WO2013187398A1 - 抗体精製用担体並びにその製造方法及びその用途 - Google Patents

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正寛 巌倉
潔憲 広田
誠治 大高
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ダイソー株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a carrier for antibody purification and a method for producing the same.
  • the present invention further relates to an affinity chromatography column packed with an antibody purification carrier and an antibody purification method using the same.
  • Protein A here refers to protein A derived from Staphylococcus aureus (described in A. Forsgren and J. Sjoquist, J. Immunol. (1966) 97, 822-827.) Or the antibody binding function constituting it. Points to some domain sequences.
  • a general antibody purification method using affinity chromatography using a carrier on which protein A is immobilized is as follows. That is, (1) The raw material crude liquid containing the antibody is passed through a column packed with a carrier on which protein A is immobilized, and the target antibody is adsorbed on the carrier. (2) The carrier on which the antibody is adsorbed is washed with a neutral buffer to remove impurities, and (3) an acidic buffer (specifically, pH 2.5 to 3.0) is used. The antibody adsorbed on the carrier is eluted.
  • the present inventors derived from protein A, which is a protein that specifically binds to the Fc domain of the antibody while controlling the orientation.
  • a technology for introducing a protein into an insoluble carrier with controlled orientation has been developed (see Patent Documents 1 to 16).
  • orientation control immobilization method developed by the present inventors is expressed as follows in a more general form.
  • Amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 [wherein the sequence represents a sequence from the amino terminal side to the carboxy terminal side, The sequence of the R1 portion may not be present, and if present is a sequence composed of amino acid residues other than lysine and cysteine residues:
  • the sequence of the R2 portion is a sequence of the protein to be immobilized derived from protein A, and is a sequence that does not contain lysine residues and cysteine residues at all so as to maintain the binding property with the antibody:
  • the sequence of the R3 portion may not be present, and if present is a spacer sequence composed of amino acid residues other than lysine and cysteine residues;
  • the sequence of the R4 portion is a sequence composed of two amino acids represented by cysteine-X (X is an amino acid residue other than lysine or cysteine):
  • the R5 portion sequence may not be present, and if present, is a
  • the present invention provides a general solution to the above-mentioned problems associated with purification by affinity chromatography using a carrier on which protein A, including protein A, is immobilized, so that many antibodies cause acid denaturation.
  • the present invention provides an affinity chromatography column for antibody purification packed with a carrier on which a protein containing protein A is immobilized, and an antibody purification method using the column.
  • the present inventors diligently studied to solve the above-mentioned problems to be solved in protein A immobilization.
  • the present inventors are responsible for the binding function to the antibody in the sequence portion consisting of the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6, which is used for protein orientation control immobilization.
  • the protein A used for the R2 portion the crude antibody-containing solution in the antibody purification process is passed through a column packed with a carrier on which protein A is immobilized, and the target antibody is adsorbed and eluted on the carrier.
  • the antibody adsorbed on the carrier is eluted using an acidic buffer without affecting the operation of washing the carrier adsorbed with the antibody with a neutral buffer to remove impurities.
  • the idea that the above problem can be solved if a protein A mutant having the property of allowing antibody desorption in the range of pH 4.0 to 5.5 can be developed. It was.
  • Sequence derived from the A domain of protein A (SEQ ID NO: 1): Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Lys-Lys Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Lys AD-1 sequence (sequence prepared based on the A domain sequence of protein A and adapted to the format of R1-R2-R3-R4-R5-R6) (SEQ ID NO: 2): Ala-Asp
  • R1, R2, R3, R4, R5 and R6 in the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 of the sequence (AD-1) shown in SEQ ID NO: 2 are the following sequences.
  • R1 methionine derived from the expression start codon in E. coli, usually removed because it is almost eliminated with expression: Met R2 (sequence obtained by modifying the amino acid sequence of the A domain of protein A so as not to contain any cysteine or lysine) (SEQ ID NO: 3): Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly R3 (free of link
  • the present inventors have comprehensively produced mutant proteins in which one amino acid substitution has been made for all amino acid residues constituting R2, based on the amino acid sequence named AD-1.
  • a thin layer of a silica monolith porous material is used as a support layer for the array substrate.
  • Protein L adsorbed by a cyanating reagent after poly L lysine is introduced into the surface of the porous silica monolith and the mutant protein is adsorbed by ion interaction by spotting the mutant with a spotter.
  • the SH group of the cysteine residue therein is cyanated, and an orientation control immobilization reaction via cyanocysteine is performed.
  • the R4-R5-R6-derived portion in the mutant protein was removed by washing with a buffer solution with a high salt concentration, and the R1-R2-R3 portion was oriented to a silica monolith porous body at its carboxy terminus.
  • an array substrate fixed in a spot shape was produced.
  • the antibody solution is passed through the array substrate on which the mutant protein is immobilized, (2) washed with a neutral buffer solution, and (3) a buffer solution having a pH of 5.0 as a buffer solution for antibody elution. Then, (4) a pH 2.5 buffer solution was passed through for regeneration.
  • the change in the amount of transmitted light at 280 nm of each spot was measured over time using an array analyzer. When an antibody binds to each mutant spot, the amount of transmitted light at 280 nm decreases as the bound antibody absorbs at 280 nm.
  • the amount of transmitted light at 280 nm increases.
  • the logarithm of the transmitted light at 280 nm was taken (corresponding to the amount of change in absorbance) when a pH 5.0 buffer solution was passed as the antibody elution buffer solution (step (3) above). This was plotted against elapsed time.
  • the logarithm value of the transmitted light at 280 nm when the buffer solution at pH 5.0 is passed is 280 nm after passing through the buffer solution at pH 2.5 (step (4) above) for regeneration. elapsed time to half of the difference between the logarithm of the light to determine the value of T 0.5.
  • mutants that gave as small a value as possible were selected.
  • the target mutant could be found.
  • a mutant in which several of the found mutant sequences were repeatedly ligated was prepared, and a carrier in which the orientation control was immobilized on the carrier was prepared.
  • an affinity column was prepared, and elution was carried out at various pH as elution conditions, and the chromatogram was analyzed.
  • protein A having a specific amino acid sequence enabling desorption of the antibody under mild pH conditions was confirmed that the object of the present invention, that is, obtaining a carrier containing sucrose was achieved, and the present invention was completed.
  • the present invention is as follows.
  • Amino acid sequence represented by general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 [wherein the sequence represents a sequence from the amino terminal side to the carboxy terminal side, The sequence of the R1 portion may not be present, and if present is a sequence composed of amino acid residues other than lysine and cysteine residues:
  • the sequence of the R2 portion is a sequence of a protein A variant that is a protein to be immobilized, or a sequence in which 1 to 3 of the sequences are linked, and does not contain lysine and cysteine residues.
  • the sequence of the R3 portion may not be present, and if present is a spacer sequence composed of amino acid residues other than lysine and cysteine residues;
  • the sequence of R4 is a sequence composed of two amino acids represented by cysteine-X (X is an alanine or an amino acid residue other than alanine and cysteine):
  • the R5 portion sequence may not be present, and if present, is a sequence that does not include lysine and cysteine residues, and is a protein comprising an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 A sequence characterized by comprising acidic amino acid residues that can bring the entire isoelectric point to the acidic side;
  • the sequence of the R6 part is an affinity tag sequence for protein purification]
  • An immobilized carrier (provided with a monolith structure
  • Protein A variant binds to protein A variant immobilized on the array substrate and is half the amount of antibody bound when eluted with 0.1 M sodium citrate solution at pH 5.0 Fixation of [1], which is a protein A variant in which the elapsed time T 0.5 until dissociation and the dissociation constant with the antibody are lower than the T 0.5 of the protein A variant represented by SEQ ID NO: 3 and the dissociation constant Carrier.
  • the R2 portion sequence is a variant protein sequence of the A domain of protein A consisting of any one of SEQ ID NOs: 4 to 7, or a protein A A consisting of any one of the sequence numbers 4 to 7
  • the sequence of the R3 portion is a sequence consisting of 1 to 10 glycines, [1] -Immobilization support
  • the sequence of the R5 portion is 1 to 10 amino acid residues consisting of amino acid residues of aspartic acid and / or glutamic acid.
  • the immobilization carrier according to any one of [1] to [7], wherein
  • the sequence of the R5 portion is a sequence consisting of 1 to 10 aspartic acids, [8 ] Immobilization carrier.
  • the sequence of the R6 portion is an amino acid sequence consisting of 4 or more histidine residues, The immobilization carrier according to any one of 1] to [9].
  • the immobilization support according to any one of [1] to [10], wherein the support is selected from the group consisting of a silica support, glass beads, and a polymer.
  • a sulfhydryl group of the only cysteine residue present in a protein comprising the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 of any one of [1] to [11] Is converted to a thiocyano group and allowed to act on an arbitrary immobilization carrier having a primary amine as a functional group, whereby R1-R2-R3 which is an amino acid sequence portion present on the amino terminal side of the cysteine residue in the protein
  • a sulfhydryl group of the only cysteine residue present in a protein comprising an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 of any one of [1] to [11] Is converted to a thiocyano group and allowed to act on an arbitrary immobilization carrier having a primary amine as a functional group, whereby R1-R2-R3 which is an amino acid sequence portion present on the amino terminal side of the cysteine residue in the protein
  • a method for producing the immobilization support according to [12] which comprises binding a moiety with an amide bond.
  • a protein comprising an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 used for immobilizing a protein comprising an amino acid sequence represented by R1-R2-R3 on an immobilization carrier
  • the amino acid sequences of the R1, R2, R3, R4, R5 and R6 moieties are selected to meet the following conditions: (a) the sequence of R1 part is not present, or if present, a sequence composed of amino acid residues other than lysine and cysteine residues is selected; (b) The sequence of the R2 portion is a protein A variant sequence, or a sequence in which 1 to 3 of the sequences are linked, and does not contain lysine and cysteine residues, and the protein A variant is an antibody A sequence that has the property of binding strongly to neutral conditions and dissociating from the antibody bound under neutral conditions under mildly acidic conditions in the range of pH 4.0 to 5.5; (c) the sequence of the R3 moiety is not present or, if present, a
  • Protein A variant binds to protein A variant immobilized on the array substrate and is half the amount of antibody bound when eluted with 0.1 M sodium citrate solution at pH 5.0
  • the method according to [17] wherein the elapsed time T 0.5 until dissociation of the protein A is a protein A variant whose dissociation constant with the antibody is lower than the T 0.5 of the protein A variant represented by SEQ ID NO: 3 and the dissociation constant .
  • protein A variant is a variant comprising an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are substituted in the amino acid sequence of protein A derived from Staphylococcus aureus.
  • the R2 portion sequence is a variant protein of the A domain of protein A consisting of any one of SEQ ID NOs: 4 to 7, or a sequence in which one to three sequences of any of SEQ ID NOs: 4 to 7 are linked.
  • an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 containing a protein A mutant as R2 is designed, a protein comprising the amino acid sequence is prepared, Elution performance that the antibody bound to protein A can be performed under milder pH conditions (pH 4.0 to 5.5) during antibody purification by immobilizing the protein A variant on a carrier Can be obtained. Further, by using the above-mentioned immobilization carrier, it becomes possible to elute the antibody under mild pH conditions (pH 4.0 to 5.5), and the recovery rate of the obtained antibody is improved. Furthermore, by using the above-mentioned immobilized carrier as a filler, an affinity chromatography column having excellent purification ability can be obtained, and an efficient antibody purification method can be provided using the column.
  • FIGS. 2A to 2F show the results of plotting the values of elution parameters and T 0.5 of AD-1 at pH 5.0. It is a figure which shows the pH dependence of the elution / recovery amount of an antibody in the affinity chromatography using protein A.
  • the horizontal axis represents the pH of the buffer used for elution
  • the vertical axis represents the recovery rate (%) of the antibody eluted at the time of elution at each pH. Is shown.
  • FIGS. 3A, B and C show chromatograms using eluates with pH 3.0, 4.0 and 5.0, respectively.
  • the sequence of the R2 moiety in the protein consisting of the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 of the present invention is the protein A to be immobilized to be immobilized, and the general formula R1
  • the sequence represents an amino acid sequence from the amino terminal side to the carboxy terminal side.
  • the sequence of the R1 portion may not be present, and if present, is a sequence composed of amino acid residues other than lysine and cysteine residues. Specific examples include methionine derived from an expression initiation codon in E. coli. However, the methionine is usually not present because it is almost removed with expression.
  • the sequence of the R2 portion is the amino acid sequence of a natural protein A mutant consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • an amino acid sequence consisting of a repeat of the sequence unit may be used with the amino acid sequence of the protein A variant as the sequence unit.
  • the number of repetitions is 1 to 3.
  • the amino acid sequence consisting of repetitions is also referred to as a sequence in which 1 to 3 amino acid sequences of protein A mutants are linked.
  • the amino acid sequence of the protein A mutant used for the R2 moiety does not contain any lysine residues or cysteine residues.
  • the protein A mutant to be used has a characteristic that it strongly binds to the antibody under neutral conditions and dissociates from the antibody bound under neutral conditions under a weakly acidic condition in the range of pH 4.0 to 5.5. .
  • protein A in the R2 portion protein A derived from Staphylococcus aureus (described in A.sForsgren and J. Sjoquist, J.olImmunol. (1966) 97, 822-827.) was designed using conventional gene modification techniques. By doing so, a protein A variant having a modified amino acid sequence can be mentioned.
  • a mutant of a domain that can bind to the Fc region of the protein A antibody may be used as the protein of the R2 portion. Examples of such domains include E domain, D domain, A domain, B domain, and C domain. Among these, A domain mutants are preferred. In the present invention, protein A includes these domains.
  • amino acid sequence of protein A contains a lysine having an ⁇ -amino group or a cysteine residue having a sulfhydryl group
  • lysine and cysteine are substituted with other amino acids so that the binding activity with the antibody of protein A does not decrease.
  • lysine and cysteine are not included in the amino acid sequence of protein A.
  • the present inventors have already established a method for producing a protein containing no lysine and cysteine (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-266219).
  • a protein A comprising an amino acid sequence composed of 18 amino acids, which is modified based on the amino acid sequence of naturally-occurring protein A and does not contain lysine and cysteine residues, A protein exhibiting the same performance as that of natural protein A can be produced.
  • sequence of the A domain of protein A derived from Staphylococcus aureus is represented by SEQ ID NO: 1 below.
  • Sequence derived from the A domain of protein A (SEQ ID NO: 1): Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Lys-Lys Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Lys
  • This protein A has 4 residues of lysine (the 35th, 49th, 50th and 58th amino acid positions), and the lysine residue was substituted with an arginine residue or a glycine residue by the above method.
  • the amino acid sequence of the A domain of protein A is represented by SEQ ID NO: 3 below.
  • a sequence in which the A domain of protein A is modified so as not to contain any cysteine and lysine (SEQ ID NO: 3): Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
  • a protein comprising an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6, including the amino acid sequence of each mutant as the R2 moiety, is represented by AD-3, AD-4, AD-6-1, and Called AD-6-2.
  • the A domain mutant of protein A in the R2 part of AD-3 has the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 4), and in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, the 15th E (glutamic acid) is replaced with H (histidine).
  • the 29th G (glycine) is replaced with A (alanine).
  • AD-3 The amino acid sequence of AD-3 (SEQ ID NO: 4): Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Met-Pro Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Phe Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
  • the A domain variant of protein A in the R2 part of AD-4 has the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 5).
  • the 15th E (glutamic acid) is replaced with H (histidine).
  • the 19th M (methionine) is replaced with V (valine), and the 29th G (glycine) is replaced with A (alanine).
  • AD-4 Amino acid sequence of AD-4 (SEQ ID NO: 5): Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Val-Pro Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Phe Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
  • the A domain variant of protein A in the R2 part of AD-6-1 consists of the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 6), and in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, the 15th E (glutamic acid) is H (histidine).
  • the 19th M (methionine) is replaced with V (valine), and the 29th G (glycine) is replaced with E (glutamic acid).
  • AD-6-1 Amino acid sequence of AD-6-1 (SEQ ID NO: 6): Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Val-Pro Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Glu-Phe Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
  • the A domain variant of protein A in the R2 part of AD-6-2 has the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 7), and in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, the 15th E (glutamic acid) is H (histidine).
  • the 19th M (methionine) is replaced with V (valine), and the 29th G (glycine) is replaced with D (aspartic acid).
  • Amino acid sequence of AD-6-2 (SEQ ID NO: 7): Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Val-Pro Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Asp-Phe Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
  • the sequence of the R3 portion is an arbitrary spacer sequence composed of amino acid residues other than lysine and cysteine residues. The R3 moiety may not be present.
  • the sequence of the R3 portion is immobilized together with the R2 portion on the immobilization carrier.
  • the R3 portion plays a role as an appropriate linker that prevents the function of the R2 portion from being inhibited by binding to the immobilization support during immobilization.
  • the role as a linker is to maintain an appropriate distance between the protein having a specific function of the R2 portion and the immobilization carrier. Therefore, the R3 portion is required to be inactive with any amino acid sequence having a certain length.
  • the number of amino acids in the R3 moiety is not limited, but is 0, ie not present, or 1 to 10 amino acids, preferably 2 to 5 amino acids.
  • Examples of the sequence of the R3 portion include polyglycine composed of 0 to 10, or 2 to 5 glycines, and specific examples include a sequence represented by Gly-Gly-Gly-Gly. It is done.
  • the sequence of the R4 portion is a sequence composed of two amino acids represented by cysteine-X (X is an amino acid residue other than lysine and cysteine), and examples thereof include Cys-Ala.
  • X is an amino acid residue other than lysine and cysteine
  • examples thereof include Cys-Ala.
  • the SH group which is a functional group on the side chain of this cysteine residue, is cyanated to change to a cyanocysteine residue, and the reaction between the cyanocysteine residue and the primary amine on the immobilization support is performed.
  • only the portion represented by R1-R2-R3 of the amino acid sequence represented by the above general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 can be immobilized on the immobilization support by controlling the orientation. .
  • the R5 portion sequence is an arbitrary sequence containing no lysine residue or cysteine residue, and the isoelectric point of the entire amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 is set to the acidic side. It is a sequence characterized by containing the resulting acidic amino acid residue.
  • a sequence containing an acidic amino acid residue capable of bringing the isoelectric point of the entire protein to the acidic side means a sequence in which the types and number of acidic amino acids are included only to make the isoelectric point of the entire protein acidic.
  • a sequence containing a large amount of aspartic acid and glutamic acid is preferable.
  • the isoelectric point of a protein depends on the type and number of amino acids constituting it. For example, when many basic amino acids such as lysine and arginine are contained, aspartic acid and glutamic acid exceeding the total number of basic amino acids are required. Calculation of the isoelectric point of a protein can be easily estimated by those skilled in the art. Preferably, it contains a large amount of aspartic acid and glutamic acid so that the isoelectric point of the protein comprising the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 is a value between 4 and 5. Design an array.
  • the number of amino acids in the sequence of the R5 portion is not limited, but is 0, ie, not present, or 1 to 20, preferably 1 to 10, alternatively 0 to 20, preferably 0 to 10.
  • polyaspartic acid composed of 2 to 10 aspartic acids can be mentioned, and specific examples include Asp-Asp-Asp-Asp-Asp.
  • the R5 portion may not be present.
  • the sequence of the R6 portion is an arbitrary affinity tag sequence that can bind to a specific compound.
  • the sequence of the R6 portion is a sequence portion that is used for purifying a synthesized protein having an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6.
  • Examples of the sequence of the R6 moiety include a sequence capable of binding to a specific compound, that is, an affinity tag sequence.
  • an epitope tag When a protein containing the tag is purified using an antibody specific to the tag, it may be referred to as an epitope tag.
  • the affinity tag sequence examples include a polyhistidine sequence comprising 2 to 12, preferably 4 or more, more preferably 4 to 7, more preferably 5 or 6, histidine, and specifically, His- His-His-His-His-His.
  • the polypeptide can be purified by using nickel chelate column chromatography using nickel as a ligand. It can also be purified by affinity chromatography using a column in which an antibody against polyhistidine is immobilized as a ligand.
  • HAT tags and HN tags composed of sequences containing histidine can also be used.
  • an immobilizing protein consisting of an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 is shown in SEQ ID NO: 2.
  • AD-1 sequence (sequence prepared based on the A domain sequence of protein A and adapted to the format of R1-R2-R3-R4-R5-R6) (SEQ ID NO: 2): Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-
  • the R1 portion is absent
  • the R2 portion is the amino acid sequence of the A domain of protein A (SEQ ID NO: 3) that does not contain lysine and cysteine
  • the R3 portion is a Gly-Gly-Gly -Gly
  • R4 portion is a sequence represented by Cys-Ala
  • R5 portion is a sequence represented by Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
  • R6 portion is His. This is a sequence represented by -His-His-His-His-His-His.
  • R1, R3, R4, R5 and R6 parts of AD-3, AD-4, AD-6-1 and AD-6-2 are the same as the above AD-1.
  • Immobilization of a protein to be immobilized on a carrier using a protein for immobilization comprising an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 of the present invention is disclosed in Japanese Patent No. 3788828, Japanese Patent Nos. 2990271, 3047020, 2003-344396, 2008-115151, 2008-115152, 2008-115153, 2008-266221 It can be carried out according to the method described in the publication.
  • a protein having cyanocysteine wherein the cysteine residue in the R4 part of the protein comprising the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 of the present invention is converted to cyanocysteine by cyanation Is reacted with an immobilized carrier having a primary amino group represented by the general formula “NH 2 -Y” (Y represents an arbitrary immobilized carrier) as a functional group under weak alkaline conditions (pH 8 to 10).
  • NH 2 -Y Y represents an arbitrary immobilized carrier
  • R1-R2-R3-CO-NH-Y (wherein Y has the above-mentioned meaning), It is bound to the immobilization carrier at a point.
  • the cyanation reaction can be performed using a cyanation reagent.
  • a cyanating reagent 2-nitro-5-thiocyanobennzoic acid (NTCB) (see Y. Degani, A. Ptchornik, Biochemistry, 13, 1-11 (1974)) or 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) or the like can be used.
  • a protein having an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 of the present invention is immobilized on the carrier.
  • the cysteine residue is cyanated and the above reaction is performed, and the protein having the amino acid sequence represented by R1-R2-R3 is immobilized on the immobilization carrier.
  • the protein and the immobilization carrier may be reacted under neutral to weakly alkaline conditions (pH 7 to 10). In weak alkaline reaction conditions, proteins are negatively charged, while immobilized carriers are positively charged and adsorb and bind to each other by electrostatic interactions.
  • the present invention is an immobilization support on which a protein having an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 is adsorbed, a solidified support before cyanating a cysteine residue, and It includes an immobilization support on which a portion represented by R1-R2-R3 is immobilized by carrying out cyanation.
  • the R1-R2-R3 moiety prepared by an immobilization reaction via cyanocysteine is immobilized.
  • the immobilized immobilized protein there are many unreacted primary amines in the immobilized carrier portion. If lysine residues or cysteine residues are present in the immobilized protein, the remaining active amine may limit the use of the immobilized protein of the present invention.
  • the R1-R2-R3 part which is an immobilized protein part, does not contain any lysine residue or cysteine residue, the surface of the carrier on which the protein is immobilized without changing the chemical control of the protein part.
  • the primary amine remaining in can be treated with a masking agent.
  • a masking agent acetic anhydride, maleic anhydride and the like are suitable, but any masking agent can be used.
  • the present invention further provides a protein comprising an amino acid sequence not containing cysteine residues and lysine residues obtained by the above-described method via an appropriate linker sequence and an immobilized carrier having a primary amino group and an amide (peptide ) To provide an immobilized protein that is firmly bound by binding.
  • a carrier that can be used for chromatography can be used as a carrier for immobilization.
  • the carrier used in the present invention excludes a carrier having a monolith structure.
  • the monolith structure is a porous body having macropores penetrating from the upper surface to the lower surface, and the porous body is characterized by having micropores inside the macropores.
  • the body has 1 to 100 ⁇ m macropores and 0 to 100 nm micropores.
  • Examples of the monolith structure include a silica monolith structure containing silicon.
  • Monolith structures are described in Japanese Patent Publication No. 08-029952, Japanese Patent Application Laid-Open No. 07-041374, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-127853, and the like.
  • any particulate carrier, membrane carrier, fibrous carrier, holofiber carrier, plate-like or sheet-like substrate, magnetic beads and the like that can immobilize proteins are included.
  • “Immobilization carrier” includes “immobilization substrate”.
  • any material having a functional group for orientation-immobilizing and immobilizing the intervening protein on the surface may be used, such as polyethylene, polypropylene, polystyrene, polystyrene divinylbenzene, Polymer materials such as polymethacrylate, polyvinyl alcohol, polyester, polyacrylate, and polymer materials such as copolymers, natural materials such as hydrogel, agarose, dextran, cellulose, chitosan, silica, glass, ceramic, etc.
  • Inorganic materials typified by, and metal materials typified by gold, alumina, silver, etc. can be used widely.
  • the carrier commercially available products such as Sepharose (registered trademark), Sephadex (registered trademark), and Cellufine (registered trademark) can be used.
  • a microchannel can also be used as a carrier.
  • the microchannel refers to a microchip or the like in which a micron-order high-precision channel is formed on a flow channel cell or a glass substrate, and the protein may be immobilized on the glass in the channel.
  • immobilization carriers into which functional groups have been introduced include amino-cellulofine (sold by Seikagaku Corporation), AF-aminotoyopearl (sold by TOSOH), EAH-sepharose 4B and lysine-sepharose 4B (Amersham). Bioscience), Porous 20NH (Boehringer Mannheim), Poros (Life Technologies), CNBr activated Sepharose FF, NHS activated Sepharose FF, etc.
  • a functional group such as an amino group into a silica carrier, glass beads, or glass flat plate using a silane compound having a primary amino group (for example, 3-aminopropylmethoxysilane). If you can.
  • a particulate carrier is packed in a chromatography column and used.
  • Protein A mutants that bind strongly to the above antibodies under neutral conditions and dissociate from antibodies bound under neutral conditions under weakly acidic conditions in the range of pH 4.0 to pH 5.5 are as follows: Can be obtained by the method.
  • a protein in which one amino acid of protein A modified so as not to contain lysine and cysteine (for example, A domain of protein A consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3) is substituted with another amino acid is prepared.
  • a protein in which one amino acid is further substituted with another amino acid that is, a variant in which a plurality of amino acid substitutions are combined is prepared.
  • a protein A variant is selected that binds strongly under the conditions and dissociates from the antibody bound under neutral conditions under mildly acidic conditions in the range of pH 4.0 to pH 5.5. By repeating this operation several times, a protein A variant strongly exhibiting the above properties can be produced. As a protein A variant having the property of finally binding strongly to the antibody under neutral conditions and dissociating from the antibody bound under neutral conditions under mildly acidic conditions in the range of pH 4.0 to pH 5.5 or A protein A mutant in which a plurality of amino acids are substituted can be obtained.
  • one, two, or three amino acids in the mutant in which lysine and cysteine are substituted with other amino acids so as not to contain lysine and cysteine residues Can be obtained.
  • 6 to 9 amino acids are substituted from wild-type amino acids including lysine and cysteine.
  • protein A as a whole can be obtained by substituting lysine and cysteine with other amino acids so as not to contain lysine and cysteine residues, and further obtaining a mutant in which 1 to 9 amino acids are substituted. it can.
  • 7 to 15 amino acids are substituted from wild-type amino acids including lysine and cysteine.
  • substitutions of lysine and cysteine with other amino acids the remaining 1 to 9 are strongly bound to the antibody under neutral conditions, and are under weakly acidic conditions in the range of pH 4.0 to pH 5.5.
  • the substitution is for imparting the property of dissociating from the antibody bound under neutral conditions.
  • the mutant which consists of an amino acid sequence represented by R2 part of the amino acid sequence of said AD-3, AD-4, AD-6-1, and AD-6-2 is mentioned.
  • An assay for the property of binding strongly to a protein A variant antibody under neutral conditions and dissociating from the antibody bound under neutral conditions under weakly acidic conditions in the range of pH 4.0 to pH 5.5 is, for example, Can be done by the method.
  • the R1-R2-R3 portion is immobilized on the array substrate by the above method using cyanation.
  • an array described in Japanese Patent No. 4528951, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-127856, Japanese Patent No. 4006523, or the like may be used.
  • the array substrate on which the mutants are immobilized is set in an array analyzer, connected to the liquid feeding system of the apparatus, and the array is irradiated with ultraviolet light of 280 nm while automatically passing the solution for analysis described below. Then, the transmitted light is taken continuously with a CCD, and the image of the array is taken into the PC.
  • Initialization buffer 150 mM sodium chloride, 50 mM sodium phosphate, pH 7.0
  • antibody solution solution obtained by diluting human polyclonal antibody with running buffer to 0.2 mg / ml
  • washing buffer (1M 0.6 ml each of sodium chloride, 50 mM sodium phosphate, pH 7.0)
  • elution buffer 0.1 M sodium citrate, pH 5.0
  • regeneration buffer 0.1 M glycine, pH 2.5
  • the spot is automatically detected in the array image, the average brightness of the pixels in the spot area and the average brightness of the pixels around the spot are calculated, The logarithm of the ratio is obtained as the signal intensity of the spot. This value has been confirmed to be proportional to the amount of protein on the spot.
  • the signal intensity of each spot is plotted against the elapsed time from the start of passing through the array substrate.
  • the characteristics of the mutant protein can be evaluated by analyzing a curve obtained from a plot of signal intensity against elapsed time. By obtaining the time course of this signal intensity, it is possible to quantitatively analyze the situation in which the antibody is adsorbed and dissociated.
  • the elapsed time T 0.5 until the half of the bound antibody dissociates was determined, and the A domain of protein A in AD-1 above in the vicinity of the array seeking T 0.5 normalized by calculating the ratio of the T 0.5 of the index of acid dissolution characteristics this value, or is evaluated as an indicator of ease of acid elution. It can be judged that the lower T 0.5 is, the better the acid elution property, that is, the property of dissociating from the antibody bound under neutral conditions under weakly acidic conditions in the range of pH 4.0 to pH 5.5. .
  • the dissociation constant of an antibody (Kd) is or may be an indicator.
  • the dissociation constant can be measured, for example, by analyzing the binding characteristics of the protein A mutant and the antibody using Biacore (Biacore) which is a surface plasmon resonance biosensor.
  • Biacore Biacore
  • the -R3 moiety may be bound to a carrier and the protein-immobilized carrier may be used.
  • the T 0.5 and the dissociation constant obtained by the above method are plotted on the coordinates as shown in FIG. 1, and the T 0.5 and the dissociation constant are in a certain value range, that is, the protein plotted in a specific range on the coordinates. Mutation with excellent characteristics that A domain mutant of A binds strongly to the antibody under neutral conditions and dissociates from the antibody bound under neutral conditions under weakly acidic conditions in the range of pH 4.0 to pH 5.5. You may choose as a body.
  • Protein A which is smaller than the measured T 0.5 and has a dissociation constant smaller than the dissociation constant measured using the A domain of protein A in AD-1, strongly binds to the antibody of the present invention under neutral conditions, and has a pH of 4 It can be selected as a mutant excellent in the property of dissociating from an antibody bound under neutral conditions under mildly acidic conditions in the range of 0.0 to pH 5.5.
  • the mutant of the present invention which binds strongly to an antibody under neutral conditions and has excellent characteristics of dissociating from an antibody bound under neutral conditions under a weakly acidic condition in the range of pH 4.0 to pH 5.5, T 0.5 when measured using the above array is 1.00 or less, preferably 0.80 or less, more preferably 0.60 or less, particularly preferably 0.55 or less, and the dissociation constant measured by the above-described via core. Is 6 ⁇ 10 ⁇ 9 or less, preferably 8 ⁇ 10 ⁇ 9 or less, more preferably 10 ⁇ 10 or less.
  • the portion represented by R1-R2-R3 is immobilized by using the immobilization support on which the protein comprising the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 is immobilized.
  • An immobilized protein can be obtained.
  • An immobilization carrier on which a protein having an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 is immobilized is an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6.
  • the protein may be adsorbed on the immobilized carrier by reacting the protein and the immobilized carrier under neutral to weakly alkaline conditions (pH 7 to 10).
  • the immobilization carrier on which the protein consisting of the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 is immobilized
  • the cysteine residue contained in the R3 portion of the protein is cyanated to obtain the above-mentioned
  • an immobilization carrier in which a protein having an amino acid sequence represented by R1-R2-R3 is immobilized on an immobilization carrier can be produced.
  • the present invention also includes an immobilization carrier on which a protein having an amino acid sequence represented by R1-R2-R3 is immobilized.
  • the antibody can be purified by affinity chromatography using an immobilized carrier on which a protein having an amino acid sequence represented by R1-R2-R3 is immobilized.
  • a column for affinity chromatography used for affinity chromatography can be produced by packing an immobilized carrier on which a protein having an amino acid sequence represented by R1-R2-R3 is immobilized. Packing of the carrier into the column can be performed by a known method.
  • the present invention also includes an affinity chromatography column for antibody purification comprising an immobilization carrier on which a protein having an amino acid sequence represented by R1-R2-R3 is immobilized.
  • Antibody purification using the affinity chromatography column of the present invention can be carried out by a known affinity chromatography method, but the antibody bound to the protein A variant can be eluted under mild pH conditions.
  • a solution containing the antibody to be purified (raw crude liquid) is affinity chromatography packed with an immobilized carrier on which a protein consisting of the amino acid sequence represented by R1-R2-R3 is immobilized.
  • the antibody is adsorbed to the protein A mutant on the carrier.
  • the raw material crude liquid is adjusted to pH 6.0 to 8.5.
  • the buffer used for adjusting the pH is not limited.
  • the affinity chromatography column is preferably equilibrated in advance using the above pH 6.0 to 8.5 buffer.
  • a neutral buffer such as sodium phosphate buffer or Tris-HCl buffer to remove impurities.
  • the bound antibody may be eluted and recovered using a pH 4.0 to pH 5.5 buffer.
  • the buffer solution of pH 4.0 to pH 5.5 sodium acetate buffer solution, sodium citrate buffer solution, sodium phosphate buffer solution or MES; 2-Morpholinoethanesulfonic acid etc. may be used.
  • the concentration of the buffer to be used is not limited. For example, it may be used at a concentration of 10 to 50 mM.
  • the column size depends on the volume of the antibody-containing raw material crude liquid used as a sample, for example, a column having a length of 2.5 to 30 cm may be used.
  • Example 1 Gene synthesis The genes described in the examples were synthesized by a contracted synthetic gene manufacturer. Based on the base sequence shown below (SEQ ID NO: 8), dsDNA is synthesized, pUC18vector is inserted into the BamHI-EcoRI site, the sequence of the obtained clone is confirmed by single-strand analysis, base sequence information is verified, and mismatch is confirmed The obtained site was subjected to mutation correction by a technique such as Site directed mutagenesis, and the obtained plasmid DNA (about 1 ⁇ g) was delivered. Regarding the target portion in the delivered plasmid, the sequence was confirmed again by sequencing.
  • the amino acid substitution of the A domain of protein A based on AD-1 (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2) is performed by converting the DNA sequence encoding the amino acid at the substitution site into the target codon sequence and 24 bases for both.
  • a DNA primer having the original sequence and its complementary DNA primer a quick change method (the method described in Stratagene's QuickChang Site-directed Mutagenesis kit) was performed.
  • E. coli strain JM109 transformed with the recombinant plasmid was cultured overnight at 35 ° C. in 2 L medium (containing 20 g sodium chloride, 20 g yeast extract, 32 g tryptone, 100 mg ampicillin sodium). Thereafter, the culture broth was centrifuged at a low speed for 20 minutes (5,000 revolutions per minute) to obtain cells having a wet weight of 3 to 5 g. This was suspended in 20 mL of 10 mM phosphate buffer (pH 7.0), the cells were disrupted with a French press apparatus, and then centrifuged at a high speed for 20 minutes (20,000 rotations per minute) to separate the supernatant. .
  • Streptomycin sulfate was added to the resulting supernatant to a final concentration of 2%, stirred for 20 minutes, and then centrifuged at high speed for 20 minutes (20,000 rotations per minute) to separate the supernatant. Then, ammonium sulfate treatment was performed, and the obtained supernatant was applied to a nickel chelate column (purchased from GE Healthcare Bioscience), and a washing buffer solution (5 mM imidazole, 20 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, Wash the column thoroughly using 20 ml or more of pH 7.4), and apply 20 ml of elution buffer (0.5 M imidazole, 20 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, pH 7.4) after washing.
  • a washing buffer solution 5 mM imidazole, 20 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, Wash the column thoroughly using 20 ml or more of pH 7.4
  • the protein of interest was eluted. Then, in order to remove imidazole from this protein solution, dialysis was performed against 5 L of 10 mM phosphate buffer (pH 7.0). MWCO3500 (purchased from Spectrum Laboratories) was used as the dialysis membrane. After dialysis, the target protein was dried using a centrifugal vacuum dryer.
  • Biacore Biacore
  • a surface plasmon resonance biosensor a surface plasmon resonance biosensor
  • the running buffer was composed of 10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM sodium chloride, 5 ⁇ M EDTA, 0.005% Surfactant P20 (Biacore) and degassed in advance.
  • SensorChip NTA (Biacore) was used as the sensor chip. After sufficiently equilibrating the sensor chip with a running buffer, 5 mM nickel chloride solution was injected to complete the coordination of nickel ions. Thereafter, the recombinant protein was immobilized on the sensor chip by injecting a recombinant protein solution (concentration: 100 ⁇ g / mL in running buffer).
  • the binding reaction between the immobilized recombinant protein and human IgG was performed by diluting and preparing human IgG (Sigma-Aldrich) using a running buffer to a concentration of 7 different concentrations in the range of 0.25 to 20 ⁇ g / ml.
  • the antibody binding / dissociation phenomenon was quantitatively observed by sequentially injecting the solution and subsequently switching to the running buffer and holding the solution.
  • the liquid flow rate was 20 ⁇ L / min
  • the binding observation time antibody solution injection time
  • the dissociation observation time was 4 minutes.
  • 6M guanidine hydrochloride solution was subsequently injected for 3 minutes to dissociate all human IgG bound to the immobilized recombinant protein, Regenerated with running buffer and used for subsequent measurements.
  • FIG. 1 shows the results of plotting the elution parameters and T 0.5 values obtained from the above.
  • the array substrate on which each mutant is spot-immobilized is set in an array analyzer, connected to the system's liquid feeding system, and 280 nm ultraviolet light is passed through the array while automatically passing the solution for analysis described below. , And the transmitted light was continuously photographed with a CCD, and the array image was captured on a PC.
  • Initialization buffer 150 mM sodium chloride, 50 mM sodium phosphate, pH 7.0
  • antibody solution solution obtained by diluting human polyclonal antibody with running buffer to 0.2 mg / ml
  • washing buffer (1M Sodium chloride, 50 mM sodium phosphate, pH 7.0)
  • elution buffer 0.1 M sodium citrate, pH 5.0
  • regeneration buffer 0.1 M glycine, pH 2.5
  • spots are automatically detected in the array image, and the average brightness of pixels in the spot area and the average brightness of pixels around the spot are calculated. Then, the logarithm of the ratio was obtained as the signal intensity of the spot. This value has been confirmed to be proportional to the amount of protein on the spot.
  • the signal intensity of each spot was plotted against the elapsed time from the start of passing through the array substrate. The characteristics of the mutant protein were evaluated by analyzing the curve obtained from the plot of signal intensity against elapsed time. By obtaining the time course of this signal intensity, it is possible to quantitatively analyze the situation in which the antibody is adsorbed and dissociated.
  • mutant proteins selection of mutant proteins was attempted based on both the acid elution characteristics and the indicators of the dissociation constant (Kd) determined by the method described in the above-mentioned analysis of binding characteristics with human antibody IgG molecules.
  • Kd dissociation constant
  • Example 2 Based on the result of Example 1, another 1 amino acid substitution mutation was further performed on the E15H mutation.
  • substitution mutations at sites of M19 (19th methionine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1) and G29 (29th glycine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1) were examined. This is because M19 is a methionine residue which is present only in AD-1 and is susceptible to air oxidation, and it is expected that the amino acid substitution at this site will add antioxidant performance as a chemical property.
  • the G29 site is a site indicated as one of the sites expected to have mutations that improve the elution characteristics at pH 5.0 as a result of array analysis.
  • Combination mutants combining these mutations include E15H + G29A (R2 portion of AD-3), E15H + M19V + G29A (R2 portion of AD-4), E15H + M19V + G29D (R2 portion of AD-6-2), E15H + M19V + G29E (AD-6-1) R2 part) of the four types of combination mutations are prepared according to the above method, expression in E. coli, expression in E. coli, recombinant protein from the expressed E. coli is separated and purified, and about 1 g of each purified product is prepared. did.
  • a protein represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5-R6 was prepared using each prepared protein.
  • R2 part is the above variant of protein A, R1 does not exist, R3 is a sequence represented by Gly-Gly-Gly-Gly, R4 is a sequence represented by Cys-Ala, and R5 is It was a sequence represented by Asp-Asp-Asp-Asp-Asp, and R6 was a sequence represented by His-His-His-His-His-His. Japanese Patent Nos.
  • the cysteine of the R4 portion is converted to cyanocysteine by cyanation
  • the R1-R2-R3 portion (actually, the R2-R3 portion) is immobilized on a carrier
  • the ligand is Each introduced affinity carrier was prepared.
  • the production method is described in “Immobilization of recombinant protein” below.
  • the “affinity carrier into which the ligand is introduced” and the following “protein-immobilized silica gel” are the same.
  • a separation column using about 1 ml of each affinity carrier was prepared. About each produced separation column, the chromatography using a polyclonal antibody was performed, pH at the time of elution was changed, and pH dependence of the elution / collection amount of an antibody was measured.
  • the solution eluted from the column was measured for absorbance and conductivity at 280 nm using a UV detector and a conductivity meter provided in the apparatus, and the values were recorded. From the chromatogram curve using the absorbance at 280 nm, the elution peak identification and the peak area were calculated, and how the applied antibody was recovered was calculated.
  • FIG. 2A is the R2 portion of AD-2
  • B is the R2 portion of AD-3
  • C is the R2 portion of AD-4
  • D is the R2 portion of AD-5
  • E is the R2 portion of AD-6-1.
  • Part F represents the result of the R2 part of AD-6-2.
  • Fig. 3 shows a chromatogram of affinity chromatography using a solidified carrier.
  • FIG. 3A, B, and C show the chromatograms at pH 3.0, 4.0, and 4.5 of A in FIG. 2, respectively.
  • (1) shows an elution peak when an eluate having a pH of 3.0, 4.0 or 4.5 is flowed
  • (2) is an elution when a regenerating solution (pH 2.5) is flowed. Shows the peak.
  • S1 and S2 elution peak areas
  • the recovery rate is calculated as 100 * S1 / (s1 + S2), and the value is calculated with respect to the pH of the elution solution.
  • FIG. 2 is a diagram plotted in this manner.
  • Immobilization of recombinant protein 50 g of silica gel (Daiso Co., Ltd.) and 10 g of 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane were reacted under reflux conditions (95 ° C.) in an aqueous solvent for 4 hours to prepare 50 g of epoxidized silica gel. .
  • the epoxidized silica gel obtained as described above was suspended in 0.1 M borate buffer (pH 9.5), 5 g of poly-L-lysine (Sigma P6516) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. Thereafter, 500 ml of a 5 mM 2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid solution and 2 g of recombinant protein (common to AD-3, AD-4, AD-6-1, and AD-6-2) were added respectively, followed by stirring for 24 hours. By switching the buffer to 10 mM borate buffer (pH 9.5) and stirring again for 24 hours, 47 g of each recombinant protein-immobilized silica gel was finally prepared.
  • IgG binding capacity of immobilized carrier The IgG binding capacity of the immobilized silica gel prepared above was measured as follows.
  • a domain-immobilized carrier of protein A of AD-3 was packed in a 5 mm ⁇ ⁇ 20 mm glass column (GEHealthcare, 0.4 ml). Under various contact time conditions (1.0, 2.4, 6.0 min), a known concentration of a polyclonal human IgG antibody (0.5 mg / ml, manufactured by Oriental Yeast) dissolved in sodium phosphate buffer Loaded. A 10% breakthrough point was calculated from the breakthrough curve at that time, thereby obtaining the following dynamic binding capacity (DBC) for each contact time. From this table, the static binding capacity was estimated to be about 60 mg / ml. The results are shown in Table 2.
  • the binding capacity was measured in the same manner on the carrier for immobilizing the A domain of protein A of each protein of AD-4, AD-6-1, and AD-6-2, and the following results were obtained. The results are shown in Table 3.
  • the technical fields to which the present invention relates include a wide range of technical fields related to immobilized antibodies, such as antibody columns and antibody arrays, as well as a wide range of laboratory technical fields such as component tests and clinical tests using immobilized antibodies, This includes the field of separation and purification using antibody columns.

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Abstract

　本発明は、多くの抗体が酸変性を引き起こさない温和なpH条件（具体的には、pH4.0～5.5）で抗体の脱離を可能にする特定のアミノ酸配列を持つプロテインＡを固定化した担体、及びその製造方法の提供を目的とする。　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列 ［式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かう配列を示し、 R2部分の配列は、固定化対象タンパク質であるプロテインＡ変異体の配列、又はその配列を１～３個連結した配列であり、該プロテインＡ変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０～ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する］からなるタンパク質であって、R1-R2-R3で表される部分を固定化担体に固定化するために用いるタンパク質が静電相互作用により吸着している固定化担体（但し、モノリス構造体を有する固定化担体を除く）。

Description

抗体精製用担体並びにその製造方法及びその用途
　本発明は、抗体精製用担体及びその製造方法に関する。本発明は、さらに抗体精製用担体が充填されたアフィニティークロマトグラフィー用カラム及びそれを用いた抗体の精製方法に関するものである。
　近年、抗体を基にした副作用の少ない抗体医薬に対する需要が年々高まっている。抗体を精製する手段として、プロテインＡを固定化した担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーが広く使用されている。ここでいうプロテインＡとは、Staphylococcus aureus由来のプロテインＡ(A. Forsgren and J. Sjoquist, J. Immunol. (1966) 97, 822-827.に記載)又はそれを構成する抗体結合機能を発揮できる一部のドメイン配列を指している。
　プロテインＡを固定化した担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを使用する一般的な抗体の精製方法は以下のとおりである。すなわち、（１）抗体を含む原料粗液を、プロテインＡを固定化した担体を充填したカラムに通液し、担体に目的とする抗体を吸着させる。（２）抗体を吸着させた担体を中性の緩衝液で洗浄し、不純物を取り除いた後、（３）酸性の緩衝液（具体的には、ｐＨ２．５～３．０）を用いて、担体に吸着した抗体を溶出させる、というものである。
　本発明者らは、担体あたりの抗体の結合容量を増大させることにより、抗体を効率よく精製する手段として、配向を制御しながら抗体のＦｃドメインと特異的に結合するタンパク質であるプロテインＡ由来のタンパク質を不溶性担体に配向を制御して導入する技術を開発している(特許文献１～１６を参照)。
　本発明者らが開発した配向制御固定化法は、より一般化した形態で表すと、以下のとおりである。
　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列
［式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かう配列を示し、
R1部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジンおよびシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列であり：
R2部分の配列は、プロテインＡ由来の固定化対象タンパク質の配列であり、抗体との結合特性を保持するようにリジン残基とシステイン残基を全く含まないようにした配列であり：
R3部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列であり；
R4部分の配列はシステイン－Ｘ（Ｘは、リジンもしくはシステイン以外のアミノ酸残基）で表される２残基のアミノ酸で構成される配列であり：
R5部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列であり；
R6部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列である］
からなるタンパク質を用いて、R4部分に唯一存在するシステイン残基のSH基をシアノ化し、シアノシステイン化したタンパク質を、アミノ基を官能基として導入された不溶性担体と反応させることにより、R1-R2-R3で表される部分が、そのカルボキシ末端が担体のアミノ基とアミド結合により固定化するという特徴を有する配向制御固定化法である。
　これまでに本発明者らが開発してきたプロテインＡを配向制御して固定化した担体を用いた抗体の精製においても、（１）抗体を含む原料粗液を、プロテインＡを固定化した担体を充填したカラムに通液し、担体に目的とする抗体を吸着させる。（２）抗体を吸着させた担体を中性の緩衝液で洗浄し、不純物を取り除いた後、（３）酸性の緩衝液（具体的には、ｐＨ２．５～３．０）を用いて、担体に吸着した抗体を溶出させるという精製手段が適用され、担体あたりの抗体の結合容量の増大により、効率の良い抗体の精製手段を提供してきた。
　しかし、ｐＨ２．５～３．０の酸性の緩衝液を用いて抗体を溶出させるという上記方法には重大な問題点がある。すなわち、抗体が強酸性（例えば、ｐＨ３.０以下）の緩衝液に接触することで、抗体が酸変性を起こし、抗体の高次構造が変化し、その結果、凝集を引き起こし、抗体が医薬品としての活性を失ってしまうという問題である。この課題を解決するため、より安定な抗体分子の開発が試みられているが、このような解決策は、プロテインＡを固定化した担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによる精製に付随する問題に対しての一般的な解決策とはなりえないことは明らかであり、多くの抗体分子の調製に幅広く適用できる方法の開発が求められている。
特開２０１１-１３２１４０号公報 特開２０１１-１３２１４５号公報 特開２０１１-１３２１４１号公報 特許２９９０２７１号公報 特許３０４７０２０号公報 特許３７４０５２９号公報 特開２００５-１１２８２７号公報 特許４５２８９５１号公報 特開２００８－１１５１５１号公報 特開２００８-１１５１５２号公報 特開２００８-１１５１５３号公報 特開２００８-２６６２１９号公報 特開２００８-２６６２２１号公報 特開２００９-１５６７６７号公報 特開２０１０-１２７８５６号公報 特許４０００６５２３号公報
　本発明は、プロテインＡを含むタンパク質を固定化した担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによる精製に付随する上記の問題に対しての一般的な解決策を提供するために、多くの抗体が酸変性を引き起こさない温和なpH条件（具体的には、ｐＨ４.０～５．５）で抗体の脱離を可能にする特定のアミノ酸配列を持つプロテインＡを固定化した担体、及びその製造方法を提供するものである。さらには、上記プロテインＡを含むタンパク質を固定化した担体を充填した抗体精製用アフィニティークロマトグラフィー用カラム、及び前記カラムを用いた抗体の精製方法を提供するものである。
　本発明者らは、プロテインＡの固定化における上記の解消すべき問題点を解決すべく鋭意検討を行なった。
　本発明者らは、タンパク質の配向制御固定化に利用される、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなる配列部分の内、抗体との結合機能を担うR2部分に用いるプロテインＡとして、抗体の精製過程の、抗体を含む原料粗液を、プロテインＡを固定化した担体を充填したカラムに通液し、担体に目的とする抗体を吸着させ、溶出する工程において、抗体を吸着させた担体を中性の緩衝液で洗浄し、不純物を取り除くという操作には影響を与えず、かつ酸性の緩衝液を用いて、担体に吸着した抗体を溶出させる際に温和なｐＨ条件として、ｐＨ４.０～５．５の範囲で、抗体の脱離を行わせることができる、という特性を有するプロテインＡ変異体を開発できれば、上記問題を解決できるとの着想を得た。
　本発明がなされるより前の時点で、本発明者らは、配列番号１で示されるプロテインＡのＡドメイン由来の配列中の全てのリジン残基をアルギニン又はグリシンに置換することによりR2部分にリジン及びシステインを全く含まないようにしたプロテインＡが、抗体と強い結合反応を示すことを明らかにした（特開２０１１-１３２１４０号公報、特開２０１１-１３２１４５号公報、特開２０１１-１３２１４１号公報）。そこで、該プロテインＡのアミノ酸配列を含む、上記の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6に適合させた配列からなるタンパク質を作製し(これを、ＡＤ-１と称する。配列番号２)、さらに、この配列を元に、網羅的に１アミノ酸置換を行わせ、上記のＡＤ-１について、約800個の変異体を作製した。本発明者らが開発したタンパク質の改良方法（特許４５３４０３０号公報、特許再公表０１/０００７９７号公報、M.Iwakura et al. J.Biol.Chem. 281, 13234-13246(2006)、特開２００５-０５８０５９号公報）に従うことにより、これら約800個の変異体全てについて、酸性条件での抗体の溶出特性を明らかにできれば、本発明が目的とする変異体にたどりつけるものと考えられた。
プロテインＡのＡドメイン由来の配列(配列番号１)：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln 
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe 
Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Lys-Lys 
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Lys
ＡＤ-１の配列（プロテインＡのＡドメイン配列を元に、R1-R2-R3-R4-R5-R6の形式に適合させて作製した配列)(配列番号２)：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln 
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe 
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg 
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly-Gly-Gly 
Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp 
His-His-His-His-His-His
　ここで、配列番号２に示される配列（ＡＤ-１）の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6における、R1、R2、R3、R4、R5及びR6は以下の配列である。
R1（大腸菌での発現開始コドン由来のメチオニン、発現とともにほとんど除去されるため、通常は存在しない）：
Met
R2（プロテインＡのＡドメインのアミノ酸配列を、システイン及びリジンを全く含まないように改変した配列）(配列番号３)：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln 
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe 
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg 
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
R3（リンカー配列、システイン及びリジンを全く含まない）：
Gly-Gly-Gly-Gly
R4(シアノシステインを介した固定化反応を起こさせる配列)：
Cys-Ala
R5（等電点を負にするための配列）：
Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
R6（精製用タグ配列）：
His-His-His-His-His-His
　本発明者らは、上記ＡＤ-１と名づけたアミノ酸配列を元に、R2を構成するアミノ酸残基全てについて１アミノ酸置換を行った変異体タンパク質を網羅的に作製してきた。
　しかしながら、これまでの知見では、本発明が目的とする、多くの抗体が酸変性を引き起こさない温和なｐＨ条件（４.０～５．５）で抗体の脱離を可能にする特定のアミノ酸配列を持つ変異体タンパク質を、800種もの１アミノ酸置換変異体の中から効率よく選別することが困難であった。このため、上記の変異体タンパク質を得るという目的を達成することができなかった。これは、変異体が目的とする特性を有するか否かを判定するためには、候補となる変異体のすべてを担体に固定化し、アフィニティカラムを作製し、作製したカラムを用いて精製実験を行う必要があったためである。このため、一つの変異体について、目的とする特性を明らかにするだけで、数日から２週間を必要とし、これを約800種の１アミノ酸置換体に対して適用することは、時間と費用の観点で、事実上困難であった。
　本発明者らは、このような状況において、鋭意研究を行った結果、本発明者らが既に開発しているアレイ解析装置(特許４５２８９５１号公報、特開２０１０-１２７８５６号公報、特許４００６５２３号公報)を活用することを着想した。
　本発明で用いたアレイ解析装置において、アレイ基板には、シリカモノリス多孔質体の薄層を支持層に用いている。該シリカモノリス多孔質体表面にポリＬリジンを導入し、この薄層に変異体をスポッターによりスポットすることにより変異体タンパク質をイオン相互作用により吸着させた後、シアノ化試薬によりスポット吸着したタンパク中のシステイン残基のＳＨ基をシアノ化し、シアノシステインを介した配向制御固定化反応を行わせる。その後、高塩濃度の緩衝液で洗浄することにより、変異体タンパク中のR4-R5-R6由来部分を除去し、R1-R2-R3部分がそのカルボキシ末端でシリカモノリス多孔質体に配向制御した形で、スポット状に固定化したアレイ基板を作製した。変異体タンパク質を固定化したアレイ基板に、（１）抗体溶液を通液し、（２）中性の緩衝液で洗浄して、（３）抗体溶出用の緩衝液としてｐＨ５．０の緩衝液を通液し、その後、（４）再生用として、ｐＨ２．５の緩衝液を通液した。この過程において、アレイ解析装置を用いて各スポットの２８０ｎｍの透過光量の変化を経時的に測定した。各変異体スポットに抗体が結合した場合は、結合した抗体の２８０ｎｍの吸収に伴い、２８０ｎｍの透過光量が減少する。
　一方、抗体溶出に伴い、各変異体スポットから抗体が解離した場合は、２８０ｎｍの透過光量が増大する。この測定の際に、抗体溶出用の緩衝液としてｐＨ５．０の緩衝液を通液した時（上記の（３）の工程）の、２８０ｎｍの透過光の対数をとり（吸光度の変化量に対応する量）、これを経過時間に対してプロットした。ｐＨ５．０の緩衝液を通液した時の２８０ｎｍの透過光の対数の値が、再生用として、ｐＨ２．５の緩衝液を通液した（上記の（４）の工程）後に、２８０ｎｍの透過光の対数の値との差の半分になるまでの経過時間、Ｔ0.5の値を求めた。この値を指標にして、できるだけ小さい値を与える変異体を選びだした。次に、小さいＴ0.5を与える変異を組み合わせた変異体を作製し、同様の測定を行い、組み合わせ変異体を作製し、Ｔ0.5の値を測定した。そのような組み合わせ変異体の中に、目的とする変異体を見出すことができた。見出した変異体配列をいくつか繰り返し連結した変異体を作製し、これを担体に配向制御固定化した担体を作製した。この担体を用いてアフィニティカラムを作製し、溶出条件として各種ｐＨでの溶出を行い、クロマトグラムを解析した結果、温和なpH条件で抗体の脱離を可能にする特定のアミノ酸配列を持つプロテインＡを含む担体を得るという本発明の課題が達成できていることを確認し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列
［式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かう配列を示し、
R1部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列であり：
R2部分の配列は、固定化対象タンパク質であるプロテインＡ変異体の配列、又はその配列を１～３個連結した配列であり、リジン及びシステイン残基を含まない配列であり、該プロテインＡ変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０～５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する；
R3部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列であり；
R4部分の配列はシステイン－Ｘ（Ｘは、アラニンであるか、もしくはアラニンとシステイン以外のアミノ酸残基）で表される２残基のアミノ酸で構成される配列であり：
R5部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列であり；
R6部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列である］
からなるタンパク質であって、R1-R2-R3で表される部分を固定化担体に固定化するために用いるタンパク質が静電相互作用により吸着している固定化担体（但し、モノリス構造体を有する固定化担体を除く）。
[２]　プロテインＡ変異体が、アレイ基板に固定化したプロテインＡ変異体に抗体を結合させ、ｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液で溶出したときの結合していた抗体の半分の量が解離するまでの経過時間Ｔ0.5及び、抗体との解離定数が、配列番号３で表されるプロテインＡ変異体のＴ0.5及び解離定数よりも低いプロテインＡ変異体である、[１]の固定化担体。
[３]　プロテインＡ変異体が、Staphylococcus aureus由来のプロテインＡのアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列からなる変異体である、[１]又は[２]の固定化担体。
[４]　プロテインA変異体が、プロテインＡのＡドメインの変異体である、[１]～[３]のいずれかの固定化担体。
[５]　R2部分の配列が、配列番号４～７のいずれかの配列からなるプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質の配列、又は配列番号４～７のいずれかの配列からなるプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質の配列を１～３個連結した配列である、[１]～[４]のいずれかの固定化担体。
[６]　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在する唯一のシステイン残基のスルフフィドリル基をチオシアノ基に変換し、１級アミンを官能基として有する任意の固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシステイン残基よりアミノ末端側に存在するアミノ酸配列部分であるR1-R2-R3部分をアミド結合により結合させるための、[１]～[５]のいずれかに記載の固定化担体。
[７]　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R3部分の配列が、１～10個のグリシンからなる配列であることを特徴とする、[１]～[６]のいずれかの固定化担体。
[８]　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R5部分の配列が、アスパラギン酸及び/又はグルタミン酸のアミノ酸残基からなるアミノ酸残基数１～10個の配列であることを特徴とする、[１]～[７]のいずれかの固定化担体。
[９]　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R5部分の配列が、１～10個のアスパラギン酸からなる配列であることを特徴とする、[８]の固定化担体。
[１０]　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R6部分の配列が、４個以上のヒスチジン残基からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、[１]～[９]のいずれかの固定化担体。
[１１]　担体がシリカ担体、ガラスビーズ、及びポリマーからなる群から選択される、[１]～[１０]のいずれかの固定化担体。
[１２]　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を担体に静電相互作用により吸着させることを含む、[１]～[１１]のいずれかの固定化担体を作製する方法。
[１３]　[１]～[１１]のいずれかの一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在する唯一のシステイン残基のスルフフィドリル基をチオシアノ基に変換し、１級アミンを官能基として有する任意の固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシステイン残基よりアミノ末端側に存在するアミノ酸配列部分であるR1-R2-R3部分をアミド結合により結合させて製造された、プロテインＡの変異体が固定化された固定化担体。
[１４]　[１]～[１１]のいずれかの一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在する唯一のシステイン残基のスルフフィドリル基をチオシアノ基に変換し、１級アミンを官能基として有する任意の固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシステイン残基よりアミノ末端側に存在するアミノ酸配列部分であるR1-R2-R3部分をアミド結合により結合させることを含む、[１２]の固定化担体を作製する方法。
[１５]　[１３]の固定化担体が充填された、抗体精製用アフィニティークロマトグラフィーカラム。
[１６]　[１５]の抗体精製用アフィニティークロマトグラフィーカラムに抗体を含む溶液をアプライし、抗体をプロテインＡ変異体に結合させ、次いで溶出緩衝液により抗体を解離溶出させることを含む、抗体の精製方法。
[１７]　固定化担体にR1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化するために用いる一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を設計する方法であって、R1、R2、R3、R4、R5及びR6部分のアミノ酸配列を以下の条件に適合するように選択することを含む方法：
(a) R1部分の配列を存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列を選択し;
(b) R2部分の配列として、プロテインＡ変異体の配列、又はその配列を１～３個連結した配列であり、リジン及びシステイン残基を含まない配列であり、該プロテインＡ変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０～５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する、配列を選択し；
(c) R3部分の配列を存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列を選択し；
(d) R4部分の配列として、システイン－Ｘ（Ｘは、アラニンもしくはシステイン以外のアミノ酸残基）で表される２残基のアミノ酸で構成される配列を選択し；
(e) R5部分の配列は存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列を選択し；そして
(f) R6部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列を選択する。
[１８]　プロテインＡ変異体が、アレイ基板に固定化したプロテインＡ変異体に抗体を結合させ、ｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液で溶出したときの結合していた抗体の半分の量が解離するまでの経過時間Ｔ0.5及び、抗体との解離定数が、配列番号３で表されるプロテインＡ変異体のＴ0.5及び解離定数よりも低いプロテインＡ変異体である、[１７]の方法。
[１９]　プロテインＡ変異体が、Staphylococcus aureus由来のプロテインＡのアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列からなる変異体である、[１７]又は[１８]の方法。
[２０]　プロテインＡ変異体が、プロテインＡのＡドメインの変異体である、[１７]～[１９]のいずれかの方法。
[２１]　R2部分の配列が、配列番号４～７のいずれかの配列からなるプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質、又は配列番号４～７のいずれかの配列を１～３個連結した配列からなるプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質の配列である、[１７]～[２０]のいずれかの方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-134905号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明の方法により、R2としてプロテインＡ変異体を含む一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列を設計し、該アミノ酸配列からなるタンパク質を作製し、該タンパク質を用いてプロテインＡ変異体を担体に固定化することにより、抗体精製の際に、プロテインＡに結合した抗体をより温和なｐＨ条件（ｐＨ４.０～５．５）で行うことができるという溶出性能に優れた固定化担体を得ることができる。また、上記固定化担体を用いることにより、温和なｐＨ条件（ｐＨ４.０～５．５）で抗体を溶出することが可能となり、得られる抗体の回収率も向上する。さらに、上記固定化担体を充填剤として用いることにより、精製能力に優れるアフィニティークロマトグラフィー用カラムを得ることができ、該カラムを用いて効率的な抗体の精製方法を提供することもできる。
ｐＨ５．０におけるＡＤ-１の溶出パラメータ及びＴ0.5の値のプロットの結果を示す図である。 プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーにおける、抗体の溶出・回収量のｐＨ依存性を示す図である。図２のＡからＦの図においては、横軸は、溶出に用いた緩衝液のｐＨを表し、縦軸は、各ｐＨにおける溶出を行った時に溶出された抗体の回収率（％）を黒丸で示している。 プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーのクロマトグラムを示す図である。図３Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれｐＨ３．０、４．０及び５．０の溶出液を用いた場合のクロマトグラムを示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中のR2部分の配列は、固定化しようとする固定化対象プロテインＡであり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることにより、R2部分が固定化された固定化タンパク質を得ることができる。上記一般式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かうアミノ酸配列を示す。
　R1部分の配列は、存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列である。具体的には、例えば、大腸菌での発現開始コドン由来のメチオニンが挙げられる。但し、該メチオニンは発現とともにほとんど除去されるため、通常は存在しない。
　R2部分の配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる天然のプロテインＡの変異体のアミノ酸配列である。また、プロテインＡの変異体のアミノ酸配列を配列単位として該配列単位の繰り返しよりなるアミノ酸配列を用いてもよい。この場合繰り返し数は１～３である。ここで、繰り返しよりなるアミノ酸配列を、プロテインＡの変異体のアミノ酸配列を１～３個連結した配列ともいう。R2部分に用いるプロテインＡの変異体のアミノ酸配列中には、リジン残基及びシステイン残基は全く含まれない。また、用いるプロテインＡの変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０～５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特徴を有する。
　R2部分のプロテインＡの一例として、Staphylococcus aureus由来のプロテインＡ(A. Forsgren and J. Sjoquist, J. Immunol. (1966) 97, 822-827.に記載)を通常の遺伝子改変技術を用いて設計することにより、アミノ酸配列を改変したプロテインＡ変異体をあげることができる。また、R2部分のタンパク質として、プロテインＡの抗体のＦｃ領域と結合し得るドメインの変異体を用いてもよい。このようなドメインとして、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン及びＣドメインが挙げられる。この中でもＡドメインの変異体が好ましい。本発明において、プロテインＡという場合、これらのドメインも含む。
　プロテインＡのアミノ酸配列中にε-アミノ基を有するリジン又はスルフヒドリル基を有するシステイン残基が含まれる場合、プロテインＡの抗体との結合活性が低下しないように、リジン及びシステインを他のアミノ酸で置換し、プロテインＡのアミノ酸配列中にリジン及びシステインが含まれないようにする。既に、本発明者らは、リジン及びシステインを全く含まないタンパク質を作製する方法を確立している（特開２００８-２６６２１９号公報）。該方法に従って、天然由来のプロテインＡのアミノ酸配列を基に、アミノ酸配列を改変し、リジン及びシステイン残基を含まない18種のアミノ酸より構成されるアミノ酸配列からなるプロテインＡであって、抗体との結合特性において天然のプロテインＡと同等の性能を発揮するタンパク質を作製することができる。
　Staphylococcus aureus由来のプロテインＡのＡドメインのアミノ酸配列は以下の配列番号１で示される。
プロテインＡのＡドメイン由来の配列(配列番号１)：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln 
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe 
Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Lys-Lys 
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Lys
　このプロテインＡは４残基のリジン（３５番目、４９番目、５０番目及び５８番目のアミノ酸位置）を有しており、上記の方法により、リジン残基をアルギニン残基又はグリシン残基で置換したプロテインＡのＡドメインのアミノ酸配列を以下の配列番号３で示す。
プロテインＡのＡドメインをシステイン及びリジンを全く含まないように改変した配列(配列番号３)：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln 
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe 
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg 
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
　配列番号３に示すアミノ酸配列をベースに改変した、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４．０～ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有するプロテインＡのＡドメインとして、以下の変異体が挙げられる。それぞれの変異体のアミノ酸配列をR2部分として含む、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をＡＤ-３、ＡＤ-４、ＡＤ-６-１及びＡＤ-６-２と呼ぶ。
　ＡＤ-３のR2部分のプロテインＡのＡドメイン変異体は、下記のアミノ酸配列（配列番号４)からなり、配列番号３のアミノ酸配列において、１５番目のＥ（グルタミン酸）がＨ（ヒスチジン）に置換され、２９番目のＧ（グリシン）がＡ（アラニン）に置換されている。
ＡＤ-３のアミノ酸配列（配列番号４）：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Phe 
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln 
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg 
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
　ＡＤ-４のR2部分のプロテインＡのＡドメイン変異体は、下記のアミノ酸配列（配列番号５）からなり、配列番号３のアミノ酸配列において、１５番目のＥ（グルタミン酸）がＨ（ヒスチジン）に置換され、１９番目のＭ（メチオニン）がＶ（バリン）に置換され、２９番目のＧ（グリシン）がＡ（アラニン）に置換されている。
ＡＤ-４のアミノ酸配列（配列番号５）：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Val-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
　ＡＤ-６-１のR2部分のプロテインＡのＡドメイン変異体は、下記のアミノ酸配列（配列番号６）からなり、配列番号３のアミノ酸配列において、１５番目のＥ（グルタミン酸）がＨ（ヒスチジン）に置換され、１９番目のＭ（メチオニン）がＶ（バリン）に置換され、２９番目のＧ（グリシン）がＥ（グルタミン酸）に置換されている。
ＡＤ-６-１のアミノ酸配列（配列番号６）：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Val-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Glu-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
　ＡＤ-６-２のR2部分のプロテインＡのＡドメイン変異体は、下記のアミノ酸配列（配列番号７）からなり、配列番号３のアミノ酸配列において、１５番目のＥ（グルタミン酸）がＨ（ヒスチジン）に置換され、１９番目のＭ（メチオニン）がＶ（バリン）に置換され、２９番目のＧ（グリシン）がＤ（アスパラギン酸）に置換されている。
ＡＤ-６-２のアミノ酸配列（配列番号７）：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Val-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Asp-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
　R3部分の配列は、リジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される任意のスペーサー配列である。R3部分は存在しなくてもよい。R3部分の配列は、固定化担体にR2部分と共に固定化される。R3部分は固定化に際して固定化担体との結合によりR2部分が有する機能が阻害されないようにする適切なリンカーとしての役割を担っている。リンカーとしての役割は、R2部分の特定の機能を有するタンパク質と固定化担体との間に適切な距離を保つことである。従って、R3部分は一定の長さを有する任意のアミノ酸配列で且つ不活性であることが求められる。R3部分のアミノ酸の数は限定されないが、０、すなわち存在しないか、１～１０アミノ酸、好ましくは２～５アミノ酸である。R3部分の配列として、例えば、０～１０個、又は２～５個のグリシンからなるポリグリシン等が挙げられ、具体的には、例えば、Gly-Gly-Gly-Glyで表される配列が挙げられる。
　R4部分の配列は、システイン－Ｘ（Ｘは、リジン及びシステイン以外のアミノ酸残基）で表される２残基のアミノ酸で構成される配列であり、例えばCys-Alaが挙げられる。一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質においてR4配列部分にのみ、唯一のシステイン残基を有する。従って、この唯一のシステイン残基の側鎖の官能基であるSH基をシアノ化することによりシアノシステイン残基に変化させ、該シアノシステイン残基と固定化担体上の１級アミンとの反応により、上記の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列のR1-R2-R3で表される部分のみを固定化担体上に配向制御して固定化させることができる。
　R5部分の配列は、リジン残基及びシステイン残基を全く含まない任意の配列で且つ一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列である。ここで、「タンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含む配列」とは、酸性アミノ酸の種類及び数がタンパク質全体の等電点を酸性にするだけ含まれている配列をいう。R5部分としては、アスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列が好適である。タンパク質の等電点は、構成するアミノ酸の種類と数に依存する。例えば、リジンやアルギニンなどの塩基性アミノ酸を多く含む場合は、塩基性アミノ酸の総数を超える数のアスパラギン酸やグルタミン酸が必要である。タンパク質の等電点の計算は、当業者であれば容易に計算により推定できる。好ましくは、上記一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の等電点を４～５の間の値になるように、アスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列を設計すればよい。R5部分の配列のアミノ酸の数は限定されないが、０すなわち存在しないか、又は１～２０個、好ましくは１～１０個、あるいは０～２０個、好ましくは０～１０個である。例えば、アスパラギン酸２～１０個からなるポリアスパラギン酸を挙げることができ、具体的にはAsp-Asp-Asp-Asp-Aspが挙げられる。R5部分を含まない部分の等電点が最初から酸性の場合は、R5部分は存在しなくてもよい。
　R6部分の配列は、特定の化合物と結合し得る任意のアフィニティータグ配列である。R6部分の配列は、合成した一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を精製するために利用される配列部分である。R6部分の配列として、特定の化合物と結合し得る配列、すなわちアフィニティータグ配列が挙げられる。該タグに特異的な抗体を用いて該タグを含むタンパク質の精製を行なう場合、エピトープタグという場合もある。アフィニティータグ配列として例えば、２～１２個、好ましくは４個以上、さらに好ましくは４～７個、さらに好ましくは５個若しくは６個のヒスチジンからなるポリヒスチジン配列が挙げられ、具体的にはHis-His-His-His-His-Hisが挙げられる。この場合、ニッケルをリガンドとしたニッケルキレートカラムクロマトグラフィーを利用することにより上記ポリペプチドを精製することができる。また、ポリヒスチジンに対する抗体をリガンドとして固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによっても精製することができる。その他、ヒスチジンを含む配列からなるHATタグ、HNタグ等も用いることができる。
　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなる固定化用タンパク質の具体的な例を配列番号２に示す。
ＡＤ-１の配列（プロテインＡのＡドメイン配列を元に、R1-R2-R3-R4-R5-R6の形式に適合させて作製した配列)(配列番号２)：
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln 
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe 
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg 
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly-Gly-Gly 
Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp 
His-His-His-His-His-His
　配列番号２に示す配列において、R1部分は存在せず、R2部分は上記のリジン及びシステインを含まないプロテインＡのＡドメインのアミノ酸配列（配列番号３）であり、R3部分はGly-Gly-Gly-Glyで表される配列であり、R4部分はCys-Alaで表される配列であり、R5部分はAsp-Asp-Asp-Asp-Asp-Aspで表される配列であり、R6部分はHis-His-His-His-His-Hisで表される配列である。
　また、ＡＤ-３、ＡＤ-４、ＡＤ-６-１及びＡＤ-６-２のR1部分、R3部分、R4部分、R5部分及びR6部分は、上記のＡＤ-１と同じである。
　本発明の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなる固定化用タンパク質を用いた、固定化対象タンパク質の担体への固定化は、特許第３７８８８２８号公報、特許第２９９０２７１号公報、特許第３０４７０２０号公報、特開２００３-３４４３９６号公報、特開２００８-１１５１５１号公報、特開２００８-１１５１５２号公報、特開２００８-１１５１５３号公報、特開２００８-２６６２２１号公報等に記載の方法に従って行なうことができる。
　具体的には、本発明の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のR4部分のシステイン残基をシアノ化によりシアノシステインとし、シアノシステインを有するタンパク質を一般式「NH2-Y」（Ｙは任意の固定化担体を表す）で示される１級アミノ基を官能基として有する固定化担体とを弱アルカリ条件下（ｐＨ８～１０）で反応させることにより、R1-R2-R3部分が固定化担体に固定化される。固定化担体にR1-R2-R3部分が結合したものは、R1-R2-R3-CO-NH-Y（式中、Ｙは上記の意味を有する。）で表され、R2部分のカルボキシ末端一箇所で固定化担体に結合している。シアノ化反応は、シアノ化試薬を用いて行うことができる。シアノ化試薬としては、２-ニトロ-５-チオシアノ安息香酸(2-nitro-5-thiocyanobennzoic acid (NTCB)) (Y.Degani, A.Ptchornik, Biochemistry, 13,1-11 (1974)参照）又は、１－シアノ-４-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロ硼酸(1-cyano-4dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate(CDAP))等を用いることができる。
　また、特開2003-344396号公報に記載の方法においては、本発明の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化担体に吸着させた後に、システイン残基をシアノ化し、上記の反応を行なわせ、固定化担体にR1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化担体に固定化する。タンパク質を固定化担体に吸着させるには、中性から弱アルカリ条件下（ｐＨ７～１０)で、タンパク質と固定化担体を反応させればよい。弱アルカリ反応条件化において、タンパク質は負に帯電し、一方、固定化担体は正に帯電し、静電相互作用により互いに吸着結合する。
　本発明は、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を吸着させた固定化担体であり、システイン残基をシアノ化する前の固体化担体、及びシアノ化を行い、R1-R2-R3で表される部分が固定化された固定化担体を包含する。
　本発明の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を用いて、シアノシステインを介した固定化反応により作製される、R1-R2-R3部分を固定化した固定化タンパク質においては、固定化担体部分に未反応の一級アミンが多数存在する。固定化されたタンパク質にリジン残基又はシステイン残基が存在する場合、残存の活性アミンが本発明の固定化タンパク質の利用を制限することがあり得る。しかしながら、固定化されたタンパク質部分であるR1-R2-R3部分は、全くリジン残基及びシステイン残基を含まないことから、タンパク質部分の化学的統制を変えることなく、タンパク質を固定化した担体表面に残存する１級アミンをマスク剤で処理することができる。マスク剤としては、無水酢酸、無水マレイン酸等が好適であるが、どのようなマスク剤であれ利用できる。
　本発明は、さらに、上記方法で得られた、システイン残基及びリジン残基を含まないアミノ酸配列よりなるタンパク質を適当なリンカー配列を介して、１級アミノ基を有する固定化担体とアミド（ペプチド）結合で強固に結合した固定化タンパク質を提供する。
　本発明において、固定化の担体としては、クロマトグラフィーに利用し得る担体を用いることができる。但し、本発明において用いる担体は、モノリス構造体を有する担体は除かれる。ここで、モノリス構造体とは、上面から下面まで貫通しているマクロ細孔を持つ多孔質体であり、多孔質体はマクロ細孔の内部にミクロ細孔を有することを特徴とし、多孔質体はマクロ細孔１～１００μm、ミクロ細孔０～１００nmである。モノリス構造体として、例えばケイ素を含むシリカモノリス構造体が挙げられる。モノリス構造体については、特公平０８-０２９９５２号公報、特開平０７-０４１３７４号公報、特開２０１０-１２７８５３号公報等に記載されている。
　また、粒子状の担体、膜状の担体、繊維状の担体、ホロファイバー状の担体、板状やシート状の基板、磁気ビーズ等タンパク質を固定化し得る不溶性のものならば、いずれも含まれる。「固定化担体」は、「固定化基板」を含む。このような形状の担体を形成する素材としては、表面に介在タンパク質を配向制御固定化するための官能基が導入されているものならどのようなものでもよくポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスチレンジビニルベンゼン、ポリメタクリエート、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ポリアクリレートに代表される重合体や共重合体であるポリマー素材やハイドロゲル、アガロース、デキストラン、セルロース、キトサンなどに代表される天然素材、シリカ、ガラス、セラミックなどに代表される無機素材、さらには、金、アルミナ、銀などに代表される金属素材など幅広く利用可能である。担体としては、Sepharose（登録商標）、Sephadex(登録商標）、Cellufine（登録商標）等の市販のものを用いることができる。さらに、ミクロ流路も担体として利用することができる。ここで、ミクロ流路とは、フローチャンネルセルやガラス基板上にミクロンオーダーの高精度の流路を形成したマイクロチップ等をいい、流路内のガラス上にタンパク質を固定化すればよい。
　ここで、官能基を導入した市販の固定化担体としては、アミノ－セルロファイン（生化学工業で販売）、AF-アミノトヨパール（TOSOHで販売）、EAH-セファロース4B及びリジン-セファロース4B（アマシャムバイオサイエンスで販売）、ポラス20NH（ベーリンガーマンハイムで販売）、ポロス（ライフテクノロジーズで販売）、CNBr活性化セファロースFF、NHS活性化セファロースFF、などがある。また、１級アミノ基を有するシラン化合物（例えば、３－アミノプロピルメトキシシランなど）を用いて、シリカ担体、ガラスビーズ又はガラス平板などにアミノ基などの官能基を導入することは当業者であれば容易にできる。
　本発明の、プロテインＡ変異体を含む担体を、抗体生成用のためのアフィニティークロマトグラフィーに用いる場合、粒子状の担体がクロマトグラフィー用カラムに充填されて用いられる。
　上記の抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０～pＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する、プロテインＡの変異体は以下の方法で取得することができる。
　最初にリジン及びシステインを含まないように改変したプロテインＡ（例えば、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるプロテインＡのＡドメイン）の１個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したタンパク質を作製する。このタンパク質について、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０～pＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有するプロテインＡ変異体を選択する。必要ならば、選択したプロテインＡ変異体について、さらに１個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したタンパク質、すなわち複数のアミノ酸置換を組合せた変異体を作製し、変異体の中から、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０～pＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有するプロテインＡ変異体を選択する。この操作を数回繰り返すことにより、上記の特性を強く呈するプロテインＡ変体を製造することができる。最終的には抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０～pＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有するプロテインＡ変異体として又は複数のアミノ酸が置換されたプロテインＡ変異体を得ることができる。例えば、プロテインＡとしてプロテインＡのＡドメインを用いた場合、リジン及びシステイン残基を含まないようにリジン及びシステインを他のアミノ酸に置換した変異体において、さらに１個、２個又は３個のアミノ酸が置換されたプロテインＡ変異体を得ることができる。この場合、リジン及びシステインを含む野生型のアミノ酸からは６～９個のアミノ酸が置換される。また、プロテインＡ全体としても、リジン及びシステイン残基を含まないようにリジン及びシステインを他のアミノ酸に置換した変異体において、さらに、１～９個のアミノ酸が置換された変異体を得ることができる。この場合、リジン及びシステインを含む野生型のアミノ酸からは７～１５個のアミノ酸が置換される。このうちの６個がリジン及びシステインの他のアミノ酸への置換であり、残りの１～９個が抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４．０～ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を付与するための置換である。具体的には、上記のＡＤ-３、ＡＤ-４、ＡＤ-６-１及びＡＤ-６-２のアミノ酸配列のR2部分で表されるアミノ酸配列からなる変異体が挙げられる。
　プロテインＡ変異体の抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０～pＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性の検定は、例えば以下の方法で行うことができる。
　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなる固定化用タンパク質中、R2部分としてプロテインＡの変異体のアミノ酸配列を含むタンパク質を製造し、該タンパク質を用いてR1-R2-R3部分をアレイ用基板に、シアノ化を利用した上記方法により固定化する。ここで用いるアレイとしては、特許４５２８９５１号公報、特開２０１０-１２７８５６号公報、特許４００６５２３号公報等に記載されているアレイを用いればよい。
　変異体を固定化したアレイ基板を、アレイ解析装置にセットし、装置の送液系に接続し、以下に記載する解析のための溶液を自動通液しながらアレイに２８０ｎｍの紫外光を照射し、その透過光をCCDで継時的に撮影しアレイの画像をPCに取り込む。初期化緩衝液（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、抗体溶液（ヒトポリクローナル抗体を０．２ｍｇ/ｍｌになるようにランニング緩衝液で希釈した溶液）、洗浄用緩衝液（１Ｍ 塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、溶出用緩衝液（０．１Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０）、再生用緩衝液（０．１Ｍ グリシン、ｐＨ２．５）の各々を０．６ｍｌ/ｍｉｎの速さで２５分間、この順に通液し、８秒間隔でアレイの画像を継時的に撮影し、画像としてPCに取り込み保存する。データの解析においては、装置に付属した解析用ソフトフェアを用いて、アレイ画像の中にスポットを自動検出し、スポット領域のピクセルの平均輝度、及び、スポット周辺のピクセルの平均輝度を計算し、その比の対数をスポットのシグナル強度として求める。この値は、スポット上のタンパク質の量に比例することが確認されている。各スポットのシグナル強度をアレイ基板に対して通液を開始してからの経過時間に対してプロットする。経過時間に対するシグナル強度のプロットから得られる曲線を解析することにより変異体タンパク質の特性を評価することができる。このシグナル強度の時間経過を求めることにより、抗体が吸着、解離する状況を定量的に解析することができる。この溶出過程のシグナル強度変化に減衰曲線をフィッティングし、結合していた抗体の半分の量が解離するまでの経過時間Ｔ0.5を求め、アレイ近傍の上記のＡＤ-１中のプロテインＡのＡドメインのＴ0.5との比を計算することによって規格化したＴ0.5を求め、この値を酸溶出特性の指標、あるいは、酸溶出の容易さの指標として評価する。Ｔ0.5が低い方が酸溶出特性、すなわち、ｐＨ４.０～ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性が良好であると判断することができる。さらに、Ｔ0.5に加えて、抗体との解離定数（Kd）を指標にしてもよい。
　解離定数は、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサーであるBiacore（ビアコア社）を用いてプロテインＡ変異体と抗体との結合特性解析を行うことにより測定することができる。この際、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなる固定化用タンパク質中、R2部分としてプロテインＡの変異体のアミノ酸配列を含むタンパク質を用いてR1-R2-R3部分を担体に結合し、該タンパク質固定化担体を用いればよい。観測された表面プラズモン共鳴によるセンサー表面の質量変化の経時変化は、Biacoreにより定義される単位ＲＵにより測定し、結合速度定数(kass)、解離速度定数(kdis)及び解離定数(Kd =kass/kdis)を求めればよい。解離定数が小さいプロテインＡ変異体ほど、抗体と中性条件で強く結合し得る変異体であると判断することができる。
　上記の方法で求めたＴ0.5及び解離定数を図１に示すような座標上にプロットし、Ｔ0.5及び解離定数が一定値範囲にあるもの、すなわち、座標上の特定の範囲にプロットされたプロテインＡのＡドメイン変異体を、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４．０～ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性が優れた変異体として選択すればよい。
　例えば、上記の配列番号２で表されるＡＤ-１を用いて作製したプロテインＡのＡドメイン固定化担体について同様の検討を行い、Ｔ0.5がＡＤ-１中のプロテインＡのＡドメインを用いて測定したＴ0.5よりも小さく、かつ解離定数がＡＤ-１中のプロテインＡのＡドメインを用いて測定した解離定数よりも小さいプロテインＡを本発明の、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４．０～ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性が優れた変異体として選択することができる。本発明の、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４．０～ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性が優れた変異体の、上記のアレイを用いて測定した場合のＴ0.5は１．００以下、好ましくは０．８０以下、さらに好ましくは０．６０以下、特に好ましくは０．５５以下であり、上記のビアコアにより測定した解離定数は６×１０-9以下、好ましくは８×１０-9以下、さらに好ましくは１０-10以下である。
　本発明の、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化した固定化担体を用いることにより、R1-R2-R3で表される部分が固定化された固定化タンパク質を得ることができる。一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化した固定化担体は、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化担体に吸着させることにより製造することができる。タンパク質の固定化担体への吸着は上記のように、中性から弱アルカリ条件下（ｐＨ７～１０）で、タンパク質と固定化担体を反応させればよい。一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化した固定化担体において、タンパク質のR3部分に含まれるシステイン残基をシアノ化することにより、上記のように、固定化担体にR1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が固定化された固定化担体を製造することができる。本発明は、R1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が固定化された固定化担体も包含する。
　R1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が固定化された固定化担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより抗体を精製することができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるアフィニティークロマトグラフィー用カラムは、カラムにR1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が固定化された固定化担体を充填することにより、製造することができる。担体のカラムへの充填は公知の方法により行うことができる。本発明は、R1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が固定化された固定化担体を含む抗体精製用アフィニティークロマトグラフィー用カラムも包含する。
　本発明のアフィニティークロマトグラフィー用カラムを用いた抗体精製は公知のアフィニティークロマトグラフィーの方法により行うことができるが、プロテインＡ変異体に結合させた抗体を温和なpH条件で溶出することができるという特徴を有する。抗体精製は、最初に、精製しようとする抗体を含む溶液（原料粗液）を、R1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が固定化された固定化担体を充填したアフィニティークロマトグラフィー用カラムに通液し、担体上のプロテインＡ変異体に抗体を吸着させる。この際、原料粗液はｐＨ６．０～８．５に調整しておく。ｐＨの調整に用いる緩衝液は限定されないが、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＨＥＰＥＳ; 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid、 ＭＥＳ; 2-Morpholinoethanesulfonic acid等を用いればよい。また、アフィニティークロマトグラフィー用カラムは、あらかじめ上記のｐＨ６．０～８.５の緩衝液を用いて平衡化しておくのが好ましい。次いで、抗体を吸着させた担体をリン酸ナトリウム緩衝液やTris-HCl緩衝液等の中性緩衝液で洗浄し、不純物を除去する。その後、ｐＨ４．０～ｐＨ５．５の緩衝液を用いて結合した抗体を溶出させ回収すればよい。ｐＨ４．０～ｐＨ５．５の緩衝液としては、酢酸ナトリウム緩衝液やクエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液あるいはMES；2-Morpholinoethanesulfonic acid等を用いればよい。用いる緩衝液の濃度は限定されないが、例えば、１０～５０ｍＭの濃度で用いればよい。カラムサイズはサンプルとして用いる抗体含有原料粗液の容積にもよるが、例えば長さ２．５～３０cmのものを用いればよい。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
　以下の実施例においては、下記の実験方法が共通的に用いられている。
（実施例１）
遺伝子合成
　実施例に記載されている遺伝子の合成は、合成遺伝子受託製造業者にて合成を行った。以下に示した塩基配列（配列番号８）にもとづき、ｄｓＤＮＡを合成しpUC18vectorのBamHI-EcoRI siteへの挿入、取得されたクローンについて片鎖解析による配列を確認、塩基配列情報の照合、ミスマッチが確認された部位についてはSite directed mutagenesis等の手法により変異修正を実施、得られた取得したプラスミドDNA（約１μg）が納入された。納入されたプラスミド中の目的部分に関しては、再度シーケンシングにより配列確認を行った。
配列番号８の塩基配列
GGATCCTTGACAATATCTTAACTATCTGTTATAATATATTGACCAGGTTAACTAACTAAGCAGCAAAAGGAGGAACGACTATGGCGGATAACAACTTTAACCGCGAACAGCAGAACGCGTTTTATGAAATTCTGAACATGCCGAACCTGAACGAAGAACAGCGCAACGGCTTTATTCAGAGCCTGCGCGATGATCCGAGCCAGAGCGCGAATCTGCTGAGCGAAGCGCGTCGTCTGAATGAAAGCCAGGCGCCGGGCTGTGCGGATGACGACGACGATGATCACCACCATCACCATCATTAAGAATTC
１アミノ酸置換変異体作製
　ＡＤ-１（アミノ酸配列を配列番号２に示す）を元にしたプロテインＡのＡドメインのアミノ酸置換は、置換部位のアミノ酸をコードするDNA配列を目的のコドン配列に転換して両方に24塩基ずつ元の配列を持つＤＮＡプライマーとその相補ＤＮＡプライマーを用いて、クイックチャンジ法（Stratagene社のQuickChang Site-directed Mutagenesis kitに記載に記載されている方法）に従って行った。
タンパク質精製
　組換えプラスミドを形質転換した大腸菌JM109株を、２Lの培地（２０ｇの塩化ナトリウム、２０ｇ酵母エキス、３２ｇのトリプトン、１００ｍｇのアンピシリンナトリウムを含んでいる）で、３５℃で一晩培養した。その後、培養液を２０分間低速遠心（毎分５，０００回転）することにより、湿重量３～５gの菌体を得た。これを２０mLの１０ｍＭの燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、フレンチプレス装置により菌体を破砕した後、２０分間高速遠心（毎分２０，０００回転）することにより、上清を分離した。得られた上清にストレプトマイシン硫酸を最終濃度が２％になるように加え２０分間撹拌後、２０分間高速遠心（毎分２０，０００回転）することにより、上清を分離した。この後、硫酸アンモニウム処理を行い、得られた上清をニッケルキレートカラム（GEヘルスケアバイオサイエンス社より購入）にアプライし、洗浄用緩衝液（５ｍＭイミダゾール、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）を２０ｍｌ以上用いて、カラムを十分洗浄し、洗浄後、溶出用緩衝液（０．５Ｍイミダゾール、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）を２０ｍｌアプライすることにより、目的のタンパク質を溶出した。その後、このタンパク質溶液からイミダゾールを除去するため、５Ｌの１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行った。透析膜にはMWCO3500（Spectrum Laboratories社より購入）を用いた。透析後、遠心真空乾燥機を用いて目的のタンパク質を乾燥させた。
ヒト抗体ＩｇＧ分子との結合特性解析
　目的タンパク質の結合特性解析には、表面プラズモン共鳴バイオセンサーであるBiacore（ビアコア社）を用い、ビアコア社の提供するプロトコールに従って解析を行った。
　ランニング緩衝液は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ (pH７．４)、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５μM EDTA、0.005％ Surfactant P20（ビアコア社）の組成のものを用い、あらかじめ脱気したものを用いた。
　センサーチップとしては、SensorChip NTA（ビアコア社）を用いた。センサーチップをランニング緩衝液にて十分平衡化した後、５ｍＭ塩化ニッケル溶液を注入することにより、ニッケルイオンの配位を完成させた。その後、センサーチップを、組み換えタンパク質溶液（ランニング緩衝液中、濃度１００μg/mL）を注入することにより、組み換えタンパク質の固定化を行った。
　固定化組換えタンパク質とヒトＩｇＧとの結合反応は、ランニング緩衝液を用いて０．２５～２０μg/ｍｌの範囲で７種類の濃度になるように希釈・調製したヒトＩｇＧ（シグマ－アルドリッチ社)溶液を逐次注入し、引き続きランニング緩衝液に切り替えて送液を保持することにより、抗体の結合・解離現象を定量的に観測した。なお、送液流量は２０μＬ/ｍｉｎ、結合観測時間（抗体溶液注入時間）は４分間、解離観測時間は４分間とした。各濃度の抗体溶液を注入し、結合・解離現象を観測した後には、引き続き６Ｍ塩酸グアニジン溶液を３分間注入し、固定化されている組換えタンパク質に結合しているヒトＩｇＧをすべて解離させ、ランニング緩衝液で再生し、その後の測定に使用した。
　観測された表面プラズモン共鳴によるセンサー表面の質量変化の経時変化は、Biacoreにより定義される単位RUにより測定し、結合速度定数(kass)、解離速度定数(kdis)及び解離定数(Kd =kass/kdis)を求めた。
　ＡＤ-１のプロテインＡのＡドメインの網羅的１アミノ酸置換変異体のビアコア測定による抗体との結合の強さを示す解離定数に対する、アレイ解析装置を用いた測定から得られたｐＨ５．０における溶出から求めた溶出パラメータ、Ｔ0.5の値のプロット結果を図１に示す。
アレイ解析装置を用いた抗体の酸溶出特性の解析
　アレイ解析装置を用いた測定は以下のように行った。
タンパク質のアレイ基板への固定化
　各変異型タンパク質をｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、BCA法で濃度を測定し、最終濃度が２ｍｇ/ｍｌになるように調整した。約２ｍｇ/ｍｌの各タンパク質溶液をアレイ用基板（シリカモノリス多孔質体の薄層）に対して、８行１２列の９６箇所に１．２ｍｍ間隔で０．２μＬずつスポットした。その際、１枚のアレイ上に同じ変異型タンパク質を二箇所にスポットし、データの再現性を確認できるようにした。また、比較用タンパク質としてＡＤ-１タンパク質を各行の中２か所にスポットし、変異型タンパク質のデータとＡＤ-１のデータとを比較できるようにした。スポットした後、タンパク質の還元反応、シアノ化反応、シアノシステインを介した配向制御固定化反応、高塩濃度の緩衝液による洗浄、及び残存アミノ基のマスク反応を逐次行うことにより、タンパク質をアレイ用基板に固定化した。
測定
　各変異体をスポット固定化したアレイ基板を、アレイ解析装置にセットし、装置の送液系に接続し、以下に記載する解析のための溶液を自動通液しながらアレイに２８０ｎｍの紫外光を照射し、その透過光をCCDで継時的に撮影しアレイの画像をPCに取り込んでいった。初期化緩衝液（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、抗体溶液（ヒトポリクローナル抗体を０．２ｍｇ/ｍｌになるようにランニング緩衝液で希釈した溶液）、洗浄用緩衝液（１Ｍ 塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、溶出用緩衝液（０．１Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０）、再生用緩衝液（０．１Ｍ グリシン、ｐＨ２．５）、各々を０．６ｍｌ/ｍｉｎの速さで２５分間、この順に通液し、８秒間隔でアレイの画像を継時的に撮影し、画像としてPCに取り込み保存した。
データ解析
　データの解析においては、装置に付属した解析用ソフトフェアを用いて、アレイ画像の中にスポットを自動検出し、スポット領域のピクセルの平均輝度、及び、スポット周辺のピクセルの平均輝度を計算し、その比の対数をスポットのシグナル強度として求めた。この値は、スポット上のタンパク質の量に比例することが確認されている。各スポットのシグナル強度をアレイ基板に対して通液を開始してからの経過時間に対してプロットした。経過時間に対するシグナル強度のプロットから得られる曲線を解析することにより変異体タンパク質の特性を評価した。このシグナル強度の時間経過を求めることにより、抗体が吸着、解離する状況を定量的に解析することができる。
　このような解析の結果、溶出用緩衝液を通液した時の抗体の解離の速さ、すなわち、抗体の酸溶出特性は、変異型タンパク質の種類によって大きく異なっていることが分かった。そこで、この溶出過程のシグナル強度変化に減衰曲線をフィッティングし、吸着していた抗体の半分の量が解離するまでの経過時間Ｔ0.5を求め、アレイ近傍のＡＤ-１のプロテインＡのＡドメインのＴ0.5との比を計算することによって規格化したＴ0.5を求め、この値を酸溶出特性の指標、あるいは、酸溶出の容易さの指標とした。
　次に、この酸溶出特性とともに、先述のヒト抗体ＩｇＧ分子との結合特性解析に記載した方法で求めた解離定数（Ｋｄ）の両方の指標を基に、変異型タンパク質の選抜を試みた。その結果、ＡＤ-１のプロテインＡのＡドメインよりも結合親和性が高く（Ｋｄの値が小さく）、且つ、酸溶出の容易な（Ｔ0.5の値が小さい）変異型タンパク質を複数選びだすことが出来た。また、それらの変異を組み合わせた変異型タンパク質を作製し、それらのアレイを作製して抗体の酸溶出特性を測定・解析することによって、さらに酸溶出の容易な変異型タンパク質を見出すことが出来た。
　配列番号１に示すアミノ酸配列の１５番目のＥ（グルタミン酸）をＨ（ヒスチジン）に置換したもの（Ｅ１５Ｈ）の酸溶出特性が良好であった。
（実施例２）
　実施例１の結果を元に、さらに、Ｅ１５Ｈ変異に他の１アミノ酸置換変異を行った。付け加える変異としては、Ｍ１９（配列番号１に示すアミノ酸配列の１９番目のメチオニン）とＧ２９（配列番号１に示すアミノ酸配列の２９番目のグリシン）の部位の置換変異について検討した。Ｍ１９は、ＡＤ-１中に唯一存在する空気酸化を受けやすいメチオニン残基であり、この部位のアミノ酸置換により、化学的な性質として抗酸化性能が付加されることが期待されるからである。Ｇ２９の部位は、アレイ解析の結果、ｐＨ５．０における溶出特性が改良する変異が期待される部位の一つとして示された部位である。Ｍ１９の部位ではｐＨ５における溶出のし易さのパラメータであるＴ0.5が改良された変異として，Ｍ１９Ｖ（１９番目のメチオニンのＶ（バリン）への置換）が、Ｇ２９の部位では、Ｇ２９Ａ（２９番目のグリシンのＡ（アラニン）への置換）、Ｇ２９Ｄ（２９番目のグリシンのＤ（アスパラギン酸）への置換及びＧ２９Ｅ（２９番目のＧのＥ（グルタミン酸への置換）が選択された。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　これらの変異を組み合わせた組み合わせ変異体として、Ｅ１５Ｈ＋Ｇ２９Ａ（ＡＤ-３のR2部分）、Ｅ１５Ｈ＋Ｍ１９Ｖ＋Ｇ２９Ａ（ＡＤ-４のR2部分）、Ｅ１５Ｈ＋Ｍ１９Ｖ＋Ｇ２９Ｄ（ＡＤ-６-２のR2部分）、Ｅ１５Ｈ＋Ｍ１９Ｖ＋Ｇ２９Ｅ（ＡＤ-６-１のR2部分）の４種類の組み合わせ変異について、上記方法に従って発現遺伝子の作製、大腸菌での発現、発現した大腸菌からの組み換えタンパク質の分離精製を行い、それぞれのタンパク質の精製品をそれぞれ約１ｇずつ調製した。調製したそれぞれのタンパク質を用いて、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるタンパク質を作製した。R2部分がプロテインＡの上記変異体であり、R1は存在せず、R3はGly-Gly-Gly-Glyで表される配列であり、R4はCys-Alaで表される配列であり、R5はAsp-Asp-Asp-Asp-Asp-Aspで表される配列であり、R6はHis-His-His-His-His-Hisで表される配列であった。特許第３７８８８２８号公報、特許第２９９０２７１号公報、特許第３０４７０２０号公報、特開２００３-３４４３９６号公報、特開２００８-１１５１５１号公報、特開２００８-１１５１５２号公報、特開２００８-１１５１５３号公報、特開２００８-２６６２２１号公報等に記載の方法に従って、R4部分のシステインをシアノ化によりシアノシステインとし、R1-R2-R3部分（実際には、R2-R3部分）を担体へ固定化し、リガンドを導入したアフィニティー担体をそれぞれ作製した。作製方法は、下記の「組換えタンパク質の固定化」に示す。前記の「リガンドを導入したアフィニティー担体」と下記の「タンパク質固定化シリカゲル」は同じ物である。それぞれのアフィニティー担体を約１ｍｌ用いた分離カラムを作製した。作製したそれぞれの分離カラムについて、ポリクローナル抗体を用いたクロマトグラフィーを行い、溶出時のｐＨを変化させ、抗体の溶出・回収量のｐＨ依存性を測定した。
　固定化担体を用いたクロマトグラフィーは以下に記載の方法で行った。
　液体クロマトグラフィー装置としてＧＥヘルスケア社のアクタを用いた。
　上記のリガンドを固定化した担体（タンパク質固定化シリカゲル）を１ｍｌのカラム（サイズ　φ=５ｍｍ、高さ＝５０ｍｍ）に充填し、液体クロマトグラフィー装置に取り付けた。
　まず、（１）（初期化）１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを１０ｍｌ通液した後、
（２）（サンプルアプライ）、サンプルループを用いて、ポリクローナルＩｇＧ抗体溶液（１ｍｌ）を通液し、溶媒切り替えバルブを切り替え、
（３）（洗浄）、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを１０ｍｌ通液した後、溶媒切り替えバルブを切り替え、
（４）（溶出）、あらかじめ設定したそれぞれのｐＨのクエン酸緩衝液を１０ｍｌ通液し、溶媒切り替えバルブを切り替え、
（５）（再生）、再生用溶液(０．１Ｍクエン酸溶液)を、１０ｍｌ通液し、溶媒バルブを切り替え、
（６）(完了)、（１）の１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを１０ｍｌ通液し、クロマトグラフィーの通液操作を完了した。
　通液中は、カラムから溶出されてくる溶液を、装置に備え付けのＵＶ検出器及び電導度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度と電導度を測定し、その値を記録した。２８０ｎｍの吸光度を用いたクロマトグラム曲線から、溶出のピークの同定とそのピーク面積を計算し、アプライした抗体がどのように回収されてくるかを計算により求めた。
　結果を、図２に示す。なお、図２のＡはＡＤ-２のR2部分、ＢはＡＤ-３のR2部分、ＣはＡＤ-４のR2部分、ＤはＡＤ-５のR2部分、ＥはＡＤ-６-１のR2部分、ＦはＡＤ-６-２のR2部分の結果をそれぞれ示す。
　図３に固体化担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。
　図３Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ図２のＡのｐＨ３．０、４．０及び４．５の時のクロマトグラムを示している。図３中、（１）は、ｐＨ３．０、４．０又は４．５の溶出液を流した時の溶出ピークを示し、（２）は再生溶液（ｐＨ２．５）を流した時の溶出ピークを示す。この（１）と（２）溶出ピークの面積(それぞれ、S1及びS2とする）を用いて、回収率を１００＊S1/(s1+S2)で計算し、その値を溶出溶液のｐＨに対してプロットした図が図２である。
組換えタンパク質の固定化
　シリカゲル（ダイソー株式会社製）５０ｇと３-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン10gを水溶媒中還流条件下（９５℃）で、４時間反応させ、エポキシ化シリカゲル５０ｇを調製した。
　上記のようにして得たエポキシ化シリカゲルを０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ９．５）中に懸濁させ、ポリ-Ｌ-リジン５ｇ（Sigma社P6516）を加え、室温で２４時間撹拌した。その後、５ｍＭの２-ニトロ-５-チオシアノ安息香酸溶液５００ｍｌと組み換えタンパク質（ＡＤ-３、ＡＤ-４、ＡＤ-６-１、ＡＤ-６-２共通）２ｇをそれぞれ加え、２４時間撹拌、続いて１０ｍＭホウ酸バッファー(ｐＨ９．５)にバッファーを切り替え、再び２４時間撹拌することで、最終的に各組み換えタンパク質固定化シリカゲル４７ｇを調製した。
固定化担体のIgG結合容量の測定
　上記で作製した固定化シリカゲルのＩｇＧ結合能を以下のようにして測定した。
　ＡＤ-３のプロテインＡのＡドメイン固定化担体を５ｍｍφx２０ｍｍのガラスカラム（GEHealthcare製、０．４ｍｌ）に充填した。様々な接触時間条件下（１．０、２．４、６．０ｍｉｎ）で、ｐＨ７のリン酸ナトリウムバッファーに溶解させた既知濃度のポリクローナルヒトＩｇＧ抗体（オリエンタル酵母製、０．５ｍｇ/ｍｌ)を負荷させた。その際の破過曲線から１０％破過点を算出し、それにより各接触時間毎に以下の動的結合容量（ＤＢＣ）を得た。なお、この表から静的結合容量は約６０ｍｇ/ｍｌと推測できた。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＡＤ-４、ＡＤ-６-１、ＡＤ-６‐２それぞれのタンパク質のプロテインＡのＡドメインの固定化担体においても同様にして、結合容量を測定し、以下の結果を得た。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明が関係する技術分野としては、固定化抗体が関わる幅広い技術分野、例えば、抗体カラム、抗体アレイなどのほか、固定化抗体を用いた、成分検査、臨床検査など幅広い検査技術分野、また、抗体カラムを用いた分離精製分野などが含まれる。
配列番号１～８　合成
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (21)

  1. 　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列
    ［式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かう配列を示し、
    R1部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列であり：
    R2部分の配列は、固定化対象タンパク質であるプロテインＡ変異体の配列、又はその配列を１～３個連結した配列であり、リジン及びシステイン残基を含まない配列であり、該プロテインＡ変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０～ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する；
    R3部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列であり；
    R4部分の配列はシステイン－Ｘ（Ｘは、アラニンであるか、もしくはアラニンとシステイン以外のアミノ酸残基）で表される２残基のアミノ酸で構成される配列であり：
    R5部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列であり；
    R6部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列である］
    からなるタンパク質であって、R1-R2-R3で表される部分を固定化担体に固定化するために用いるタンパク質が静電相互作用により吸着している固定化担体（但し、モノリス構造体を有する固定化担体を除く）。
  2. 　プロテインＡ変異体が、アレイ基板に固定化したプロテインＡ変異体に抗体を結合させ、ｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液で溶出したときの結合していた抗体の半分の量が解離するまでの経過時間Ｔ0.5及び、抗体との解離定数が、配列番号３で表されるプロテインＡ変異体のＴ0.5及び解離定数よりも低いプロテインＡ変異体である、請求項１記載の固定化担体。
  3. 　プロテインＡ変異体が、Staphylococcus aureus由来のプロテインＡのアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列からなる変異体である、請求項１又は２に記載の固定化担体。
  4. 　プロテインＡ変異体が、プロテインＡのＡドメインの変異体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の固定化担体。
  5. 　R2部分の配列が、配列番号４～７のいずれかの配列からなるプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質の配列、又は配列番号４～７のいずれかの配列からなるプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質の配列を１～３個連結した配列である、請求項１～４のいずれか１項に記載の固定化担体。
  6. 　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在する唯一のシステイン残基のスルフフィドリル基をチオシアノ基に変換し、１級アミンを官能基として有する任意の固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシステイン残基よりアミノ末端側に存在するアミノ酸配列部分であるR1-R2-R3部分をアミド結合により結合させるための、請求項１～５のいずれか１項に記載の固定化担体。
  7. 　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R3部分の配列が、１～１０個のグリシンからなる配列であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか１項に記載の固定化担体。
  8. 　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R5部分の配列が、アスパラギン酸及び/又はグルタミン酸のアミノ酸残基からなるアミノ酸残基数１～１０個の配列であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の固定化担体。
  9. 　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R5部分の配列が、１～１０個のアスパラギン酸からなる配列であることを特徴とする、請求項８記載の固定化担体。
  10. 　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R6部分の配列が、４個以上のヒスチジン残基からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１～９のいずれか１項に記載の固定化担体。
  11. 　担体がシリカ担体、ガラスビーズ、及びポリマーからなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の固定化担体。
  12. 　一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を担体に静電相互作用により吸着させることを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の固定化担体を作製する方法。
  13. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在する唯一のシステイン残基のスルフフィドリル基をチオシアノ基に変換し、１級アミンを官能基として有する任意の固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシステイン残基よりアミノ末端側に存在するアミノ酸配列部分であるR1-R2-R3部分をアミド結合により結合させて製造された、プロテインＡの変異体が固定化された固定化担体。
  14. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在する唯一のシステイン残基のスルフフィドリル基をチオシアノ基に変換し、１級アミンを官能基として有する任意の固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシステイン残基よりアミノ末端側に存在するアミノ酸配列部分であるR1-R2-R3部分をアミド結合により結合させることを含む、請求項１２に記載の固定化担体を作製する方法。
  15. 　請求項１３記載の固定化担体が充填された、抗体精製用アフィニティークロマトグラフィーカラム。
  16. 　請求項１５記載の抗体精製用アフィニティークロマトグラフィーカラムに抗体を含む溶液をアプライし、抗体をプロテインＡ変異体に結合させ、次いで溶出緩衝液により抗体を解離溶出させることを含む、抗体の精製方法。
  17. 　固定化担体にR1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化するために用いる一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を設計する方法であって、R1、R2、R3、R4、R5及びR6部分のアミノ酸配列を以下の条件に適合するように選択することを含む方法：
    (a) R1部分の配列を存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列を選択し;
    (b) R2部分の配列として、プロテインＡ変異体の配列、又はその配列を１～３個連結した配列であり、リジン及びシステイン残基を含まない配列であり、該プロテインＡ変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、ｐＨ４.０～ｐＨ５．５の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する、配列を選択し；
    (c) R3部分の配列を存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列を選択し；
    (d) R4部分の配列として、システイン－Ｘ（Ｘは、アラニンもしくはシステイン以外のアミノ酸残基）で表される２残基のアミノ酸で構成される配列を選択し；
    (e) R5部分の配列は存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列を選択し；そして
    (f) R6部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列を選択する。
  18. 　プロテインＡ変異体が、アレイ基板に固定化したプロテインＡ変異体に抗体を結合させ、ｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液で溶出したときの結合していた抗体の半分の量が解離するまでの経過時間Ｔ0.5及び、抗体との解離定数が、配列番号３で表されるプロテインＡ変異体のＴ0.5及び解離定数よりも低いプロテインＡ変異体である、請求項１７記載の方法。
  19. 　プロテインＡ変異体が、Staphylococcus aureus由来のプロテインＡのアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列からなる変異体である、請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. 　プロテインＡ変異体が、プロテインＡのＡドメインの変異体である、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 　R2部分の配列が、配列番号４～７のいずれかの配列からなるプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質、又は配列番号４～７のいずれかの配列を１～３個連結した配列からなるプロテインＡのＡドメインの変異体タンパク質の配列である、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の方法。
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