CN102000550B - 一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法。公开了采用琼脂糖凝胶为载体，通过高碘酸盐氧化制备蛋白免疫吸附材料的方法，该方法用高碘酸盐对琼脂糖凝胶进行氧化，制备含醛基的琼脂糖凝胶，再将含醛基的琼脂糖凝胶与免疫球蛋白结合蛋白进行偶联，最后将材料进行封端，还原，或者不进行封端直接还原，即得免疫吸附血液净化材料。本发明具有工艺简单、环保、成本低等特点，同时产品的特异性、吸附性能、再生等性能优异，可实际用于临床上免疫吸附治疗。

Description

一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法

技术领域

本发明涉及一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法，属于生物医学材料及血液净化领域。

背景技术

免疫吸附(immunoadsorption，IA)疗法是近十五年来发展起来的一种新的血液净化技术，用于治疗一些传统方法难以奏效的疾病。其基本原理是先将抗原、抗体或一些具有特异性亲和力的物质作为配体与载体相连，制备成体外吸附柱，用于体外血液净化，利用其特异性吸附性能，选择性或特异性地清除患者血液中内源性致病因子，从而达到净化血液、缓解病情的目的。2001年，在英国伦敦召开了欧洲第一届免疫吸附研讨会,来自17个国家的200多位专家学者参加了会议，重点讨论了免疫吸附在风湿病、肾脏病、神经系统疾病、血液病和心血管疾病中应用的经验。免疫吸附治疗已成为一项重要的血液净化技术。

葡萄球菌蛋白A(SPA,简称蛋白A)是某些金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质，其分子量约为42KD。蛋白A可与人类及哺乳动物血液中的免疫球蛋白分子的Fc段结合，特别是免疫球蛋白G(IgG)及其免疫复合物特异性结合，具有高度的亲和力。因此通过化学方法将蛋白A连接于某一载体上制备成蛋白A免疫吸附柱，当人体血浆通过该吸附柱时，血浆中的抗体及其免疫复合物就会被特异性吸附而去除，因此一些因抗体及其免疫复合物导致的疾病与症状，如自身免疫性疾病、器官移植排斥反应、恶性肿瘤等即可得到治疗或缓解。蛋白A免疫吸附柱是目前临床上应用比较成功的一种免疫吸附疗法。对于蛋白A免疫吸附材料性能的影响因素，主要包括三个：载体、活化偶联方法及蛋白A的性能。载体方面，一般采用的载体基质主要是琼脂糖凝胶和硅胶，由于琼脂糖凝胶具有良好的生物相容性及多孔等特性而使用最为广泛。而蛋白A方面，多为研究蛋白A的特异性及亲和性能，同时在蛋白A耐温、耐酸碱性能也有较多研究，如Amersham Biosciences公司改变抗体结合蛋白上的某些氨基酸，可提高蛋白在pH13-14的化学稳定性[WO 03/08655]，GE公司将蛋白A上的不耐酸碱氨基酸换成耐酸碱的氨基酸，研究出能够耐1摩尔的碱的蛋白A，通过这样的蛋白A制备的免疫吸附材料具有便于清洗、多次使用、安全等优点[US20100048876]。

而在活化偶联方法上也有比较多的研究。目前临床上使用的蛋白A免疫吸附柱材料，一般采用的活化方法包括溴化氰、羰基咪唑、环氧氯丙烷等方法。这些方法都具有一定的局限性，如溴化氰活化方法中，使用的溴化氰为剧毒，合成过程中对人体和环境危害巨大，同时溴化氰方法偶联的蛋白容易脱落等缺点。而使用环氧氯丙烷活化方法，一般还要使用二胺、二醛过渡增加间隔臂，然后再偶联蛋白A，制备过程繁琐且二胺、二醛反应都会有交联副反应发生，同时由于胺与醛反应生成西弗碱(Schiff Base)，即有碳-氮双键的生成，使得材料具有颜色，因此还原过程中使用大量的还原剂，可能对蛋白A的性能具有影响。而且在还原过程中一般很难将其还原成白色，为还原的碳氮双键具有比较明显的非特异性吸附。同时，这种蛋白A材料在放置及使用一段时间，有颜色再变深的趋势，影响蛋白A吸附柱的性能。

同时，除了蛋白A，在免疫球蛋白结合蛋白中，还有蛋白G和蛋白L。这类蛋白是一类来源于细菌、能选择性吸附哺乳动物（包括人）的免疫球蛋白的蛋白分子。这类分子往往包含一定程度的重复序列（即同源片段），且结构简单、稳定性高，能与免疫球蛋白进行可逆结合等。这类蛋白的最大特点在于其对免疫球蛋白或抗体的选择性吸附作用，目前，蛋白A、蛋白G和蛋白L都已被开发成抗体吸附介质的功能分子，广泛应用于抗体纯化、制备和生产。特别是蛋白A，不仅已经开发出一系列的抗体吸附产品，更通过基因工程的方法，开发出耐强碱的重组蛋白A，为单克隆抗体药物的生产提高了强有力的纯化工具。但这三种蛋白的应用仍受到其本身的反应性范围所限，如对于Fab段和基因工程单链抗体scFv的纯化，蛋白A和蛋白G都显得无能为力。而嵌合体蛋白的优势将得到体现，较为典型的是BioVision公司开发的Protein AGL，这个重组体可吸附不同种属来源的几乎所有类型的免疫球蛋白，是纯化生产多克隆抗体、单克隆抗体以及基因工程抗体的理想工具。

除抗体纯化外，免疫球蛋白结合蛋白（Immunoglobulin-binding proteins, IBP）分子还被用于免疫吸附—一种通过去除体内抗体达到治疗目的的临床疗法[Matic, et al. Ther Apher. 2001; Samuelsson. J Clin Apher. 2001]。其中，蛋白A免疫吸附已被证明对多种疾病具有临床疗效，包括FDA批准的适应症：原发性血小板减少性紫癜（ITP）、难治性类风湿性关节炎（refractory RA）和血友病，以及标注外的适应症（即off-label，又称为非适应症使用，意为在非FDA批准的适应症中使用某疗法或药物，这种现象在许多药物和疾病治疗中都普遍存在。）：血栓性血小板减少性紫癜（TTP）和溶血性尿毒症综合征（HUS）。另外，还有很多种疾病，尽管仍缺乏足够的临床试验证据，但相当数量的研究文献显示，蛋白A免疫吸附对这些疾病的疗效令人期待，这包括：慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经根性神经病（CIDP）、重症肌无力（MG）、伴癌综合征、扩张性心肌病（DC）、系统性红斑狼疮（SLE）、急性进展性肾小球肾炎（RPGN）以及肾移植（降低抗体介导的超急性排斥反应的发生几率、抑制移植后的排斥反应等，以提高移植物的存活几率、延长移植物的存活时间）另一方面，蛋白A免疫吸附的临床安全性也已经得到确认，这种疗法被认为具有较好的临床耐受性[Snyder, et al.]。目前，经FDA批准上市的蛋白A免疫吸附产品有两种：SPA-silica Prosorba（Fresenius Medical Care公司生产）和SPA-Sepharose Immunosorba（Cobe BCT公司生产，2000年被Fresenius Medical Care公司收购）。1987年和1999年，Prosorba分别被FDA批准用于原发性血小板减少性紫癜和难治性类风湿性关节炎的治疗；1998年，Immunosorba被FDA批准用于血友病的治疗。

但除蛋白A外，目前仍未见以其他IBP分子或嵌合体作为功能分子的吸附介质用于临床免疫吸附治疗的报道。尽管如此，与蛋白A相比，蛋白G和蛋白L的抗体吸附性能仍具有一定的互补性，尤其是嵌合体蛋白，更表现出更高、更全面的抗体吸附性能，因此，随着免疫吸附技术的深入研究和临床应用的广泛开展，以蛋白G、蛋白L或嵌合体作为功能分子的吸附介质必将受到关注，相关产品的开发和临床应用也将受到重视而加速发展。

另外，在非常具有应用前景的以嵌合体蛋白（尤其是Protein LG、Protein LA和Protein AGL）为功能分子的吸附介质中，由于功能分子对免疫球蛋白的亲和力提高，导致抗体洗脱条件更为苛刻，如在pH2.0的条件下才能将90-95%结合于Protein LG的免疫球蛋白洗脱[Kihlberg, et al.]，这会是洗脱下来的抗体更不稳定而不利于抗体活性的保留；同时，由于IBP分子在过低的pH条件下会变得不稳定，容易发生降解并脱落，而这对于抗体纯化生产和免疫吸附治疗均是不可忽视的潜在危害因素。因此，分别制备以蛋白A、蛋白G和蛋白L为功能分子的吸附介质，再以合适的比例形成混合体，在提高吸附性能的同时，避免了苛刻洗脱条件的使用，这可能是综合利用不同IBP分子的抗体吸附性能的更为可行的途径。

本发明采用高碘酸盐直接对琼脂糖进行氧化，然后与免疫球蛋白结合蛋白进行偶联，因此制备过程简单，基本不使用有机溶剂及有机反应试剂，利于实际生产以及对环境友好等优点。同时，环氧氯丙烷活化方法由于使用二胺、二醛过渡，使用二醛产生高度交联使得材料颜色很深，很难还原以及还原时使用还原剂对蛋白的影响，而高碘酸盐活化方法因无交联，因而材料的颜色基本与琼脂糖颜色基本一致，且颜色不随使用过程而变深。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法。本发明具有工艺简单、产品性能优异、成本低等特点。

本发明所采用的技术方案是：

一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法，它包括如下步骤：

1) 用高碘酸盐溶液直接对琼脂糖凝胶进行氧化，制备含醛基的琼脂糖凝胶；

2) 将步骤1所得含醛基的琼脂糖凝胶与免疫球蛋白结合蛋白进行偶联；

3) 将步骤2所得材料进行封端，然后用还原剂还原。

步骤1所述高碘酸盐为高碘酸钠、高碘酸钾或两者的混合溶液。

更为具体地，包括如下步骤：

1) 称取高碘酸钠或高碘酸钾，加入水溶解配制成溶液，然后加入洗涤干净的琼脂糖凝胶混匀，最好于避光的条件下，通过搅拌或摇床进行反应，然后用大量水洗涤，或者可以用乙二醇溶液浸泡，除去未反应的高碘酸钠或高碘酸钾，然后再用水洗涤干净，抽干得到含醛基的琼脂糖凝胶；

2) 将含醛基的琼脂糖凝胶与免疫球蛋白结合蛋白溶液按比例混匀，然后通过搅拌或摇床进行偶联，反应结束后，用少量水多次洗涤，收集洗涤液可测试未反应的免疫球蛋白结合蛋白的量，从而通过投料和未反应的免疫球蛋白结合蛋白，可以计算琼脂糖凝胶上偶联的免疫球蛋白结合蛋白的量；

3) 将步骤2制备的材料在缓冲溶液中，加入封端剂进行封端，然后再加入还原剂进行还原，最后用大量水洗涤干净，即得免疫吸附血液净化材料。

本发明中高碘酸盐溶液浓度为0.05-0.4摩尔/升，优选0.05-0.2。琼脂糖凝胶与高碘酸盐溶液的质量比为1:0.5-1:5，优选1:0.8-1:2，氧化温度为4-50℃，优选20-40℃，氧化时间1-10小时，优选2-5小时。

本发明所采用的免疫球蛋白结合蛋白包括：蛋白A、蛋白G、蛋白L或三者的任意比混和，所述的蛋白A、蛋白G、蛋白L都包括天然的和基因重组的蛋白A、蛋白G、蛋白L，由于蛋白A在血液净化领域应用最广，因此优选蛋白A。

本发明也可以通过先分别制备以蛋白A、蛋白G和蛋白L的免疫吸附血液净化材料，再以三者的任意比混合。这种混合可以先测试蛋白A、蛋白G、蛋白L三种免疫吸附血液净化材料的性能，再根据性能选择更优的混合比例。

在步骤1制得的含醛基的琼脂糖与免疫球蛋白结合蛋白进行偶联时，免疫球蛋白结合蛋白溶液的浓度为0.5-30mg/ml，优选2-15 mg/ml，含醛基的琼脂糖与免疫球蛋白结合蛋白溶液的质量比为1:0.5-1:50，优选质量比为1:0.8-1:10，免疫球蛋白结合蛋白水溶液的pH值为4-11，优选pH值6-9，一般指在缓冲液中， 偶联温度为4-90℃，优选偶联温度20-40℃，偶联时间为0.5-48小时，优选偶联时间0.5-12小时。

在本发明的合成方法中，对材料进行封端，可采用乙醇胺或甘氨酸乙酯进行封端，其加入量为已经与免疫球蛋白结合蛋白偶联的凝胶的质量的0.001-0.5倍，优选0.01-0.2倍，封端时间为0.5-3小时，优选0.5-1小时。本发明中，也可以不对材料进行封端处理，由于高碘酸盐氧化琼脂糖凝胶后，生成醛基，封端后变成羟基或者酯基，同时生产双键需要还原。而醛基直接还原后即为羟基，因此不用封端仍然可以得到令人满意的效果。

在本发明的合成方法中，所使用的还原剂优选为硼氢化钠或氰基硼氢化钠，加入量为已封端或未经封端的凝胶质量的0.001-0.5倍，优选0.001-0.25倍，还原时间为2-24小时，优选8-12小时。还原剂主要还原醛基与免疫球蛋白结合蛋白、封端剂反应生成的双键，或者未封端的醛基，使这些双键变成单键，以提高血液净化材料的稳定性，如耐酸碱、耐热等性能。

本发明的主要原理为：通过具有氧化性的高碘酸盐，氧化琼脂糖凝胶多糖环上的邻二醇，环开环产生醛基，醛基易于与蛋白上的氨基进行反应，然后通过还原剂再对其进行还原，即可得到性能优异的血液净化材料。本发明可实际用于生物、医药中抗体的纯化，同时，如果控制整个过程中无菌无热原条件下进行合成，可用于临床血液净化领域进行免疫吸附治疗。

基于以上叙述，本发明的显著优势和效果是：

1、整个方法过程简单，都是在水相中进行，基本不使用有机溶剂及有机反应试剂，因此制备过程环境友好，同时也有利于大规模生产。

2、本发明避免了采用溴化氰等剧毒的活化方法。

3、现有技术中环氧氯丙烷活化方法由于使用二胺、二醛过渡，使用二醛产生高度交联使得材料颜色很深，很难还原以及还原时使用还原剂对免疫球蛋白结合蛋白的影响，而高碘酸钠活化方法因无交联，因而材料的颜色基本与琼脂糖颜色基本一致，且颜色不随使用过程而变深。

4、本发明中，所得到的产品没有间隔臂，因此基本不会因间隔臂而产生非特异性吸附。

5、本发明不仅涉及目前应用广泛的蛋白A免疫吸附材料，同时还涉及蛋白G、蛋白L以及蛋白A、蛋白G、蛋白L三者的混合体等吸附材料，蛋白G、蛋白L等吸附材料具有潜在的应用价值。

具体实施方式

 以下详述本发明的实施例。应理解的是，本发明的实施例用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质而进行的改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：

1) 将200克琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)用10倍左右的水洗涤干净，洗去用于保存的乙醇，然后与4倍质量的0.05 mol/L的高碘酸钠溶液混合，于避光的条件下，30℃下反应3小时，然后用大量水洗涤，得到含有醛基的琼脂糖凝胶；

2) 将含醛基的琼脂糖凝胶与蛋白A溶液混合，蛋白A溶液的量为含醛基琼脂糖凝胶的质量的1倍，在pH 8.4的硼酸盐缓冲液中，蛋白A溶液浓度为4 mg/ml，于30℃下反应4小时，然后用大量水洗涤，得到偶联蛋白A的琼脂糖凝胶；

3) 将偶联蛋白A的琼脂糖凝胶，加入2倍的pH 7.6的磷酸盐缓冲液中，加入0.001倍质量的乙醇胺封端，于30℃封端1小时，然后分3次加入0.001倍质量的硼氢化钠进行还原，还原12小时；

最后将制备好的蛋白A材料用大量水洗涤，再用0.05 %的NaN₃进行保存即可。

实施例2：

1) 将200克琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)用10倍左右的水洗涤干净，洗去用于保存的乙醇，然后与0.5倍质量的0.4 mol/L的高碘酸钠溶液混合，于避光的条件下，40℃下反应3小时，然后用大量水洗涤，得到含有醛基的琼脂糖凝胶；

2) 将含醛基的琼脂糖凝胶与蛋白A溶液混合，蛋白A溶液的量为含醛基琼脂糖凝胶的质量的2倍，在pH 11的碳酸盐缓冲液中，蛋白A溶液浓度为3 mg/ml，于30℃下反应4小时，然后用大量水洗涤，得到偶联蛋白A的琼脂糖凝胶；

3) 将偶联蛋白A的琼脂糖凝胶，加入2倍的pH 7.6的磷酸盐缓冲液中，加入0.5倍质量的乙醇胺封端，于30℃封端1小时，然后分3次加入0.001倍质量的硼氢化钠进行还原，还原24小时；

最后将制备好的蛋白A材料用大量水洗涤，再用0.05 %的NaN₃进行保存即可。

实施例3：

1) 将200克琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)用10倍左右的水洗涤干净，洗去用于保存的乙醇，然后与2倍质量的0.2 mol/L的高碘酸钾溶液混合，于避光的条件下，30℃下反应5小时，然后用大量水洗涤，得到含有醛基的琼脂糖凝胶；

2) 将含醛基的琼脂糖凝胶与蛋白A溶液混合，蛋白A溶液的量为含醛基琼脂糖凝胶质量的4倍pH 4的醋酸盐缓冲液中，浓度为2 mg/ml，于40℃下反应8小时，然后用大量水洗涤，得到偶联蛋白A的琼脂糖凝胶；

3) 将偶联蛋白A的琼脂糖凝胶，加入2倍的pH 7.6的磷酸盐缓冲液中，加入0.001倍质量的甘氨酸乙酯封端，于30℃封端1小时，然后分3次加入0.02倍质量的硼氢化钠进行还原，还原24小时；

最后将制备好的蛋白A材料用大量水洗涤，再用0.05 %的NaN₃进行保存即可。

实施例4：

1) 将200克琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)用10倍左右的水洗涤干净，洗去用于保存的乙醇，然后与5倍质量的0.1 mol/L的高碘酸钠溶液混合，于避光的条件下，10℃下反应8小时，然后用大量水洗涤，得到含有醛基的琼脂糖凝胶；

2) 将含醛基的琼脂糖凝胶与蛋白G溶液混合，蛋白G溶液的量为含醛基琼脂糖凝胶的质量的2倍pH 7.6的磷酸盐缓冲液中，浓度为8 mg/ml，于30℃下反应10小时，然后用大量水洗涤，得到偶联蛋白G的琼脂糖凝胶；

3) 将偶联蛋白G的琼脂糖凝胶，加入2倍的pH 7.6的磷酸盐缓冲液中，加入0.01倍质量的乙醇胺封端，于30℃封端1小时，然后分3次加入0.001倍质量的硼氢化钠进行还原，还原8小时；

最后将制备好的蛋白G材料用大量水洗涤，再用0.05 %的NaN₃进行保存即可。

实施例5：

1) 将200克琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)用10倍左右的水洗涤干净，洗去用于保存的乙醇，然后与2倍质量的0.3 mol/L的高碘酸钾溶液混合，于避光的条件下，30℃下反应2小时，然后用大量水洗涤，得到含有醛基的琼脂糖凝胶；

2) 将含醛基的琼脂糖凝胶与蛋白L溶液混合，蛋白L溶液的量为含醛基琼脂糖凝胶的质量的4倍pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，浓度为2 mg/ml，于30℃下反应8小时，然后用大量水洗涤，得到偶联蛋白L的琼脂糖凝胶；

3) 将偶联蛋白L的琼脂糖凝胶，加入2倍的pH 7.6的磷酸盐缓冲液中，加入0.5倍质量的甘氨酸乙酯封端，于30℃封端1小时，然后分3次加入0.05倍质量的硼氢化钠进行还原，还原12小时；

最后将制备好的蛋白L材料用大量水洗涤，再用0.05 %的NaN₃进行保存即可。

实施例6：

1) 将200克琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)用10倍左右的水洗涤干净，洗去用于保存的乙醇，然后与4倍质量的0.2 mol/L的高碘酸钠溶液混合，于避光的条件下，30℃下反应5小时，然后用大量水洗涤，得到含有醛基的琼脂糖凝胶；

2) 将含醛基的琼脂糖凝胶与蛋白A溶液混合，蛋白A溶液的量为含醛基琼脂糖凝胶的质量的0.5倍pH 6.0的磷酸盐缓冲液中，浓度为30 mg/ml，于90℃下反应0.5小时，然后用大量水洗涤，得到偶联蛋白A的琼脂糖凝胶；

3) 将偶联蛋白A的琼脂糖凝胶，加入2倍的pH 7.6的磷酸盐缓冲液中，无需封端，然后分3次加入0.05倍质量的硼氢化钠进行还原，还原10小时；

最后将制备好的蛋白A材料用大量水洗涤，再用0.05 %的NaN₃进行保存即可。

实施例7：

1) 将200克琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)用10倍左右的水洗涤干净，洗去用于保存的乙醇，然后与4倍质量的0.1 mol/L的高碘酸钠溶液混合，于避光的条件下，40℃下反应2小时，然后用大量水洗涤，得到含有醛基的琼脂糖凝胶；

2) 将含醛基的琼脂糖凝胶与免疫球蛋白结合蛋白溶液混合，免疫球蛋白结合蛋白溶液中蛋白A、蛋白G、蛋白L的质量比为1:1:1， 蛋白溶液的量为含醛基琼脂糖凝胶的质量的1倍pH 7.6的磷酸盐缓冲液中，蛋白溶液中蛋白的总浓度为8 mg/ml，于30℃下反应8小时，然后用大量水洗涤，得到偶联免疫球蛋白结合蛋白的琼脂糖凝胶；

3) 将偶联免疫球蛋白结合蛋白的琼脂糖凝胶，加入2倍的pH 7.6的磷酸盐缓冲液中，加入0.01倍质量的乙醇胺封端，于30℃封端1小时，然后分3次加入0.05倍质量的硼氢化钠进行还原，还原12小时；

最后将制备好的血液净化材料用大量水洗涤，再用0.05 %的NaN₃进行保存即可。

实施例8：

1) 将200克琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)用10倍左右的水洗涤干净，洗去用于保存的乙醇，然后与5倍质量的0.1 mol/L的高碘酸钾溶液混合，于避光的条件下，4℃下反应48小时，然后用大量水洗涤，得到含有醛基的琼脂糖凝胶；

2) 将含醛基的琼脂糖凝胶与蛋白A溶液混合，蛋白A溶液的量为含醛基琼脂糖凝胶的质量的50倍pH 9.0的硼酸盐缓冲液中，浓度为0.5 mg/ml，于30℃下反应5小时，然后用大量水洗涤，得到偶联蛋白A的琼脂糖凝胶；

3) 将偶联蛋白A的琼脂糖凝胶，加入2倍的pH 7.6的磷酸盐缓冲液中，无需封端，然后分3次加入0.05倍质量的硼氢化钠进行还原，还原10小时；

最后将制备好的蛋白A材料用大量水洗涤，再用0.05 %的NaN₃进行保存即可。

实施例9：

1) 将200克琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)用10倍左右的水洗涤干净，洗去用于保存的乙醇，然后与4倍质量的0.2 mol/L的高碘酸钠溶液混合，于避光的条件下，50℃下反应1小时，然后用大量水洗涤，得到含有醛基的琼脂糖凝胶；

2) 将含醛基的琼脂糖凝胶与蛋白A溶液混合，蛋白A溶液的量为含醛基琼脂糖凝胶的质量的1倍pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，浓度为6 mg/ml，于30℃下反应5小时，然后用大量水洗涤，得到偶联蛋白A的琼脂糖凝胶；

3) 将偶联蛋白A的琼脂糖凝胶，加入2倍的pH 7.6的磷酸盐缓冲液中，无需封端，然后分3次加入0.05倍质量的硼氢化钠进行还原，还原10小时；

最后将制备好的蛋白A材料用大量水洗涤，再用0.05 %的NaN₃进行保存即可。

实施例10：

1) 将200克琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)用10倍左右的水洗涤干净，洗去用于保存的乙醇，然后与4倍质量的0.2 mol/L的高碘酸钠溶液混合，于避光的条件下，20℃下反应8小时，然后用大量水洗涤，得到含有醛基的琼脂糖凝胶；

2) 将含醛基的琼脂糖凝胶与蛋白A溶液混合，蛋白A溶液的量为含醛基琼脂糖凝胶的质量的3倍pH 8.4的硼酸盐缓冲液中，浓度为2 mg/ml，于30℃下反应5小时，然后用大量水洗涤，得到偶联蛋白A的琼脂糖凝胶；

3) 将偶联蛋白A的琼脂糖凝胶，加入2倍的pH 7.6的磷酸盐缓冲液中，无需封端，然后分3次加入0.05倍质量的硼氢化钠进行还原，还原10小时；

最后将制备好的蛋白A材料用大量水洗涤，再用0.05 %的NaN₃进行保存即可。

实施例11：

基本同实施例1，不同之处在于，采用0.05 mol/L的高碘酸钠溶液和0.05 mol/L的高碘酸钾溶液两种溶液进行混合，然后再进行氧化，高碘酸钠溶液和高碘酸钾溶液两者的质量为1:1。

实施例12：

基本同实施例1，不同之处在于，采用乙醇胺和甘氨酸乙酯混合进行封端，乙醇胺和甘氨酸乙酯两者的质量为1:1。

氰基硼氢化钠

实施例13：

基本同实施例1，不同之处在于，采用硼氢化钠和氰基硼氢化钠混合进行还原，硼氢化钠和氰基硼氢化钠两者的质量为1:1。

实施例14：

根据实施例1、4、5分别制备的蛋白A、蛋白G、蛋白L三种血液净化材料，然后再将三种血液净化材料按质量1:1:1（各50克）混合制得血液净化材料。

性能测试

本发明制备的血液净化材料，主要用于吸附人体血浆中的免疫球蛋白以及其复合物等致病因子，以治疗因免疫球蛋白等引起的自身免疫性疾病、器官移植等疾病。因此，检测其对免疫球蛋白的吸附性能至关重要，为了检测合成的免疫吸附材料性能，通过模拟临床上免疫吸附的步骤，采用体外对血浆内免疫球蛋白吸附性能测试，以此来评价免疫吸附材料的吸附性能，进而可以了解其临床使用价值，具体步骤如下：

先将制备的血液净化材料用大量水洗涤干净，抽干至恒重，然后称取3g血液净化材料，约4.5 ml，装入层析住中，然后分别用pH7.4的平衡液平衡8分钟，pH值2.5洗脱液洗脱5分钟，然后再用平衡液平衡6分钟，加入25ml血浆，过完血浆后，然后用平衡液冲洗掉未结合的其它蛋白，约15分钟左右，然后用pH值2.5的洗脱液洗脱，收集洗脱峰立即加入Tris（三羟甲基氨基甲烷）中和，然后通过紫外测试结合的免疫球蛋白。

这里按照上述方法对实施例1、2、3制备的吸附剂一、吸附剂二、吸附剂三进行检测，检测结果如下（三种吸附分别是实施例1、2、3制得，第二栏是每克吸附剂中蛋白A的投料量，第三栏为每克吸附剂对血浆中免疫球蛋白的吸附量）：

吸附剂一、吸附剂二、吸附三都是蛋白A免疫吸附材料，三种免疫吸附材料根据上述测试步骤进行检测，计算所得其对免疫球蛋白的吸附量都可以达到30mg/g以上，目前国内外蛋白A免疫吸附材料的吸附性能大约为27mg/g左右，考虑到合成方法中可能对不同蛋白A活性、蛋白A偶联上的量有关，采用环氧氯丙烷合成方法，蛋白A投料量为4mg/g做对比，其吸附量也只能达到26mg/g左右，而本发明方法可以达到30mg/g，同时所得吸附材料颜色浅，批间差异小等优点。因此可以看出，通过本方法制备的吸附剂，方法简单，步骤短，基本不使用有机试剂，利于大规模生产，同时所得吸附材料性能优异，吸附性能稳定，对免疫球蛋白吸附量高等优点，适用于血液净化领域。

Claims (10)

1.一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法，其特征在于它包括如下步骤：

1) 用高碘酸盐溶液直接对琼脂糖凝胶进行氧化，制备含醛基的琼脂糖凝胶；

2) 将步骤1所得含醛基的琼脂糖凝胶与免疫球蛋白结合蛋白进行偶联；

3) 将步骤2所得材料进行封端，然后用还原剂还原。

2.根据权利要求1所述的一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法，其特征在于步骤1所述高碘酸盐为高碘酸钠、高碘酸钾或两者的混合物。

3.根据权利要求2所述的一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法，其特征在于所述的高碘酸盐溶液浓度为0.05-0.4摩尔/升，琼脂糖凝胶与高碘酸盐溶液的质量比为1:0.5-1:5，氧化温度为4-50℃，氧化时间1-10小时。

4.根据权利要求1所述的一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法，其特征在于步骤2所述的免疫球蛋白结合蛋白包括蛋白A、蛋白G、蛋白L或三者的任意比混和。

5.根据权利要求1所述的一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法，其特征在于步骤2所述的含醛基的琼脂糖与免疫球蛋白结合蛋白进行偶联时，免疫球蛋白结合蛋白溶液的浓度为0.5-30mg/ml，免疫球蛋白结合蛋白水溶液的pH值为4-11，含醛基的琼脂糖与免疫球蛋白结合蛋白溶液的质量比为1:0.5-1:50，偶联温度为4-90℃，偶联时间为0.5-48小时。

6.根据权利要求5所述的一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法，其特征在于免疫球蛋白结合蛋白水溶液的浓度为2-15 mg/ml，pH值为6-9，含醛基的琼脂糖与免疫球蛋白结合蛋白溶液的质量比为1:0.8-1:10，偶联温度为4-30℃，偶联时间为0.5-12小时。

7.根据权利要求1所述的一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法，其特征在于步骤3所述封端反应是采用选自乙醇胺、甘氨酸乙酯或两者混合剂进行封端。

8.根据权利要求7所述的一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法，其特征在于所述的封端剂的加入量为已经与免疫球蛋白结合蛋白偶联的凝胶的质量的0.001-0.5倍，封端时间为0.5-3小时。

9.根据权利要求1所述的一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法，其特征在于所述的还原剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠或两者混合剂。

10.根据权利要求9所述的一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法，其特征在于所述的还原剂的加入量为经封端的凝胶质量的0.001-0.5倍，还原时间为2-24小时。