CN108816208B - 一种高载量的蛋白a免疫吸附材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种高载量的蛋白A免疫吸附材料及其制备方法，本发明通过加入低成本的试剂乙二胺作为“催化剂”，能克服环氧基与蛋白A反应活性不高的缺点，实现蛋白A在环氧基载体上的固定。通过采用这种制备方法，能有效提高蛋白A在环氧基载体上的偶联率，而且制备得到的蛋白A免疫吸附材料对血浆中抗体的吸附量高，这种高吸附性能对蛋白A免疫吸附疗法的广泛应用至为关键。本发明中制备的蛋白A免疫吸附材料对抗体的吸附量大，高于传统方法制备得到的蛋白A免疫吸附材料，提高了临床治疗效果、安全性和可靠性。
Description
技术领域
本发明属于医用生物材料，具体涉及一种高载量的蛋白A免疫吸附材料及其制备方法。
背景技术
各种自身免疫性疾病和器官移植排斥反应都是由于人体内产生自身抗体，对抗自身组织器官或移植器官，引起组织器官的损害而导致的一系列疾病，是目前国内外医学界面临的治疗难题之一。自身免疫性疾病是由于人体免疫系统发生紊乱而导致，具有相当高的致残率或病死率，常见的有系统性红斑狼疮(SLE)、血友病、类风湿关节炎(RA)、系统性硬化(SSc)、重症肌无力(MG)、干燥综合征(SS)等。移植排斥反应是器官移植失败的主要原因，这涉及到病人机体对移植的异源器官所产生的免疫不耐受，进而促使供体特异性抗体的产生。针对这类急危重症，传统的药物和手术治疗无能为力，而免疫吸附疗法通过选择性清除患者血液中致病性抗体，具有其独特的疗效，已成为近年来国内外的推荐疗法。
免疫吸附疗法利用亲和层析的原理，直接从患者血液中选择性或特异性地清除致病因子，从而达到净化血液，治疗疾病的目的。蛋白A是一种从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)提取出来的单链蛋白质，它对IgG抗体的C2-C3区域具有高度的选择性和亲和性。蛋白A的N端含有5个组成高度类似的IgG结合区：E、D、A、B、C，这五个结合区分别都能与IgG抗体的Fc段结合，且吸附能力相近。将蛋白A偶联到凝胶载体上，当患者的血液经过该吸附材料时，一些因抗体质与量的改变而导致的疾病就可得到缓解或治愈。临床应用结果表明，蛋白A免疫吸附治疗对自身免疫性疾病、器官移植排斥反应等具有很好的治疗效果。
目前，关于蛋白A免疫吸附材料合成方法的专利很多(CN1367181A，CN1365853A，CN101190409A，CN101185878A)，但利用环氧基载体固定蛋白A的专利很少，这是因为载体上的环氧基团的活性不高，与蛋白A上的伯氨基很难发生反应，因而蛋白A在这些载体上的偶联率非常低，甚至不能偶联在载体上。通过采取增加分子间隔臂臂长的方法，对增加蛋白A在环氧基载体上的偶联率有一定的帮助，如专利CN101069751A和CN107754764A。但这些方法需要使用缩水甘油醚增加分子间隔臂的长度，由于缩水甘油醚成本较高，限制了蛋白A免疫吸附的进一步推广。
环氧基与蛋白A反应后键接牢固，蛋白A不易脱落，适用于临床用蛋白A免疫吸附材料的制备。本发明通过加入便宜的试剂乙二胺作为“催化剂”，能克服环氧基与蛋白A反应活性不高的缺点，实现蛋白A在环氧基载体上的固定。通过采用这种制备方法，能有效提高蛋白A在环氧基载体上的偶联率至90％，而且制备得到的蛋白A免疫吸附材料对血浆中抗体的吸附量最高可达到56mg/g，这种高吸附性能对蛋白A免疫吸附疗法的广泛应用至为关键。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种环氧基载体的蛋白A免疫吸附材料。此外本发明还提供该蛋白A免疫吸附材料的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下方案实现：
一种蛋白A免疫吸附材料，其特征在于，具有如下化学结构：
其中，
亲水性凝胶微球；SPA为蛋白A。
所述蛋白A免疫吸附材料中，偶联在凝胶微球上的蛋白A含量为：3.5-12mg/g。本发明制备得到的蛋白A免疫吸附材料对人血浆中抗体的吸附量为每毫升填料吸附30～64mg。
上述蛋白A免疫吸附材料的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备环氧基载体；
S2：将环氧基载体与蛋白A、乙二胺溶液混合反应，得反应产物；
S3：用封端试剂与步骤S2所得产物的残余环氧基反应封端，得到蛋白A免疫吸附材料。
其中所述步骤S1中，制备环氧基载体包括多种方法，可以通过琼脂糖凝胶微球或纤维素微球在碱性条件下与环氧氯丙烷反应，得到环氧基琼脂糖凝胶微球或环氧基纤维素微球。
上述方法更为具体的为：
所述步骤S1中，用琼脂糖凝胶微球加入NaOH溶液、硼氢化钠以及环氧氯丙烷置于恒温摇床中，在30℃～50℃反应3～5小时后，用蒸馏水冲洗，得到环氧基琼脂糖凝胶微球。
其中环氧基纤维素微球可以用纤维素微球制备。其制备方法为现有技术或者直接购买环氧基纤维素微球。
所述步骤S2中，将环氧基载体与蛋白A溶液以及浓度为0.02～0.1M的乙二胺，在pH为8～10，温度为5～30℃条件下反应10～48小时，得到混合反应产物。优选的，三种物质的配比一般为，1g环氧基载体：4～16mg蛋白A：1.5～6mL乙二胺溶液。
所述步骤S3中，将步骤S2中所得产物，可能由于反应不完全，有残余的环氧基团，因此需要采用封端试剂与残余的环氧基团反应，具体为：依次用0.5～1.5M的NaCl水溶液和蒸馏水冲洗后，加入0.1～2M的封端试剂溶液中，调节pH至8～10，在20～40℃反应6～12小时与残余的环氧基反应封端，用水冲洗、抽干，得到蛋白A免疫吸附材料。其中封端试剂可以为乙醇胺、巯基乙醇或甘氨酸。
反应方程式如下：
以上反应方程式中，
代表亲水性凝胶微球；SPA代表蛋白A。
蛋白A是一个分子量约42kD大分子，其表面有可以与活性载体反应的伯氨基。虽然环氧基载体具有稳定的优点，但是环氧基团与蛋白质表面伯氨基的反应活性很低，蛋白质只有充分靠近载体时，才能与环氧基反应从而固定在载体上。本发明中的乙二胺能够将蛋白A拉近载体，一方面它可以与蛋白A表面的负电荷区域离子结合，一方面它具有靠近环氧基的倾向，从而将蛋白A与载体充分接触，固定蛋白A。本发明制备得到的蛋白A免疫吸附材料对抗体的吸附量可达到每毫升填料吸附30～64mg。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过加入乙二胺，可以使蛋白A直接固定在环氧基载体上，方法简便，成本更低。
(2)本发明中制备的蛋白A免疫吸附材料对抗体的吸附量可达到30～64mg/g，高于传统方法制备得到的蛋白A免疫吸附材料。
以上的优势在临床治疗上表现为提高了临床治疗效果、安全性和可靠性。体外血浆吸附试验数据表明，本发明的蛋白A免疫吸附材料对人体免疫球蛋白特别是IgG具有特异性吸附。
附图说明
图1为加入乙二胺和不加乙二胺对比反应上清液中蛋白A的浓度。
具体实施方式
为使本发明实施的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。下面实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、环氧基载体的制备
取100g琼脂糖凝胶微球(Sepharose 6FF)，用蒸馏水冲洗干净后，抽干，加入到500mL的圆底烧瓶中，加入200mL 2.5M NaOH溶液，0.4g硼氢化钠，100mL环氧氯丙烷，置于恒温摇床中，在40℃反应4小时后，用蒸馏水冲洗，结束反应。用硫代硫酸钠法检测该载体上的环氧基团数量，测得每克载体上有50μmol的环氧基。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
将上述合成的100g环氧基琼脂糖凝胶微球加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入400mL 0.05M的乙二胺溶液中(用盐酸调节pH为9)，0.8g蛋白A，在20℃反应24小时，通过测量反应后上清液中蛋白A的浓度，测得偶联在凝胶微球上的蛋白A约为7.2mg/g，偶联率为90％。用大量蒸馏水冲洗，抽干，加入200毫升1M的乙醇胺溶液(用盐酸调pH值为8)，置于恒温摇床中，20℃反应12小时封端，最后用大量蒸馏水冲洗，抽干，获得蛋白A免疫吸附材料。
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
采集上述蛋白A免疫吸附材料1g，加入健康人血浆10mL，在37℃振荡2小时进行吸附。将该混悬液用大量生理盐水冲洗，除去血浆，然后用50毫升0.1mol/L的柠檬酸溶液(pH＝2.5)洗脱吸附在材料上的IgG抗体，在280nm测试洗脱液的吸光度A。
作为对照试验，将1毫升琼脂糖凝胶代替蛋白A免疫吸附材料，与上述方法同法处理。
通过下式计算蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量。
A：吸附试验中洗脱液在280nm的吸光度
A0：对照试验中洗脱液在280nm的吸光度
计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为56mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
将上述蛋白A免疫吸附材料30毫升，放入烧杯中分别用0.1M的氢氧化钠浸泡4小时，然后用无菌无内毒素的生理盐水浸泡2小时后，装于一根φ26×50mm的吸附柱(已高温蒸汽灭菌)中，用大量无菌无内毒素的生理盐水充分冲洗柱子(以上操作均在超净工作台进行)。以动物实验狗(体重约为10kg)为试验对象，将狗麻醉后，建立体外循环。从狗的股动脉中以60mL/min的速度引出血液，经过血浆分离器分离出血浆，经另一个泵驱动以25mL/min的速度进入吸附柱进行IgG吸附，经过吸附柱的血浆与血细胞混合一同泵入狗的股动脉中。吸附1小时后，完成吸附试验。试验动物狗在免疫吸附后当天恢复正常生理活动，试验后一周未发现异常症状。
分别抽取试验前和试验后狗的血浆进行IgG浓度的测试，计算IgG的下降率。IgG下降率按照以下公式计算：
下降率＝(Cb-Ca)/Cb×100％
Cb为试验前狗的IgG浓度
Ca为试验后狗的IgG浓度
计算结果表示，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为50％。
实施例2
一、环氧基载体的制备
选用直接购买的环氧琼脂糖凝胶(Epoxy-actived Sepharose 6FF，GEhealthcare)。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
将上述购买的100g环氧琼脂糖凝胶(Epoxy-actived Sepharose 6FF，GEhealthcare)加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入400mL 0.05M的乙二胺溶液中(用盐酸调节pH为9)，0.8g蛋白A，在20℃反应24小时，通过测量反应后上清液中蛋白A的浓度，测得偶联在凝胶微球上的蛋白A约为7.2mg/g，偶联率为90％。用大量蒸馏水冲洗，抽干，加入200毫升1M的乙醇胺溶液(用盐酸调pH值为8)，置于恒温摇床中，20℃反应12小时封端，最后用大量蒸馏水冲洗，抽干，获得蛋白A免疫吸附材料。
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
测试方法如实施例1，计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为56mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
测试方法如实施例1，计算结果表示，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为50％。
实施例3
一、环氧基载体的制备
制备方法与实施例1相同。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
将上述合成的100g环氧基琼脂糖凝胶微球加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入400mL 0.02M的乙二胺溶液中(用盐酸调节pH为10)，0.8克蛋白A，在20℃反应24小时，通过测量反应后上清液中蛋白A的浓度，测得偶联在上凝胶微球上的蛋白A约为5.4mg/g，偶联率为67.5％。用大量蒸馏水冲洗，抽干，加入200毫升1M的乙醇胺溶液(用盐酸调pH值为8)，置于恒温摇床中，20℃反应12小时封端，最后用大量蒸馏水冲洗，抽干，获得蛋白A免疫吸附材料。
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
测试方法如实施例1，计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为42mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
测试方法如实施例1，计算结果表明，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为38％。
实施例4
一、环氧基载体的制备
与实施例1相同。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
将上述合成的100g环氧基琼脂糖凝胶微球加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入400mL 0.1M的乙二胺溶液中(用盐酸调节pH为8)，0.8克蛋白A，在20℃反应24小时，通过测量反应后上清液中蛋白A的浓度，测得偶联在上凝胶微球上的蛋白A约为6.4mg/g，偶联率为80％。用大量蒸馏水冲洗，抽干，加入200毫升1M的乙醇胺溶液(用盐酸调pH值为8)，置于恒温摇床中，20℃反应12小时封端，最后用大量蒸馏水冲洗，抽干，获得蛋白A免疫吸附材料。
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
测试方法如实施例1，计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为40mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
测试方法如实施例1，计算结果表明，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为35％。
实施例5
一、环氧基载体的制备
制备方法与实施例1相同。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
将上述合成的100g环氧基琼脂糖凝胶微球加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入400mL 0.05M的乙二胺溶液中(用盐酸调节pH为10)，0.4g蛋白A，在30℃反应10小时，通过测量反应后上清液中蛋白A的浓度，测得偶联在上凝胶微球上的蛋白A约为3.5mg/g，偶联率为87.5％。用大量蒸馏水冲洗，抽干，加入200毫升1M的巯基乙醇溶液(调pH值为9)，置于恒温摇床中，30℃反应8小时封端，最后用大量蒸馏水冲洗，抽干，获得蛋白A免疫吸附材料。
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
测试方法如实施例1，计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为30mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
测试方法如实施例1，计算结果表明，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为25％。
实施例6
一、环氧基载体的制备
制备方法与实施例1相同。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
将上述合成的100g环氧基琼脂糖凝胶微球加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入600mL 0.02M的乙二胺溶液中(用盐酸调节pH为10)，1.6g蛋白A，在5℃反应48小时，通过测量反应后上清液中蛋白A的浓度，测得偶联在上凝胶微球上的蛋白A约为10mg/g，偶联率为62.5％。用0.5M的NaCl水溶液和蒸馏水冲洗后，抽干，加入200毫升2M的巯基乙醇溶液(调pH值为9)，置于恒温摇床中，20℃反应8小时封端，最后用大量蒸馏水冲洗，抽干，获得蛋白A免疫吸附材料。
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
测试方法如实施例1，计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为64mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
测试方法如实施例1，计算结果表明，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为58％。
实施例7
一、环氧基载体的制备
制备方法与实施例1相同。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
将上述合成的100g环氧基琼脂糖凝胶微球加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入150mL 0.1M的乙二胺溶液中(用盐酸调节pH为9)，1.0g蛋白A，在25℃反应30小时，通过测量反应后上清液中蛋白A的浓度，测得偶联在上凝胶微球上的蛋白A约为7.2mg/g，偶联率为72％。用1.5M的NaCl水溶液和蒸馏水冲洗后，抽干，加入200毫升0.1M的甘氨酸溶液(调pH值为9)，置于恒温摇床中，40℃反应6小时封端，最后用大量蒸馏水冲洗，抽干，获得蛋白A免疫吸附材料。
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
测试方法如实施例1，计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为58mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
测试方法如实施例1，计算结果表明，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为56％。
实施例8
一、环氧基载体的制备
取100g琼脂糖凝胶微球(Sepharose 6FF)，用蒸馏水冲洗干净后，抽干，加入到500mL的圆底烧瓶中，加入200mL 2.5M NaOH溶液，0.4g硼氢化钠，100mL环氧氯丙烷，置于恒温摇床中，在30℃反应5小时后，用蒸馏水冲洗，结束反应。用硫代硫酸钠法检测该载体上的环氧基团数量，测得每克载体上有42μmol的环氧基。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
制备方法同实施例1.
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
测试方法如实施例1，计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为54mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
测试方法如实施例1，计算结果表明，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为48％。
实施例9
一、环氧基载体的制备
取100g琼脂糖凝胶微球(Sepharose 6FF)，用蒸馏水冲洗干净后，抽干，加入到500mL的圆底烧瓶中，加入200mL 2.5M NaOH溶液，0.4g硼氢化钠，100mL环氧氯丙烷，置于恒温摇床中，在50℃反应3小时后，用蒸馏水冲洗，结束反应。用硫代硫酸钠法检测该载体上的环氧基团数量，测得每克载体上有48μmol的环氧基。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
制备方法同实施例1。
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
测试方法如实施例1，计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为56mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
测试方法如实施例1，计算结果表明，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为50％。
对比例
一、环氧基载体的制备
制备方法与实施例1相同
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
将上述合成的100g环氧基琼脂糖凝胶微球加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入0.8g蛋白A(用缓冲溶液调节pH为9)，在20℃反应24小时，通过测量反应后上清液中蛋白A的浓度，测得蛋白A的浓度基本没有变化，与实施例1中的测定结果对比如图1所示。
图1中，横坐标为反应时间，纵坐标为反应后上清液中蛋白A的浓度C0与原溶液中蛋白A浓度C的比值，从图中可以看出，随着反应时间的增加，加入乙二胺催化的蛋白A会逐渐与环氧基琼脂糖凝胶微球发生反应，因此，上清液中蛋白A的含量逐渐下降；而不加乙二胺，蛋白A的浓度基本没有发生变化，说明不加入乙二胺催化，蛋白A基本不会与环氧基琼脂糖凝胶微球发生偶联反应，由此可知，乙二胺的催化在本发明所述的制备方法中，起着关键的作用。
以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照以上较佳实施方式对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换都不应脱离本发明技术方案的精神和范围。本领域技术人员还可在本发明精神内做其它变化等用在本发明的设计，只要其不偏离本发明的技术效果均可。这些依据本发明精神所做的变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。
Claims (8)
1.一种蛋白A免疫吸附材料的制备方法，其特征在于，所述蛋白A免疫吸附材料具有如下化学结构：
其中，
亲水性凝胶微球；SPA为蛋白A；
所述蛋白A免疫吸附材料的制备方法包括以下步骤：
S1：制备环氧基载体；
S2：将环氧基载体与蛋白A、乙二胺溶液混合反应，得反应液；
S3：用封端试剂与步骤S2所得产物的残余环氧基反应封端，得到蛋白A免疫吸附材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，将环氧基载体与蛋白A溶液以及浓度为0.02~0.1M的乙二胺，在pH为8~10，温度为5~30℃条件下反应10~48小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，三种物质的配比为，1g环氧基载体:4~16mg蛋白A:1.5~6mL乙二胺溶液。
4.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，环氧基载体由琼脂糖凝胶微球或纤维素微球制得。
5.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述环氧基载体的制备方法包括：用琼脂糖凝胶微球或纤维素微球加入NaOH溶液、硼氢化钠以及环氧氯丙烷置于恒温摇床中，在30℃~50℃反应3~5小时后，用蒸馏水冲洗，得到环氧基载体。
6.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，将步骤S2中所得产物依次用0.5~1.5M的NaCl水溶液和蒸馏水冲洗后，加入0.1~2M的封端试剂溶液中，调节pH至8~10，在20~40℃反应6~12小时与残余的环氧基反应封端，用水冲洗、抽干，得到蛋白A免疫吸附材料。
7.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中的封端试剂为乙醇胺、巯基乙醇或甘氨酸。
8.一种如权利要求1~7任一项所述方法制备的蛋白A免疫吸附材料。
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| CN101185878A (zh) * | 2006-11-17 | 2008-05-28 | 广州康盛生物科技有限公司 | 一种用于去除致病抗体及其复合物的蛋白a免疫吸附材料及其合成方法和应用 |
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