CN101323454A - 表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

一种表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球制备方法，由制备磁性二氧化硅微球、磁性二氧化硅微球的环氧基化、磁性二氧化硅微球羧基化、金属离子的螯合工艺步骤组成。本发明与现有的制备方法相比，具有设计合理、操作简单、金属螯合量大等优点。采用本发明制备的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球中含有钴离子，具有与修饰微球间较强的结合力不易使钴离子泄漏，而且与蛋白质上的组氨酸具有较高选择性和合适的结合强度，使表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球对六聚组氨酸标签蛋白有很高的选择性和易于实现目标蛋白的分离和纯化。采用本发明所制备表面鳌合金属离子的磁性二氧化硅微球可用于分离六聚组氨酸标签蛋白。

Description

表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球制备方法及其用途

技术领域

本发明属于材料技领域，具体涉及到用于从大肠杆菌中分离六聚组氨酸蛋白的材料。

背景技术

生物磁分离技术是在传统磁分离技术的基础上发展起来，以细胞、细菌、核酸和蛋白质等生物体为应用对象的高效分离技术。它利用磁性或磁性标记生物体在外磁场作用下做定性运动这一特性，对目标生物体进行提取、富集、分离和纯化。早期的工作主要集中于发展磁性标记物的制备技术上，包括通过在磁流体中浸渍将磁性纳米粒子吸附到琼脂糖、聚丙烯酰胺、聚戊二醛和聚乙烯醛等聚合物微球中。这种微球以颗粒大小分布均匀和磁性粒子含量均匀为特征，保证了不同生物分离过程的可重现性和可控性。生物磁分离技术与标准分离步骤相比有一定优势。首先磁分离过程通常非常简单，只涉及几个处理步骤，所有的纯化步骤都可在单个试管或者容器中发生，不需要昂贵的液相色谱系统、离心机、过滤器或者其它设备。分离过程可以在含有悬浮固体物质的粗制样品上直接进行。在某些情况下(例如细胞内蛋白质的提取)甚至可以整合裂解和分离步骤，从而缩短整个分离时间。磁分离技术对细胞、蛋白质和核酸等生物体通常是非常温和的。与高速离心和亲和色谱相比，磁分离技术具有较低的剪切力，能较好地保持被分离细胞的活力和生物分子的生物活性。

目前，生物磁分离技术正在成为生命科学研究的一个重要手段。在细胞生物学领域中，根据细胞表面表达的不同蛋白质，表面结合特异性抗体的磁珠被用来分离富集特殊类型的细胞。在蛋白质科学领域内，根据蛋白质表面特性或组成氨基酸的差异，利用金螯合磁性微球可对蛋白质进行分离、富集和纯化。在分子生物学研究中，经常涉及核酸的分离和纯化，基于磁珠的核酸纯化方法具有高效快速和易于自动化的特点，正在逐步替代传统的溶剂萃取法，广泛地应用于核酸的提取、纯化、序列测定和扩增等过程中。磁性高分子微球制备方法有机械分散或喷珠法、单体聚合法、渗磁法、大分子稳定铁氧化物溶胶法、天然磁颗粒、磁性转化法。传统方法难以对蛋白质进行分离且保持其活性，但采用连在磁珠上的单克隆抗体进行免疫沉淀富集，电泳法检测可达想要结果。用磁珠分离细胞溶菌液中的蛋白质，几乎不需要预先处理，与其它方法相比，非特异性结合也较少。要从全血、培养上清液、血清、腹水中分离蛋白质，用于制备、分析，运用磁珠作为固相载体进行免疫测定的优点在于快速的结合动力学和简单的分离，洗涤过程。在蛋白质纯化中，为了得到高结合容量需使用大孔如粒径为3.5um，并用链霉亲和素修饰的磁珠，生物素修饰的免疫球蛋白(IgM)可顺利结合到磁珠上。键合配基的活性不会因孔结构而改变。

融合标签技术是20世纪末兴起的一种基于报告基因的重组DNA技术，其主要过程是利用重组DNA技术在靶蛋白编码基因的3端或5端融合某种标签的编码基因，通过适宜的宿主来表达重组蛋白质，表达的重组蛋白质可以通过融合的标签与包被在固相基质上的特异配基结合而进行纯化。

目前常用的蛋白纯化标签是GST，His和表位标签。最常用的标签是多聚组氨酸，即His标签。该标签由6～10个连续组氨酸组成，置于蛋白的氨基或梭基末端。His标签与其它标签相比有很多明显优势：①对金属离子如镍、钻有高度的选择性和亲和力；②与金属离子的结合不受变性剂(尿素、肌)的影响；③温和多样的洗脱条件(100～250mmol/Lol/L咪哇，低pH，10mmol/Lol/LEDTA)。目前已有各种商品化介质(Ni-NTA-Agarose，Ni-IDA-Agarose)提供。另外，抗His标签的单抗或多抗也被应用于His融合蛋白的纯化。

金属螯合亲和色谱(Immol/Lobilized Metal ion Affinity Chrometography，IMAC)最早是由Porath于1975年提出的。Porath认为，某些蛋白质与重金属离子之间的亲和力可以作为现代色谱技术中蛋白质分离与纯化的基础驱动力。具有这类特性的蛋白质必然拥有组氨酸或半胱氨酸等结构片段，可以与其产生非特异性亲和力的金属离子主要是过渡族金属离子Zn²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、Ni²⁺等。

Porath以琼脂糖为基质，环氧氯丙烷为交联剂，亚氨基二乙酸(IDA)为配基合成了一系列分别螯合Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺的新色谱填料，并用该系列填料对血清蛋白分别进行了分离纯化。例如，专利号为200710040486、发明名称为《一种表面固定金属离子的磁性微球及其制备方法和应用》专利中，采用(2，3-环氧丙氧基)丙基三乙氧基硅烷和亚氨基二乙酸(IDA)对其进行表面化学修饰，进而固定金属离子而获得该固定金属离子的磁性微球作为微吸附剂。在常见的络合剂中IDA是三配位，与金属离子之间的作用力比较弱，很容易引起金属离子的遗漏问题，N，N，N′-三(羧甲基)乙烯二胺TED是五配位，与金属离子的作用力较强，由于其仅余一个键与蛋白质作用，所以和蛋白质的作用力又太弱。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述磁性高分子微球制备方法的缺点提供一种设计合理、工艺可行、操作简便、具有超顺磁性的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球制备方法。

本发明所要解决的技术问题在于提供一种表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球的新用途。

解决上述技术问题所采用的技术方案是该制备方法步骤如下：

1、制备磁性二氧化硅微球

将十六烷基三甲基溴化铵与甲苯按质量比为1∶12～20加入到四口烧瓶内，用搅拌器以1000转/分钟搅拌均匀，将FeCl₂-4H₂O与FeCl₃·6H₂O按质量比为1∶3溶解于二次水中，配制成浓度为130～150g/L的水溶液，在2～3mL/min N₂气保护下将此溶液以4～5mL/h滴加到上述混合物中，800转/分钟持续搅拌4～6小时，再加入质量浓度为25％氨水，十六烷基三甲基溴化铵与质量浓度为25％氨水的质量比为1∶0.1～0.2，以800转/分钟持续搅拌2小时，在混合物中，有四氧化三铁纳米颗粒形成。将十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯按质量比为1∶1～1.5的正硅酸乙酯缓慢加入，以800转/分钟搅拌反应，调节pH至8，以2～3mL/h滴加正硅酸乙酯完毕后1小时，停止氮气保护，800转/分钟搅拌，常温常压下老化5天，在产物中加入乙醇，十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比为1∶2～2.5，以2000转/分钟离心40分钟，去掉上层液，沉淀物在乙醇中回流12小时，回流乙醇用量按十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比为1∶20～25计。冷却至室温，离心分离，去掉上层亮黄色溶液。黑色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗涤，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成磁性二氧化硅微球。

2、磁性二氧化硅微球的环氧基化

将磁性二氧化硅微球与甲苯按质量比为1∶1000～1100加入三口烧瓶，用超声清洗机频率为60Hz的超声处理10分钟，在2～3mL/min N₂气保护下，再加入与该混合溶液质量比为1∶25的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷800转/分钟搅拌，110℃回流12小时，用外部磁铁将沉淀物分离，依次用二甲基甲酰胺、丙酮、无水乙醇、水洗涤3次，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球。

3、磁性二氧化硅微球羧基化

将L-天冬氨酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液按质量比为1∶15～20混合溶解加入两口烧瓶内，用搅拌器以1000转/分钟搅拌均匀，通过调节两者的相对量使溶液pH至8。再加入与该混合溶液质量比为1∶100～200的表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球，800转/分钟搅拌，并加热至80℃反应24小时。反应完毕，用外部磁铁将沉淀分离，用0.5mol/L乙酸浸泡沉淀10分钟后，弃去乙酸，用二次水洗涤沉淀3次，将洗涤的沉淀放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球。将溴乙酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液按质量比为1∶15～20混合溶解加入两口烧瓶内，用搅拌器以1000转/分钟搅拌均匀，调节pH至9，再加入与该混合溶液质量比为1∶100～200的L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球，室温搅拌24小时。反应完毕，用外部磁铁将沉淀物分离，用0.5mol/L氯化钠水溶液洗涤沉淀6～10次，再用二次水洗涤6～10次，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备得羧基化的磁性二氧化硅微球。

4、金属离子的螯合

将羧基化的磁性二氧化硅微球与浓度为0.2mol/L的CoCl₂·6H₂O按质量比为1∶100～150加入烧杯内，在室温下用磁力搅拌器以100转/分钟搅拌72小时，用外部磁铁将沉淀物分离，用二次水洗沉淀6～10次，在真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成表面螯合的磁性二氧化硅微球。

在本发明制备磁性二氧化硅微球工艺步骤1中，十六烷基三甲基溴化铵与甲苯的优选质量比为1∶12～18，FeCl₂·4H₂O与FeCl₃·6H₂O的质量比为1∶3溶解于二次水中，配制成优选浓度为140～150g/L的水溶液，滴加到上述混合物中，再加入质量浓度为25％氨水，十六烷基三甲基溴化铵与质量浓度为25％氨水的优选质量比为1∶0.15～0.2。在混合物中，将十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯优选按质量比为1∶1.2～1.5的正硅酸乙酯缓慢加入，在产物中加入乙醇，十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的优选质量比为1∶2.1～2.4，沉淀物用乙醇回流12小时，回流乙醇用量按十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比为1∶20～24计，制备成磁性二氧化硅微球。在磁性二氧化硅微球的环氧基化工艺步骤2中，将磁性二氧化硅微球与甲苯按优选质量比为1∶1020～1080加入三口烧瓶内混合。在磁性二氧化硅微球羧基化工艺步骤3中，将L-天冬氨酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液按优选质量比为1∶16～18混合溶解加入两口烧瓶内，再加入与该混合溶液优选质量比为1∶120～180的表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球，制备成L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球。将溴乙酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液按优选质量比为1∶15～20混合溶解加入两口烧瓶内，再加入与该混合溶液优选质量比为1∶120～180的L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球。在金属离子的螯合工艺步骤4中，将羧基化的磁性二氧化硅微球与浓度为0.2mol/L的CoCl₂·6H₂O按优选质量比为1∶120～150加入烧杯内。

在本发明制备磁性二氧化硅微球工艺步骤1中，十六烷基三甲基溴化铵与甲苯的最佳质量比为1∶15，FeCl₂·4H₂O与FeCl₃·6H₂O的质量比为1∶3溶解于二次水中，配制成浓度最佳为140g/L的水溶液，滴加到上述混合物中，再加入质量浓度为25％氨水，十六烷基三甲基溴化铵与质量浓度为25％氨水最佳质量比为1∶0.17，在混合物中；将十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯最佳按质量比为1∶1.25的正硅酸乙酯缓慢加入；在产物中加入乙醇，十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的最佳质量比为1∶2.25；沉淀物用乙醇回流12小时，十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的最佳质量比为1∶22.5，制备成磁性二氧化硅微球。在磁性二氧化硅微球的环氧基化工艺步骤2中，将磁性二氧化硅微球与甲苯最佳质量比为1∶1050加入三口烧瓶内混合。在磁性二氧化硅微球羧基化工艺步骤3中，将L-天冬氨酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液按最佳质量比为1∶18混合溶解加入两口烧瓶内，再加入与该混合溶液最佳质量比为1∶150的表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球，制备成L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球；将溴乙酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液最佳按质量比为1∶18混合溶解加入两口烧瓶内，再加入与该混合溶液最佳质量比为1∶150的L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球。在金属离子的螯合工艺步骤4中，将羧基化的磁性二氧化硅微球与浓度为0.2mol/L的CoCl₂·6H₂O最佳按质量比为1∶120加入烧杯内。

上述制备的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球在大肠杆菌中分离六聚组氨酸标签蛋白中的用途。

本发明采用了溶胶凝胶法制备了以四氧化三铁纳米颗粒为核，以正硅酸乙酯作硅源为壳的磁性二氧化硅微球，以此微球作模版经环氧硅烷偶联剂3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷、L-天冬氨酸以及溴乙酸修饰后形成的配体为络合剂，螯合金属钴离子，制备成表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球。本发明采用了L-天冬氨酸和溴乙酸共同修饰磁性二氧化硅微球，可以为金属离子提供多个配位点，不仅保证了修饰微球与金属离子的作用力较强，同时金属离子未饱和配位点可以与蛋白质作用，从而实现表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球分离溶液中的蛋白质。采用本发明制备的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球中含有钴离子，具有与修饰微球间较强的结合力不易使钴离子泄漏，而且与蛋白质上的组氨酸具有较高选择性和合适的结合强度，从而使表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球对六聚组氨酸标签蛋白有很高的选择性和易于实现目标蛋白的分离和纯化。本发明与现有的制备方法相比，具有设计合理、操作简单、金属螯合量大等优点。采用本发明所制备表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球可用子分离六聚组氨酸标签蛋白。

附图说明：

图1是实施例1制备表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球的VSM磁滞回线。

图2是实施例1制备的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅硅微球的透射电子显微镜照片。

图3是实施例1制备的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球的扫描电子显微镜照片。

图4是实施例1制备的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球XPS光电子能谱图。

图5是实施例1制备的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球XPS光电子能谱N元素的化学位移谱图。

图6是实施例1制备的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球的全自动X-射线衍射图谱。

图7是以实例1制备的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球测得的电泳照片。

图8是实例1的磁性二氧化硅微球和表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球分离蛋白的电泳照片。

图9是不同量表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球的纯化分析蛋白的电泳照片。

图10是用环氧氯丙烷及3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷分别修饰所得磁性二氧化硅微球纯化分析蛋白的电泳照片。

图11六聚组氨酸标签蛋白标准曲线。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发1明不限于这些实施例。

实施例1

本实施例给出了表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球制备方法，其工艺步骤如下：

1、制备磁性二氧化硅微球

取7.2892g十六烷基三甲基溴化铵与100.0g甲苯加入到四口烧瓶内，十六烷基三甲基溴铵与甲苯的质量比为1∶15，用搅拌机以1000转/分钟搅拌均匀；将0.329g FeCl₂·4H₂O与0.987g FeCl₃·6H₂O溶解于9.4397g二次水中配制成浓度为140g/L的水溶液，FeCl₂·4H₂O与FeCl₃·6H₂O质量比为1∶3，在2～3mL/min N₂气保护下将此溶液以4～5mL/h滴加到上述混合物中，800转/分钟持续搅拌4～6小时；再加入质量浓度为25％氨水2mL，十六烷基三甲基溴化铵与质量浓度为25％氨水的质量比为1∶0.17，800转/分钟持续搅拌2小时，在混合物中有四氧化三铁纳米颗粒形成：以2～3mL/h缓慢加入正硅酸乙酯9.79mL，十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯按质量比为1∶1.25，800转/分钟搅拌反应，用氨水调节pH至8，以2～3mL/h滴加正硅酸乙酯滴加完毕后1小时，停止氨气保护：800转/分钟搅拌，常温常压下老化5天；在产物中加入乙醇16.4g。十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比为1∶2.25，以2000转/分钟离心40分钟，去掉上层液，沉淀物在164g乙醇中回流12小时，回流乙醇用量按十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比为1∶22.5计；分离沉淀物，并去掉上层亮黄色溶液，黑色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗涤，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成磁性二氧化硅微球。

2.磁性二氧化硅微球的环氧基化

取磁性二氧化硅微球0.1g、甲苯105g加入三口烧瓶，磁性二氧化硅微球与甲苯的质量比为1∶1050，用超声清洗机频率在60Hz下超声处理10分钟，在2～3mL/minN₂气保护下，再加入3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷4.2g，3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷与该混合溶液质量比为1∶25，800转/分钟搅拌，110℃回流12小时，用外部磁铁将沉淀物分离，依次用二甲基甲酰胺、丙酮、无水乙醇、水洗涤3次，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球。

3.磁性二氧化硅微球羧基化

取L-天冬氨酸2.66g、体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液47.88g，L-天冬氨酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液按质量比为1∶18混合溶解加入两口烧瓶内，用搅拌器以1000转/分钟搅拌均匀，通过调节两者的相对量使溶液pH至8：再加入表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球0.337g，表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球与该混合溶液质量比为1∶150，800转/分钟搅拌，并加热至80℃反应24小时；反应完毕，用外部磁铁将沉淀分离，用0.5mol/L乙酸浸泡沉淀10分钟，用二次水洗沉淀3次，将洗涤的沉淀放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球；将溴乙酸2.77g、体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液50.02g混合溶解加入两口烧瓶内，溴乙酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液的质量比为1∶18，用搅拌器以1000转/分钟搅拌均匀，调节两者相对比例使pH至9；再加入L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球0.352g，L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球与该混合溶液质量比为1∶150，室温搅拌24小时；反应完毕，用外部磁铁将沉淀物分离，用0.5mol/L氯化钠水溶液洗涤沉淀6～10次，再用二次水洗涤6～10次，将洗涤的沉淀放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备得羧基化的磁性二氧化硅微球。

4.金属离子的螯合

将羧基化的磁性二氧化硅微球0.2g与浓度为0.2mol/L的CoCl₂·6H₂O的水溶液24g加入烧杯内，羧基化的磁性二氧化硅微球与浓度为0.2mol/L的CoCl₂·6H₂O的质量比为1∶120；室温用磁力搅拌器以100转/分钟搅拌72小时后，用外部磁铁将沉淀物分离，用二次水洗涤沉淀6～10次，所得沉淀在真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球。

上述制备的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球可用于在大肠杆菌中分离六聚组氨酸标签蛋白。

实施例2

在制备磁性二氧化硅微球工艺步骤1中，取7.2892g十六烷基三甲基溴化铵与87.47g甲苯加入到四口烧瓶内，十六烷基三甲基溴化铵与甲苯的质量比为1∶12，用搅拌器以1000转/分钟搅拌均匀；将0.305g FeCl₂·4H₂O与0.916g FeCl₃·6H₂O溶解于9.4397g二次水中配制成浓度为130g/L的水溶液，FeCl₂·4H₂O与FeCl₃·6H₂O质量比为1∶3，在2～3mL/min N₂气保护下以4～5mL/h将此溶液滴加到上述混合物中，800转/分钟持续搅拌4～6小时；再加入质量浓度为25％氨水1.15mL，十六烷基三甲基溴化铵与质量浓度为25％氨水的质量比为1∶0.1，800转/分钟持续搅拌2小时，在混合物中，有四氧化三铁纳米颗粒形成；以2～3mL/h缓慢加入正硅酸乙酯6.78mL，十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯按质量比为1∶1，800转/分钟搅拌反应，用氨水调节pH至8，正硅酸乙酯滴加完毕后1小时，停止氮气保护；800转/分钟搅拌，常温常压下老化5天；在产物中加入乙醇14.58g，十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比为1∶2，以2000转/分钟离心40分钟，去掉上层液，沉淀物在145.8g乙醇中回流12小时，回流乙醇用量按十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比为1∶20计；离心分离沉淀，去掉上层亮黄色溶液，黑色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗涤；将洗涤的沉淀放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成磁性二氧化硅微球。

在磁性二氧化硅微球的环氧基化工艺步骤2中，取磁性二氧化硅微球0.1g、甲苯100g加入三口烧瓶，磁性二氧化硅微球与甲苯的质量比为1∶1000，用超声清洗机频率为60Hz的超声处理10分钟：在2～3mL/min N₂气保护下，再加入3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷4.0g，3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷与该混合溶液质量比为1∶25，该工艺步骤中的其它步骤与实施例1相同。制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球。

在磁性二氧化硅微球羧基化工艺步骤3中，取L-天冬氨酸2.66g、体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液39.9g，L-天冬氨酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液的质量比为1∶15混合溶解加入两口烧瓶内，用搅拌器以1000转/分钟搅拌均匀，通过调节两者的相对量使溶液pH至8；再加入表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球0.4256g，表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球与该混合溶液质量比为1∶100，800转/分钟搅拌，并加热至80℃反应24小时；反应完毕，用外部磁铁将沉淀分离，用0.5mol/L乙酸浸泡沉淀10分钟，用二次水洗沉淀3次，将洗涤的沉淀放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球；将溴乙酸2.77g、体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液41.55g混合溶解加入两口烧瓶内，溴乙酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液的质量比为1∶15，用搅拌器以10000转/分钟搅拌均匀，调节两者相对比例使pH保持至9；再加入L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球0.4332g，L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球与该混合溶液质量比为1∶100。该工艺步骤中的其它步骤与实施例1相同。制备得羧基化的磁性二氧化硅微球。

在金属离子的螯合工艺步4中，将羧基化的磁性二氧化硅微球0.2g与浓度为0.2mol/L的CoCl₂·6H₂O 20g加入烧杯内，羧基化的磁性二氧化硅微球与浓度为0.2mol/L的CoCl₂·6H₂O的质量比为1∶100。该工艺步骤中的其它步骤与实施例1相同。制备成表面修饰的磁性二氧化硅微球。

实施例3

在制备磁性二氧化硅微球工艺步骤1中，取7.2892g十六烷基三甲基溴化铵与145.784g甲苯加入到四口烧瓶内，十六烷基三甲基溴化铵与甲苯的质量比为1∶20，用搅拌器以1000转/分钟搅拌均匀；将0.354g FeCl₂·4H₂O与1.060g FeCl₃·6H₂O溶解于9.4397g二次水中配制成浓度为150g/L的水溶液，FeCl₂·4H₂O与FeCl₃·6H₂O质量比为1∶3，在2～3mL/min N₂气保护下将此溶液以4～5mL/h滴加到上述混合物中，800转/分钟持续搅拌4～6小时；再加入质量浓度为25％氨水2.28mL，十六烷基三甲基溴化铵与质量浓度为25％氨水的质量比为1∶0.2，800转/分钟持续搅拌2小时，在混合物中，有四氧化三铁纳米颗粒形成；以2～3mL/h缓慢加入正硅酸乙酯11.76mL，十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯按质量比为1∶1.5，800转/分钟搅拌反应，用氨水调节pH至8，以2～3mL/h滴加正硅酸乙酯完毕后1小时，停止氮气保护：800转/分钟搅拌，常温常压下老化5天；在产物中加入乙醇18.223g，十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比为1∶2.5，以2000转/分钟离心40分钟，去掉上层液，沉淀物在182.23g乙醇中回流12小时，回流乙醇用量按十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比为1∶25计；冷却至室温，离心分离，去掉上层亮黄色溶液，黑色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗涤，将洗涤的沉淀放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成磁性二氧化硅微球。

在磁性二氧化硅微球的环氧基化工艺步骤2中，取磁性二氧化硅微球0.1g、甲苯110g加入三口烧瓶，磁性二氧化硅微球与甲苯的质量比为1∶1100，用超声清洗机在频率为60Hz下超声处理10分钟；在2～3mL/min N₂气保护下，再加入3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷4.4g，3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷与该混合溶液质量比为1∶25，该工艺步骤中的其它步骤与实施例1相同。制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球。

在磁性二氧化硅微球羧基工艺步骤3中，取L-天冬氨酸2.66g、体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液53.2g，L-天冬氨酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液按质量比为1∶20混合溶解加入两口烧瓶内，用搅拌机以1000转/分钟搅拌均匀，通过调节两者的相对量使溶液pH至8；再加入表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球0.2793g，表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球与该混合溶液质量比为1∶200，800转/分钟搅拌，并加热至80℃反应24小时：反应完毕，用外部磁铁将沉淀分离，用0.5mol/L乙酸浸泡沉淀10分钟，用二次水洗涤沉淀3次，将洗涤的沉淀放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球；将溴乙酸2.77g、体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液65.4g混合溶解加入两口烧瓶内，溴乙酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液按质量比为1∶20，用搅拌器以1000转/分钟搅拌均匀，调节两者相对比例使pH至9；再加入L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球0.291g，L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球与该混合溶液质量比为1∶200。该工艺步骤中的其它步骤与实施例1相同。制备得羧基化的磁性二氧化硅微球。

在金属离子的螯合工艺步4中，将羧基化的磁性二氧化硅微球0.2g与浓度为0.2mol/L的CoCl₂·6H₂O 30g加入烧杯内，羧基化的磁性二氧化硅微球与浓度为0.2mol/L的CoCl₂·6H₂O的质量比为1∶150。该工艺步骤中的其它步骤与实施例1相同。制备成表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球。

为了确定本发明最佳的工艺步骤，发明人进行了大量的实验室研究试验，各种试验情况如下：

1、不同偶联剂对表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球纯化六聚组氨酸标签蛋白性能的影响

在本发明实施例1的磁性二氧化硅微球的环氧基化工艺步骤2中，将等摩尔的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷和环氧氯丙烷作偶联剂分别加入等量的磁性二氧化硅微球，并在甲苯里回流，分别得到带有环氧基的两种磁性微球，后续工艺步骤与实例1完全相同，得到两种表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球。所得到两种表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球纯化分析蛋白的电泳照片见图10。在图10中，泳道1为蛋白标签的电泳照片，泳道2为裂解液含六聚组氨酸标签蛋白的电泳照片，泳道3为裂解液经3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷为偶联剂所得表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球纯化蛋白后裂解液残留蛋白的电泳照片，泳道4为3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷为偶联剂所得表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球处理含六聚组氨酸标签蛋白裂解液后微球洗脱液中蛋白的电泳照片，泳道7为裂解液经环氧氯丙烷为偶联剂所制表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球纯化蛋白后裂解液残留蛋白的电泳照片，泳道8为环氧氯丙烷为偶联剂所制表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球处理含六聚组氨酸标签蛋白裂解液后微球洗脱液中蛋白的电泳照片。由图10看出，以环氧氯丙烷为偶联剂所制备的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球对目标蛋白无法分离，用3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷做偶联剂制备的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球能有效地选择性分离六聚组氨酸标签蛋白。

2、正硅酸乙酯对表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球纯化六聚组氨酸标签蛋白性能的影响

在本发明实施例1的制备磁性二氧化硅微球的工艺步骤1中，四氧化三铁纳米颗粒不经正硅酸乙酯作用形成磁性二氧化硅微球，而是将四氧化三铁纳米颗粒上直接键合3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，后续其它工艺步骤与实例1完全相同，制备成直接由3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷作为偶联剂的表面螯合金属离子的磁性微球。所制备的表面螯合金属离子的磁性微球纯化分析蛋白的电泳照片见图10。在图10中，泳道5为裂解液经本实验条件下所得表面螯合金属离子的磁性微球纯化蛋白后裂解液残留蛋白的电泳照片，泳道6为本实验条件下所得表面螯合金属离子的磁性微球处理含六聚组氨酸标签蛋白裂解液后微球洗脱液中蛋白的电泳照片。比较泳道5和泳道6照片可以看出，直接在四氧化三铁纳米磁粒上键合3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷所制备的表面螯合金属离子的磁性微球无法有效分离六聚组氨酸蛋白。

为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1制备表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球，使用VSM磁滞回线仪、XPS光电子能谱仪、全自动X-射线衍射仪、扫描电子显微镜、透射电镜、元素分析仪、原子吸收光谱仪对其进行了表征；利用凝胶电泳测试了表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球分离六聚组氨酸标签蛋白性能，各种试验情况如下：

观察物品：表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球

实验仪器：振动样品磁强计型号为vsm-9500；高分辨透射电子显微镜型号为JEM-3010；XPS光电子能谱仪型号为PHI-5400型；全自动X-射线衍射仪型号为D/Max-3c；环境扫描电子显微镜型号为Quanta 200；元素分析仪；原子吸收分光度计型号为TAS 986(G)。

1、观察

按透射电镜、扫描电子显微镜使用方法对表面修饰的磁性二氧化硅微球进行观察，观测结果见图2、图3。由图2、图3可见，透射电镜观察和扫描电子显微镜观察表面修饰的磁性二氧化硅微球呈类球形，结构完整。

2、测试

按VSM磁滞回线仪、XPS光电子能谱仪、全自动X-射线衍射仪、元素分析仪、原子吸收光谱仪，电泳分析的测试方法对表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球进行测试。

3、观测结果

用VSM磁滞回线仪测试表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球结果见图1。由图1可见，表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球顺磁性好，无矫顽力，饱和磁化强度为14.967emu/g。用XPS光电子能谱仪测试的光电子能谱图见图4，由图4可见，Co²⁺离子螯合在表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球上。

各元素的含量见表1。

表1表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球XPS光电子能谱元素含量

元素	峰面积(cts-eV/s)	灵敏常数	浓度
				Si2p	28407	0.339	21.36
Cls	31652	0.296	27.26
				Ols	128827	0.711	46.19
Nls	3340	0.477	1.79
				Fe2p	21280	2.957	1.83
Co2p	22083	3.590	1.57

由表1可见，所得微球含有Si、C、O、N、Fe、Co等元素，表明表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球含有制备该微球相应成分。

表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球XPS光电子能谱N元素的化学位移谱图见图5。由图5可见，N元素峰在399.7ev，说明N元素以叔胺形式存在。

用全自动X-射线衍射仪测定表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球的X-射线衍射图谱示于图6。由图6可见，X-射线衍射图谱2θ在18.2°、30.613°、35.690°、43.420°、53.949°和57.214°等处出现了Fe₃O₄的特征强衍射峰，在22.700°等处出现了SiO₂的特征强衍射峰，这些衍射信号与立方晶系Fe₃O₄的(111)、(220)、(311)、(400)、(422)、(511)等点阵面的衍射峰[JCPDS，65-3107]相一致，在22.700°附近出现了SiO₂无定型的特征衍射峰。用元素分析仪进行测试，得到的磁性二氧化硅微球和表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球的元素含量。

测试结果见表2。

表2磁性二氧化硅微球和表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球的元素含量

由表2可见，表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球与磁性二氧化硅微球相比，C、H、N的含量显著升高，说明磁性二氧化硅微球已被相应的有机成分所修饰。

分别配制100mL体积浓度(umol/L)为40、80、120、160的Co²⁺离子标准溶液，用原子吸收分光光度计进行分析，测得Co²⁺离子浓度与吸光度的标准曲线，并由此标准曲线得到表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球所含Co²⁺离子含量见表3。

表3原子吸收所测的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球所含Co²⁺离子含量

名称	吸光度	浓度(umol/L)	质量(g)	SD	RSD
						1	0.2294	40		0.0029	1.25
2	0.3689	80		0.0039	1.05
						3	0.5031	120		0.0022	0.43
4	0.6540	160		0.0039	0.64
						样品	0.2392	43.2	0.1023	0.0010	0.93
样品	0.4202	94.7	0.2060	0.0053	1.06

由表3可见，在表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球上的钴离子浓度平均值为4.37×10^-5mol/g。

图7是以实例1制备的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球测得的电泳照片。在图7中，泳道1为蛋白标签的电泳照片，泳道2为含六聚组氨酸标签蛋白的裂解液电泳照片，泳道3为表面螯合金属离子的磁性微球纯化蛋白后裂解液残留蛋白的电泳照片，泳道4为表面螯合金属离子的磁性微球处理含六聚组氨酸标签蛋白裂解液后微球洗脱液中蛋白的电泳照片。由图7可见，表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球能够有效地选择性分离六聚组氨酸标签蛋白。

磁性二氧化硅和表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球分离蛋白的电泳照片见图8，在图8中，泳道1为蛋白标签的电泳照片；泳道2为含六聚组氨酸标签蛋白裂解液的电泳照片；泳道3为磁性二氧化硅微球处理含六聚组氨酸标签蛋白裂解液后微球洗脱液中蛋白的电泳照片；泳道4、5为表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球处理含六聚组氨酸标签蛋白裂解液后微球洗脱液中蛋白的电泳照片；泳道6为磁性二氧化硅微球纯化蛋白后裂解液残留蛋白的电泳照片；泳道7、8为表面螯含金属离子的磁性二氧化硅微球纯化蛋白后裂解液残留蛋白的电泳照片。由图8可见，通过第2泳道和第6泳道的对比可知，裂解液中的六聚组氨酸蛋白全部和二氧化硅磁性微粒结合，但洗脱液中的第3泳道中未见明显的蛋白条带，说明六聚组氨酸蛋白和二氧化硅磁性微粒结合是一种非特异性的吸附，可以在清洗步骤中从磁粒上洗去。而对于表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球而言，六聚组氨酸标签蛋白的结合是特异性的，只有通过竞争性洗脱剂才能破坏靶蛋白与表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球之间的亲和作用。

不同用量的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球纯化分析蛋白的电泳照片见图9。在图9中，泳道1为蛋白标签的电泳照片；泳道2为含六聚组氨酸标签蛋白裂解液的电泳照片；泳道3为2mg表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球处理含六聚组氨酸标签蛋白裂解液后微球洗脱液中蛋白的电泳照片；泳道4为4mg表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球处理含六聚组氨酸标签蛋白裂解液后微球洗脱液中蛋白的电泳照片。由图9可见，随着表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球用量增加，纯化得到的六聚组氨酸标签蛋白量也增加，用2mg、4mg表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球纯化蛋白，得到蛋白的量分别为22.26μg、45.52μg。

4、用表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球从大肠杆菌中分离六聚组氨酸融合蛋白

从大肠杆菌中挑取重组菌BL 21(DE 3)-pETlla-dxs的单菌落，接入10mL含Cam⁺，AMP⁺的LB培养液中，30℃过夜培养，将过夜培养的种子液按5mL种子液：200mL LB培养液转接再次扩大培养，35℃，180转/分钟，2～3小时，至光密度为0.4～0.6；加入异丙基-B-D-硫代半糖苷至终浓度100μg/mL，150转/分钟，30℃离心3小时，收菌体。按细胞培养液与裂解液体积比10∶1，用裂解缓冲液(100mmol/LNaH₂PO₄、10mmol/L Tris、10mmol/L咪唑混合，调pH至8.0)重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL，冰浴下超声破菌，离心去除细胞碎片，收集上清液。

取表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球1mg，用裂解缓冲液平衡两遍，磁性分离，去掉上清液，加入含六聚组氨酸标签蛋白的裂解液200μL，裂解缓冲液300μL，室温摇床孵育1小时，磁性分离，取上清液用于电泳分析见图7的泳道3，图8的泳道7、泳道8，在沉淀物中加入清洗缓冲液1mL(50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑，pH 8.0)，清洗一遍，弃清洗上清，在沉淀物中加入洗脱缓冲液100μL(50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，pH 8.0)，室温摇床上振摇5分钟，取上清，该洗脱上清液含有六聚组氨酸蛋白，进行电泳分析见图7的泳道4、图8的泳道4和泳道5、图9的泳道3和泳道4。

用Bradford法测定蛋白浓度：取5μl的六聚组氨酸蛋白样品按常规方法配制成体积浓度(mg/ml)为0、0.1、0.4、0.7、1.1、1.4标准溶液加入200μL Bradford试剂，反应5分钟。用酶标仪于595nm测吸光值，六聚组氨酸蛋白标准溶液中蛋白含量与吸光度的关系见表4，标准曲线见图11。

表4六聚组氨酸蛋白标准溶液中蛋白含量与吸光度的关系

蛋白质含量(mg/ml)    吸  光  值        平均

0                  0.327      0.316    0.3215

0.1                0.355      0.35     0.3525

0.4                0.436      0.448    0.442

0.7                0.518      0.557    0.5375

1.1                0.671      0.659    0.665

1.4                0.745      0.746    0.7455

取3mg表面修饰的磁性二氧化硅微球，等分成3份纯化六聚组氨酸蛋白，各取洗脱上清液，分别测得六聚组氨酸蛋白含量见表5。

表5洗脱上清液中六聚组氨酸蛋白含量

名称     吸光度  浓度μg/μL   纯化的量μg/mg  平均值μg/mg

Sample1  0.3625  0.132593      13.25931

Sample2  0.357   0.114631      11.4631         11.1365

Sample3  0.3485  0.086871      8.687133

由表5可见，采用本发明实施例1制备的1mg表面修饰的磁性二氧化硅微球用于从大肠杆菌中分离六聚组氨酸的量为11.1365μg。

Claims (4)

1、一种表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球制备方法，其特征在于该制备方法步骤如下：

(1)制备磁性二氧化硅微球

将十六烷基三甲基溴化铵与甲苯按质量比为1∶12～20加入到四口烧瓶内，用搅拌器以1000转/分钟搅拌均匀，将FeCl₂·4H₂O与FeCl₃·6H₂O按质量比为1∶3溶解于二次水中，配制成浓度为130～150g/L的水溶液，在2～3mL/min N₂气保护下将此溶液以4～5mL/h滴加到上述混合物中，800转/分钟持续搅拌4～6小时，再加入质量浓度为25％氨水，十六烷基三甲基溴化铵与质量浓度为25％氨水的质量比为1∶0.1～0.2，以800转/分钟持续搅拌2小时，在混合物中，有四氧化三铁纳米颗粒形成；将十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯按质量比为1∶1～1.5的正硅酸乙酯缓慢加入，以800转/分钟搅拌反应，调节pH至8，以2～3mL/h滴加正硅酸乙酯完毕后1小时，停止氮气保护，800转/分钟搅拌，常温常压下老化5天，在产物中加入乙醇，十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比为1∶2～2.5，以2000转/分钟离心40分钟，去掉上层液，沉淀物在乙醇中回流12小时，回流乙醇用量按十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比为1∶20～25计；冷却至室温，离心分离，去掉上层亮黄色溶液；黑色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗涤，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成磁性二氧化硅微球；

(2)磁性二氧化硅微球的环氧基化

将磁性二氧化硅微球与甲苯按质量比为1∶1000～1100加入三口烧瓶，用超声清洗机频率为60Hz的超声处理10分钟，在2～3mL/min N₂气保护下，再加入与该混合溶液质量比为1∶25的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷800转/分钟搅拌，110℃回流12小时，用外部磁铁将沉淀物分离，依次用二甲基甲酰胺、丙酮、无水乙醇、水洗涤3次，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球；

(3)磁性二氧化硅微球羧基化

将L-天冬氨酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液按质量比为1∶15～20混合溶解加入两口烧瓶内，用搅拌器以1000转/分钟搅拌均匀，通过调节两者的相对量使溶液pH至8；再加入与该混合溶液质量比为1∶100～200的表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球，800转/分钟搅拌，并加热至80℃反应24小时；反应完毕，用外部磁铁将沉淀分离，用0.5mol/L 乙酸浸泡沉淀10分钟后，弃去乙酸，用二次水洗涤沉淀3次，将洗涤的沉淀放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球；将溴乙酸与体积浓度为60/L的Na₂CO₃水溶液按质量比为1∶15～20混合溶解加入两口烧瓶内，用搅拌器以1000转/分钟搅拌均匀，调节pH至9，再加入与该混合溶液质量比为1∶100～200的L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球，室温搅拌24小时；反应完毕，用外部磁铁将沉淀物分离，用0.5mol/L氯化钠水溶液洗涤沉淀6～10次，再用二次水洗涤6～10次，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备得羧基化的磁性二氧化硅微球；

(4)金属离子的螯合

将羧基化的磁性二氧化硅微球与浓度为0.2mol/L的CoCl₂·6H₂O按质量比为1∶100～150加入烧杯内，在室温下用磁力搅拌器以100转/分钟搅拌72小时，用外部磁铁将沉淀物分离，用二次水洗沉淀6～10次，在真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成表面鏊合的磁性二氧化硅微球。

2、按照权利要求1所述的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球制备方法，其特征在于：在制备磁性二氧化硅微球工艺步骤(1)中，十六烷基三甲基溴化铵与甲苯的质量比其中为1∶12～18，FeCl₂·4H₂O与FeCl₃·6H₂O的质量比为1∶3溶解于二次水中，其中配制成浓度为140～150g/L的水溶液，滴加到上述混合物中，再加入质量浓度为25％氨水，十六烷基三甲基溴化铵与质量浓度为25％氨水的质量比其中为1∶0.15～0.2；在混合物中，将十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯按质量比其中为1∶1.2～1.5的正硅酸乙酯缓慢加入，在产物中加入乙醇，十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比其中为1∶2.1～2.4，沉淀物用乙醇回流12小时，回流乙醇用量按十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比为1∶20～24计，制备成磁性二氧化硅微球；

在磁性二氧化硅微球的环氧基化工艺步骤(2)中，将磁性二氧化硅微球与甲苯按质量比其中为1∶1020～1080加入三口烧瓶内混合；

在磁性二氧化硅微球羧基化工艺步骤(3)中，将L-天冬氨酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液按质量比其中为1∶16～18混合溶解加入两口烧瓶内，再加入与该混合溶液质量比其中为1∶120～180的表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球，制备成L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球；将溴乙酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液按质量比其中为1∶15～20混合溶解加入两口烧瓶内，再加入与该混合溶液质量比其中为1∶120～180的L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球；

在金属离子的螯合工艺步骤(4)中，将羧基化的磁性二氧化硅微球与浓度为0.2mol/L的CoCl₂·6H₂O其中按质量比为1∶120～150加入烧杯内。

3、按照权利要求1所述的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球制备方法，其特征在于：在制备磁性二氧化硅微球工艺步骤(1)中，十六烷基三甲基溴化铵与甲苯的质量比其中为1∶15，FeCl₂·4H₂O与FeCl₃·6H₂O的质量比为1∶3溶解于二次水中，配制成浓度最佳为140g/L的水溶液，滴加到上述混合物中，再加入质量浓度为25％氨水，十六烷基三甲基溴化铵与质量浓度为25％氨水质量比其中为1∶0.17，在混合物中；将十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯其中按质量比为1∶1.25的正硅酸乙酯缓慢加入；在产物中加入乙醇，十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比其中为1∶2.25；沉淀物用乙醇回流12小时，十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比其中为1∶22.5，制备成磁性二氧化硅微球；

在磁性二氧化硅微球的环氧基化工艺步骤(2)中，将磁性二氧化硅微球与甲苯质量比其中为1∶1050加入三口烧瓶内混合；

在磁性二氧化硅微球羧基化工艺步骤(3)中，将L-天冬氨酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液按最佳质量比为1∶18混合溶解加入两口烧瓶内，再加入与该混合溶液最佳质量比为1∶150的表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球，制备成L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球；将溴乙酸与体积浓度为60g/L的Na₂CO₃水溶液其中按质量比为1∶18混合溶解加入两口烧瓶内，再加入与该混合溶液质量比其中为1∶150的L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球；

在金属离子的螯合工艺步骤(4)中，将羧基化的磁性二氧化硅微球与浓度为0.2mol/L的CoCl₂·6H₂O其中按质量比为1∶120加入烧杯内。

4、表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球在大肠杆菌中分离六聚组氨酸标签蛋白中的用途。

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