CN101185880A - 一种用于抗体清除的血液净化吸附剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学材料领域中一种用于抗体清除的血液净化吸附剂及其制备方法。血液净化吸附剂包括载体基质和配基两个部分，其中配基通过化学偶联固定在载体基质上，其特征在于采用苯甲酸分子作为血液净化吸附剂的固定化配基。血液净化吸附剂的制备方法是以琼脂糖等交联多糖作为载体基质，经过活化、接臂、偶联配基、后处理四个步骤制备此吸附剂材料。其优点在于：能够高载量地吸附血浆中的抗体组分，对血清白蛋白等其他血浆组分非特异性吸附有限，而且制备成本低、物理化学性质稳定。此材料可作为血液净化装置的吸附填料用于血浆中自身抗体和免疫复合物的清除。
Description
技术领域：
本发明涉及生物医学领域中用于抗体清除的血液净化吸附剂及其制备方法。
背景技术
自身抗体和免疫复合物已被证实与一系列疾病的产生和发展密切相关，如免疫反应(过敏，移植排斥)、自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮，类风湿等)，甚至于癌症。因此，临床上需要一种能够从人血液中选择性地清除自身抗体和循环免疫复合物的吸附剂，以缓解急性症状，遏制病情发展进而对疾病起到治疗作用。随着此类疾病尤其是自身免疫性疾病发病率的逐年提高，这种需求也越来越大。基于上述考虑，目前已有多家机构开发出不同性质的吸附剂材料，其中一些已经应用到临床。
应用于血液净化的吸附剂一般由两部分组成：作为吸附剂基质的高分子载体材料和利用化学交联固定在载体表面的配基分子，其中配基分子的结构和性质决定了吸附剂的作用效果。目前，临床中主要采用的两种用于抗体吸附的血液净化吸附剂分别以蛋白A和疏水氨基酸作为配基分子。
蛋白A是某些金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白组分，它对人类和其他哺乳动物的多种免疫球蛋白具有可逆的亲和作用，特别是对免疫球蛋白G(IgG)的Fc区具有较强的结合能力。同时，Phillips等人也发现蛋白A对循环免疫复合物(Circulating immune complexes)也具有较强的特异性相互作用(T.M.Phillips，Analytical Techniques inImmunochemistry；New York：Marcel Dekker，Inc.，1992，p.75)。目前，蛋白A作为一种典型的生物亲和配基已被用于临床中上述疾病患者体内自身抗体和免疫复合物的清除。Prosorba和Immunosorba(Fresenius，Germany)是两种目前应用最为广泛的蛋白A吸附剂，分别以硅胶和琼脂糖作为载体基质。国内也有同类产品(中国专利：99112880.X)。对于这一类采用蛋白A作为配基的吸附剂，其优点在于利用生物分子间天然的亲和作用，能够实现对目标分子的特异性识别，从而达到较高的吸附选择性。但其缺点在于蛋白A作为具有生物活性的蛋白质分子，需要从金黄色葡萄球菌或基因工程菌中获得，其生产成本很高。目前Prosorba吸附柱的市场价约为1000欧元，而一对可切换使用的Immunosorba吸附柱市场价约为10000欧元。同时，蛋白质配基在固定化和保存过程中不稳定，易失活；虽然能够再生，重复使用，但也存在难以在线清洗灭菌的问题和配基分子脱落的隐患。以上这些缺点限制了蛋白A免疫吸附剂在临床中的使用。
Noriko Hirata报道了两种分别采用苯丙氨酸和色氨酸作为吸附基团，固定在载体基质上，用作吸附血液中抗体类组分和免疫复合物的吸附剂材料(Noriko Hirata，ToshijiKuriyama，and Naokuni Yamawaki，Immusorba TR and PH；Therapeutic Apheresis andDialysis，2003，7(1)：85-90)。中国专利200410021373.3中也涉及一种利用组氨酸作为吸附基团的吸附剂材料。除此以外，亦有采用聚氨基酸作为吸附基团用在此领域的报道(中国专利03130403.6)。在吸附剂的设计合成中采用氨基酸，尤其是疏水性氨基酸作为吸附基团，以此替代蛋白A，是新一代血液净化吸附剂的特征之一。采用人工合成的小分子化合物基团的好处在于产品价格低廉，结构相对稳定。但是，采用什么样的化合物分子，以及如何提高小分子吸附基团的作用效果，是这一领域所面临的新问题。上述固定化小分子的吸附材料普遍存在的缺点在于吸附剂在实际病人血浆中对目标分子吸附容量不高。这是由所选用吸附基团的性质决定的。在Noriko Hirata的报道中(Noriko Hirata，Toshiji Kuriyama，and NaokuniYamawaki，Immusorba TR and PH；Therapeutic Apheresis and Dialysis，2003，7(1)：85-90)可以看到，吸附剂基于免疫球蛋白表面广泛分布的疏水位点和整体的正电性，在不溶性亲水载体上固定化有机小分子，利用其表面分布的负电基团和疏水基团两部分共同作用吸附抗体类分子和免疫复合物。这种吸附剂对人血清白蛋白等主要蛋白没有明显的吸附作用，但是问题在于带电基团弱化了疏水作用强度，使吸附剂与目的蛋白之间的作用力减弱，造成吸附容量不高，约7mg IgG/mL吸附剂，从而单次治疗效果不明显。
发明内容
本发明的目的和任务是要克服此领域现有技术所存在的问题：(1)蛋白A吸附剂价格高昂，病人购买一支国产吸附柱需要承担的费用高达3万元以上，适用范围有限；(2)以疏水氨基酸作为配基的吸附剂治疗效率不高，单柱清除抗体量约2.2g，治疗效果不明显。进而提出一种新型血液净化的吸附材料，它对血浆中的目标组分具有选择性的吸附作用，单位体积吸附剂对抗体的吸附容量能达到10mg以上；并具有化学和物理性质稳定，成本相对低廉的优点。特提出本发明：一种用于抗体清除的血液净化吸附剂。
本发明采用的技术方案是：
血液净化吸附剂是采用交联多糖作为多孔载体基质，以苯甲酸分子作为固定化配基；通过化学偶联固定在载体基质上的苯甲酸分子的偶合密度在1.0-2.6mmol/g干基质；多孔载体基质是球形颗粒，其胶孔透过分子量为150000-5000000。交联多糖选用琼脂糖。
本发明包括一种用于抗体清除的血液净化吸附剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
第一步，活化，用羰基二咪唑活化载体基质，反应在丙酮中进行，羰基二咪唑加入量为0.8-1.2g/10mL湿基质，15-30℃反应1-2h，产物用丙酮洗涤；
第二步，接臂，选用己二胺作为间隔臂，将其一端偶合到活化位点上，向羰基二咪唑活化的载体基质一丙酮等体积的悬液中添加5-10倍过量的己二胺，20-35℃反应2-3h，然后分别用丙酮和去离子水分多次反复清洗；
第三步，偶联配基，将苯甲酸共价键合到载体表面，反应条件为：把苯甲酸加入到体积比为1∶3的丙酮/2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液的混合体系中，其中2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液为0.1M溶解，pH4.5，加入活化接臂后的载体基质，用0.1M NaOH溶液调pH值为4.5-6.5，加入羧合剂1-乙基一3-(3-二甲氨丙基)-碳酰二亚胺，20-35℃反应3-4h，依次用去离子水、0.1M NaOH溶液、去离子水洗涤；
第四步，后处理，用pH10-13的NaOH溶液水解剩余咪唑。
本发明吸附剂的多孔载体基质可以是任何合适的材料，在一个实施方案中，载体由交联多糖材料构成，例如琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、壳聚糖等等。本发明吸附剂的载体基质应该具有良好的亲水性，基质本身不应对蛋白质产生吸附，同时，应具有良好的血液相容性，不会造成凝血机制激活等不良反应。因此，在本发明载体基质的一个具体的实施方案中，选用了交联琼脂糖凝胶。
本发明吸附剂的多孔载体基质是球形颗粒，它们需要有足够的通透性和相对稳定的空间结构，其胶孔的透过分子量最好在150,000到5,000,000。因为材料要吸附的目的分子中IgG的分子量为150,000，而免疫复合物，尤其是IgM免疫复合物分子量则要大得多。
本发明吸附剂的苯甲酸分子在多孔载体基质上的偶合密度最好在1mmol/g干基质到2.6mmol/g干基质之间，此数据以元素分析检测结果为准。本发明吸附剂的特点在于利用抗体类分子表面相对平坦，疏水位点小而分散的结构特征，所以对吸附基团的偶合密度有着特殊的要求，密度过低则作用强度不够，在中性溶液和生理盐浓度下吸附材料对血液中的自身抗体和免疫复合物之间很难产生有效的吸附；但另一方面，如果疏水性基团的偶合密度过大，则很容易导致血清白蛋白等其他血浆组分的过量吸附，从而影响吸附选择性和材料的血液相容性，严重的可能会引起机体的免疫反应。同时，亲水性吸附剂载体基质过量偶连疏水性化合物，会引起其空间网状结构的变化，孔隙减小，甚至结构坍塌。在一个具体的实施方案中，苯甲酸偶合密度达到2.1mmol/g干基质时，材料对人IgG的动态结合容量已经超过30mg/ml湿材料，但对HSA仍没有明显吸附作用，随密度增加结合容量并没有进一步增长，说明在此体系下吸附已达到饱和，但随着配基密度的增加，HSA的结合量有增高的趋势，故以此为依据确定偶合密度的上限。实验表明配基密度降低时，材料对IgG的结合容量呈下降趋势，当偶合密度降至1mmol/g干基质时，材料对IgG的动态结合容量降至17mg/mL，以此作为偶合密度的下限。
任何标准固定化方法都可以使用，参见例如Immobilized Affinity Ligand Techniques，Hermanson等，Academic Press，INP，1992和Bioconjugate Techniques，Greg T.HermansonAcademic Press，INP，1996。在本发明吸附剂的一个制备方案中，交联琼脂糖被选作载体基质，羰基二咪唑(CDI)用作活化试剂。本领域技术人员会发现当需要高密度活化多糖载体时，CDI活化是一种非常合适的方法，它能够很容易使活化密度达到3mmol/g干基质以上，而且反应快速，条件也不苛刻。未完全反应的CDI活化位点需要用水解的方式释放活性，否则很容易和蛋白质表面的氨基基团反应，造成非特异性的吸附，碱性条件会加速其活化位点基团的水解，优选pH12的NaOH溶液。
己二胺作为双功能团试剂，反应物不足量会增加发生交联反应的机率，同时出于节约的考虑，本合成方案中己二胺用量5-10倍摩尔数过量于活性基团数。
苯甲酸分子不溶于2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)，但能够溶于丙酮，本合成方案中采用丙酮作为苯甲酸的助溶剂，其用量加至1∶3的比例时能够全部溶解反应体系中的苯甲酸。
本发明采用苯甲酸分子作为血液净化吸附材料的吸附基团，它是一种价格低廉且性质稳定的小分子化合物。在吸附剂的合成设计中回避了静电作用，高密度活化亲水性多孔载体基质后在其表面偶合上疏水性吸附基团，呈空间网状结构。因为结构的特点，这种吸附剂对白蛋白几乎没有吸附作用，但对免疫球蛋白G的动态结合容量大于17mg/mL吸附剂。同时，对其他血浆组分非特异性吸附有限，而且制备成本低、性能相对稳定，可用作血液净化装置的吸附填料用作血浆中自身抗体和免疫复合物的清除，其优点在实施例部分的具体评价结果中将会得到进一步展现。
附表说明：表1苯甲酸吸附剂对类风湿因子的去除效果
本表纵向列出了8种不同的血清样品，在横向分别列出了此8种血清样品在经吸附剂处理前后类风湿因子的浓度，以及在此过程中单位体积吸附剂对类风湿因子的吸附容量和清除率。
具体实施方式
实施例1
取充分沉降(过夜)后体积为10mL的凝胶，用200mL无水丙酮分多次洗涤以除去胶内含水，然后把琼脂糖凝胶均匀分散在等体积的丙酮中，并保证整个体系无水。称取0.8gCDI与凝胶悬液混合，将所得混合物于15℃悬桨搅拌1小时。反应结束后，凝胶用200mL无水丙酮分多次清洗。得到带有咪唑氨基甲酸盐活性基团的交联琼脂糖凝胶，元素分析得到取代度为1.6mmol/g干胶，1g干胶折合35mL湿体积。
将10mL CDI活化的凝胶均匀分散在等体积的丙酮中，往凝胶体系中按5倍过量添加己二胺，将所得混合物于20℃悬桨搅拌2小时。反应结束后，分别用100mL无水丙酮，100mL去离子水分多次洗涤。得到带有己二胺的交联琼脂糖凝胶。
称取0.8g苯甲酸溶解于4mL丙酮中，继续向此溶液中添加6mL MES缓冲液。将pH4.610mL CDI活化后以己二胺接臂的凝胶抽干成湿饼状，加入到苯甲酸溶液中，混合均匀后用1M NaOH溶液调节体系pH到4.5，然后称取1g 1-乙基一3-(3-二甲氨丙基)-碳酰二亚胺(EDC)加入混合体系中20℃悬桨搅拌3小时。过滤反应混合物后，凝胶依次用50mL去离子，50mL0.1M NaOH溶液，50mL去离子水洗涤。将清洗干净的凝胶湿饼加入到50mL pH12的NaOH溶液中30℃摇床中130rmp震荡过夜。过滤反应混合物后，凝胶依次用50mL去离子，50mL1M NaCl溶液，50mL去离子洗涤。得到以苯甲酸作为吸附基团的交联琼脂糖凝胶吸附剂。元素分析其偶合密度为1mmol/g干胶。
实施例2
具体步骤同实施例1，区别在于CDI用量增至1.2g/10mL湿胶，活化反应在30℃进行2小时。活化结束后元素分析测得取代度为3.6mmol/g干胶。接臂反应时己二胺用量为10倍过量，接臂反应在35℃进行3小时，偶联苯甲酸时，反应在pH6.5的缓冲液中，35℃进行4小时。水解剩余咪唑活化基团时采用pH13的NaOH溶液。其产品经元素分析得偶合密度为2.6mmol/g干胶。
实施例3
具体步骤同实施例1，区别在于CDI用量为1.0g/10mL湿胶，活化反应在30℃进行1小时。活化结束后元素分析测得取代度为3.1mmol/g干胶。接臂反应时己二胺用量为10倍过量，接臂反应在30℃进行2.5小时，偶联苯甲酸时，反应在pH6.5的缓冲液中，30℃进行3小时。其产品经元素分析得偶合密度为2.1mmol/g干胶。
实施例4
具体步骤同实施例3，区别在于CDI用量为0.5g/10mL湿胶，活化结束后元素分析测得取代度为1.1mmol/g干胶。其产品经元素分析得偶合密度为0.75mmol/g干胶。
实施例5
具体步骤同实施例3，区别在于水解剩余咪唑活化基团时采用pH13.5的NaOH溶液。其产品经元素分析得偶合密度为1.5mmol/g干胶。
实施例6：偶合密度为2.6mmol/g干胶的苯甲酸吸附剂材料对IgG和HSA动态吸附容量的评价
为了测试本发明吸附剂材料对人免疫球蛋白的吸附能力，实验以人免疫球蛋白G(IgG)和人血清白蛋白(HSA)作为模型蛋白，在相同条件下分别检测了吸附剂材料对这两种血浆高丰度蛋白的动态结合容量。实验方法如下：用1mL吸附材料填充长径分别为30mm和6mm的玻璃层析柱，并将层析柱连入配套有恒流蠕动泵和紫外检测器的色谱系统，紫外检测器在280nm波长监测信号。用磷酸盐缓冲液(10mM，pH 7.4，0.154M NaCl)平衡层析柱，评价材料动态吸附容量时，IgG和HSA的上样蛋白浓度均为5mg/mL，50％流穿，流速为1mL/min。收集流穿液，分别检测蛋白浓度，对照上样前的蛋白量确定吸附材料分别对两种蛋白的动态吸附容量。
结果显示，在此评价条件下苯甲酸吸附剂材料对IgG的动态结合容量为31.6mg/mL湿材料，对HSA的动态结合容量为2.12mg/mL湿材料。
实施例7：偶合密度为2.1mmol/g干胶的苯甲酸吸附剂材料对IgG和HSA动态吸附容量的评价
具体操作步骤如实施例6，结果显示此材料对IgG的动态结合容量为30.2mg/mL湿材料，对HSA的动态结合容量为1.13mg/mL湿材料。
实施例8：偶合密度为1mmol/g干胶的苯甲酸吸附剂材料对IgG和HSA动态吸附容量的评价
具体操作步骤如实施例6，结果显示此材料对IgG的动态结合容量为17.25mg/mL湿材料，对HSA的动态结合容量为0.98mg/mL湿材料。
实施例9：蛋白A材料对IgG和HSA动态吸附容量的评价
具体操作步骤如实施例6，结果显示，相同条件下蛋白A吸附剂对IgG的动态结合容量为22.4mg/mL湿材料，对HSA的动态结合容量为1.55mg/mL湿材料。
实施例10：偶合密度为2.1mmol/g干胶的苯甲酸吸附剂材料对血浆中抗体类组分及白蛋白的动态吸附评价
用1mL吸附材料填充长径分别为30mm和6mm的玻璃层析柱，并将层析柱连入配套有恒流蠕动泵和紫外检测器的色谱系统，紫外检测器在280nm波长监测信号。用磷酸盐缓冲液(10mM，pH 7.4，0.154M NaCl)平衡层析柱，取5mL新鲜人血浆，以1mL/min的流速泵入血浆样品，流穿后收集未被吸附的血浆蛋白，检测样品中主要抗体组分和白蛋白含量变化以确定单位体积吸附材料的作用效果。
实验结果表明，在此模拟血浆循环的评价体系中，1mL湿体积的吸附材料对白蛋白的吸附量为3.62mg；对IgG的吸附量为18.06mg；对IgM的吸附量为2.3mg；对IgA的吸附量为3.98mg，此实验结果证明了苯甲酸吸附材料在血浆体系中对免疫球蛋白的吸附能力和选择性，尤其对IgG吸附量可观。
实施例11：偶合密度为1mmol/g干胶的苯甲酸吸附剂材料对血浆中抗体类组分及白蛋白的动态吸附评价
具体操作同实施例10，结果显示此材料在血浆中对白蛋白的吸附量为2.5mg；对IgG的吸附量为12.7mg；对IgM的吸附量为2.6mg；对IgA的吸附量为2.2mg。
实施例12：偶合密度为2.1mmol/g干胶的苯甲酸吸附材料对人血液中类风湿因子的清除
取8份类风湿因子(RF)超标的人血清样品，分别以1∶5的胶血比往血清样品中添加偶合密度为2.1mmol/g干胶的苯甲酸吸附剂，37℃摇床中温育120分钟，恒温摇床转速为130rpm。8000转离心10分钟，取上清液，分析样品中类风湿因子含量变化。结果如表1所示，苯甲酸吸附材料对血浆中的类风湿因子具有普遍的吸附能力。
附表：
表1 苯甲酸吸附剂对类风湿因子的去除效果
| 样品序号 | RF含量(IU/mL) | 去除率(％) | 单位体积吸附量(IU/mL吸附剂) | |
| 吸附前 | 吸附后 | |||
| 12345678 | 226197197117102385232294 | 15815414287.340.4349177159 | 30.121.827.925.460.49.423.745.9 | 340215275186385225275675 |
Claims (3)
1.一种由载体基质和配基组成用于抗体清除的血液净化材料，其特征在于血液净化吸附剂是采用交联多糖作为多孔载体基质，以苯甲酸分子作为固定化配基；通过化学偶联固定在载体基质上的苯甲酸分子的偶合密度在1.0-2.6mmol/g干基质；多孔载体基质是球形颗粒，其胶孔透过分子量为150000-5000000。
2.按照权利要求1所述的血液净化吸附剂，其特征在于所述的交联多糖选用琼脂糖。
3.一种按照权利要求1所述血液净化吸附剂的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：第一步，活化，用羰基二咪唑活化载体基质，反应在丙酮中进行，羰基二咪唑加入量为0.8-1.2g/10mL湿基质，15-30℃反应1-2h，产物用丙酮洗涤；
第二步，接臂，选用己二胺作为间隔臂，将其一端偶合到活化位点上，向羰基二咪唑活化的载体基质-丙酮等体积的悬液中添加5-10倍过量的己二胺，20-35℃反应2-3h，然后分别用丙酮和去离子水分多次反复清洗；
第三步，偶联配基，将苯甲酸共价键合到载体表面，反应条件为：把苯甲酸加入到体积比为1∶3的丙酮/2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液的混合体系中，其中2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液为0.1M溶解，pH4.5，加入活化接臂后的载体基质，用0.1M NaOH溶液调pH值为4.5-6.5，加入羧合剂1-乙基一3-(3-二甲氨丙基)-碳酰二亚胺，20-35℃反应3-4h，依次用去离子水、0.1MNaOH溶液、去离子水洗涤；
第四步，后处理，用pH10-13的NaOH溶液水解剩余咪唑。
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