CN107670649B - 一种定向固定蛋白a的活性载体和制备方法以及蛋白a免疫吸附材料的制备方法 - Google Patents

一种定向固定蛋白a的活性载体和制备方法以及蛋白a免疫吸附材料的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种直接从细胞破碎上清液中定向固定蛋白A制备的免疫吸附材料，具体公开了制备该免疫吸附材料的活性载体，以及利用该载体制备蛋白A免疫吸附材料的方法。该活性载体以亲水性凝胶微球为基质，依次与环氧氯丙烷、天冬氨酸、环氧氯丙烷、氢氧化钠反应后得到。该活性载体上含有金属螯合基和环氧基，在一定条件下，能直接从细胞破碎上清液中定向固定带有组氨酸标签的目的蛋白质。本发明的活性载体能够将带有组氨酸标签的蛋白A从细胞破碎上清液中直接固定制备得到蛋白A免疫吸附材料，省略蛋白A的纯化过程，大大减少固定化的成本；固定条件温和，制备得到的蛋白A免疫吸附材料吸附效率高，可用于临床上免疫吸附治疗。

Description

一种定向固定蛋白A的活性载体和制备方法以及蛋白A免疫吸 附材料的制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白质固定化技术领域，尤其涉及一种定向固定蛋白A的活性载体和制备方法以及蛋白A免疫吸附材料的制备方法。
背景技术
各种自身免疫性疾病和器官移植排斥反应都是由于人体内产生自身抗体，对抗自身组织器官或移植器官，引起组织器官的损害而导致的一系列疾病，是目前国内外医学界面临的治疗难题之一。自身免疫性疾病是由于人体免疫系统发生紊乱而导致，具有相当高的致残率或病死率，常见的有系统性红斑狼疮 (SLE)、血友病、类风湿关节炎(RA)、系统性硬化(SSc)、重症肌无力(MG)、干燥综合征(SS)等。移植排斥反应是器官移植失败的主要原因，这涉及到病人机体对移植的异源器官所产生的免疫不耐受，进而促使供体特异性抗体的产生。针对这类急危重症，传统的药物和手术治疗无能为力，而免疫吸附疗法通过选择性清除患者血液中致病性抗体，具有其独特的疗效，已成为近年来国内外的推荐疗法。
免疫吸附疗法利用亲和层析的原理，直接从患者血液中选择性或特异性地清除致病因子，从而达到净化血液，治疗疾病的目的。蛋白A是一种从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)提取出来的单链蛋白质，它对IgG抗体的Cγ2- Cγ3区域具有高度的选择性和亲和性。蛋白A的N端含有5个组成高度类似的 IgG结合区：E、D、A、B、C，这五个结合区分别都能与IgG抗体的Fc段结合，且吸附能力相近。将蛋白A偶联到凝胶载体上，当患者的血液经过该吸附材料时，一些因抗体质与量的改变而导致的疾病就可得到缓解或治愈。临床应用结果表明，蛋白A免疫吸附治疗对自身免疫性疾病、器官移植排斥反应等具有很好的治疗效果。
2000年，美国食品药品管理局(FDA)批准德国Fresenius公司蛋白A免疫吸附柱Immunosorba用于治疗带有抑制因子的血友病和其它自身免疫性疾病。 Immunosorba吸附柱在临床推广应用过程中，存在两方面的不足：蛋白A免疫吸附材料的制备成本高昂，导致售价过高；蛋白A与载体偶联后其活性损失，导致吸附性能不高。目前免疫吸附材料所用的蛋白A均采用基因工程方法生成，一般采用重组大肠杆菌发酵生产，在经过细胞破碎、柱层析等一系列分离纯化后才能获得高纯度的基因工程重组蛋白A，生成过程复杂，成本较高。目前每克基因工程重组蛋白A的售价在1000～1500美元左右，主要生产成本集中在柱层析精分离段，每支蛋白A免疫吸附柱(75ml免疫吸附材料)需要1～1.5克的基因重组蛋白A，高的纯化成本导致蛋白A免疫吸附住售价过高(5000～8000 美元一支)。此外，蛋白A与载体的化学偶联方式往往导致固定到凝胶载体上的蛋白A不同程度的丧失其结合抗体的能力。传统的固定化方法主要利用随机分布在蛋白A表面的氨基与凝胶载体表面的化学基团(如醛基)进行化学交联，导致蛋白A随机朝向固定，部分活性位点丧失功能，制备得到的蛋白A免疫吸附材料对抗体的吸附效率降低。为了提高固定化蛋白A的抗体结合能力，本发明人报道过基因重组时在蛋白A的C端加上1个半胱氨酸，由于蛋白A本身不含有巯基，可以利用巯基与载体表面的的琥珀酰亚胺的反应实现蛋白A的定点固定化，此方法能够实现蛋白A末端的定点固定，提高蛋白A免疫吸附材料的抗体吸附能力。但由于巯基的存在，蛋白A易形成二硫键，在反应时需要提供还原环境，而且琥珀酰亚胺基载体合成成本高昂，限制了其广泛应用。因此，寻找新的蛋白A定向固定方法，并且能降低其成本，对蛋白A免疫吸附疗法的广泛应用至为关键。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种定向固定蛋白A的活性载体，该活性载体无需精细纯化蛋白A，能够从细胞破碎上清液中直接定向固定蛋白A配基。此外本发明还提供该活性载体的制备方法，以及基于活性载体制备蛋白A免疫吸附材料的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下方案实现：
一种能直接从细胞破碎上清液中定向固定蛋白A的活性载体，它具有如下的化学结构：
Figure GDA0002375568410000021
其中，
Figure GDA0002375568410000031
代表亲水性凝胶微球。
所述活性载体上含有20～60μmol/g的环氧基和20～60μmol/g金属螯合基；所述金属螯合基由两个羧基和一个叔氨基组成，能螯合二价金属离子(如Cu2+， Zn2+，Co2+，Ni2+)；所述亲水性凝胶微球可以为琼脂糖凝胶微球、纤维素微球或聚乙烯醇微球。
上述活性载体的制备方法包括如下步骤：
S1：在亲水性凝胶微球上形成环氧基；在亲水性凝胶微球上形成环氧基有多种方法，如凝胶微球在不同浓度的氢氧化钠溶液中(加入少量硼氢化钠防止氧化)与环氧氯丙烷或环氧溴丙烷反应，可以在凝胶微球上形成不同密度的环氧基；或者凝胶微球在二甲亚砜中，加入适量氢氧化钠固体或溶液后与环氧氯丙烷反应，也可以在凝胶微球上形成不同密度的环氧基。
S2：在步骤S1所得的产物上形成具有仲氨基的金属螯合基，该金属螯合基是由环氧基反应形成；在环氧基的基础上形成具有仲氨基的金属螯合基可采用现有技术，如步骤S1所得的环氧基凝胶微球在碱性条件(pH为10～12)下与天门冬氨酸反应，得到具有仲氨基的金属螯合基产物。
S3：将步骤S2所得的产物置于碳酸钠溶液中，加入环氧氯丙烷，环氧氯丙烷与仲氨基反应，随后用蒸馏水冲洗、抽干；
S4：将步骤S3所得的产物置于氢氧化钠溶液中反应，随后用蒸馏水冲洗获得活性载体。
上述方法更具体的为：
步骤S1中：将亲水性凝胶微球与2～3M的氢氧化钠溶液混合后，加入硼氢化钠和环氧氯丙烷，在20～40℃反应2～8小时后，用蒸馏水冲洗、抽干；
步骤S2中：将步骤S1中所得产物加入0.2～1.5M的天冬氨酸溶液，调节pH 至10～12(如采用碳酸钠调节)，在40～60℃反应4～12小时后，用蒸馏水冲洗、抽干；
步骤S3中：将步骤S2中所得产物加入0.2～1M的碳酸钠溶液混合后，加入环氧氯丙烷，在20～40℃反应2～8小时后，用蒸馏水冲洗、抽干；
步骤S4中：将步骤S3中所得产物加入1.5～3M的氢氧化钠溶液，在20～40℃反应1～2小时后，用蒸馏水冲洗至中性，获得活性载体(活性载体可保存在0.1％叠氮钠水溶液中备用)。
反应方程式如下：
Figure GDA0002375568410000041
利用上述活性载体制备蛋白A免疫吸附材料的方法，包括如下步骤：
a：将6×His(组氨酸标签)引入蛋白A的C端，获得重组蛋白A表达菌株后，培养发酵得到带有组氨酸标签的蛋白A菌体，破碎后离心，得到细胞破碎上清液；
b：将上述所述的活性载体与金属离子溶液混合，振荡后用蒸馏水冲洗、抽干，然后与步骤a得到的细胞破碎上清液混合，加入咪唑后反应，反应结束后用蒸馏水冲洗、抽干；
c：将步骤b所得产物用EDTA溶液冲洗，除去金属离子，然后用封端试剂与残余的环氧基反应封端，得免疫吸附材料。
其中，步骤b中，加入咪唑至咪唑的浓度为5～20mM，在pH为6.8～7.8， 10～30℃反应12～24小时；金属离子溶液为含有Cu2+、Co2+、Ni2+或Zn2+的水溶液；步骤c中，封端试剂为乙醇胺、巯基乙醇或甘氨酸。
本发明的活性载体可应用于制备用于血液净化的吸附材料。通过本发明的活性载体所制备的蛋白A免疫吸附材料可应用于血浆中抗体的吸附，抗体吸附量可达到每毫升填料吸附抗体45～55mg。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明得到的活性载体上带有金属螯合基和环氧基，活性载体螯合金属后，在一定条件下可特异性吸附细胞破碎上清液中带有组氨酸标签的蛋白A。另外，活性载体上的环氧基在中性条件下不与蛋白质发生化学反应，这可保证细胞上清液中的其它蛋白质不会偶联在载体上，但是吸附在载体上的蛋白A可与环氧基反应，这一特点实现了细胞破碎上清液中带有组氨酸标签的蛋白A的选择化固定，该方法省去了蛋白A生成中占主导地位的分离纯化步骤，显著降低了蛋白A免疫吸附材料的生成成本，对降低蛋白A免疫吸附疗法成本具有重要的意义。
2、本发明中蛋白A通过其C端的组氨酸标签被吸附在载体上后，只有在组氨酸标签附近的氨基才能与环氧基反应，实现了蛋白A在载体上的定向固定。同时，蛋白A与活性载体的偶联只需要在中性条件下进行，避免的碱性条件对蛋白A活性的破坏，上述两个优势提高了蛋白A免疫吸附材料对抗体的吸附能力。
具体实施方式
为了让本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明作进一步阐述。
实施例1
一、活性载体的制备
(1)环氧氯丙烷活化：取100mL琼脂糖凝胶微球(Sepharose 6FF)，用蒸馏水冲洗干净后，抽干，加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入150mL 3mol/L的氢氧化钠水溶液，0.3克硼氢化钠，100mL环氧氯丙烷，置于恒温摇床中，在40℃反应2小时后，用大量蒸馏水冲洗直至中性，结束反应。用硫代硫酸钠法检测该载体上的环氧基团数量，测得每克载体上有55μmol的环氧基。
(2)键接天冬氨酸：取步骤(1)中反应得到的琼脂糖凝胶100mL，用大量蒸馏水冲洗，抽干后加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500毫升1.5mol/L 的天冬氨酸溶液(用碳酸钠调pH为12)，置于恒温摇床中，在60℃反应4小时，用大量蒸馏水冲洗，结束反应。键接在琼脂糖凝胶上的金属螯合基团等于步骤(1)中载体上的环氧基，约为55μmol/g载体。
(3)键接环氧氯丙烷：取步骤(2)中反应得到的琼脂糖凝胶100mL，用大量蒸馏水冲洗，抽干后加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入150毫升1mol/L 的碳酸钠溶液，100ml环氧氯丙烷，置于恒温摇床中，在40℃反应2小时，用大量蒸馏水冲洗，抽干，然后加入3mol/L的氢氧化钠溶液，置于恒温摇床中，在40℃反应1小时，用大量蒸馏水冲洗直至中性，结束反应。用高碘酸钠法检测该载体上的环氧基团数量，测得每克载体上有50μmol的环氧基。获得的活性载体保存在0.1％叠氮钠水溶液中备用。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
(1)重组蛋白A细菌破碎上清液的制备
通过人工合成的方法获得蛋白A的编码序列(SEQ.ID.NO.1)，该序列包括天然蛋白A中EDABC结构域的序列，位于序列5’端的限制性内切酶NdeI的识别序列和3’端XhoI的识别序列之间。
通过NdeI和XhoI酶切，将上述序列连接到大肠杆菌表达菌株pET-22b，该菌株的C端含有6×His标签，获得表达质粒体。然后将该质粒体转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，获得C端带有6×His标签的重组蛋白A表达菌株。
将该菌株分别在三个装有6L的LB培养基的摇瓶中于37℃、200rpm振荡培养至OD600＝1.2，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为1mM，继续振摇6小时后，离心收集三个摇瓶的菌体(6000rpm，20分钟)共约180 克。将按上述方法获得的菌体混匀于900毫升的PBS缓冲液，超声破碎细胞(超声时间5s，间隔时间5s，超声次数99次，功率300W)后离心收集(8000rpm， 20分钟)上清组分，获得细胞破碎上清液约900毫升。
(2)蛋白A免疫吸附材料的制备
将上述100ml活性载体用大量蒸馏水冲洗，抽干后加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500毫升0.2mol/L的氯化钴溶液，置于恒温摇床中，在30℃振荡 1小时后，用大量蒸馏水冲洗、抽干。然后加入步骤(1)得到的细胞破碎上清液200mL，加入咪唑至咪唑浓度为10mM，置于恒温摇床中，10℃反应24小时后(本实施例的细胞破碎上清液pH约为7)，依次用大量蒸馏水冲洗、500毫升 0.05mol/L的EDTA溶液、大量蒸馏水冲洗，然后抽干，加入200毫升1mol/L 的乙醇胺溶液(用盐酸调pH值为9)，置于恒温摇床中，25℃反应10小时封端，最后用大量蒸馏水冲洗，抽干，获得蛋白A免疫吸附材料。
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
采集上述蛋白A免疫吸附材料1毫升，加入健康人血浆10mL，在37℃振荡2小时进行吸附。将该混悬液用大量生理盐水冲洗，除去血浆，然后用50毫升0.1mol/L的柠檬酸溶液(pH＝2.5)洗脱吸附在材料上的IgG抗体，在280nm 测试洗脱液的吸光度A。
作为对照试验，将1毫升琼脂糖凝胶代替蛋白A免疫吸附材料，与上述方法同法处理。
通过下式计算蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量。
Figure GDA0002375568410000071
A：吸附试验中洗脱液在280nm的吸光度
A0：对照试验中洗脱液在280nm的吸光度
计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为46mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
将上述蛋白A免疫吸附材料30毫升，放入烧杯中分别用0.1mol/L的氢氧化钠浸泡4小时，生理盐水浸泡2小时后，装于一根φ26×50mm的吸附柱(高温蒸汽灭菌)中，然后用大量生理盐水充分冲洗柱子(以上操作均在超净工作台进行)。以动物实验狗(体重约为10kg)为试验对象，将狗麻醉后，建立体外循环。从狗的股动脉中以60ml/min的速度引出血液，经过血浆分离器分离出血浆，经另一个泵驱动以25ml/min的速度进入吸附柱进行IgG吸附，经过吸附柱的血浆与血细胞混合一同泵入狗的股动脉中。吸附1小时后，完成吸附试验。试验动物狗在免疫吸附后当天恢复正常生理活动，试验后一周未发现异常症状。
分别抽取试验前和试验后狗的血浆进行IgG浓度的测试，计算IgG的下降率。IgG下降率按照以下公式计算：
下降率＝(Cb-Ca)/Cb×100％
Cb为试验前狗的IgG浓度
Ca为试验后狗的IgG浓度
计算结果表示，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为35％。
实施例2
一、活性载体的制备
(1)环氧氯丙烷活化：取100mL纤维素微球(MT500，80-100μm)，用蒸馏水冲洗干净后，抽干，加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入150mL 2mol/L的氢氧化钠水溶液，0.3克硼氢化钠，100mL环氧氯丙烷，置于恒温摇床中，在30℃反应6小时后，用大量蒸馏水冲洗直至中性，结束反应。用硫代硫酸钠法检测该载体上的环氧基团数量，测得每克载体上有45μmol的环氧基。
(2)键接天冬氨酸：取步骤(1)中反应得到的纤维素微球100mL，用大量蒸馏水冲洗，抽干后加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500毫升0.5mol/L 的天冬氨酸溶液(用碳酸钠调pH为11)，置于恒温摇床中，在45℃反应8小时，用大量蒸馏水冲洗，结束反应。键接在纤维素微球上的金属螯合基团等于步骤(1)中载体上的环氧基，约为45μmol/g载体。
(3)键接环氧氯丙烷：取步骤(2)中反应得到的纤维素微球100mL，用大量蒸馏水冲洗，抽干后加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入150毫升0.5mol/L 的碳酸钠溶液，100ml环氧氯丙烷，置于恒温摇床中，在30℃反应4小时，用大量蒸馏水冲洗，抽干，然后加入2mol/L的氢氧化钠溶液，置于恒温摇床中，在25℃反应2小时，用大量蒸馏水冲洗直至中性，结束反应。用高碘酸钠法检测该载体上的环氧基团数量，测得每克载体上有40μmol的环氧基。获得的活性载体保存在0.1％叠氮钠水溶液中备用。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
(1)重组蛋白A细菌破碎上清液的制备
制备方法如实施例1。
(2)蛋白A免疫吸附材料的制备
将上述100ml活性载体用大量蒸馏水冲洗，抽干后加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500毫升0.2mol/L的硫酸铜溶液，置于恒温摇床中，在30℃振荡 1小时后，用大量蒸馏水冲洗、抽干。然后加入步骤(1)得到的细胞破碎上清液200mL，加入咪唑至咪唑浓度为5mM，置于恒温摇床中，25℃反应18小时后(本实施例的细胞破碎上清液pH约为7)，依次用大量蒸馏水冲洗、500毫升0.05mol/L的EDTA溶液、大量蒸馏水冲洗，然后抽干，加入200毫升0.2mol/L的巯基乙醇溶液(用碳酸钠调pH值为9)，置于恒温摇床中，25℃反应10小时封端，最后用大量蒸馏水冲洗，抽干，获得蛋白A免疫吸附材料。
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
测试方法如实施例1，计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为52mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
测试方法如实施例1，计算结果表明，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为38％。
实施例3
一、活性载体的制备
(1)环氧氯丙烷活化：取100mL琼脂糖凝胶微球(Sepharose 4FF)，用蒸馏水冲洗干净后，抽干，加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入150mL 2mol/L的氢氧化钠水溶液，0.3克硼氢化钠，100mL环氧氯丙烷，置于恒温摇床中，在20℃反应8小时后，用大量蒸馏水冲洗直至中性，结束反应。用硫代硫酸钠法检测该载体上的环氧基团数量，测得每克载体上有35μmol的环氧基。
(2)键接天冬氨酸：取步骤(1)中反应得到的琼脂糖凝胶微球100mL，用大量蒸馏水冲洗，抽干后加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500毫升0.2mol/L 的天冬氨酸溶液(用碳酸钠调pH为10)，置于恒温摇床中，在40℃反应12小时，用大量蒸馏水冲洗，结束反应。键接在琼脂糖凝胶微球上的金属螯合基团等于步骤(1)中载体上的环氧基，约为35μmol/g载体。
(3)键接环氧氯丙烷：取步骤(2)中反应得到的琼脂糖凝胶微球100mL，用大量蒸馏水冲洗，抽干后加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入150毫升0.2mol/L 的碳酸钠溶液，100ml环氧氯丙烷，置于恒温摇床中，在20℃反应8小时，用大量蒸馏水冲洗，抽干，然后加入1.5mol/L的氢氧化钠溶液，置于恒温摇床中，在20℃反应2小时，用大量蒸馏水冲洗直至中性，结束反应。用高碘酸钠法检测该载体上的环氧基团数量，测得每克载体上有26μmol的环氧基。获得的活性载体保存在0.1％叠氮钠水溶液中备用。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
(1)重组蛋白A细菌破碎上清液的制备
制备方法如实施例1。
(2)蛋白A免疫吸附材料的制备
将上述100ml活性载体用大量蒸馏水冲洗，抽干后加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500毫升0.2mol/L的氯化镍溶液，置于恒温摇床中，在30℃振荡 1小时后，用大量蒸馏水冲洗、抽干。然后加入步骤(1)得到的细胞破碎上清液200mL，加入咪唑至咪唑浓度为20mM，置于恒温摇床中，30℃反应12小时后(本实施例的细胞破碎上清液pH约为7)，依次用大量蒸馏水冲洗、500毫升 0.05mol/L的EDTA溶液、大量蒸馏水冲洗，然后抽干，加入200毫升0.2mol/L 的甘氨酸溶液(用碳酸钠调pH值为9)，置于恒温摇床中，25℃反应10小时封端，最后用大量蒸馏水冲洗，抽干，获得蛋白A免疫吸附材料。
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
测试方法如实施例1，计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为55mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
测试方法如实施例1，计算结果表明，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为40％。
上述实施例仅为本发明的其中具体实现方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些显而易见的替换形式均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 云南师范大学
<120> 一种定向固定蛋白A的活性载体和制备方法以及蛋白A免疫吸附材料的制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 877
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggcgcaac acgatgaagc tcaacaaaat gctttttatc aagtcttaaa tatgcctaac 60
ttaaatgctg atcaacgcaa tggttttatc caaagcctta aagatgatcc aagccaaagt 120
gctaacgttt taggtgaagc tcaaaaactt aatgactctc aagctccaaa actgatgcgc 180
aacaaaataa cttcaacaaa gatcaacaaa gcgccttcta tgaaatcttg aacatgccta 240
acttaaacga agcgcaacgt aacggcttca ttcaaagtct taaagacgac ccaagccaaa 300
gcactaacgt tttaggtgaa gctaaaaaat taaacgaatc tcaagcaccg aaactgataa 360
caatttcaac aaagaacaac aaaatgcttt ctatgaaatc ttgaatatgc ctaacttaaa 420
cgaagaacaa cgcaatggtt tcatccaaag cttaaaagat gacccaagcc aaagtgctaa 480
cctattgtca gaagctaaaa agttaaatga atctcaagca ccgaaagcgg ataacaaatt 540
caacaaagaa caacaaaatg ctttctatga aatcttacat ttacctaact taaacgaaga 600
acaacgcaat ggtttcatcc aaagcctaaa agatgaccca agccaaagcg ctaacctttt 660
agcagaagct aaaaagctaa atgatgctca agcaccaaaa gctgacaaca aattcaacaa 720
agaacaacaa aatgctttct atgaaatttt acatttacct aacttaactg aagaacaacg 780
taacggcttc atccaaagcc ttaaagacga tccttcggtg agcaaagaaa ttttagcaga 840
agctaaaaag ctaaacgatg ctcaagcacc aaaaccc 877

Claims (10)

1.一种定向固定蛋白A的活性载体，其特征在于，它具有如下的化学结构：
Figure FDA0002375568400000011
其中，
Figure FDA0002375568400000012
代表亲水性凝胶微球。
2.根据权利要求1所述的定向固定蛋白A的活性载体，其特征在于，金属螯合基由两个羧基和一个叔氨基组成，能螯合二价金属离子。
3.根据权利要求1所述的定向固定蛋白A的活性载体，其特征在于，所述活性载体上含有20～60μmol/g的环氧基和20～60μmol/g金属螯合基。
4.一种如权利要求1或2或3所述的定向固定蛋白A的活性载体的制备方法，其特征在于，
包括如下步骤：
S1：在亲水性凝胶微球上形成环氧基；
S2：在步骤S1所得的产物上形成具有仲氨基的金属螯合基，该金属螯合基是由环氧基反应形成；
S3：将步骤S2所得的产物置于碳酸钠溶液中，加入环氧氯丙烷，环氧氯丙烷与仲氨基反应，随后用蒸馏水冲洗、抽干；
S4：将步骤S3所得的产物置于氢氧化钠溶液中反应，随后用蒸馏水冲洗获得活性载体。
5.根据权利要求4所述的定向固定蛋白A的活性载体的制备方法，其特征在于，
步骤S1中：将亲水性凝胶微球与2～3M的氢氧化钠溶液混合后，加入硼氢化钠和环氧氯丙烷，在20～40℃反应2～8小时后，用蒸馏水冲洗、抽干；
步骤S2中：将步骤S1中所得产物加入0.2～1.5M的天冬氨酸溶液，调节pH至10～12，在40～60℃反应4～12小时后，用蒸馏水冲洗、抽干。
6.根据权利要求4所述的定向固定蛋白A的活性载体的制备方法，其特征在于，
步骤S3中：将步骤S2中所得产物加入0.2～1M的碳酸钠溶液混合后，加入环氧氯丙烷，在20～40℃反应2～8小时后，用蒸馏水冲洗、抽干；
步骤S4中：将步骤S3中所得产物加入1.5～3M的氢氧化钠溶液，在20～40℃反应1～2小时后，用蒸馏水冲洗至中性，获得活性载体。
7.一种蛋白A免疫吸附材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a：将6×His引入蛋白A的C端，获得重组蛋白A表达菌株后，培养发酵得到带有组氨酸标签的蛋白A菌体，破碎后离心，得到细胞破碎上清液；
b：将权利要求1或2或3所述的活性载体与金属离子溶液混合，振荡后用蒸馏水冲洗、抽干，然后与步骤a得到的细胞破碎上清液混合，加入咪唑后反应，反应结束后用蒸馏水冲洗、抽干；
c：将步骤b所得产物用EDTA溶液冲洗，除去金属离子，然后用封端试剂与残余的环氧基反应封端，得免疫吸附材料。
8.根据权利要求7所述的蛋白A免疫吸附材料的制备方法，其特征在于，步骤b中，加入咪唑至咪唑的浓度为5～20mM，在pH为6.8～7.8，10～30℃反应12～24小时。
9.根据权利要求7所述的蛋白A免疫吸附材料的制备方法，其特征在于，步骤b中，金属离子溶液为含有Cu2+、Zn2+、Co2+或Ni2+的水溶液。
10.根据权利要求7所述的蛋白A免疫吸附材料的制备方法，其特征在于，步骤c中，封端试剂为乙醇胺、巯基乙醇或甘氨酸。
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