JPWO2006059727A1 - タンパク質アレイ用検出および解析システム - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイおよび分光光度計を含む、タンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステムであって、分光光度計を用いて前記タンパク質アレイに光を照射し、タンパク質アレイを透過した光を測定することによりアレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
2 光学系(光照射手段)
3 タンパク質固定化光透過性基板
4 紫外-可視光変換デバイス
5 CCDカメラ(光検出手段)
6 ビデオキャプチャボード
7 データ処理手段
8 レンズまたはスリット
9 通信手段
10 アレイ基板
11 固定化したタンパク質
12 カバー
13 流入口
14 排出口
15 合成石英ガラス。
16 マトリックス
17 蛍光ガラス
18 スポット
19 光断面
吐出量、吐出速度を適宜設定すればこの範囲で任意の幅のラインパターンで固定化することができる。また、ドットパターンを採用する場合、ドット一つに対して1滴分のタンパク質溶液を吐出して直径数μmから数mmの円状のドットとしてタンパク質を固定化することもできるし、プリンティング時のパターニングを調整し、一辺が数μmから数mmの矩形状にドットを形成させることもできる。この際も、所望のドットパターンによりタンパク質溶液の吐出量や吐出速度を適宜設定すればよい。なお、1ドットあるいは1ライン上に固定化するタンパク質の量は上記のとおりであり、この際の、固定化に用いるタンパク質溶液の濃度は1mM〜1M程度が望ましく、固定化するタンパク質溶液の量は、0.1μl〜100μl程度が望ましいが、限定されず固定化しようとするタンパク質量に応じて、タンパク質溶液の濃度および固定化するタンパク質溶液の量を適宜変更することができる。
アレイ用基材の作製においては、先ずバインドシランを石英ガラス(7.7cm×2.6cm×1mmのスライドガラスのサイズに加工したもの、VIOSIL-SG2AS;信越化学工業社より購入)の表面に導入し、その後、アミノ基を有するポリマー(分子量30,000〜70,000のポリLリジン;シグマ社より購入)を含むポリアクリルアミドゲルの薄板(2.4cm×5.0cm×約50μm)を形成させた。
緑色蛍光タンパク質(GFP)(配列番号1)のカルボキシ末端に固定化用の配列として、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp(配列番号2)なる配列を付加し、式(1) NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOHに該当する固定化用タンパク質(配列番号3)を作製し、固定化反応の条件等を検討した。
ジヒドロ葉酸還元酵素の変異酵素(AS-DHFRと略す) (配列番号4)のカルボキシ末端に固定化用の配列として、Gly-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp(配列番号2)なる配列を付加し、式(1) NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOHに該当する固定化用タンパク質(配列番号5)を作製し、タンパク質の紫外線領域における光学的活性をアレイ上で検出に用いた。
上記〔1〕において作製したアレイ用基材に、固定化用緑色蛍光タンパク質もしくは固定化用AS-DHFRを以下のように吸着整列化させた。先端の開口部の半径が約0.5mmのマイクロロード用のピペット用チップ(QSP社より購入)を、容量が10μlのマイクロインジェクション用のシリンジ(ハミルトン社より購入)に装着し、これを、ナリシゲ社より購入した油圧式のコントローラに装着し、マイクロマニピュレータとして用い、上下、左右、前後の3方向に、そのホルダーを移動させることで、タンパク質のスポット用装置とした。この装置を用いることで、タンパク質のスッポッティングを、位置に関しては0.5mmの単位で、溶液量に関しては0.1μlの単位でコントロールすることが可能であった。
上記〔4〕において、固定化用緑色蛍光タンパク質または固定化用AS-DHFRを吸着させた基板に、5mMの2-ニトロ-5-チオシアノ安息香酸(NTCB)を含む10mM燐酸緩衝液(pH7.0)を1mlを用いて、基板全体をこの溶液で浸らせた状態で、室温で4時間放置し、タンパク質のシアノ化反応を行わせた。その後、10mM燐酸緩衝液(pH7.0)で十分洗い、過剰な試薬等を除去した後、基板を10mM硼酸緩衝液(pH9.5)に浸し、室温で24時間穏やかに攪拌させることにより固定化反応を行った。固定化反応が終了した後、スライドガラスごとシャーレの中の1MKClを含む10mM燐酸緩衝液(pH7.0)に浸し、24時間穏やかに攪拌することにより、未反応タンパク質及び副反応生成物を除去した。その結果を図3に示す。これは、緑色蛍光タンパク質を固定化したアレイ用基材を自然光下で撮影したものであるが、固定化されたタンパク質が示す蛍光強度から、本実施例で作製した基板を用いた場合、固定化可能な蛍光タンパク質の面密度の上限は、おおよそ2μg/mm2であると推測された。
固定化されたタンパク質の光学的活性を測定した。
測定に用いた機器装置は以下のとおりである。
光照射用の光源として島津UV-1200またはAVIV-ATG14を用いた。前者はスリット幅の調整はできず、また出力が約30W(0.3mA×100V)と比較的低いことを特徴とする。後者は、Xenonランプ(450W)を採用しておりスリット幅を調整することができる。これらの、光源の回折格子からの光をセルホルダー手前に置いたUV専用ミラーで外側に光路を移して観測系を構築した。図4に島津UV-1200の観測系の光学系統図(光路)を示す。図4の行光学系統図中、回折格子が光学系にあるため、波長は装置制御側で設定する。
Claims (34)
- 光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイおよび分光光度計を含む、タンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステムであって、分光光度計を用いて前記タンパク質アレイに光を照射し、タンパク質アレイを透過した光を測定することによりアレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
- 光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイ、光照射手段、光検出手段を含む、タンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステムであって、光照射手段によりタンパク質アレイに光を照射し、光検出手段によりタンパク質アレイを透過した光を測定することによりアレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
- さらに、データ処理手段を含む、請求項2記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
- タンパク質がタンパク質アレイの1スポット当たり0.01μg/mm2以上の密度で固定化されている請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
- タンパク質がタンパク質アレイの1スポットにおける吸光度が0.001以上となる密度で固定されている請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
- 高密度で整列固定化したタンパク質が、式 NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-Y [式中、R1およびR2は任意のアミノ酸配列を表し、Yは基板を表す]で示される、請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
- 光透過性ガラスの表面にキャストされた一級アミンを含む担体とタンパク質のアミノ酸配列のC末端のカルボキシ基が共有結合してタンパク質が整列固定化された、請求項1〜6のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
- 光検出手段がCCDまたはフォトダイオードアレイである、請求項1〜7のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
- タンパク質アレイに照射される光が紫外光であり、光透過性基板が紫外光透過性基板である請求項1〜8のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
- 紫外光透過性基板が石英ガラス製基板である請求項9記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
- タンパク質アレイを透過した紫外光を紫外-可視光変換デバイスに照射し、紫外光から可視光に変換された光を検出する請求項9または10に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
- 紫外-可視光変換デバイスが蛍光ガラスである請求項11記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
- タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と検体を接触させ、接触前後におけるタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、固定化タンパク質と相互作用する検体中のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出する、請求項1〜12のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
- タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と他のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を接触させ、接触前後にわたってタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、固定化タンパク質とタンパク質またはタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、請求項1〜12のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
- 光透過性基板が、内部に流路が形成されたフローチャンネルセルまたはマイクロチップであり、該流路内にタンパク質が固定化されており、検体を該流路を通すことにより、固定化タンパク質と検体中のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、請求項1〜12のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
- 光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイに分光光度計を用いて光を照射し、タンパク質アレイを透過した光を測定することによりアレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。
- タンパク質がタンパク質アレイの1スポット当たり0.01μg/mm2以上の密度で固定化されている請求項16記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。
- タンパク質がタンパク質アレイの1スポットにおける吸光度が0.001以上となる密度で固定されている請求項16記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。
- 高密度で整列固定化したタンパク質が、式 NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-Y [式中、R1およびR2は任意のアミノ酸配列を表し、Yは基板を表す]で示される、請求項16〜18のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。
- 光透過性ガラスの表面にキャストされた一級アミンを含む担体とタンパク質のアミノ酸配列のC末端のカルボキシ基が共有結合してタンパク質が整列固定化された、請求項16〜19のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。
- 光検出手段がCCDまたはフォトダイオードアレイである、請求項16〜20のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。
- タンパク質アレイに照射される光が紫外光であり、光透過性基板が紫外光透過性基板である請求項16〜21のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。
- 紫外光透過性基板が石英ガラス製基板である請求項22記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。
- タンパク質アレイを透過した紫外光を紫外-可視光変換デバイスに照射し、紫外光から可視光に変換された光を検出する請求項22または23に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。
- 紫外-可視光変換デバイスが蛍光ガラスである請求項24記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。
- タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と検体を接触させ、接触前後におけるタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、固定化タンパク質と相互作用する検体中のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出する、請求項16〜25のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。
- タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と他のタンパク質または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を接触させ、接触前後にわたってタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、タンパク質とタンパク質またはタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、請求項16〜25のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。
- 光透過性基板が、内部に流路が形成されたフローチャンネルセルまたはマイクロチップであり、該流路内にタンパク質が固定化されており、検体を該流路を通すことにより、固定化タンパク質と検体中のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、請求項16〜25のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。
- 式 NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-Y [式中、R1およびR2は任意のアミノ酸配列を表す]で示されるタンパク質が高密度で整列固定化したタンパク質アレイであって、Yで表される固定化基板が光透過性ガラス製であるタンパク質アレイ。
- 光透過性ガラスが紫外光透過性ガラスである請求項29記載のタンパク質アレイ。
- 紫外光透過性ガラスが石英ガラスである請求項30記載のタンパク質アレイ。
- タンパク質がタンパク質アレイの1スポット当たり0.01μg/mm2以上の密度で固定化されている請求項29〜31のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ。
- タンパク質がタンパク質アレイの1スポットにおける吸光度が0.001以上となる密度で固定されている請求項29〜31のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ。
- 光透過性ガラスの表面にキャストされた一級アミンを含む担体とタンパク質のアミノ酸配列のC末端のカルボキシ基が共有結合してタンパク質が整列固定化された請求項29〜33のいずれか1項に記載のタンパク質アレイ。
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