CN103331147A - 一种特异性清除甲状旁腺激素的血液净化吸附剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于特异性清除甲状旁腺激素的血液净化吸附剂的制备方法。该方法包括基因重组人甲状旁腺激素的表达与纯化，蛋鸡免疫与特异性IgY的获得，特异性IgY的固载及吸附剂效果的评价。本吸附剂由固相载体基质和特异性IgY配基两部分组成，能够有效吸附人血清中的甲状旁腺激素，且制备成本低，物理化学性质稳定，可作为血液净化装置的吸附填料用于甲状旁腺功能亢进患者血液中甲状旁腺激素的清除。

Description

一种特异性清除甲状旁腺激素的血液净化吸附剂的制备方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体地说，涉及到一种能够特异性清除人甲状旁腺激素的血液净化吸附剂的制备方法。 

背景技术

流行病学研究发现全世界有超过5亿人口患有肾脏病，我国成人慢性肾脏病的患病率平均为10%，超过1.2亿。目前我国终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）又称尿毒症（uremia）患者人数已超过一百万人。尿毒症患者由于绝大部分肾实质被破坏,导致多种代谢废物和内分泌激素难以被排泄或降解，从而在体内蓄积而产生毒性作用，出现厌食，恶心，贫血，心衰，肺水肿，周围神经病变等症状，甚至导致患者的死亡。据统计，2010年全球用于尿毒症和透析治疗的费用已攀升至10,000亿美元。 

根据尿毒症毒素分子量的大小可以分为三大类。小分子毒素（分子量小于500Da）主要包括尿素、多胺等，中分子毒素（分子量在500Da到12000Da之间）主要包括晚期糖基化终末产物、甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）等。大分子毒素（分子量大于12000Da）主要包括游离免疫球蛋白轻链、瘦素等。目前普遍认为，PTH是尿毒症的主要毒性物质之一（Vanholder R.,Smet R.D.,Glorieux G.,et al.Review on uremic toxins:Classification,concentration,and interindividual variability[J].Kidney International.2003,63:1934–1943.）。 

甲状旁腺激素是人体内调节钙磷代谢平衡的主要激素之一，是由84个氨基酸组成的一条碱性多肽分子，分子量9425Da，等电点9.1。现在PTH的基因结构与序列已经很清楚，PTH在基因文库的编号为:CI190702，基因全长1156bp;编码序列中有两个内含子;编码PHT(1-84)的片段在309-563bp处。PTH一方面通过与骨细胞膜受体结合，增强骨矿物的溶解速度，使血液循环中钙磷水平升高；另一方面通过与肾上皮细胞膜上的受体结合，增加钙的重吸收和磷的排泄，防止血液中磷浓度升高；最终大部分PTH在肾脏被分解。肾衰病人由于肾小球滤过率及肾小管功能下降，导致PTH分解减少和血磷浓度的增加，机体为了提高肾小球滤过能力，继发性刺激甲状旁腺分泌更多PTH，但PTH的增加又加强溶骨活动，使骨磷释放进一步增多，从而形成恶性循环，使PTH处于一种超负荷水平，引起继发性甲状旁腺功能亢进。继发性甲状旁腺功能亢进是慢性肾功能衰竭的主要并发症之一,发病率高达80%。 

临床检测发现，几乎所有的肾衰竭患者体内PTH含量过高，而高PTH使肾衰竭患者机体处于一种高危状态，严重影响肾衰竭患者生存质量及生存率。人体几乎所有器官 均为PTH作用的靶器官,机体内累积过多的PTH可引起多系统病理改变和临床表现，骨骼系统主要表现为骨痛、骨折、急性关节周围炎、假性痛风、肌痛及肌无力等；血液系统表现为贫血、白细胞减少和血小板功能不全；神经系统表现为周围神经及脑神经病变；循环系统表现为心力衰竭、高血压、高脂血症、动脉硬化等。因此临床上正大量研究减少肾衰竭患者血清中PTH的含量的方法。 

目前针对高PTH的治疗方法包括3种：药物治疗、外科手术和血液净化。针对高PTH血症的药物和手术治疗主要是通过升高体液内钙离子浓度间接控制PTH水平，或将甲状腺部分或全切除，虽然在一定程度上可以降低血液内PTH水平，但治疗后可能导致高钙血症与血磷上升，进一步加重肾脏负担或导致甲状旁腺功能亢进。通过血液净化方式去除体液内过高的PTH被认为是一种有效的、很有发展前景的治疗方式。目前已经开展的一些血液净化方式主要包括血液透析、血液灌流等。由于与其他血浆蛋白相比，PTH在血液内含量非常低（健康人群血清PTH浓度为15-65ng/L，晚期肾病病人增加至几百ng/L，浓度高时甚至达到1mg/L），另一方面，PTH分子的理化性质如电荷性质、亲疏水性与血液内存在的很多分子性质相似，而一些人体内主要蛋白含量远大于PTH，例如白蛋白为40-55g/L，球蛋白为20-30g/L，因此血液透析和非特异性配基的血液灌流对PTH的去除能力非常有限，并同时丢失了很多人体必需的其它分子，造成很大副作用。 

基于抗原抗体的高选择性相互作用，抗体技术目前已广泛应用于生物医学领域。卵黄抗体（Egg Yolk Immunoglobulin）是禽类体内存在的一种免疫球蛋白，能够经由蛋黄薄膜进入蛋黄中。IgY和哺乳动物IgG相比具有如下优势：（1）无需动物采血，获取方便；（2）稳定性好。具有耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力，在室温下，活性可保持6个月，4℃，6-7年活性仅下降5%左右;（3）不激活补体，不易引起人体过敏反应，具有很高的安全性。 

特异性IgY为配基制备的血液净化吸附剂能够利用抗原抗体亲和作用高效去除目标分子。迄今，未见利用IgY作为配基制备血液净化吸附剂清除人体内PTH的报道。基于此，本发明确定了一个以IgY为配基的适用于人血液中甲状旁腺激素特异性清除的吸附剂制备方法，形成下述内容。 

发明内容

本发明为克服目前利用血液净化去除PTH疗法的不足，即：（1）血液透析由于截留分子量的限制，对PTH的去除效果不理想；（2）血液灌流对PTH的去除能力非常有限且选择性低，治疗过程中同时丢失了很多人体必需的其它有益蛋白，造成很大副作用。发展了一种以特异性IgY为配基的选择性清除人甲状旁腺激素的血液净化吸附剂的制备 方法。该吸附剂能够有效清除慢性肾衰竭患者血清内的PTH，并具有物理化学性质稳定，对人体安全等优点。 

本发明的技术方案是： 

（1）人甲状旁腺激素的制备 

化学合成人甲状旁腺激素基因（PTH），在基因两端引入BamH Ⅰ和Nde Ⅰ酶切位点，双酶切连接插入pET23a中，并在大肠杆菌BL21（DE3）内进行表达。收集菌体，超声破碎，离心取上清，依次利用聚乙烯亚胺沉淀，硫酸铵沉淀，等电点沉淀，SP强阳离子交换纯化得到目标蛋白PTH。 

（2）PTH免疫亲和柱的制备 

取Sepharose CL-4B，加入环氧氯丙烷碱性溶液，反应1-2h。取清洗后的活化凝胶，加入己二胺溶液，用1mol/L NaOH调节pH=11-13，反应1-2h,硼酸缓冲液（0.15mol/L，pH8.2）清洗。取反应后的凝胶，加入一定量的戊二醛和硼酸缓冲液，反应1-2h。反应结束后用硼酸缓冲液清洗。取反应后的凝胶，加入PTH溶液，反应1-2h清洗后备用。 

（3）特异性IgY的制备 

150-160日龄蛋鸡初次免疫人PTH，每只鸡肌肉、皮下三点注射，两次免疫之间间隔2周，共计免疫3-4次。收集第四次免疫后鸡蛋，分离蛋黄，按1:4～1:10的比例加入双蒸水，1M HCl调节pH至5.0-5.2，4℃静置6-12h。依次利用盐析和免疫亲和纯化方法得到特异性IgY。 

（4）血液净化吸附剂的制备 

①活化。若用羰基二咪唑活化载体基质，羰基二咪唑加入量为0.1-0.3g/mL湿基质，15-30℃反应1-2h；若用环氧氯丙烷活化载体基质，环氧氯丙烷加入量为0.1-0.3mL/mL湿基质，15-30℃反应1-2h； 

②偶联配基。特异性IgY硼酸缓冲液与活化基质在15-30℃反应1-2h，清洗后备用。 

本发明吸附剂的固相载体可以是多种合适材料，包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖在内的多糖类天然高分子；经取代或未经取代的聚酰亚胺、聚乙烯醇在内的合成高分子材料等。本发明吸附剂的固相载体基质本身不应对蛋白质产生吸附，且应该具有良好的亲水性和血液相容性，不会造成凝血机制激活等不良反应。 

本发明的有益效果如下：相对于其它目前采用的血液净化方法，该吸附剂能表现出更高的PTH吸附选择性,在去除PTH的同时最大程度降低人体内有益分子的损失；该吸附剂以特异性IgY为配基，具有耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力；此外，IgY不与人类风湿因子结合，不激活补体，因而该吸附剂应用于人体内很少引起过敏反 应，具有很高的安全性。该血液净化吸附剂可用作血液净化吸附柱的填充材料，用于清除肾衰竭患者血浆中的甲状旁腺激素。 

附图说明

图1.甲状旁腺激素纯化后SDS-PAGE凝胶电泳结果，其中M为低分子量蛋白marker；泳道1为细胞破碎后上清；泳道2为PEI沉淀后上清；泳道3为硫酸铵沉淀后pH3.5溶液溶解后离心所得沉淀；泳道4为硫酸铵沉淀后pH3.5溶液溶解后离心所得上清；泳道5为SP强阳离子交换层析所得终产品。 

图2.特异性IgY纯化后SDS-PAGE凝胶电泳结果，其中M为低分子量蛋白marker；1为纯化后IgY。 

图3.纯化前后抗体效价对比。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。 

实施例1：甲状旁腺激素的重组表达与纯化 

（1）化学合成人甲状旁腺激素基因，在基因两端引入BamH Ⅰ和Nde Ⅰ酶切位点，双酶切连接插入pET23a中，目的片段转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取阳性转化单菌落接种到含有100mg/L青霉素的20mL LB液体培养基中，170r/min、37℃摇瓶培养活化过夜。然后取0.5mL活化菌液接种到含有100mg/L青霉素的50mL LB液体培养基中，170r/min、37℃摇瓶培养3h，加入诱导物异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，诱导后继续培养5h。 

（2）取一定量湿菌，加入5倍体积的裂解液（pH7.4，20mM PBS缓冲液，含60mM NaCl），摇匀后冰浴超声破碎10min。10000rpm离心5min，取上清并加入PEI溶液至终浓度达到0.1%，沉淀上清中的DNA，10000rpm离心5min，弃沉淀；加入pH7.4饱和硫酸铵溶液至终浓度50%,4℃放置15min，10000rpm离心5min；pH3.5，100mM柠檬酸缓冲液重悬沉淀，10000g离心5min，上清液调节pH至中性，4℃透析过夜；SP强阳离子交换层析精分离目标蛋白，A液：pH8.0，20mM PBS缓冲液；B液：pH8.0，20mM PBS缓冲液，含1M NaCl，线性梯度洗脱，收集目标蛋白。 

实施例2:PTH免疫亲和柱的制备 

（1）取一定量保存于20%乙醇溶液的琼脂糖凝胶Sepharose CL-4B，用单蒸水清洗数次除至凝胶中的乙醇成分完全去除。取5mL Sepharose CL-4B放置于50mL的三角瓶。将1mL环氧氯丙烷（EPI）加入到三角瓶中，再向其中加入一定量的2M NaOH溶液使其终浓度为0.4M。40℃，150rpm摇床反应2h。反应结束后用丙酮、蒸馏水各清洗5 次。 

(2)取环氧活化后的凝胶5mL，加入4mL水和1mL己二胺，用1M NaOH调节pH至13，50℃、150rpm摇床反应2h。反应结束后用硼酸缓冲液（0.15M，pH8.2）清洗5次。 

(3)取反应后的凝胶5mL，加入4mL上述硼酸缓冲液和1mL50%戊二醛，30℃、150rpm摇床反应2h。反应结束后用硼酸缓冲液清洗5次。 

(4)取反应后的凝胶5mL，加入5mL PTH蛋白硼酸缓冲液，30℃、150rpm摇床反应2h，用双蒸水清洗5次。 

（5）取反应后的凝胶5mL，加入5mL6%乙醇胺溶液（pH8.2），30℃、150rpm摇床反应2h，用双蒸水清洗5次备用。 

实施例3：特异性IgY的制备 

(1)挑选健康蛋鸡进行隔离饲养，160日龄初次免疫人PTH，首次免疫采用弗氏完全佐剂，跟踪免疫采用弗氏不完全佐剂，包括肌肉、皮下三点注射，两次免疫之间间隔2周，共计免疫4次。第四次免疫后开始收集鸡蛋。 

（2）使用蛋黄分离器分离蛋黄，量取蛋黄体积，按1:4～1:9的比例加入双蒸水，搅拌均匀，1M HCl调节pH至5.0，4℃静置8h。离心回收上清，加饱和硫酸铵至终浓度40%，PBS缓冲液溶解沉淀，再次加饱和硫酸铵至终浓度40%，收集沉淀。 

（3）取PTH免疫亲和柱，用PBS（0.02M，pH7.4，含1M NaCl）缓冲液平衡吸附柱。将待纯化IgY溶解于PBS（0.02M，pH7.4，含0.2M NaCl）缓冲液中,以100cm/h的流速上样，吸附饱和后，用PBS缓冲液洗脱杂蛋白，柠檬酸（0.1M，pH3.5）缓冲液作为洗脱液洗脱柱上吸附的特异性IgY，收集洗脱液。由图2SDS-PAGE分析可以看出经亲和纯化后IgY纯度高，未见其它明显杂蛋白。 

（4）利用间接ELISA法检测纯化前后IgY效价变化。PTH包被96孔板,4℃过夜,0.2%牛血清白蛋白封闭。一抗为将纯化前后的IgY稀释至相同浓度后进行梯度稀释（1×，5×，25×，125×，625×，3125×）的卵黄上清和纯化后抗体溶液（同时做空白、阴性及阳性孔对照)，二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgG。3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）为底物溶液显色，2M H₂S0₄溶液终止反应，酶标仪检测450nm的吸光值。由图3可以看出，在相同浓度情况下，经过纯化的IgY效价与纯化之前相比进一步提高。 

实施例4：制备特异性IgY为配基的交联琼脂糖吸附剂 

取琼脂糖凝胶Sepharose CL-4B5mL，置于锥形瓶中，加入0.1g CDI溶液5mL，反应1h。反应结束后用丙酮清洗，取活化后的凝胶，用硼酸缓冲液（0.15mol/L，pH8.2） 平衡，加入纯化后的特异性IgY硼酸缓冲液5mL，反应2h，清洗备用。 

实施例5：制备特异性IgY为配基的葡聚糖吸附剂 

取葡聚糖凝胶5mL，置于锥形瓶中，加入0.1g CDI溶液5mL，反应1h。反应结束后用丙酮清洗，取活化后的凝胶，用硼酸缓冲液（0.15mol/L，pH8.2）平衡，加入纯化后的特异性IgY硼酸缓冲液5mL，反应2h，清洗备用。 

实施例6：制备特异性IgY为配基的纤维素吸附剂 

取球形纤维素5mL，置于50mL的三角瓶，加入1mL环氧氯丙烷（EPI），再向其中加入一定量的2M NaOH溶液使其终浓度为0.3M，40℃，150rpm摇床反应1h，反应结束后用丙酮、单蒸水各清洗5次。取反应后的凝胶，加入IgY溶液5mL，30℃，150rpm摇床反应2h后清洗。 

实施例7：制备特异性IgY为配基的壳聚糖吸附剂 

取球形壳聚糖5mL，置于50mL的三角瓶，加入0.8mL环氧氯丙烷（EPI），再向其中加入一定量的2M NaOH溶液使其终浓度为0.2M，40℃，150rpm摇床反应2h，反应结束后用丙酮、单蒸水各清洗5次。取活化后的凝胶，用硼酸缓冲液（0.15mol/L，pH8.2）平衡，加入纯化后的特异性IgY硼酸缓冲液5mL，反应2h，清洗备用。 

实施例8：制备特异性IgY为配基的聚酰亚胺吸附剂 

取聚酰亚胺微球5mL，置于锥形瓶中，加入0.08g CDI溶液5mL，反应1h。反应结束后用丙酮清洗，取活化后的凝胶，用硼酸缓冲液（0.15mol/L，pH8.2）平衡，加入纯化后的特异性IgY硼酸缓冲液5mL，反应2h，清洗备用。 

实施例9：制备特异性IgY为配基的聚乙烯醇吸附剂 

取球形聚乙烯醇，置于50mL的三角瓶，加入1mL环氧氯丙烷（EPI），再向其中加入一定量的2M NaOH溶液使其终浓度为0.2M，40℃，150rpm摇床反应2h，反应结束后用丙酮、单蒸水各清洗5次。取活化后的凝胶，用硼酸缓冲液（0.15mol/L，pH8.2）平衡，加入纯化后的特异性IgY硼酸缓冲液5mL，反应2h，清洗备用。 

实施例10.吸附剂对人血清中PTH组分的吸附效果评价 

收集PTH阳性的人血清样品，混合后用于吸附剂性能评价。分别取按照实施例4-9合成的吸附剂用生理盐水冲洗3遍，称取0.2g吸附剂加入到盛有1mL血清材料与血清体积比例为1:5的样品瓶中，37℃温育2h。检测吸附前后血清样品中PTH浓度。具体结果如表1所示。 

评价结果表明，以特异性IgY为配基，使用不同材料作为固相载体制备的吸附剂对人血清中PTH均具有明显的清除效果，去除率在在35-60%之间。证明以特异性IgY为 配基，合适固相载体制成的血液净化吸附剂对患者血清中PTH去除的有效性。 

表1吸附剂对甲状旁腺激素的去除效果 

Claims (2)

1.一种特异性清除甲状旁腺激素的血液净化吸附剂的制备方法，其特征在于，吸附剂由固相载体基质和特异性IgY配基两部分组成，其中配基IgY通过以重组表达的人甲状旁腺激素为抗原免疫蛋鸡获取卵黄经免疫亲和纯化得到，并化学偶联固定到载体基质上；

所述的人甲状旁腺激素的制备方法为：

（1）人甲状旁腺激素的重组表达：化学合成人甲状旁腺激素基因，在基因两端引入BamH Ⅰ和Nde Ⅰ酶切位点，双酶切连接插入pET23a中，并在大肠杆菌BL21（DE3）内进行表达；

（2）人甲状旁腺激素的纯化：收集菌体，超声破碎，离心取上清，依次利用聚乙烯亚胺沉淀，硫酸铵沉淀，等电点沉淀，SP强阳离子交换层析纯化得到目标蛋白；

所述的特异性IgY的制备方法为：

（1）抗原制备与动物免疫：160日龄蛋鸡初次免疫人PTH，每只鸡肌肉、皮下三点注射，两次免疫之间间隔2周，共计免疫4次；

（2）卵黄抗体的提取和纯化：分离蛋黄，按1:4～1:10的比例加入双蒸水，1M HCl调节pH至5.0，4℃静置8h；依次利用盐析和免疫亲和纯化方法得到特异性IgY；

该吸附剂制备方法包括如下步骤：

（1）活化，若用羰基二咪唑活化载体基质，羰基二咪唑加入量为0.1-0.3g/mL湿基质，15-30℃反应1-2h；若用环氧氯丙烷活化载体基质，环氧氯丙烷加入量为0.1-0.3mL/mL湿基质，15-30℃反应1-2h，产物用蒸馏水洗涤；

（2）偶联配基，特异性IgY硼酸缓冲液与活化基质在15-30℃反应1-2h。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征还在于该血液净化吸附剂所使用的固相载体包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖在内的多糖类天然高分子；经取代或未经取代的聚酰亚胺、聚乙烯醇在内的合成高分子材料。

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