JP2010127856A - タンパク質アレイを用いた検出および解析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイに分光光度計を用いて光を照射し、透過した光を測定することによりアレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による通過光量の減少割合を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法において、タンパク質を固定化した部分の透過光強度とタンパク質を固定化していない部分の透過光強度とを比較・演算することにより測定する方法であって、濃度を算出し、アレイ上のタンパク質と相互作用したタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物の量を測定する方法。
【選択図】図1
Description
[1] 基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイに分光光度計を用いて光を照射し、タンパク質アレイを通過した光を測定することによりアレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による通過光量の減少割合を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法において、タンパク質を固定化した部分の通過光強度とタンパク質を固定化していない部分の通過光強度とを比較・演算することにより、該アレイ上のタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物の量を測定する方法であって、
(a) アレイ上のタンパク質または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を結合させる前にアレイ上のタンパク質を固定化したタンパク質スポット部位およびタンパク質スポット以外の部位の通過光を2次元のマルチチャンネル光センサを用いて検出し各測定点の検出値からタンパク質スポット部位およびタンパク質スポット以外の部位の通過光の平均値を算出し、
(b) アレイ上のタンパク質または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を結合させた後にアレイ上のタンパク質スポット部位およびタンパク質スポット以外の部位の通過光を2次元のマルチチャンネル光センサを用いて検出し各測定点の検出値からタンパク質スポット部位部分およびタンパク質スポット以外の部位の通過光の平均値を算出し、
(c) 上記(a)および(b)で算出した通過光の平均値に基づいて、アレイ上のタンパク質スポット部位およびアレイ上に結合したタンパク質スポット以外の部位のタンパク質または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物の濃度を算出し、アレイ上のタンパク質と相互作用したタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物の量を測定する方法。
(ii) 各測定点における測定値と(i)で算出した平均値とを比較し、
(iii) 各測定点における測定値が前記平均値より小さい場合に、該測定点はアレイ上のタンパク質スポット上の測定点と判断し、測定点における測定値が前記平均値より大きい場合に、該測定点はアレイ上のタンパク質スポット以外の部位上の測定点と判断し、
(iv) (iii)でアレイ上のタンパク質スポット以外の部位上の測定点の位置とタンパク質スポットの位置との間の距離を算出し、算出した距離をあらかじめ定めた所定の値とを比較し、
(v) 算出した距離が前記所定の値より小さい場合に、該測定点をタンパク質スポットの周辺部位上の測定点と判断し、測定値が前記所定の値より大きい場合に、該測定点をタンパク質スポットおよびタンパク質スポットの周辺部位以外の部位上の測定点と判断する、
ことによりタンパク質スポット部分とタンパク質スポットの周辺部位を決定する、[1]〜[3]のいずれかのアレイ上のタンパク質と相互作用したタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物の量を測定する方法。
(ii) 基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイに分光光度計を用いて光を照射し、タンパク質アレイを通過した光を測定することにより測定したタンパク質アレイデータを画像として得て、
(iii) (i)で作成した鋳型タンパク質アレイデータと(ii)で得た測定タンパク質アレイデータを比較し、該鋳型タンパク質アレイデータを移動、拡大、縮小または回転させることにより、前記鋳型タンパク質アレイデータと前記測定タンパク質アレイデータを重ね合せる、
ことによりタンパク質スポット部位とタンパク質スポットの周辺部位を決定する、[1]〜[3]のいずれかのアレイ上のタンパク質と相互作用したタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物の量を測定する方法。
石英ガラスの表面に0.1mmの深さの窪みを作製し、その窪みにシリカモノリスゲルを形成させ、エポキシ基を導入し、さらにそこにアミノ基含有ポリマーを導入することにより、タンパク質固定化用モノリス基板を作製した(図2)。以下に作製過程の詳細を記す。
実施例1で作製しモノリス基板に、抗体結合特性を有するリガンドタンパク質の固定化を行った。以下の実施例においては、12行×8列の96個の格子点にタンパク質をスポットして固定化した例を示している。
モノリス基板を用いたフローセルを組み立てた。構成を、図3に示す。図3Bにはフローセルの写真を示す。
モノリス基板は、一見して不透明であり、いわゆる光吸収で測定することが可能か疑問であった。そこで、平行化した強い光を照射して、反対側にもれてくるいわゆる通過してくる光の量がタンパク質の存在によりどのような挙動を示すかを調べた。なお、通過してくる光には、ゲル等の基板に由来する多重散乱による光が含まれ、いわゆる、迷光となる。
S=-log(Ip/Io)
として求めた。このシグナルを表す式は、透過光を基準としたときの光吸収の度合い、いわゆる、吸光度と同じ形式である。
実施例3において用いたフローセルに、固定化リガンドに結合するタンパク質として、ヒトポリクローナル抗体溶液を送液することにより、シグナルがどのように変化するかを観察した。
実施例3において用いたフローセルに、固定化リガンドに結合するタンパク質として、ヒトポリクローナル抗体溶液を送液することにより、シグナルが刑事的にどのように変化するかを観察した。
本実施例では、8種類の異なるリガンドを固定化したリガンドタンパク質アレイを以下のように作製した。8種類の固定化用リガンドタンパク質の配列としては、プロテインA(Staphylococcus aureus)の抗体結合ドメインAを様々に改変したものや、プロテインG(Streptococci)の抗体結合ドメインを改変したものに、固定化用のアミノ酸配列を各々のカルボキシ末端に連結させたものを用いた。実施例2で示したのと同様の方法で、これらのアミノ酸配列をコードする遺伝子を大腸菌で発現させて精製し、固定化用モノリス基板にスポットした。ただしスポットでは、8種類のリガンド各々が12行×8列の96個の格子点を斜め方向に渡るように、各々のリガンドタンパク質を12個ずつスポットした(図6)。このように並べたリガンドに関して得られるデータの平均をとることにより、場所に依存する影響を可能な限り排除した。スポットした後の固定化反応やアミノ基のブロッキング反応等の作業は全て実施例2で示したのと同じ方法で行なった。
様々な種類のリガンドに関して、その性質(抗体に対する親和性)の違いを検出するため、実施例3で作製したリガンドアレイ2に関して、実施例4で示した方法に従い、抗体の結合・解離を観察した(図7)。結合過程・洗浄過程では、すべての種類のリガンドに関してほとんど同じように吸光度が変化していたが、溶出過程においては、リガンドの種類に依存して吸光度減少のスピードに大きな違いがみられた。このことは、pH=5の環境下では、各種リガンドから抗体が解離するスピードが異なること、すなわちリガンドの種類によって抗体親和性に大きな違いがあることを示している。
溶液がモノリスの内部を容易に拡散できるかどうか確かめるため、色素分子溶液(1%のブリリアントブルー水溶液)を用い、色素分子がモノリスゲル基板の中をどのように移動していくのか以下のように観察した。
本発明のデータ処理方法を示す。図1に示す装置を用いた。本実施例においては、具体的な画像から、親和性を計算するまでのデータ処理を中心に説明する。
第1の方法は、各タンパク質を整列固定化した部分(スポット)と、タンパク質を固定していない部分との区別をする方法として、通過してくる光の強度の画像情報からこれらの部分を自動決定することを特徴とする。
第2の方法は、各タンパク質を整列固定化した部位(スポット部位)と、タンパク質を固定していない部位との区別をする方法として、あらかじめ使用者がスポット直径・スポット間隔・スポット行数・スポット列数などを入力し、それにより形成されたパターンを画面上で移動・拡大・縮小・回転などすることにより実際の画像にあてはめることで区別することを特徴とする。
2 光学系(光照射手段)
3 タンパク質固定化光透過性基板
4 紫外-可視光変換デバイス
5 CCDカメラ(光検出手段)
6 ビデオキャプチャボード
7 データ処理手段
8 レンズまたはスリット
9 通信手段
10 アレイ基板
11 固定化したタンパク質
12 カバー
13 溶液流入口
14 溶液排出口
15 担体
16 固定化されたタンパク質濃度
17 溶液中のタンパク質のうち非特異的に吸着した濃度
18 溶液中のタンパク質のうち固定されたタンパク質との特異的親和力で吸着した濃度
19 CCD検出器の1ピクセル
20 スポット
21 スポット半径
22 スポット外周の半径
23 スポット中の測定点
24 スポット外周の測定点
25 スポット外周以外の測定点
Claims (7)
- 基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイに分光光度計を用いて光を照射し、タンパク質アレイを通過した光を測定することによりアレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による通過光量の減少割合を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法において、タンパク質を固定化した部分の通過光強度とタンパク質を固定化していない部分の通過光強度とを比較・演算することにより、該アレイ上のタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物の量を測定する方法であって、
(a) アレイ上のタンパク質または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を結合させる前にアレイ上のタンパク質を固定化したタンパク質スポット部位およびタンパク質スポット以外の部位の通過光を2次元のマルチチャンネル光センサを用いて検出し各測定点の検出値からタンパク質スポット部位およびタンパク質スポット以外の部位の通過光の平均値を算出し、
(b) アレイ上のタンパク質または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を結合させた後にアレイ上のタンパク質スポット部位およびタンパク質スポット以外の部分の通過光を2次元のマルチチャンネル光センサを用いて検出し各測定点の検出値からタンパク質スポット部位およびタンパク質スポット以外の部位の通過光の平均値を算出し、
(c) 上記(a)および(b)で算出した通過光の平均値に基づいて、アレイ上のタンパク質スポット部位およびアレイ上に結合したタンパク質スポット以外の部位のタンパク質または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物の濃度を算出し、アレイ上のタンパク質と相互作用したタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物の量を測定する方法。 - アレイ上のタンパク質スポット以外の部位が、タンパク質スポットの周辺部位である請求項1記載のアレイ上のタンパク質と相互作用したタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物の量を測定する方法。
- 内部に流路が形成されたフローチャンネルセルまたはマイクロチップ中の流路内において、タンパク質が基板に固定化されており、検体を該流路を通すことにより、固定化タンパク質と検体中のタンパク質および/または固定化タンパク質と相互作用するフローシステムを用いる、請求項1または2に記載のアレイ上のタンパク質と相互作用したタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物の量を測定する方法。
- タンパク質を固定する基板がモノリスゲルである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアレイ上のタンパク質と相互作用したタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物の量を測定する方法。
- 2次元のマルチチャンネル光センサがCCD、CMOSまたはフォトダイオードアレイである請求項1〜4のいずれか1項に記載のアレイ上のタンパク質と相互作用したタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物の量を測定する方法。
- (i) 2次元のマルチチャンネル光センサで得られた各測定点における測定値の平均値を算出し、
(ii) 各測定点における測定値と(i)で算出した平均値とを比較し、
(iii) 各測定点における測定値が前記平均値より小さい場合に、該測定点はアレイ上のタンパク質スポット上の測定点と判断し、測定点における測定値が前記平均値より大きい場合に、該測定点はアレイ上のタンパク質スポット以外の部位上の測定点と判断し、
(iv) (iii)でアレイ上のタンパク質スポット以外の部位上の測定点の位置とタンパク質スポットの位置との間の距離を算出し、算出した距離をあらかじめ定めた所定の値とを比較し、
(v) 算出した距離が前記所定の値より小さい場合に、該測定点をタンパク質スポットの周辺部位上の測定点と判断し、測定値が前記所定の値より大きい場合に、該測定点をタンパク質スポットおよびタンパク質スポットの周辺部位以外の部位上の測定点と判断する、
ことによりタンパク質スポット部分とタンパク質スポットの周辺部位を決定する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアレイ上のタンパク質と相互作用したタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物の量を測定する方法。 - (i) タンパク質アレイに関する、タンパク質を固定化するスポット直径、スポット間隔、スポット行数およびスポット列数を所定の値に設定した鋳型タンパク質アレイデータを作成し、
(ii) 基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイに分光光度計を用いて光を照射し、タンパク質アレイを通過した光を測定することにより測定したタンパク質アレイデータを画像として得て、
(iii) (i)で作成した鋳型タンパク質アレイデータと(ii)で得た測定タンパク質アレイデータを比較し、該鋳型タンパク質アレイデータを移動、拡大、縮小または回転させることにより、前記鋳型タンパク質アレイデータと前記測定タンパク質アレイデータを重ね合せる、
ことによりタンパク質スポット部位とタンパク質スポットの周辺部位を決定する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアレイ上のタンパク質と相互作用したタンパク質および/またはタンパク質以外の他の化合物の量を測定する方法。
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