7.0)に懸濁し、フレンチプレス装置を用い て菌体を破砕することにより無細胞抽出液を得た。その後、ストレプトマイシン硫酸処 理、硫安分画処理、 DEAEトヨパールクロマトグラフィー (東ソ一株式会社より購入）に よる精製処理、 SuperQトヨパールクロマトグラフィー (東ソ一株式会社より購入）による 精製処理を施すことにより、均一になるまでタンパク質を精製し、約 60mgの均一な固 定化用緑色蛍光タンパク質を得た。固定化用緑色蛍光タンパク質の濃度は、緑色蛍 光タンパク質の分子吸光係数 =22,000M_1cm_1を用いて、 280nmの吸光度より決定し た。なお、当業者であれば配列番号 1で示される緑色蛍光タンパク質をコードする遺 伝子が入手できれば、配列番号 3で示される固定ィ匕用緑色蛍光タンパク質を容易に 作製できる。
[0087] 〔3〕 固定化用ジヒドロ葉酸還元酵素の調製
ジヒドロ葉酸還元酵素の変異酵素 (AS-DHFRと略す）（配列番号 4)のカルボキシ末 端に固定化用の配列として、 Gly-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp (配列番 号 2)なる配列を付カ卩し、式 (1) NH - R -CO-NH-R - CO- NH- CH(CH - SH)- CO- NH
2 1 2 2
- R -COOHに該当する固定ィ匕用タンパク質 (配列番号 5)を作製し、タンパク質の紫
3
外線領域における光学的活性をアレイ上で検出に用いた。
[0088] 配列番号 5をコードする DNA配列に、遺伝子発現に必要なリボゾーム結合配列及 びベクター組み込みに必要な制限酵素切断部位を加えた DNA配列を合成し、発現 ベクター PUC18の EcoRIと Hindlll部位に組み込み、組み換えプラスミドを作製した。こ れを大腸菌株 JM109株に導入し、以下に述べるようにして、発現させた後、分離精製 した。 [0089] 固定ィ匕用 AS-DHFRを発現する組み換え大腸菌を、 2リツターの培地（10gの塩ィ匕ナ トリウム、 10gの酵母エキス、 16gのトリプトン、 280mgのアンピシリンナトリウムを含んで いる）で、 37°Cで一晩培養した後、培養液を 20分間低速遠心（毎分 5000回転)するこ とにより、湿重量約 5gの菌体を得た。これを、 30mlの ImMエチレンジァミン 4酢酸（ED TA)を含む 10mM燐酸緩衝液 (pH7.0)に懸濁し、フレンチプレス装置を用いて菌体を 破砕することにより無細胞抽出液を得た。その後、ストレプトマイシン硫酸処理、硫安 分画処理、メソトレキセートァフィ-ティクロマトグラフィー（シグマ社より購入）による精 製処理、 DEAEトヨパールクロマトグラフィー (東ソ一株式会社より購入）による精製処 理を施すことにより、均一になるまでタンパク質を精製し、約 70mgの均一な固定ィ匕用 AS- DHFRを得た。固定化用 AS- DHFRの濃度は、 AS- DHFRの分子吸光係数 =31, 10 0M_ 1cm_1を用いて、 280nmの吸光度より決定した。なお、当業者であれば配列番号 4で示されるタンパク質をコードする遺伝子が入手できれば、配列番号 5で示される 固定ィ匕用 AS-DHFRを容易に作製できる。
[0090] 〔4〕タンパク質のアレイ用基材への吸着整列化
上記〔1〕において作製したアレイ用基材に、固定化用緑色蛍光タンパク質もしくは 固定ィ匕用 AS-DHFRを以下のように吸着整列化させた。先端の開口部の半径が約 0.5 mmのマイクロロード用のピペット用チップ（QSP社より購入）を、容量が 10 μ 1のマイク 口インジェクション用のシリンジ (ノヽミルトン社より購入）に装着し、これを、ナリシゲ社ょ り購入した油圧式のコントローラに装着し、マイクロマニピュレータとして用い、上下、 左右、前後の 3方向に、そのホルダーを移動させることで、タンパク質のスポット用装 置とした。この装置を用いることで、タンパク質のスッポッティングを、位置に関しては 0 •5mmの単位で、溶液量に関しては 0.1 μ 1の単位でコントロールすることが可能であつ た。
[0091] 緑色蛍光タンパク質の基板へのスポッティングは、 2.5mg/ml、 5mg/ml、 10mg/ml、 2 Omg/mU 40mg/mlの 5種類の濃度の固定ィ匕用緑色蛍光タンパク質溶液を準備し、薄 いタンパク質溶液力も順番に 0.2 1ずつアレイ用基材にスポットしていった。 2.5mg/m 1のタンパク質溶液を 0.2 1ずつアレイ基板の左端に縦一列に 3力所、互いに 5mmず つ離してスポットし、次にこの 4mm右隣に、 5mg/mlのタンパク質溶液を 0.2 μ 1ずつ縦 一列に 3力所、互いに 5mmずつ離してスポットした。以下同様に、 10mg/ml、 20mg/ml 、 40mg/mlの濃度のタンパク質溶液を 0.2 1ずつスポットした。このことにより、 0.5 g 、 1 g、 2 g、 4 g、 8 gの緑色蛍光タンパク質力 ¾力所ずつにスポットされたことに なる。スポットした直後は、タンパク質溶液はゲルの表面上に直径約 lmmの液滴を形 成したが、その後速やかにゲルの中に吸収されていった。スポット完了後、アレイ基 材ごと 10mM燐酸緩衝液 (pH7.0)に浸してスポットの状況を観察したところ、 0.5 g、 1 μ g、 2 gのタンパク質を用いた場合は、スポットの拡散は認められなかったが、 4 g 、 8 gのタンパク質を用いた場合は、蛍光タンパク質が緩衝液の中に徐々に散逸し ていくのが観察された。結果的に、 2 g以上のタンパク質をスポットしても、 2 gのタ ンパク質をスポットした場合と同程度タンパク質のみが基板中に吸着されることが観 察された。このことは、スポットの大きさが直径約 lmmであることから考えて、吸着可能 な蛍光タンパク質の面密度の上限が約 2.5 g/mm2であることを示している。なお、以 下の〔5〕に示す固定化反応を施す前に、 1Mの KC1で十分洗うと、このように吸着させ た緑色蛍光タンパク質はゲル薄板カゝら離脱した。
[0092] 固定ィ匕用 AS-DHFRに関しても、これと同様に、アレイ用基材への吸着を行った。
[0093] [5] 固定化反応
上記〔4〕において、固定ィ匕用緑色蛍光タンパク質または固定ィ匕用 AS-DHFRを吸着 させた基板に、 5mMの 2-ニトロ- 5-チオシァノ安息香酸 (NTCB)を含む 10mM燐酸緩 衝液 (PH7.0)を lmlを用いて、基板全体をこの溶液で浸らせた状態で、室温で 4時間 放置し、タンパク質のシァノ化反応を行わせた。その後、 10mM燐酸緩衝液 (pH7.0) で十分洗い、過剰な試薬等を除去した後、基板を 10mM硼酸緩衝液 (pH9.5)に浸し、 室温で 24時間穏やかに攪拌させることにより固定ィ匕反応を行った。固定化反応が終 了した後、スライドガラスごとシャーレの中の 1MKC1を含む 10mM燐酸緩衝液（pH7.0) に浸し、 24時間穏やかに攪拌することにより、未反応タンパク質及び副反応生成物を 除去した。その結果を図 3に示す。これは、緑色蛍光タンパク質を固定ィ匕したアレイ 用基材を自然光下で撮影したものであるが、固定化されたタンパク質が示す蛍光強 度から、本実施例で作製した基板を用いた場合、固定ィ匕可能な蛍光タンパク質の面 密度の上限は、おおよそ 2 g/mm2であると推測された。 [0094] 〔6〕 固定化されたタンパク質の光学的活性の測定
固定化されたタンパク質の光学的活性を測定した。
測定に用いた機器装置は以下のとおりである。
光照射用の光源として島津 UV-1200または AVIV-ATG14を用いた。前者はスリット 幅の調整はできず、また出力が約 30W(0.3mA X 100V)と比較的低いことを特徴とする 。後者は、 Xenonランプ (450W)を採用しておりスリット幅を調整することができる。これ らの、光源の回折格子力ゝらの光をセルホルダー手前に置いた UV専用ミラーで外側に 光路を移して観測系を構築した。図 4に島津 UV-1200の観測系の光学系統図 (光路 )を示す。図 4の行光学系統図中、回折格子が光学系にあるため、波長は装置制御 側で設定する。
[0095] 図 5に上記 AVIV ATF104を用いた場合の光学系統図を示す。図中、装置左に光 源が設置され、光は矢印のように移動する。 1の部分にミラー 1、 2の部分に基板ホル ダー（セルホルダー）、 3の部分にミラー 2を設置し、 4の部分に CCDカメラを設置した 。 CCDカメラは、 Logicool社の Logicool Qcam QV— 700Nを用いた。 CCDの解像度は 3 0万画素であった。 CCD素子のゲイン調整等は、 CCDカメラに附属のアプリケーショ ンを用いて行った。図中 3の部分のミラー力も CCDカメラまでの焦点距離は 18cm以上 とした。上記基板ホルダーに装着するタンパク質固定ィ匕基板は、上記〔1〕から〔5〕の ように合成石英ガラス製の基板ガラス上の 20mm X 20mmの範囲に φ l〜2mmで DHF Rをスポットして固定化した。スポット当りのタンパク質量は、 10、 15および 20 gであつ た。紫外-可視変換デバイスとして、住田光学ガラス社製のルミラス Bを用いた。 AS-D HFRを固定ィ匕したガラス基板の模式図を図 6に示す。図 6に示すように AS-DHFR固 定ィ匕ガラス基板と蛍光ガラスを組合せた。スポットの直径は l〜2mm、光の当たる光 断面の大きさは 20mm X 20mm、スポット間の距離は 4mm未満であった。各スポットの 固定ィ匕タンパク質量は、図 7右に示すように、右の列からそれぞれ、 10、 15および 20 μ g/スポットであった。 280nmの波長の紫外光を照射し、蛍光ガラスから照射される蛍 光を撮像した。撮像条件は、シャッタースピードが 1/30、ゲインは max、画像サイズは 3 20 X 240であった。図 7左に撮像した画像を示す。
[0096] 図 7に示すように、 DHFRを固定ィ匕したスポットの部分は、固定ィ匕した DHFRにより紫 外光が吸収され、紫外光の透過光が弱ぐ蛍光ガラスから蛍光が発せられないので、 スポットの部分のみ光っていない。なお、上記条件においては固定化密度が高すぎ たため、吸収が大きすぎ吸光度測定に飽和がおきていた。
[0097] より大きい固定化密度での測定を行うため、より解像度の高い CCDを用いて同様の 検討を行った。 CCDカメラは-コン社の Coolpix4300を用いた。撮像条件は、シャツタ 一スピード 1/4であり、同カメラの接写機能を用い、 4cmの距離で撮像した。この際、 焦点はマニュアルフォーカスにて合わせた。画像サイズは 640 X 480であった。照射 光の波長は 280nmであった。上と同様に、合成石英ガラス上に上記と同様に DHFRを スポットし、蛍光ガラスと組合せ、 280nmの波長の紫外光を照射した。図 8右に示すよ うに、右の列からそれぞれ、 0.5、 1、 2および 4 gをスポットしたものを調製した。図 8左 にその撮像画像を示す。
[0098] このタンパク質基板を用いて、 280nmから 310nmまでの波長範囲で 5nmおきに紫外 線を照射し、蛍光ガラスから照射される蛍光を測定し、吸光度は、スポットしていない 基板上の部分における蛍光ガラスからの発光強度を Iとし、スポットした部分の蛍光
0
ガラスからの発光強度を Iとして、 log(I /1)で求めた。それぞれの濃度での 4つのスポッ
0
トから得られる吸光度を平均し、その平均値とエラーバーを照射した紫外線の波長に 対してプロットした結果を図 9に示す。 280nmの吸光度より、 0.5、 1、 2および 4 gをス ポットした各ポイントでのタンパク質の線密度は、 AS-DHFRの分子吸光係数より、そ れそれ、 0.り nmoles/cm、 1.5nmoles/cm、 2.8nmoles/cm、お び 4.7nmoles/cmと見 積もられた。また、各波長での吸光度の値を、 AS-DHFRの溶液中でのスペクトルにフ ィティングすることにより、それぞれ、 0.7 M (図中 1の曲線で示すスペクトル)、 1.3 Μ (図中 2の曲線で示すスペクトル)、 2.5 Μ (図中 3の曲線で示すスペクトル)、および 4. 4 /ζ Μ (図中 4の曲線で示すスペクトル)が得られた。この図に示されるように、本発明 の測定により、固定ィ匕されたタンパク質の吸収スペクトルが溶液中のそれと非常によ く一致することが示された。また、固定ィ匕に要したタンパク質量に比例して、スぺタト ル強度が増加することが示され、固定ィ匕したタンパク質の定量ィ匕を行うことが出来るこ とが示された。また、この値を用いると、 0.5、 1、 2および 4 gの AS-DHFR用いてスポ ットし固定ィ匕されたタンパク質の密度は、 AS-DHFRの分子量を 18000として計算する ことにより、それぞれ、 0.11 μ g/mm2、 0.27 μ g/mm2、 0.50 μ g/mm2、および 0.85 μ g/m m2と見積もることが出来、スポット面積としては、約 4から 5mm2と見積もることが出来た 今回用いた分光光度計の精度力 荒く見積もることにより、上記シグナル強度の約 1/10までは精度よく測定できることから、本発明のタンパク質アレイシステムにおいて は、固定ィ匕されたタンパク質の密度として、 0.01 μ g/mm2に十分対応できることが考え られる。

Claims

請求の範囲
[1] 光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定ィ匕したタンパク質アレイおよび 分光光度計を含む、タンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク 質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出 ·解析するシステムであって、 分光光度計を用いて前記タンパク質アレイに光を照射し、タンパク質アレイを透過し た光を測定することによりアレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相 互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定し、タンパク質アレイ 上のタンパク質および Zまたはタンパク質以外の他の化合物を検出 ·解析するシステ ム。
[2] 光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定ィ匕したタンパク質アレイ、光照 射手段、光検出手段を含む、タンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕 タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析するシステムで あって、光照射手段によりタンパク質アレイに光を照射し、光検出手段によりタンパク 質アレイを透過した光を測定することによりアレイ上のタンパク質および Zまたは固定 化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定し、 タンパク質アレイ上のタンパク質および zまたはタンパク質以外の他の化合物を検出 '解析するシステム。
[3] さらに、データ処理手段を含む、請求項 2記載のタンパク質アレイ上のタンパク質お よび Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出
'解析するシステム。
[4] タンパク質がタンパク質アレイの 1スポット当たり 0.01 μ g/mm2以上の密度で固定化 されている請求項 1〜3のいずれ力 1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質およ び Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出- 解析するシステム。
[5] タンパク質がタンパク質アレイの 1スポットにおける吸光度が 0.001以上となる密度で 固定されている請求項 1〜3のいずれ力 1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク 質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を 検出'解析するシステム。
[6] 高密度で整列固定化したタンパク質力 式 NH - R - CO-NH-R - CO-NH-Y [式
2 1 2
中、 Rおよび Rは任意のアミノ酸配列を表し、 Yは基板を表す]で示される、請求項 1
1 2
〜5のいずれか 1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕 タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析するシステム。
[7] 光透過性ガラスの表面にキャストされた一級アミンを含む担体とタンパク質のァミノ 酸配列の C末端のカルボキシ基が共有結合してタンパク質が整列固定化された、請 求項 1〜6のいずれ力 1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは 固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析するシ ステム。
[8] 光検出手段が CCDまたはフォトダイオードアレイである、請求項 1〜7のいずれか 1 項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互 作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析するシステム。
[9] タンパク質アレイに照射される光が紫外光であり、光透過性基板が紫外光透過性 基板である請求項 1〜8のいずれか 1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質お よび Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出 '解析するシステム。
[10] 紫外光透過性基板が石英ガラス製基板である請求項 9記載のタンパク質アレイ上 のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の 化合物を検出'解析するシステム。
[11] タンパク質アレイを透過した紫外光を紫外-可視光変換デバイスに照射し、紫外光 力も可視光に変換された光を検出する請求項 9または 10に記載のタンパク質アレイ 上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の 他の化合物を検出 ·解析するシステム。
[12] 紫外-可視光変換デバイスが蛍光ガラスである請求項 11記載のタンパク質アレイ上 のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の 化合物を検出'解析するシステム。
[13] タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と検体を接触させ、接触前後におけ るタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用する タンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、固定ィ匕タンパク 質と相互作用する検体中のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用 するタンパク質以外の他の化合物を検出する、請求項 1〜12のいずれ力 1項に記載 のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用する タンパク質以外の他の化合物を検出'解析するシステム。
[14] タンパク質アレイ上に固定ィ匕されたタンパク質と他のタンパク質および Zまたは固 定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を接触させ、接触前後 にわたつてタンパク質アレイ上のタンパク質および zまたは固定ィ匕タンパク質と相互 作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、固定ィ匕 タンパク質とタンパク質またはタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する
、請求項 1〜12のいずれか 1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zま たは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析す るシステム。
[15] 光透過性基板が、内部に流路が形成されたフローチャンネルセルまたはマイクロチ ップであり、該流路内にタンパク質が固定化されており、検体を該流路を通すことによ り、固定ィ匕タンパク質と検体中のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互 作用するタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、請求項 1〜 12のい ずれ力 1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク 質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析するシステム。
[16] 光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定ィ匕したタンパク質アレイに分光 光度計を用いて光を照射し、タンパク質アレイを透過した光を測定することによりァレ ィ上のタンパク質および zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の 他の化合物による光の吸収を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および Zまた は固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析する 方法。
[17] タンパク質がタンパク質アレイの 1スポット当たり 0.01 μ g/mm2以上の密度で固定化 されている請求項 16記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕 タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析する方法。
[18] タンパク質がタンパク質アレイの 1スポットにおける吸光度が 0.001以上となる密度で 固定されている請求項 16記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固 定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析する方法。
[19] 高密度で整列固定化したタンパク質力 式 NH - R - CO-NH-R - CO-NH-Y [式
2 1 2
中、 Rおよび Rは任意のアミノ酸配列を表し、 Yは基板を表す]で示される、請求項 16
1 2
〜18のいずれか 1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定 化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析する方法。
[20] 光透過性ガラスの表面にキャストされた一級アミンを含む担体とタンパク質のァミノ 酸配列の C末端のカルボキシ基が共有結合してタンパク質が整列固定化された、請 求項 16〜19のいずれ力 1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまた は固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析する 方法。
[21] 光検出手段が CCDまたはフォトダイオードアレイである、請求項 16〜20のいずれ 力 1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と 相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析する方法。
[22] タンパク質アレイに照射される光が紫外光であり、光透過性基板が紫外光透過性 基板である請求項 16〜21のいずれ力 1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質 および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検 出'解析する方法。
[23] 紫外光透過性基板が石英ガラス製基板である請求項 22記載のタンパク質アレイ上 のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の 化合物を検出 ·解析する方法。
[24] タンパク質アレイを透過した紫外光を紫外-可視光変換デバイスに照射し、紫外光 力も可視光に変換された光を検出する請求項 22または 23に記載のタンパク質アレイ 上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の 他の化合物を検出 ·解析する方法。
[25] 紫外-可視光変換デバイスが蛍光ガラスである請求項 24記載のタンパク質アレイ上 のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の 化合物を検出 ·解析する方法。
[26] タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と検体を接触させ、接触前後におけ るタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用する タンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、固定ィ匕タンパク 質と相互作用する検体中のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用 するタンパク質以外の他の化合物を検出する、請求項 16〜25のいずれか 1項に記 載のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用す るタンパク質以外の他の化合物を検出 ·解析する方法。
[27] タンパク質アレイ上に固定ィ匕されたタンパク質と他のタンパク質または固定ィ匕タンパ ク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を接触させ、接触前後にわたって タンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互作用するタ ンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、タンパク質とタンパ ク質またはタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、請求項 16〜25 のいずれか 1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タン パク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析する方法。
[28] 光透過性基板が、内部に流路が形成されたフローチャンネルセルまたはマイクロチ ップであり、該流路内にタンパク質が固定化されており、検体を該流路を通すことによ り、固定ィ匕タンパク質と検体中のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパク質と相互 作用するタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、請求項 16〜25の いずれか 1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および Zまたは固定ィ匕タンパ ク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出'解析する方法。
[29] 式 NH - R - CO- NH- R - CO- NH- Y [式中、 Rおよび Rは任意のアミノ酸配列を表
2 1 2 1 2
す]で示されるタンパク質が高密度で整列固定ィ匕したタンパク質アレイであって、 Yで 表される固定ィ匕基板が光透過性ガラス製であるタンパク質アレイ。
[30] 光透過性ガラスが紫外光透過性ガラスである請求項 29記載のタンパク質アレイ。
[31] 紫外光透過性ガラスが石英ガラスである請求項 30記載のタンパク質アレイ。
[32] タンパク質がタンパク質アレイの 1スポット当たり 0.01 μ g/mm2以上の密度で固定化 されている請求項 29〜31のいずれか 1項に記載のタンパク質アレイ。
[33] タンパク質がタンパク質アレイの 1スポットにおける吸光度が 0.001以上となる密度で 固定されている請求項 29〜31のいずれか 1項に記載のタンパク質アレイ。
[34] 光透過性ガラスの表面にキャストされた一級アミンを含む担体とタンパク質のァミノ 酸配列の C末端のカルボキシ基が共有結合してタンパク質が整列固定化された請求 項 29〜33のいずれ力 1項に記載のタンパク質アレイ。
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