CN111659355B - 烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂及其制备方法。该烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂包括活化的吸附载体以及与活化的吸附载体偶联结合的烷基化修饰的乙肝病毒抗体，所述烷基化修饰是在所述乙肝病毒抗体与所述活化的吸附载体偶联后进行，用于修饰所述乙肝病毒抗体中的巯基。其制备方法首先将活化的吸附载体与乙肝病毒抗体进行偶联，然后对乙肝病毒抗体中的巯基进行烷基化修饰，最后进行还原处理，得到烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂。本发明通过对偶联后的乙肝病毒抗体进行烷基化修饰，能够得到吸附效率高、特异性好且可再生性好的乙肝病毒免疫吸附剂，增强了临床使用中的可操作性和重复利用率，进而降低了生产和使用成本。

Description

烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学吸附材料技术领域，尤其涉及一种烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂及其制备方法。
背景技术
慢性乙型病毒性肝炎是由于感染乙型肝炎病毒(HBV)引起的，乙型肝炎患者和HBV携带者是本病的主要传染源，HBV可通过母婴、血液、血液制品、破损的皮肤黏膜以及性接触等传播。目前，我国乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带者超过1.3亿，其中约10％转化为各种慢性肝炎，最终转化为肝硬化甚至肝癌，给社会带来了巨大的经济负担。目前乙型肝炎的治疗主要是通过药物，如干扰素、拉米夫定、胸腺肽等，但是由于HBV致病机理及人体免疫系统的高度复杂性，加之HBV在慢性乙型肝炎患者体内持久存在、复制和变异，不能彻底被人类免疫系统和药物清除，通常使肝脏病变持续发生，另外现有的治疗手段还存在毒副作用大治疗费用高的缺点。
血液中的毒蛋白是乙型肝炎的主要致病因子，因此如果能够降低甚至清除血液中的毒蛋白及相关标志物，对早期HBV急性感染、肝脏移植患者及慢性乙型肝炎患者都具有重要的治疗意义。免疫吸附疗法是近20年来发展起来的一种新技术，它将高度特异性的抗原、抗体或某些具有特定物理化学亲和力的物质(配体)与吸附材料(载体)结合，制成吸附剂(柱)。利用配体的特异性吸附性能，选择性或相对特异性地清除患者血液中内源性致病因子，达到缓解病情的目的。合成的吸附剂要求具有高吸附效率和低的非特异性吸附，因此配基和载体的选择、配基和载体的结合方式、偶联条件、配基的活性等对吸附剂的性能都有重要影响。
例如，中国专利CN102000550B公开了一种高碘酸盐氧化制备用于清除治病抗体吸附剂的合成方法，该方法采用琼脂糖凝胶为载体，氧化后与免疫球蛋白进行偶联，最后再进行封端、还原，得到用于清除治病抗体的吸附剂。中国专利CN103111270B公开了一种乙型肝炎抗原蛋白的吸附材料及其制备方法，是以钠离子牛磺胆酸共转运多肽作为配基对乙肝病毒进行吸附，该钠离子牛磺胆酸共转运多肽采用细菌表达体系表达，在一定程度上对乙肝病毒有特异结合能力，但原核细菌表达的蛋白在蛋白剪切、修饰和构象折叠方面理论上无法达到真核细胞表达的蛋白的水平，因此，对乙肝病毒的特异结合能力有一定的限制。中国专利CN104772121A公开了一种乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法，该方法利用氨基酸处理连接了配基的吸附微球，使配基结合更牢固，降低了乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂脱落的几率和速率，提高了应用安全性。中国专利CN1431025A公开了一种血液内乙型肝炎病毒免疫吸附柱，是将有效量的乙型肝炎病毒的特异性抗体的Fc端键合于经环氧化、氨基化和醛基化的琼脂糖凝胶颗粒上制备而成。
上述吸附材料的制备过程，一般都需要经过吸附载体的活化、偶联、封端和还原等过程，偶联配体尤其是抗体蛋白在经此一系列反应后，其结构及活性均可能会受到不同程度的影响，如发生二硫键的还原或构象的转变，导致抗体蛋白出现较多的游离巯基，进而影响免疫球蛋白的特异性吸附能力。
由于以上问题的存在，针对于乙肝病毒，目前还没有可应用的免疫吸附产品。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂及其制备方法，通过对偶联后的乙肝病毒抗体蛋白进行烷基化修饰，封闭游离巯基，从而获得吸附效率高、特异性好且可再生性好的乙肝病毒免疫吸附剂。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案实现：
一种烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂，包括活化的吸附载体以及与所述活化的吸附载体偶联结合的烷基化修饰的乙肝病毒抗体，所述烷基化修饰是在所述乙肝病毒抗体与所述活化的吸附载体偶联结合后进行，用于修饰所述乙肝病毒抗体中的游离巯基。
进一步的，所述烷基化修饰的试剂包含但不限于为碘乙酰胺、碘乙酸、氯乙酰氨、N-乙基马来酰亚胺中的一种或多种。
进一步的，所述活化的吸附载体包含但不限于为含醛基的琼脂糖凝胶、纤维素凝胶和聚乙烯醇凝胶中的一种或多种。
一种以上所述的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备得到能与乙肝病毒抗体进行偶联反应的活化的吸附载体；
S2.将步骤S1得到的所述活化的吸附载体与乙肝病毒抗体进行偶联反应，得到偶联有乙肝病毒抗体的吸附载体；
S3.将步骤S2得到的所述偶联有乙肝病毒抗体的吸附载体加入到烷基化试剂的溶液中，进行乙肝病毒抗体中巯基的烷基化修饰；
S4.对烷基化修饰后的偶联有乙肝病毒抗体的吸附载体进行还原处理，即得到烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂。
进一步的，在步骤S3中，所述烷基化修饰的试剂包含但不限于为碘乙酰胺、碘乙酸、氯乙酰氨、N-乙基马来酰亚胺中的一种或多种；所述烷基化试剂的溶液的浓度为0.02～0.2％g/mL。
进一步的，在步骤S3中，所述偶联有乙肝病毒抗体的吸附载体与烷基化试剂的溶液的质量体积比为1g：1～3mL。
进一步的，在步骤S3中，所述烷基化修饰温度为4～30℃，时间为15～60min。
优选地，在步骤S3中，所述烷基化修饰温度为25℃，时间为45min。
进一步的，在步骤S1中，所述活化的吸附载体的制备方法包括：用高碘酸盐对吸附载体进行氧化处理，得到含醛基的活化的吸附载体；所述活化的吸附载体包含但不限于为含醛基的琼脂糖凝胶、纤维素凝胶和聚乙烯醇凝胶中的一种或多种。
进一步的，在步骤S2中，所述偶联反应的温度为5～40℃，时间为2～24h。
进一步的，在步骤S4中，所述还原处理的试剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠或两者的混合剂。
有益效果
与现有技术相比，本发明提供的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂及其制备方法具有如下有益效果：
(1)本发明提供的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂，包括活化的吸附载体以及与所述活化的吸附载体偶联结合的烷基化修饰的乙肝病毒抗体。通过对偶联后的乙肝病毒抗体蛋白进行烷基化修饰，封闭游离巯基，避免因巯基化反应对抗体活性造成损失以及造成非特异性吸附的问题，并使抗体暴露更多的与抗原的作用位点，从而获得吸附效率高、特异性好且可再生性好的乙肝病毒免疫吸附剂，增强了临床使用中的可操作性和重复利用率，进而降低了生产和使用成本。
(2)本发明提供的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂的制备方法，首先将乙肝病毒抗体与活化的吸附载体进行偶联，然后进行烷基化修饰，最后进行封端和还原处理，得到吸附量和吸附率高、可再生性好的乙肝病毒免疫吸附剂。在整个制备过程中，吸附载体上残留的氧化剂、偶联环境的影响及封端和还原均有可能导致乙肝病毒抗体中暴露更多游离巯基，从而影响乙肝病毒抗体与抗原的特异性结合能力。因此本发明通过烷基化修饰，有效克服了此问题；而且烷基化修饰后，再进行封端和还原处理时，能够对乙肝病毒抗体起到更好的保护作用，防止抗体失活，从而提高乙肝病毒免疫吸附剂的特异性吸附性能。
(3)本发明提供的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂的制备方法，通过合理控制烷基化修饰过程中的修饰剂的种类和浓度、修饰剂与吸附载体的配比以及烷基化修饰温度和时间，能够在保证修饰剂成功修饰的情况下，还不对乙肝病毒抗体的结构和活性造成影响，从而显著提高免疫吸附剂的特异性吸附能力。本发明整个制备方法操作简单、可重复性强，增强了临床使用中的可操作性和重复利用率，进而降低了成本；同时，本发明制备的免疫吸附剂的总蛋白吸附率较低，说明其非特异性吸附减少，安全性好。
具体实施方式
以下将对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
本发明提供的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂，包括活化的吸附载体以及与所述活化的吸附载体偶联结合的烷基化修饰的乙肝病毒抗体，所述烷基化修饰是在所述乙肝病毒抗体与所述活化的吸附载体偶联结合后进行，用于修饰所述乙肝病毒抗体中的游离巯基。乙肝病毒抗体在偶联反应过程中，可能会导致部分二硫键被还原成游离巯基，或者导致乙肝病毒抗体球形结构的内部纵深处的巯基暴露出来，因此，通过对游离巯基进行烷基化修饰，避免因巯基化反应对抗体活性造成损失以及造成非特异性吸附的问题，并使抗体暴露更多的与抗原的作用位点，从而提高乙肝病毒免疫吸附剂的特异性吸附量和吸附率。
其中，所述烷基化修饰的试剂包含但不限于为碘乙酰胺、碘乙酸、氯乙酰氨、N-乙基马来酰亚胺中的一种或多种。
优选地，所述烷基化修饰的试剂为碘乙酰胺或碘乙酸。
进一步的，所述活化的吸附载体包含但不限于为含醛基的琼脂糖凝胶、纤维素凝胶和聚乙烯醇凝胶中的一种或多种。吸附载体通过氧化作用得到醛基，通过醛基与乙肝病毒抗体中的氨基发生偶联生成席夫碱，最后还需进行封端和还原处理。在整个制备过程中，吸附载体上残留的氧化剂、偶联环境的影响及封端和还原均有可能导致乙肝病毒抗体中暴露更多游离巯基，从而影响乙肝病毒抗体与抗原的特异性结合能力。因此本发明通过烷基化修饰，有效克服了此问题，而且烷基化修饰后，再进行封端和还原处理时，能够对乙肝病毒抗体起到更好的保护作用，防止抗体失活，从而提高乙肝病毒免疫吸附剂的特异性吸附性能。
本发明提供的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备能够与乙肝病毒抗体进行偶联反应的活化的吸附载体。
优选地，所述活化载体的制备方法包括：用高碘酸盐对吸附载体进行氧化处理，得到含醛基的活化的吸附载体。所述活化的吸附载体包含但不限于为含醛基的琼脂糖凝胶、纤维素凝胶和聚乙烯醇凝胶中的一种或多种。
S2.将步骤S1得到的所述活化的吸附载体与乙肝病毒抗体进行偶联反应，得到偶联有乙肝病毒抗体的吸附载体。
所述偶联反应的温度为5～40℃，时间为2～24h。
S3.将步骤S2得到的所述偶联有乙肝病毒抗体的吸附载体加入到烷基化试剂的溶液中，进行乙肝病毒抗体中巯基的烷基化修饰。
所述烷基化修饰的试剂包含但不限于为碘乙酰胺、碘乙酸、氯乙酰氨、N-乙基马来酰亚胺中的一种或多种；所述烷基化试剂的溶液的浓度为0.02～0.2％g/mL。所述偶联有乙肝病毒抗体的吸附载体与烷基化试剂的溶液的质量体积比为1g：1～3mL。所述烷基化修饰温度为4～30℃，时间为15～60min。
修饰剂的种类和浓度、修饰剂与吸附载体的配比以及烷基化修饰温度和时间，均对修饰成功与否有重要影响，且还对修饰过程中乙肝病毒抗体的三级结构及活性有重要影响。因此通过合理调控上述条件，能够在保证修饰剂成功修饰的情况下，还不对乙肝病毒抗体的结构和活性造成影响，从而显著提高免疫吸附剂的特异性吸附能力。
S4.对烷基化修饰后的偶联有乙肝病毒抗体的吸附载体进行还原处理，即得到烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂。
所述还原处理的试剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠或两者的混合剂。
以下通过具体实施例和对比例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
一种烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂，其制备方法包括以下步骤：
(1)取一定量的琼脂糖凝胶微球，加入0.2mol/L高碘酸钠溶液(所述琼脂糖凝胶微球和高碘酸钠溶液的比例为1g：1.5mL)，在37℃下震荡4h，最后反复清洗除去琼脂糖凝胶微球表面的高碘酸钠，得到活化的琼脂糖凝胶微球；
(2)将活化的琼脂糖凝胶微球和乙肝病毒抗体在缓冲溶液中进行偶联反应，所述偶联反应的温度为25℃，时间为4h，得到偶联有乙肝病毒抗体的琼脂糖凝胶微球；
(3)将偶联有乙肝病毒抗体的琼脂糖凝胶微球与0.1％g/mL的碘乙酸溶液按1g：2mL的比例混合后，于25℃下反应45min，对乙肝病毒抗体中的巯基进行烷基化修饰，反应完成后抽干，得到烷基化修饰的偶联有乙肝病毒抗体的琼脂糖凝胶微球；
(4)将烷基化修饰的偶联有乙肝病毒抗体的琼脂糖凝胶微球加入到2mg/mL的NaBH4溶液中进行还原反应，所述NaBH4溶液与琼脂糖凝胶微球的比例为1.5mL：1g，反应12h后，清洗得到烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂。
其中，所述乙肝病毒抗体和所有其他试剂均为采购获得。
实施例2
一种烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂，其制备方法与实施例1相比，不同之处在于，步骤(3)中的碘乙酸替换为碘乙酰胺，其他与实施例1大致相同，在此不再赘述。
对比例1
一种乙肝病毒免疫吸附剂，其制备方法与实施例1相比，不同之处在于，不包含步骤(3)中的烷基化修饰，即偶联后直接进行步骤(4)的还原反应。其他与实施例1大致相同，在此不再赘述。
对实施例及对比例制备的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂进行HBsAg吸附量和吸附率以及总蛋白吸附率的检测，具体方法如下：
称取经抽干的吸附剂0.50g于10mL离心管或三角瓶中，加入含有乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的牛血浆5mL(HBsAg浓度在1000-2000IU/mL范围内)，置于恒温37℃±1℃的摇床上、80～100rpm震荡2h，然后以3000r/min的转速离心5min后取样，吸取上清液待测。
用HBV检测试剂盒和全自动生化分析仪测定吸附前和吸附后血浆中的乙型肝炎病毒含量，按下式计算吸附量：
AC＝(Cb-Ca)×V/m
式中：AC为吸附量；Cb为吸附前血浆中乙型肝炎表面抗原HBsAg含量，单位为IU/mL；Ca为附2h后血浆中乙型肝炎表面抗原HBsAg含量，单位为IU/mL；V为吸附用血浆(或等效的替代溶液)体积；m为吸附剂重量，单位g。
用总蛋白测定试剂盒和相关方法测定吸附前和吸附后血浆中的总蛋白的浓度，按下式计算总蛋白吸附率：
T＝(C01-Ct1)/C01×100％
T为总蛋白吸附率；C01为吸附前血浆中总蛋白的浓度，单位为g/L或mmol/L；Ct1为吸附后血浆中总蛋白的浓度，单位为g/L或mmol/L。测试结果如表1所示。
表1实施例1～2和对比例1制备的乙肝病毒免疫吸附剂的吸附性能
试样 HbsAg吸附量(IU/g) HbsAg吸附率(％) 总蛋白吸附率(％)
实施例1 14752.6 98.3 8.9
实施例2 14890.0 99.1 8.5
对比例1 14296.4 95.2 12.8
从表1可以看出，实施例1和实施例2在偶联后经碘乙酸或碘乙酰胺烷基化修饰后，免疫吸附剂对HBsAg的吸附率均高达98％以上，对总蛋白的吸附率均低于9％，而对比例1未经烷基化修饰时，对HBsAg的吸附率仅为95.2％，对总蛋白的吸附率升至12.8％，且免疫吸附剂的吸附量相比实施例1降低了约500IU/g。由此说明，本发明经烷基化修饰，能够提高乙肝病毒免疫吸附剂对乙肝病毒表面抗原的特异性吸附效率，降低对非目标蛋白的非特异性吸附，从而能够减少吸附剂的用量，降低使用成本。
实施例3～6和对比例2～3
实施例3～6和对比例2～3提供的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂，其制备方法与实施例1相比，不同之处在于，步骤(3)中的碘乙酸溶液浓度及偶联有乙肝病毒抗体的琼脂糖凝胶微球与碘乙酸溶液的质量体积比如表1所示，其他与实施例2大致相同，在此不再赘述。
表2实施例3～6和对比例2～3的制备条件及吸附性能
Figure BDA0002552235090000091
Figure BDA0002552235090000101
从表2可以看出，随着碘乙酸浓度的增大，免疫吸附剂对HBsAg的吸附率先增大后减小，对总蛋白的吸附率先降低后增大。说明碘乙酸浓度过高和过低均不利于免疫吸附剂特异性吸附能力的提高以及非特异性吸附率的降低。本发明通过在制备免疫吸附剂时，合理控制烷基化试剂的浓度，能够在提高其特异性吸附能力的同时，避免碘乙酸浓度过高而对吸附剂造成二次破坏。
实施例7～10
实施例7～10提供的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂，其制备方法与实施例1相比，不同之处在于，步骤(3)中的烷基化修饰的反应温度和时间如表3所示，其他与实施例1大致相同，在此不再赘述。
表3实施例7～10的制备条件及吸附性能
Figure BDA0002552235090000102
从表3可以看出，在本发明限定的烷基化温度和时间范围内，免疫吸附剂均具有较好的特异性吸附能力，且对非目标蛋白的非特异性吸附较弱。
本发明制备的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂的再生性能如下：
对烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂进行再生试验，具体方法为：以0.01mol/L的柠檬酸溶液作为再生液，对吸附剂进行吸附-再生-吸附试验，取再生50次的吸附剂进行吸附试验，按上述方法检测其吸附量。测试结果如表4所示。
表4实施例1和2和对比例1再生50次后的吸附量测试结果
Figure BDA0002552235090000111
从表4可以看出，实施例1和2制备的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂再生50次后，对HbsAg的吸附量下降率分别为17.3％和21.6％，而对比例1的下降率高达45.0％，说明本发明制备的免疫吸附剂，通过对乙肝病毒抗体进行烷基化修饰，能够在再生过程中更好地保持乙肝病毒抗体的结构完整性和活性，从而更好地保持其特异性吸附性能，提高免疫吸附剂的再生利用性能，降低使用成本。
需要说明的是，本领域技术人员应当理解，本发明提供的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂的吸附载体不限于为琼脂糖凝胶微球，还可以是纤维素凝胶微球和聚乙烯醇凝胶微球或其他能够与乙肝病毒抗体偶联的吸附载体；活化方法也可以是采用碘酸钾或其他氧化剂。
综上所述，本发明提供的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂，包括活化的吸附载体以及与所述活化的吸附载体偶联结合的烷基化修饰的乙肝病毒抗体。通过对偶联后的乙肝病毒抗体蛋白进行烷基化修饰，封闭游离巯基，避免因巯基化反应对抗体活性造成损失的问题，并使抗体暴露更多的与抗原的作用位点，从而获得吸附效率高、特异性好且可再生性好的乙肝病毒免疫吸附剂，增强了临床使用中的可操作性和重复利用率，进而降低了生产和使用成本。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂，其特征在于，包括活化的吸附载体以及与所述活化的吸附载体偶联结合的烷基化修饰的乙肝病毒抗体，所述烷基化修饰是在所述乙肝病毒抗体与所述活化的吸附载体偶联结合后进行，用于修饰所述乙肝病毒抗体中的游离巯基；所述烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂的制备方法包括以下步骤：
S1.制备得到能够与乙肝病毒抗体进行偶联反应的活化的吸附载体；
S2.将步骤S1得到的所述活化的吸附载体与乙肝病毒抗体进行偶联反应，得到偶联有乙肝病毒抗体的吸附载体；
S3.将步骤S2得到的所述偶联有乙肝病毒抗体的吸附载体加入到烷基化试剂的溶液中，进行乙肝病毒抗体中巯基的烷基化修饰；所述烷基化试剂的溶液的浓度为0.1～0.2％g/mL；所述烷基化修饰温度为25～30℃，时间为45～60min；
S4.对烷基化修饰后的偶联有乙肝病毒抗体的吸附载体进行还原处理，即得到烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂。
2.根据权利要求1所述的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂，其特征在于，所述烷基化修饰的试剂为碘乙酰胺、碘乙酸、氯乙酰氨、N-乙基马来酰亚胺中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂，其特征在于，所述活化的吸附载体为含醛基的琼脂糖凝胶、纤维素凝胶和聚乙烯醇凝胶中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂，其特征在于，在步骤S3中，所述偶联有乙肝病毒抗体的吸附载体与烷基化试剂的溶液的质量体积比为1g：1～3mL。
5.根据权利要求1所述的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂，其特征在于，在步骤S1中，所述活化的吸附载体的制备方法包括：用高碘酸盐对吸附载体进行氧化处理，得到含醛基的活化的吸附载体；所述活化的吸附载体为含醛基的琼脂糖凝胶、纤维素凝胶和聚乙烯醇凝胶中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂，其特征在于，在步骤S2中，所述偶联反应的温度为5～40℃，时间为2～24h。
7.根据权利要求1所述的烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂，其特征在于，在步骤S4中，所述还原处理的试剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠或两者的混合剂。
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