发明概述
本发明试图解决至少一个上文提到的问题或局限或试图解决至少一个上文提到的需求,并且在一个实施方案中提供一种使合成基材适配用于在其上固定靶分子的方法。这种方法包括以下步骤:
-提供一种合成基材;
-提供金属离子用于与这种基材结合,其中这些金属离子不与靶分子络合;
-使这些金属离子与这种基材在靶分子不存在的情况下接触,从而形成其中该基材与这些金属离子的配位位点结合的一种配位络合物;
-在这种基材存在的情况下从这些金属离子中形成低聚金属络合物,从而基本上全部的与这种基材配位络合的这些金属离子处于低聚金属络合物形式;
因而适配这种基材用于在其上固定一种靶分子。
在另一个实施方案中,提供一种使合成基材适配用于在其上固定靶分子的方法。这种方法包括以下步骤:
-提供金属离子用于与一种基材结合,其中这些金属离子不与一种靶分子络合;
-在基材不存在的情况下从金属离子中形成低聚金属络合物,从而基本上全部的金属离子处于低聚金属络合物形式;
-使这些低聚金属络合物与这种基材在靶分子不存在的情况下接触,从而形成其中该基材与这些低聚金属络合物的金属离子的配位位点结合的一种配位络合物;
因而适配这种基材用于在其上固定靶分子。
在某些实施方案中,提供一种在合成基材上固定靶分子的方法,所述方法包括:
-提供一种合成基材和一种待固定在其上的靶分子;
-提供能够与该基材和该靶分子结合的金属离子,其中以低聚金属络合物的形式提供基本上全部的这些金属离子;
-使这些低聚金属络合物与该靶分子和该基材接触,从而形成一种配位络合物,在这种配位络合物中,该基材和该靶分子与这些低聚金属络合物的金属离子的配位位点结合并且安排这些低聚金属络合物以便使该靶分子与该基材连接;
从而使靶分子固定在基材上。
在其他实施方案中,提供一种使合成基材适配用于在其上固定靶分子的方法,所述方法包括:
-提供一种合成基材用于在其上固定一种靶分子;
-提供能够与该基材和该靶分子结合的金属离子,其中以低聚金属络合物的形式提供基本上全部的这些金属离子;
-使这些低聚金属络合物与这种基材接触,从而形成其中这种基材与这些低聚金属络合物的金属离子的配位位点结合的一种配位络合物;
因而适配所述基材用于在其上固定一种靶分子。
可以筛选/选择基本上处于低聚金属络合物形式的两种或更多种金属离子以提供靶这种分子和基材之间稳定的结合相互作用或连接。这意指靶分子借助与基本上全部处于低聚金属络合物形式的两种或更多种金属离子的配位作用固定在基材上。下文更详细解释据信发挥作用的机制。
术语‘基本上全部处于低聚金属络合物形式’意指,优势比例的金属离子处于低聚金属络合物(例如二聚体、三聚体、四聚体等)形式,与单体金属络合物相对。例如,优选地多于75%、优选地多于80%、优选地多于85%、优选地多于90%、优选地多于95%、优选地多于98或99%的与基材配位络合的金属离子处于低聚金属络合物形式。可以根据本文所述的毛细管电泳方法和技术人员已知的其他方法测定组合物中单体或低聚物的量%。
可以通过将包含单体络合物和低聚络合物的金属络合物的样品分级并且回收低聚络合物,获得其中基本上全部金属离子处于低聚金属络合物形式的金属离子组合物。可以理解在一些实施方案中,在可能存在随低聚金属络合物一起回收的一些残留单体金属络合物时,分级可能是不完善的。
在其他实施方案中,可以在支持超过单体金属络合物产生低聚金属络合物的条件下产生这种组合物,在这种情况下,这种组合物包含金属离子,其中以低聚金属络合物形式提供基本上全部金属离子。
在某些实施方案中,这种组合物含有处于单体金属络合物和低聚金属络合物形式的金属离子,在特定条件下施加至基材时,这些金属离子可以允许这些络合物竞争基材上的可用螯合位点,从而单体金属络合物实际上退出对基材上有限螯合位点的竞争。
在一个实施方案中,提供一种在合成基材上固定靶分子的方法,所述方法包括:
-一种提供合成基材和一种待固定在其上的靶分子;
-提供能够与该基材和该靶分子结合的金属离子,这些金属离子处于低聚金属络合物和单体金属络合物形式;
-使这些金属络合物与靶分子和基材在其中低聚金属络合物优选地与靶分子和基材结合的条件下接触,从而形成一种配位络合物,在这种配位络合物中该基材和靶分子与低聚金属络合物的金属离子的配位位点结合并且设置这些低聚金属络合物以便使该靶分子与该基材连接;
从而使靶分子固定在基材上。
在其他实施方案中,这种方法使用低聚金属络合物的组合物或用这种组合物包被的基材,该组合物特征在于它基本上不包含单体金属络合物。
低聚金属络合物可以包含多于一种类型的金属离子,或这些络合物可以由单一类型的元素金属离子组成。
低聚金属络合物可以包含相同数目的金属离子。作为替代方案,用于在基材上缀合或固定靶分子的低聚金属络合物的组合物可以包括具有不同数目金属离子的络合物。例如,组合物可以具有包含2、3、4、5、6个和更多个金属离子的络合物。
这些低聚金属络合物可以具有相同的构象、几何形状或结构。在其他实施方案中,用于在基材上固定靶的金属离子组合物可以含有具有不同构象、几何形状或结构的低聚金属络合物。例如,一些可以是线性的,其他可以是分枝的,其他可以使簇集的等。
本发明也在于合成和选择相对于靶分子具有不同结合特征的低聚金属络合物(金属二聚体、三聚体四聚体等)并且以这种方式提供特定金属低聚物,从而可以进一步操作相对于靶分子的结合结果。结果是通过低聚金属络合物的改进结合作用,这种低聚金属络合物可以相对于靶分子实现较高的结合亲和力和可能变动的选择性水平。类似地,通过选择处于不同比率的不同低聚金属络合物的特定混合物,相对于靶分子和基材,其他结合特征和选择性可以是可能的。
这里,术语“基材”总体而言用来指希望结合特定靶分子的一些种类。“合成基材”总体上是一种非生物基材,即它不是细胞或细胞片段。“基材”可以是作为一种固定目的靶分子的合适平台的常规固相材料。总体而言,所用的基材将是具有先前存在的固相应用中常用模式的合成基材。例如,这种基材可以包括二氧化硅/玻璃、金和其他金属或多个塑料/聚合物材料实例,包括聚(乙烯醇)表面或甲基丙烯酸酯表面。基材可以采取任何形式。在生物学应用中,基材通常将处于微米或纳米大小的珠、膜、多孔板、载玻片、毛细管柱、筒形式或其他模式。基材的表面可能已经含有羧酸、酰胺、胺、羟基、醛或其他给电子基团,或经修饰以在其表面上提供低水平的给电子基团。如将要描述那样,基材的表面特征可以没有最佳的金属螯合配体,但是通过选择特定的低聚金属络合物或其特定组合,可以实现本文所述方法的功效或优化。
在本发明的实施方案中,术语“基材”意在包括这类事物如可检测标记物和其他分子种类。术语“标记物”以常规含义用来意指任何种类,它是可以检测的并且与另一种分子连接时用来鉴定这种分子。标记物的确切形式不是特别关键的,前提是本发明的基础原理适用。以举例方式,标记物可以是放射性标记物、酶、特异性结合对组分(例如,抗生物素蛋白、链霉亲和素)、比色标记或染料(例如,UV、VIS或红外染料)、荧光标记、化学发光标记、抗体、蛋白A、蛋白G等。本发明可以在诊断测定法领域具有特殊用途,并且原则上,可以使用在这种环境下常规用来提供增加的信号检测的任何标记物。在这种背景下,本术语意在指活性(可检测)标记物种类本身或与配位配体结合的活性标记物,其中所述的配位配体使活性标记物能够与根据本发明所用的金属络合物结合。取决于活性标记物种类的性质,可能需要筛选并且选择特定的低聚金属络合物或其特定组合,以便实现活性标记物种类和金属络合物的金属的必要结合。
这种标记物可以结合一种或多种低聚金属络合物并且低聚金属络合物可以结合一个或多个标记物。在本发明的一个实施方案中,这种标记物可以在特征上是聚合性的,包含多种活性标记物种类,并且它具有结合(螯合)多于一个分子的低聚金属络合物的能力。
这里,术语“标记物”还包括(预标记)分子,如无机、有机或生物分子(例如,合成肽或寡核苷酸),它们没有作为活性标记物发挥作用的能力,但是可以进一步经反应或官能化以导致检测到预标记的靶分子。在此情况下,这种进一步反应/官能化在不破坏结合(配位)相互作用的情况下发生,其中所述的结合(配位)相互作用最初负责使预标记分子和靶分子与低聚金属络合物的金属离子结合不会破坏。可以理解,金属络合物的功能在此是充当靶分子和预标记分子之间的交联剂。如上文解释,预标记分子可能需要与合适的配位配体结合,以便通过金属络合物实现结合。
在下文并且除非上下文另外需要,否则,出于提及的便利,术语“标记物”和其变体(如“标记”)将用来包括所描述的实施方案,其中所述标记物是预标记物并且本发明的作用是是促进靶分子与这种预标记物交联。除非另外指出,在本发明的环境下,术语“靶分子”指希望标记的任何分子。
除非另外指出,在本发明的环境下,术语“靶分子”指希望固定在基材上的分子。在本发明的一个实施方案中,这种靶分子是一种生物分子。对于作为靶分子的抗体而言,本发明具有特别的适用性。这就是说,术语靶分子可以包括希望固定在基材表面上的任何分子。例如,靶分子可以是一种蛋白质,如抗体、链霉亲和素、蛋白A或蛋白G。
本文中,术语“低聚金属络合物”指包含连接在一起的两种或更多种单体种类的金属络合物种类。单体金属络合物是当溶液中的金属离子与溶液中还存在的电子供体配体形成配位共价键也称作配位的共价键(dative covalent bond)时所形成的金属种类。这类配体将在本文中称作配位配体、金属配体或简单地称作配体。例如,在水溶液中,铬(III)可以作为八面体络合物存在,这种八面体络合物具有6个围绕中央铬离子安排的配位水分子。对于任何给定金属所形成的单体金属络合物的性质将取决于溶液中的配体以及配体与金属离子形成适度稳定的缔合的能力。取决于它们的结构和与金属离子相互作用从而形成络合物的能力,配体可以是单齿的、双齿的或多齿的。水合物和/或阴离子是配体(也称作反离子),它们总是溶液中金属络合物的结构的一部分。
低聚金属络合物包含至少两个借助配体的一个或多个桥接相互作用结合在一起的这些单体金属络合物。可以通过更多配体桥接更多金属种类以形成包含许多单体金属种类的团簇来形成更大的低聚络合物。单体金属络合物可以结合在一起,以便形成具有任何构象、几何形状或结构的低聚金属络合物。例如,低聚金属络合物可以具有线性、分枝或团簇几何形状或构象。例如,图1描述了3种基于铬的低聚络合物。在这个具体例子中,不同的pH条件可以导致独立单体铬络合物即[Cr(H2O)6]3+经其配体结合,从导致二聚体、三聚体和四聚体和更大低聚金属络合物的形成。在一个实施方案中,基于铬的低聚金属络合物是水解性低聚金属络合物。在另一个实施方案中,铬低聚金属络合物通过两个或更多个独立金属离子之间的其他桥接配体形成。在另一个实施方案中,可以组合使用桥接金属络合物的不同方法。类似地,其他金属络合物形成低聚种类,并且不同的低聚物群(根据它们特定的形成方法)是有可能的。同样,据它们特定的形成方法,添加其他配体或配体的组合可以产生更复杂的低聚金属络合物。除非下文另外说明,否则术语“金属络合物”和“低聚金属络合物”互换地使用。与组分单体形式金属络合物以及不同低聚物种类之间相比,低聚金属络合物的结构有可能赋予不同的结合特征。
另外,由于低聚金属络合物具有更大的三维复杂性,因此这提供了比单体金属络合物更大的设计灵活性。本发明在于选择最合适的低聚金属络合物或其混合物,以便实现靶分子和基材之间所希望的结合相互作用,其中对于单体金属络合物而言,所述结合相互作用可能没有适度强大的螯合种类。考虑到这一点,认为就金属类型和低聚形式而言,本发明具有针对一系列不同低聚金属络合物的适用性,并且这些金属络合物的变体代表了允许更灵活实施本发明的多样性观点。
据信这种金属络合物借以促进结合靶分子,更准确地说结合靶分子区域的机制涉及靶分子替换与低聚金属络合物缔合的一个或多个配体。为了这种情况发生,与一个或多个现存的配位配体相比时,靶分子必须能够与金属络合物的金属离子形成优选缔合,其中所述的现存配位配体与靶分子相互作用之前已经与金属离子缔合存在。根据本发明的实施方案,可以相对于靶分子操纵金属离子的结合特征,以便实现所希望的结合相互作用。因此,在本发明的一个实施方案中,选择与金属离子缔合的一个或多个配体,以便按要求控制靶分子的结合。
低聚金属络合物可以通过如上文连同靶分子所描述的相似配体替换机制促进与基材结合,并且也可以根据需要操纵金属离子相对于基材的结合特征。
鉴于提出的机制,可以理解,在金属离子结合靶分子时所形成的种类可以被视为金属络合物,因为在结合时,靶分子是与金属离子缔合的配位配体。对于金属离子与基材结合时所形成的种类,同样可以这样认为。然而,为避免混淆,除非另外指出或明显的,术语“金属络合物”将在本文中用来指在任何类结合事件已经发生之前的低聚金属络合物和缔合的配位配体。
这里,除非另外指出,术语配位和结合和配位和结合的相互作用互换使用。如讨论,使用低聚金属络合物赋予更大的结合稳定性,这归因于该低聚金属络合物和基材或靶分子之间的多重结合相互作用。取决于络合物结构(金属离子数目和它们对一些配体的各自固有结合亲和力)和使用条件,配位键的强度是可调的,从基本上不可逆性共价键至弱结合相互作用。
本发明的方法可能在其中需要将一个或多个靶分子固定在固体基材上或出于鉴定目的需要用一些可检测“标签”标记靶分子(在所谓的捕获测定法中)的固相测定法中具有特别的适用性。本发明也可以用于亲和层析、2D凝胶电泳、表面等离子体共振、体外和体内成像、递送治疗性物质或过程(processe)和其中已知靶分子与基材结合时有用的任何其他应用中。本发明扩展至所述方法在这些实用环境下的应用。
如本文所用,除非上下文要求,否则术语“包含”和该术语的变体,如“包含着”(comprising)、“包含了”(comprises)和“被包含”(comprised)不意在排除其他添加物、组分、整数或步骤。
前述段落中所述的本发明其他方面和这些方面的其他实施方案将从以举例方式给出的以下描述中并且参考附图而变得清楚。
实施方案的具体说明
现在将详细地参照本发明的某些实施方案。尽管将结合实施方案描述本发明,应当理解本发明将不限于这些实施方案。相反,本发明意在涵盖全部替代形式、修改和等同物,它们可以被包括于如权利要求书所定义的本发明范围内部。
本领域技术人员会认出与本文所述的那些方法和材料相似或等同的许多方法和材料,它们可以用于本发明的实施。本发明无论如何不限于至所述的方法和材料。
应当理解,本说明书中披露和限定的本发明扩展至所提到或从文本或附图中明显的两个或更多个单独特征的全部替代性组合。这些不同组合的全体构成本发明的多种替代性方面。
在导致本文所述的本发明的工作中,发明人发现,对金属络合物组合物的某些操作,如PCT/AU2005/00966(公开为WO 2006/002472)中描述的那些,能够形成具有具有下述表面的合成基材,其中所述表面具有改进的靶分子结合亲和力、或改进的所结合靶分子的取向容量或对靶分子功能的损害更少,并且最重要地,增加修饰基材的改进货架期的稳健性、重现性和稳定性。对处于操作和未操作形式下的组合物的性质的进一步研究已经揭示,在一个实施方案中,关键差异是与基材结合的金属低聚物的比例。具体而言,如本文实例中所述,本发明人已经发现,根据PCT/AU2005/00966(公开为WO 2006/002472)的方法所制备的组合物和基材倾向于具有较低含量的低聚金属络合物(约70%或更小)和较高含量的单体金属络合物(直至约30%)。相反,本文中披露的组合物和基材具有大于70%和高于90%的低聚金属络合物含量及低至10%或更小的单体金属络合物含量。采用本文所述的多种实验,本发明人已经显示,关键优点即修饰的靶分子结合作用和活化基材(即,通过这种方法过程适配用于结合靶的基材)的改进的增加的稳健性、重现性和稳定性,可能源自较高含量的低聚金属络合物。这是在做出本发明时未预料到的。
在一个实施方案中,本发明是一种使合成基材适配用于在其上固定靶分子的方法。这种方法包括以下步骤:
-提供一种合成基材;
-提供金属离子用于与这种基材结合,其中所述金属离子不与一种靶分子络合;
-使这些金属离子与这种基材在靶分子不存在的情况下接触,从而形成其中基材与金属离子的配位位点结合的一种配位络合物;
-在这种基材存在的情况下从这些金属离子中形成低聚金属络合物,从而基本上全部的与这种基材配位络合的金属离子处于低聚金属络合物形式;
因而适配这种基材用于在其上固定靶分子。
这个实施方案总体上涉及在基材表面上形成金属络合物的涂层或层,这个涂层或层的特征在于,这个涂层或层中的基本上全部金属络合物以低聚络合物形式提供。如本文中进一步讨论,这个过程的产物可以称作“活化的基材”,其意义在于,使低聚金属络合物在其上布置的基材随后能够与靶分子结合用于使靶分子在其上固定。
发明人已经发现,总体上可以通过提供形成给电子基团用于桥接或连接或结合两个或更多个金属离子的条件,形成低聚金属络合物。这可以通过向组合物提供约3.3至11、优选地约4至10、优选地约4至8或4、5、6或7的pH做到,其中所述组合物因而金属络合物与基材接触而形成。在PCT/AU2005/00966(公开为WO 2006/002472)中,pH条件总体上低于3,并且通过在盐水溶液中进行反应避免任何调节。
可以将上述实施方案的方法工艺步骤作为一个单步骤实施。重要地,应当理解,一旦金属离子和基材已经彼此接触并且已经将相关组合物的pH调节至上述范围,则与基材和金属离子形成配位络合物并且金属离子的低聚化总体上同时出现。
尽管不想受假设约束,但是认为在上述实施方案中,所实现的相对较高的pH范围例如在基材上并且还在随金属离子一起存在的(在下文进一步描述的)桥接配体中形成给电子基团,从而辅助低聚化和基材和低聚金属络合物之间配位络合物的形成。
可以在靶分子不存在的情况下实施以下步骤:在基材存在的情况下从金属离子中形成低聚金属络合物,从而基本上全部的与这种基材配位络合的金属离子处于低聚金属络合物形式。
可以理解,可以产生金属离子以便与基材接触之前形成低聚金属络合物。在这些环境下,形成一种组合物,其中将组合物中的基本上全部金属离子以低聚金属络合物形式提供用于与基材接触。因此在另一个实施方案中,提供一种使合成基材适配用于在其上固定靶分子的方法。这种方法包括以下步骤:
-提供金属离子用于与基材结合,其中所述金属离子不与一种靶分子络合;
-在基材不存在的情况下从金属离子中形成低聚金属络合物,从而基本上全部的金属离子处于低聚金属络合物形式;
-使该低聚金属络合物与该基材在靶分子不存在的情况下接触,从而形成其中该基材与低聚金属络合物的金属离子的配位位点结合的一种配位络合物;
因而适配这种基材用于在其上固定靶分子。
可以在靶分子不存在的情况下实施以下步骤:在基材不存在的情况下从金属离子中形成低聚金属络合物,从而基本上全部的金属离子处于低聚金属络合物形式。
在这个实施方案中,低聚物优选地因提供用于形成给电子基团以便桥接或连接组合物中两个或更多个金属离子的条件而从单体金属络合物中形成。这可以通过向组合物提供约3.3至约11、优选地约4至10、优选地约4至8或4、5、6或7的pH做到。
如本文所述的,可以通过提供盐或桥接配体提供相关的pH条件。“盐”通常是由金属原子或电正性原子团替换酸的一个或多个氢原子所产生的化合物。在这种情境下,盐的实例包括NaOH、KOH或NH4OH和其他碱性盐。总体上,那些优选的盐是将升高金属络合物组合物的pH的那些盐,并且特别提供反离子的那些盐,所述盐能够在与基材的相关配位络合物中充当配位配体。
转向相关的桥接配体,这些桥接配体可以处于含有一个或多个官能团的化合物、通常有机化合物的形式,所述官能团具有给电子潜能,尤其在上文所述的pH-范围。可以将这些配体描述为“碱性”或“酸性”配体。后者在上述pH范围内处于去质子形式。本文中描述了碱性配体的实例并且优选的配体包括含有胺或亚胺基团的那些,尤其乙二胺。
在上述实施方案中有用的金属离子的实例如下文描述。
在其他实施方案中,本发明在于形成和鉴定能够实现靶基材和靶分子之间预定和所需的结合相互作用的低聚金属络合物和/或它们的混合物。在这个方面,可以将低聚金属络合物视为一种形式的交联剂,这种交联剂促进靶分子与靶基材结合。通过多组分结合,意图在低聚金属络合物、所靶向的基材和靶分子彼此暴露的条件下实现稳定的涉及这些种类的结合相互作用。结合相互作用也必须在实际应用本发明的条件(如诊断测定法等)下是稳定的。
可以理解,在实施本发明中有用的低聚金属络合物是一种低聚金属络合物,它能够经历热动力稳定的配体替换,从而与基材并且与靶分子在这些种类彼此暴露的条件(如pH、温度、离子强度等)下和在与其中使用本发明方法的实际应用(例如,测定法)相关的条件下形成稳定的结合相互作用(即配位键)。这借助低聚络合物内部的多重金属螯合作用实现,所述多重金属螯合作用组合在一起维持所希望的稳定性。在这个方面,基材-金属、金属-靶分子和靶基材-金属-靶分子结合相互作用因足够数目的金属结合相互作用而是热动力学稳定的,从而所希望的相互作用比这种金属根据主要实用条件否则可能经历的其他可能的(配位配体)结合相互作用占优,其中这种(些)结合相互作用在所述主要实用条件下发生。例如,这意味金属和靶基材之间相互作用的性质是这样的,从而借助低聚金属络合物和/或它们的混合物与靶基材-金属络合物结合后,靶分子不从靶基材-金属络合物解离。
在另一个实施方案中,在本发明中有用的低聚络合物是一种低聚络合物,它与靶分子形成足够强的相互作用,但是可以随后从基材上的低聚络合物中脱离。
在本发明的一个实施方式中,低聚金属络合物包含一个或多个结合配体,这些结合配体被选择为测定最终低聚金属络合物的总体分子量分布和尺寸范围,并且因而改变金属络合物对基材和/或靶分子的总体结合特征。
在本发明的又一个实施方案中,低聚金属络合物和靶基材在暴露于靶分子之前彼此结合。在这个实施方案中,靶分子的添加可以在形成低聚物金属-基材络合物之后立即进行,或作为替代方案在低聚物金属-基材络合物贮存一段时间时进行。这里,本发明的方法包括形成一种低聚物金属-基材络合物,它是可贮存的并且一旦使预定的金属-靶基材络合物暴露于含有靶分子的分析物时有效结合靶分子。选择合适的低聚金属络合物以形成金属-靶基材络合物将取决于多种因素。据信金属-靶基材络合物借以与靶分子,更准确的说靶分子区域结合的机制涉及靶分子替换与低聚金属络合物缔合的一个或多个配体。为了这种情况发生,与一个或多个现存的配位配体相比时,靶分子必须能够与金属-靶基材络合物的金属离子形成优选缔合,其中所述的现存配位配体与靶分子相互作用之前已经与金属络合物缔合。根据本发明的实施方案,可以相对于长期贮存和靶分子操纵金属离子的结合特征,以便实现所希望的结合相互作用。
可以使用的金属离子的实例包括过渡金属如钪、钛、钒、铬、钌、铂、锰、铁、钴、镍、铜、钼和锌的离子。优选铬、钌、铁、钴、铝和铑。
本发明金属的效能可以取决于金属的氧化状态而改变。例如,铬(III)可以用于本发明的实施方案中。可以在低聚金属络合物中包括一个或多个结合配体以测定最终低聚金属络合物的总体分子量分布和尺寸范围。含有给电子种类的配体可以用来形成低聚金属络合物。简单离子如OH-或NH2-至更复杂的结构物可以用作桥接配体。可以使用碱性和酸性配体。含有一个或多个孤对电子的配体可以是胺、亚胺、羰基、醚、酯、肟、醇、硫醚,连同其他。碱性配体的其他实例包括吡啶、咪唑、苯并咪唑、组氨酸或吡啶、最优选地是乙二胺。可以在丢失质子时与金属络合物配位的酸性配体可以是羧酸、磺酸、磷酸、烯醇基、酚基、硫烯醇或硫代苯酚基,连同其他。酸性配体的其他实例包括亚氨基二酸、次氨基三乙酸、草酸或水杨酸。也可以使用桥接配体的组合。例如,胺配体可以选自包括但不限于氨、乙胺、乙二胺、二亚乙基三胺、双氨基丙二胺等的组。在这个类别中,OH-或NH2-均可以充当桥接配体。可以通过添加其他桥接配体(如含有羧酸以形成更多络合物结构的那些)进一步操作这类低聚金属络合物。能够跨越2个或更多个金属离子桥接的任何配体可以用来形成低聚金属络合物,并且作为结果,低聚金属络合物结合靶基材和/或靶分子的结合作用进一步受到影响。
低聚金属络合物可以通过已经在靶基材上存在的单齿、两齿或多齿配体与靶基材结合。任何给电子基团可以与低聚金属络合物结合。可以使用碱性或酸性配体。含有一个或多个孤对电子的配体可以是胺、亚胺、羰基、醚、酯、肟、醇、硫醚,连同其他。可以在丢失质子时与金属络合物配位的酸性配体可以是羧酸、磺酸、磷酸、烯醇基和酚基,连同其他。尽管已知一些这类配体不与单体金属络合物形成强结合相互作用,但是可以通过低聚金属络合物内部的多重相互作用实现强结合稳定性。
在一个实施方案中,可以选择用于本发明方法中低聚物的金属离子浓度,从而相关方法的产物是非聚集的基材,例如其中基材处于珠形式的情况下,为非聚集的珠。
低聚金属络合物中包括的反离子可以选自但不限于氯化物、乙酸盐、溴化物、磷酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、明矾和硫酸盐。
在另一个实施方案中,与基材结合的单体金属离子络合物可以(通过对其合适的暴露)低聚化以形成(低聚金属离子络合物基材)-(靶基材)缀合物。随后通过使这种缀合物暴露于靶分子而交联这种基材,缀合物的金属离子部分因与基材结合时替换(仍)与金属离子缔合的一个或多个配位配体而经历与靶分子的结合相互作用。用于如上文所述的金属络合物的相似选择标准将适用。
在另一个实施方案中,低聚金属离子络合物(通过对其合适的暴露)与靶分子结合以形成(金属离子)-(靶分子)缀合物。随后通过使这种缀合物暴露于基材而交联这种靶分子,缀合物的金属离子络合物部分因与靶分子结合时替换(仍)与金属离子络合物缔合的一个或多个配位配体而经历与靶基材的结合相互作用。用于如上文所述的低聚金属络合物的相似选择标准将适用。
对于这些情况,反应混合物也可以含有缓冲剂和或防腐剂,典型地来自分析物,以稳定靶分子。为了本发明如预期那样发挥作用,重要的是,任何缓冲剂或防腐剂或来自缓冲剂或防腐剂的配体/离子不论发生的结合事件的任何顺序不利地干扰靶分子与基材结合所必需的结合相互作用。对于任何给定的系统,可能需要操纵配体化学以便确保所希望的相互作用比否则将折衷所需的结合相互作用的相互作用占优。
无论使用的确切方法是什么,重要的是,基材和靶分子能够借助低聚金属络合物彼此相互作用以便实现所希望的结合效果。在这个方面,低聚金属络合物作为分子一种“胶水”发挥作用。基于靶基材和靶分子在低聚金属络合物存在下彼此暴露的主要条件,基材和靶分子借助低聚金属络合物的优选结合将大体上由热动力学条件(thermodynamicconsideration)决定。在测定法的情况下,这将显然取决于该测定法进行的条件并取决于含有靶分子的分析物的特征。
在惯例中,可以借助一种发现过程,使用不同种类组合的文库(library)鉴定在本发明中待使用的合适低聚金属络合物,包括数目和类型。根据这个过程,基于所用的低聚物金属化合物、基材、靶分子和主要条件,在多种不同的排列范围内评估特定金属化合物形成低聚金属络合物的能力、不同低聚物群体形成的条件和低聚金属络合物使特定基材与特定靶分子结合的能力。可以评估基材借助低聚金属络合物通过相互作用对靶分子的亲和力,以便鉴定产生可取结果的变量的组合。通过以这种方式继续进行,实际上可能根据观察到的针对给定靶分子的结合功效,评定变量的组合。这种发现过程提供了巨大的手段灵活性。例如,可能希望的是基于特定靶分子产生一种可操作的结合系统。在此,在发现过程中,在操作其他可能变体的同时,靶分子自始至终维持恒定,以便鉴定对这种靶分子和标记物特异的潜在有用组合。可以理解这种手段具有广泛潜力和范围,而不脱离构成本发明基础的总体构思,即,使用低聚金属络合物实现基材与靶分子结合。
在一个实施方案中,金属离子是一种过渡金属。实例包括铑、铂、钪、铝、钛、钒、铬、钌、锰、铁、钴、镍、铜、钼或锌。已经发现,某些金属化合物产生在所述发现过程中总体上用作先导物的络合物(在水溶液中)。多种金属如Fe(III)、Co(III)、Al(III)、Cr(III)和Ru(IV)可以在由金属中心之间μ-羟桥和μ-氧桥所形成的更小低聚物种类的分布下存在,以便产生二聚体、三聚体、四聚体和更高级别低聚物,但是低聚金属不只限于这些金属离子,低聚物形成也不只限于μ-羟桥和μ-氧桥。已经发现铬低聚物特别适于实施本发明。
在另一个实施方案,可以通过添加其他螯合配体如氨、乙胺、乙二胺等和/或乙酸、琥珀酸等形成其他低聚物种类,并且低聚物形成的实际条件改变多种形式的群体分布。低聚络合物的可能多样性大大地扩展,并且借助多重结合相互作用,具有低给电子潜力的基材和靶分子现在能够形成用于实际应用本发明的稳定相互作用。形成和使用多样金属低聚物群体的能力未曾用来改善需要靶分子与靶基材结合的应用的性能。因此,不存在这样的应用,其中筛选不同的低聚金属络合物群体以便检验一旦与用于色谱、固相测定法、诊断成像、治疗药物递送和其他目的应用中的一些基材结合时靶分子的性能。已经发现通过添加不同浓度的碱和/或潜在螯合配体,使用不同的铬低聚物群体在免疫测定法中产生不同的结果。这个观察结果基于使用特定靶分子的实验。
在本发明的一个实施方案中,配体在形成低聚金属络合物时的性质有助于确定金属络合物的组成,并且也可以控制靶分子替换的“可用性”,以便按要求操纵结合作用。例如,在已经发现靶分子的给定官能团或区域对特定金属络合物或金属-标记络合物显示特殊的结合亲和力时,可以通过在络合物中包含与靶分子的相互作用发生时更容易替换的一个或多个配体而增强(或减弱)这种结合亲和力。以这种方式或类似方式,有可能通过变动存在于用来结合靶分子的络合物中的配位配体的类型,向给定靶分子的一些官能团或区域提供选择性。
本发明还提供了一种用于在基材上固定靶分子的组合物,所述组合物包含:
-具有能够与基材结合的配位位点的金属离子,其中基本上全部的金属离子处于低聚金属络合物形式。
本发明还提供了一种用于检测样品中分析物的合成基材,所述合成基材包含:
-具有与基材和靶分子结合的配位位点的金属离子,其中以低聚金属络合物的形式提供基本上全部的金属离子。
本发明还提供了一种用于样品是否含有分析物的合成方法,所述方法包括:
-提供一种如上文所述并且使靶分子固定在其上的基材;
-使基材与其中待确定存在或不存在分析物的样品在靶分子结合分析物条件下接触;
-确定靶分子是否已经结合分析物;
从而确定样品是否含有分析物。
本发明还提供了一种用于在基材上固定靶分子的试剂盒,所述试剂盒包含:
-具有能够与基材结合的配位位点的金属离子,其中基本上全部的金属离子处于低聚金属络合物形式。
应当理解,本说明书中披露和限定的本发明扩展至所提到或从文本或附图中明显的两个或更多个单独特征的全部替代性组合。这些不同组合的全体构成本发明的多个替代性方面。
实例
在以下非限制性实例中显示本发明的实施方案。
实例1:基材与单体铬络合物或与低聚铬络合物的结合。
将使用单体铬离子使靶分子结合到珠基材上与含有0%单体形式的低聚铬络合物的一个实例比较。
a.铬单体溶液
简言之,将六水合高氯酸铬(2.3g)溶解于50mL纯水中并且彻底混合直至全部固体溶解。使用Beckman Coulter ProteomeLab PA800毛细管电泳(CE)仪和其推荐的操作方案,发现这种溶液具有大约99%单体,pH为2.1。
铬低聚物溶液
高氯酸铬与双(3-氨基丙基)二乙胺。
简言之,将六水合高氯酸铬(2.3g)溶解于25mL纯水中并且彻底混合直至全部固体溶解。类似地,将545μl双(3-氨基丙基)二乙胺溶液添加至25mL纯水。将这些溶液合并并且在室温搅拌2日。
将已知浓度的新鲜制备的六水合高氯酸铬水溶液在CE上运行,以便获得单体铬种类的计算峰面积以产生>0.9999的线性相关。使用这条标准曲线,通过CE分析法对高氯酸铬/双(3-氨基丙基)二乙胺络合物的分析没有显示可检测的单体种类。溶液具有pH 4.3。
b.添加铬溶液至磁珠(Bangs)。
ProMag羧基封端的磁珠(目录号PMC3N/9080)从Bangs,IN,USA供应。为制备这些珠子,允许它们达到室温并且将这些珠子涡旋混合30秒,随后超声处理另外60秒。将2×50μL珠浓缩物分配至2×1.7mL微管中。将这些管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加每管50μL相应的铬溶液。在室温留置1小时伴以转动。
c.山羊抗小鼠多克隆抗体与铬连接珠表面的偶联
从转子中取出铬活化的Bangs ProMag珠并且将悬液涡旋混合30秒。将这些管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向每管添加50μl的50mM MES缓冲液(pH 5.2)。重复涡旋混合,移出上清液并且另外添加两(2)次MES。在移出上清液后,将50mM MES中的50μl 1.0mg/ml山羊抗小鼠Fc特异性多克隆抗体(Lampire Biological,目录号7455527,USA)添加至珠粒。将珠溶液涡旋混合30秒。将管在室温孵育1小时伴以转动。
在涡旋混合悬液30秒后,将多个管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加50μL150mM盐水,同时向管添加0.025%Proclin 300溶液。涡旋混合并且在盐水溶液中反复洗涤另外2次。
d.进行抗体载量测定。
根据以下方法进行磁珠上的抗体载量测定。简言之,材料和方法如下所述。
测定法组分:
抗体偶联的珠。
检测抗体:小鼠-IgG-FITC(2mgs/ml,Jackson,USA)
洗涤缓冲液:10mM PBS,pH 7.4,含有0.05%Tween 20
分析缓冲液:10mM PBS,pH 7.4,含有1%BSA,0.05%Tween 20
微板:96孔Millipore 0.42um滤板(Millipore,USA)
测定操作方案:
在45μl分析缓冲液中稀释2.5μl每种珠样品。在涡旋混合至少30秒后,取出40μl悬液并且在760μl分析缓冲液中再次稀释。在分析缓冲液中稀释小鼠IgG-FITC检测抗体至工作浓度10μg/ml。在涡旋混合稀释的珠悬液至少30秒后,向孔添加100μl抗体包被的珠。使用真空过滤设备从孔中移除珠溶液。在添加50μl检测抗体至适宜的孔后,在室温在平板摇床上于黑暗下孵育60分钟。使用真空过滤设备从孔中移除检测抗体溶液。添加200μl洗涤缓冲液至平板的每个孔并且将平板置于平板摇床上30秒。从孔中移除200μl上清液。添加200μl洗涤缓冲液至每个孔,在FACS Canto II(BD Biosciences,USA)上对珠读数。
e.结果实例。
比较使用单体铬离子对低聚物铬离子与磁珠结合的山羊抗小鼠抗体,显示十分不同的结合小鼠抗体的容量。在相同的条件下,低聚制品产生五(5)倍的小鼠抗体结合(见图2)。胺添加物可以通过二种可能的作用模式启动低聚化。具体而言,双(3-氨基丙基)二乙胺络合物中存在可以允许金属离子之间潜在桥接的4个氨基。另外,pH 4.3可以允许金属离子之间形成水解性连接。
实例2:比较不同的纯化铬低聚物。
a.铬二聚体和三聚体的分级
根据Spiccia,L.,Marty,W.和Giovanoli,R.Hydrolytic Trimer ofChromium(II1).Synthesis through Chromite Cleavage and Use in thePreparation of the″Active″Trimer Hydroxide(水解性铬(II1)三聚体.借助亚铬酸盐切割的合成和在制备“活性”三聚体氢氧化物中的用途),Inorganic Chemistry,1988,27,2660-2666,以及Stunzi,H.和Marty,W.Early Stages of the Hydrolysis of Chromium(II1)in Aqueous Solution 1.Characterization of a Tetrameric Species(水溶液中铬(II1)水解的早期阶段.1.四聚种类的表征),Inorganic Chemistry,1983,22,2145-2150中描述的方法分离铬二聚体、三聚体和其他低聚物。
简言之,将Cr3+(5mL,0.5M)在酸(大约0.66M HClO4)中的溶液转移至容量瓶(50mL)中并且添加NaOH(10mL,2M),同时剧烈和连续地搅拌。通过添加HClO4(35mL,2M)立即酸化所产生的绿色溶液。将这种溶液在25°C留置24小时。随后取出一个等分试样(3mL),用水稀释90mL,并且添加10mL 0.7M HClO4。使所得到的溶液吸附到SPSephadex阳离子交换柱(1X5cm)上。通过添加1mL 0.5M NaClO+0.01M HClO启动洗脱。当洗脱液中上清液的水平降至2mm时,添加另外1mL这种0.5M NaClO4,随后添加1mL 1M NaClO4+0.01M HClO4,并且再次添加这种最终溶液的另外6mL部分。此时,蓝-紫色单体带已经明显向下移动,并且蓝-绿二聚体已经在树脂顶部与绿色聚合物分开。洗脱用1mL并且随后用6mL 2M NaClO4+0.02M HClO4继续,并且随后用1mL 4M NaClO4+0.04M HClO4继续。同时,单体和二聚体已经彻底洗脱并且三聚体的绿色带已经抵达柱底部。用这种4M NaClO4溶液进一步洗脱产生了这种三聚体。
通过UV/Vis分析需来自柱的溶液并且发现它含有不同但是浓度相似的不同UV/Vis活性种类(见表1)。
b.添加铬单聚体、二聚体和三聚体至luminex珠。
为制备这些珠子,允许它们达到室温并且将这些珠子涡旋混合20秒,随后超声处理另外20秒。必须将这些珠悬浮为单分散的单个粒子。如果观察到任何聚集珠,则重复涡旋混合和超声波处理直至观察不到聚集物。将100μl珠浓缩物分配至1.7mL微管中。将珠溶液以14,000转/分钟离心3分钟,此后,取出管并且温和弹击它,以便使管侧壁上的珠脱落,随后离心另外5分钟。将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加从柱中洗脱的100μl铬低聚物溶液。在添加后,超声波处理和涡旋混合,使悬液静置60分钟,偶尔混合。在这段时间后,将珠子在去离子水中洗涤3次。
c.TSH捕获抗体与铬连接珠表面的偶联
使用在50mM乙酸盐缓冲液(pH5.0)中浓度100μg/mL的TSH捕获抗体(OEM Concepts抗体,克隆#057-11003)。向旋转向下成塞状物(plug)的无上清液的250μl铬包被珠添加250μl抗体溶液。将溶液涡旋混合并超声处理,并且静置1小时,伴以偶尔涡旋混合。将溶液用150mM盐水洗涤一次。在进行测定法之前,抗体偶联的珠在4°C贮存于含有0.05%叠氮化物的盐水中。
d.通过酰胺偶联法(对照)偶联TSH捕获抗体
使用推荐的Luminex方法,将抗TSH单克隆抗体(OEM Concepts抗体,克隆#057-11003)与Luminex xMAP微球体偶联。允许这些珠子达到室温,涡旋混合20秒,随后超声处理另外20秒。必须将这些珠悬浮为单分散的单个粒子。如果观察到任何聚集珠,则重复涡旋混合和超声波处理直至观察不到聚集物。将100μl珠浓缩物分配至1.7mL微管中。将珠溶液以14,000转/分钟离心3分钟,此后,取出管并且温和弹击它,以便使管侧壁上的珠脱落,随后离心另外5分钟。将上清液从珠粒小心地移出并弃去。用pH 6.3的0.1M磷酸钠缓冲液重复洗涤过程。
对于已经如所述那样旋转向下的每100μl珠浓缩物(1.25x106个珠),添加50μl的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)在0.1M磷酸钠缓冲液(pH 6.3)中的50mg/ml溶液,并且在室温于黑暗下静置20分钟,伴以偶尔涡旋混合。珠随后用200μl 0.05M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液,pH 5.0洗涤两次。
用超声波处理和涡旋混合在200μl MES缓冲液中重悬珠子后,添加75μL抗体(MES缓冲液中200μg/mL)并且留在柔和摇床上在室温孵育2小时。这些珠随后用含有0.05%Tween的2×200μL 10mM PBS洗涤。最后,将珠子贮存于含有1%BSA和0.05%叠氮化物(pH 7.4)的100μl10mM PBS中。
e.进行抗体载量测定
根据Luminex方法进行多微珠(multiplexed bead)上的TSH测定。简言之,材料和方法如下所述。
测定法组分:
抗体偶联的珠:添加10μl浓缩物至590μl分析缓冲液
检测抗体:使用EZ-连接-Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce),使抗TSH检测单克隆抗体(Medix Biochemica抗体,克隆#5403)生物素酰化。工作溶液是在含有1%BSA的10mM PBS中20μg/mL
在含有1%BSA的10mM PBS中制备TSH标准物
链霉亲和素-R-藻红蛋白:在含有1%BSA的10mM PBS中20μg/mL
洗涤缓冲液:含有1%BSA的10mM PBS
分析缓冲液:含有4%BSA的10mM PBS
测定操作方案:
通过将100μl洗涤缓冲液置入每个孔并且施加足以温和清空孔的真空,使滤板预湿润。添加20μl TSH标准物至适宜的微量滴定孔。添加分析缓冲液至零(0uIU/ml)孔。添加10μl稀释的珠混合物至适宜的微量滴定孔。在室温于黑暗下以500转/分钟摇动滤板1小时,随后添加20μl抗TSH检测抗体溶液至适宜的微量滴定孔。在室温于黑暗下以500转/分钟摇动滤板30分钟,随后添加20μl稀释的链霉亲和素-R-藻红蛋白溶液至适宜的微量滴定孔。在室温于黑暗下以500转/分钟摇动滤板15分钟。通过施加足以温和清空孔的真空从孔中移除溶液。添加100μL洗涤缓冲液至每个孔并且施加足以温和清空孔的真空。重复洗涤过程,随后添加100μl洗涤缓冲液至每个孔并且摇动60秒。将平板载入Luminex XYPTM平台并读数。
f.结果实例。
如表2中所示,当使用不同的铬种类以便使抗TSH抗体与Luminex珠结合时,TSH测定的结果明显不同。采用单体铬离子时的不良信号表明抗体结合不良或表明这些低聚物种类与抗体上的不同位点结合,从而改变其对TSH抗原的结合容量。
实例3:增加低聚物形成:胺和氢氧化物结合配体的组合。
a.形成不同的铬溶液。
铬低聚物溶液(含有30%单体)。简言之,将六水合高氯酸铬(2.3g)溶解于25mL纯水中并且彻底混合直至全部固体溶解。类似地,将190μl乙二胺溶液添加至25mL纯水。将这些溶液合并并且在室温搅拌过夜。通过CE,这种溶液含有大约30%单体并且pH稳定在大约pH 3.0。通过用去离子水稀释制备100mM溶液和10mM溶液两者。
铬低聚物溶液(含有10%单体)。向上述溶液(20ml),逐滴添加1.5M氢氧化钠溶液,从而它不超过pH 5并且在12小时后稳定在pH 4。通过CE,这种pH调节过的溶液含有小于10%单体。通过用去离子水稀释制备100mM溶液和10mM溶液。
b.添加铬溶液至磁珠(Ademtech)
Ademtech羧基封端的磁珠(目录号0215)从Ademtech,Fra.供应。为制备这些珠子,允许它们达到室温并且将这些珠子涡旋混合30秒以重悬珠子。取出200μl母悬液(10mg微球体)至1.5-ml微管。将管置于磁分离器上至少60秒,并且小心不要扰动微球体小粒,移除并弃去Ademtech MasterBeads溶液。从磁分离器中取下管并且在1.0ml去离子水中重悬微球体。通过涡旋混合30秒重悬微球体,并且在单独的管中将其分成4×250μl。将这些管置于磁分离器上至少60秒以便允许微球体与洗涤溶液彻底分离。小心不要扰动微球体小粒,移除并弃去洗涤溶液。
在4×250μl多种铬溶液中重悬微球体。通过涡旋混合30秒重悬微球体。在使微球体保持悬浮的管转动器中使用翻滚转动,在室温孵育铬低聚物溶液中的微球体60分钟。珠子可以在相同的溶液中贮存在4°C。
在3至6图中显示通过不同低聚物溶液处理的珠的显微镜图片。
c.山羊抗小鼠多克隆抗体与铬连接珠表面的偶联
从转子中取出铬活化的Ademtech珠并且将悬液涡旋混合30秒。将这些管置于磁分离器上至少60秒以便允许铬活化的Ademtech珠与溶液彻底分离。小心不要扰动微球体小粒,移除并弃去溶液。从磁分离器中取下管并且在含有0.01%Tween 20的250μl去离子水中重悬微球体30秒。将管置于磁分离器上至少60秒以便允许珠与溶液彻底分离。从磁分离器中取下管。再一次重复洗涤过程。
在含有0.01%Tween 20的去离子水中制备1mg/ml的1.0mL GAM抗体溶液。添加(含有250μg GAM抗体的)250μl GAM抗体溶液至铬活化多种Ademtech珠粒。通过涡旋混合20秒重悬微球体。在管转动器上使用翻滚转动,在室温孵育微球体60分钟。将含有微球体的这些管置于磁分离器上至少60秒以便允许微球体与GAM抗体溶液彻底分离。小心不要扰动微球体颗粒,移除并弃去GAM抗体溶液。从磁分离器中取下管并且在含有0.05%Tween 20,0.3%PF-127和0.025%Proclin(贮存溶液)的250μl 50mM TBS pH 8中重悬微球体30秒。涡旋混合30秒。将管置于磁分离器上至少60秒以便允许微球体与溶液彻底分离。小心不要扰动微球体颗粒,移除并弃去溶液。从磁分离器中取下管。再一次重复洗涤过程。添加250μl贮存溶液至GAM抗体偶联的微球体。通过涡旋混合30秒,重悬10mg/ml的GAM抗体偶联的珠。在4°C贮存GAM抗体偶联的Ademtech珠。
d.进行抗体载量测定。
根据以下方法进行磁珠上的抗体载量测定。简言之,材料和方法如下所述。
测定法组分:
抗体偶联的珠
检测抗体:小鼠抗兔IgG-HRP(0.8mgs/ml,Jackson,USA)
洗涤缓冲液:10mM PBS,pH 7.4,含有0.05%Tween 20
分析缓冲液:10mM PBS,pH 7.4,含有1%BSA,0.05%Tween 20
微板:96孔聚丙烯白色平板-U形(BioSciencej Germany)
Adem-Mag 96平板磁体(Ademtech,France)
PS-atto-基材(Lumigen,USA)
测定操作方案:
在90μl分析缓冲液中稀释10μl每种珠样品。在涡旋混合至少30秒后,取出50μl悬液并且在950μl分析缓冲液中再次稀释。在分析缓冲液中稀释小鼠抗兔IgG-HRP检测抗体至工作浓度1.56ng/mL。在涡旋混合稀释的珠悬液至少30秒后,向孔添加50μl抗体包被的珠。将平板留在平板磁体上5分钟后,从孔中移除珠溶液。在添加50μl检测抗体至适宜的孔后,在室温在平板摇床上于黑暗下孵育60分钟。使用板磁体从孔中移除检测抗体溶液。添加200μl洗涤缓冲液至平板的每个孔并且将平板置于平板摇床上30秒。从孔中移除200μl上清液。再一次重复这种洗涤。添加100μl PS-atto至每个孔。在FLUOstar上使用Luminescence法(BMGLABTECH,Germany)对珠读数。
e.结果实例
不同的低聚组合物给予基材不同的特征。10mM和100mM高氯酸铬/乙二胺络合物在pH 3导致珠聚集,同时布朗运动消失(见图3和图4)。类似地,100mM高氯酸铬/乙二胺络合物在pH 4也导致珠聚集,同时布朗运动消失(见图5)。然而,10mM浓度在pH 4(通过CE显示含有大约10%单体的制品)没有显示可观察的聚集并且维持与未修饰珠可比的完全布朗运动(见图6)。在这些实例中,在山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗体捕获小鼠抗兔抗体-HRP的结合容量方面不存在差异(见图7),这表明调节pH至pH4并没有不利地影响GAM偶联反应。
实例4:增加低聚物形成:增加胺配体浓度。
在保留一种特定铬盐和配体的同时,评估可能随后影响靶分子与铬低聚物-表面结合的不同配体浓度的影响。通过用另一种磁珠测试高氯酸铬-乙二胺,例举不同乙二胺浓度的影响。抗体结合作用可以根据如载量测定法所测定的配体浓度变动。
a.高氯酸铬-乙二胺溶液的制备。
将六水合高氯酸铬(3×1.15g)溶解于3×25mL纯水中并且彻底地摇动小瓶直至全部固体溶解。添加67μl、134μl和167.5μl乙二胺溶液至3种铬溶液。在添加时将形成沉淀物。将所得到的溶液在平台混合器上摇动48小时。应当见不到沉淀物。应当通过将溶液离心并且保留上清液除去任何残留的沉淀物。
通过CE分析,命名为X、Y和Z的3种不同样品分别含有在低聚络合物中的30%、10%和0%单体组分。相关的pH点是2.7、3.0和3.3。
b.添加铬低聚物至磁珠。
BcMag羧基封端的磁珠(目录号FB-101)从Bioclone,CA,USA供应。为制备这些珠子,允许它们达到室温并且将这些珠子涡旋混合30秒,随后超声处理另外60秒。必须将这些珠悬浮为单分散的单个粒子。如果观察到任何聚集珠,则重复涡旋混合和超声波处理直至观察不到聚集物。将50μl珠浓缩物分配至1.7mL微管中。将全部管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加50μl不同的铬溶液(分别命名为X型、Y型和Z型)并且将管涡旋混合30秒,并且随后将悬液静置60分钟,伴以偶尔混合。
c.山羊抗小鼠多克隆抗体与铬连接珠表面的偶联
从转子中取出铬活化的BcMag珠并且将悬液涡旋混合30秒。将12.5μl每种类型的活化珠等分取样至另一个管中。将管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加50μl 50mM MES缓冲液至该管。涡旋混合并且重复mES缓冲液洗涤另外2次。在移除上清液后,添加50μl 500μg/ml山羊抗小鼠Fc特异性多克隆抗体(LampireBiological,USA)并且将悬液涡旋混合30秒,并且随后将悬液静置60分钟,伴以偶尔混合。在涡旋混合悬液30秒后,将全部管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加50μL150mM盐水,同时向管添加0.025%Proclin 300溶液。涡旋混合并且在盐水溶液中反复洗涤另外2次。
d.小鼠单克隆抗体与铬连接珠表面的偶联
从转子中取出铬活化的BcMag珠并且将悬液涡旋混合30秒。将12.5μl每种类型的活化珠等分取样至另一个管中。将管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加50μl 50mM MES缓冲液至该管。涡旋混合并且重复MES缓冲液洗涤另外2次。在移除上清液后,添加50μl 500μg/ml 3A1-小鼠单克隆抗体(Agen,Australia)并且将悬液涡旋混合30秒,并且随后将悬液静置60分钟,伴以偶尔混合。在涡旋混合悬液30秒后,将全部管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加50μL150mM盐水,同时向管添加0.025%Proclin 300溶液。涡旋混合并且在盐水溶液中反复洗涤另外2次。
e.进行抗体载量测定。
根据以下方法进行磁珠上的抗体载量测定。简言之,材料和方法如下所述。
测定法组分:
抗体偶联的珠
检测抗体:
山羊抗小鼠-IgG-R-藻红蛋白(250μg/ml,Sigma,USA)
小鼠-IgG-FITC(2mgs/ml,Jackson,USA)
洗涤缓冲液:10mM PBS,pH 7.4,含有0.05%Tween 20
分析缓冲液:10mM PBS,pH 7.4,含有1%BSA,0.05%Tween 20
微板:PP白色,U形式(Greinerbio,USA)
测定操作方案:
在60μl分析缓冲液中稀释2.5μl每种珠样品。在涡旋混合至少60秒后,取出20μl悬液并且在480μl分析缓冲液中再次稀释。在分析缓冲液中稀释小鼠IgG-FITC检测抗体至工作浓度20μg/ml。在分析缓冲液中稀释山羊抗小鼠IgG-RPE检测抗体至工作浓度1μg/ml。
在涡旋混合稀释的珠悬液至少60秒后,向孔添加50μl抗体包被的珠。在添加50μl检测抗体至适宜的孔后,在室温于黑暗下孵育60分钟。将珠平板置于磁平板上2分钟,并且从孔中移除100μl上清液。添加100μl洗涤缓冲液至每个孔,并且将珠平板置于磁平板上2分钟,并且从孔中移除100μl上清液。在添加100μl分析缓冲液后,在FACS Canto II(BDBiosciences,USA)上对珠读数。
f.结果实例
如8图中所示,山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗体捕获小鼠单克隆抗体-荧光素的结合容量随用来使GAM抗体与基材结合的不同铬低聚混合物(分别命名为X型、Y型和Z型)变化。
类似地在9图中,小鼠单克隆抗体捕获山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗体-藻红蛋白的结合容量随用来使小鼠抗体与基材结合的不同铬低聚混合物(分别命名为X型、Y型和Z型)变化。
实例5:增加低聚物形成:不同的胺配体。
a.形成不同的铬低聚物。
高氯酸铬与乙二胺。
简言之,将六水合高氯酸铬(2.3g)溶解于25mL纯水中并且彻底混合直至全部固体溶解。类似地,将190μl乙二胺溶液添加至25mL纯水。将这些溶液合并并且在室温搅拌过夜。通过CE,这种溶液含有30%单体高氯酸铬以及双(3-氨基丙基)二乙胺。pH是2.3。
简言之,将六水合高氯酸铬(2.3g)溶解于25mL纯水中并且彻底混合直至全部固体溶解。类似地,将545μl双(3-氨基丙基)二乙胺溶液添加至25mL纯水。将这些溶液合并并且在室温搅拌2日。通过CE,这种特殊溶液不显示与铬单体对应的峰。pH是4.8。
b.添加铬低聚物至磁珠(Bangs)。
ProMag羧基封端的磁珠(目录号PMC3N/9080)从Bangs,IN,USA供应。为制备这些珠子,允许它们达到室温并且将这些珠子涡旋混合30秒,随后超声处理另外60秒。将2×550μL珠浓缩物分配至2×1.7mL微管中。将这些管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加每管550μL相应的铬低聚物溶液。在室温留置1小时伴以转动。
c.山羊抗小鼠多克隆抗体与铬连接珠表面的偶联
从转子中取出铬低聚物活化的Bangs ProMag珠并且将悬液涡旋混合30秒。将这些管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向每管添加550μl的50mM MES缓冲液(pH 5.2)。重复涡旋混合,移出上清液并且另外添加两(2)次MES。在移出上清液后,将50mM MES中的550μl 1mg/ml山羊抗小鼠Fc特异性多克隆抗体(LampireBiological,目录号7455527,USA)添加至珠粒。将珠溶液涡旋混合30秒。将管在室温孵育1小时伴以转动。
在涡旋混合悬液30秒后,将多个管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加550μL 150mM盐水,同时向管添加0.025%Proclin 300溶液。涡旋混合并且在盐水溶液中反复洗涤另外2次。
d.进行抗体载量测定。
根据以下方法进行磁珠上的抗体载量测定。简言之,材料和方法如下所述。
测定法组分:
抗体偶联的珠。
检测抗体:小鼠-IgG-FITC(2mgs/ml,Jackson,USA)
洗涤缓冲液:10mM PBS,pH 7.4,含有0.05%Tween 20
分析缓冲液:10mM PBS,pH 7.4,含有1%BSA,0.05%Tween 20
微板:96孔Millipore 0.42um滤板(Greinerbio,USA)
测定操作方案:
在50μl分析缓冲液中稀释2.5μl每种珠样品。在涡旋混合至少30秒后,取出10μl悬液并且在490μl分析缓冲液中再次稀释。在分析缓冲液中稀释小鼠IgG-FITC检测抗体至工作浓度10μg/ml。在涡旋混合稀释的珠悬液至少30秒后,向孔添加50μl抗体包被的珠。使用真空过滤设备从孔中移除珠溶液。在添加50μl检测抗体至适宜的孔后,在室温在平板摇床上于黑暗下孵育60分钟。使用真空过滤设备从孔中移除检测抗体溶液。添加200μl洗涤缓冲液至平板的每个孔并且将平板置于平板摇床上30秒。从孔中移除200μl上清液。添加100μl洗涤缓冲液至每个孔,在FACS Canto II(BD Biosciences,USA)上对珠读数。
e.结果实例。
如10图中所示,使用相同摩尔浓度的不同配体形成了不同的低聚络合物并且改变了山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗体捕获小鼠单克隆抗体-荧光素的结合容量。
实例6:操纵低聚金属-基材络合物的水解性低聚物形成。在结合靶分子之前使用缓冲液预处理活化的金属-基材络合物。
使用在金属-基材络合物中具有大约30%单体组分的制品作为模型,以便确定改变络合物中给电子条件的影响和其对靶分子结合作用和其性能的后续作用。通过比较MES缓冲液pH5.2与MES缓冲液pH7,例举不同洗涤缓冲液的影响。抗体与表面结合的铬低聚物的结合可以根据如载量测定法所测定的洗涤缓冲液pH选择而变动。
a.铬种类选择。
使用具有大约30%单体组分的高氯酸铬与乙二胺络合物(见实例5a)。
b.添加洗涤缓冲液至磁珠(Dynal)。
M-270羧基封端的磁珠(目录号143.16D)从Dynal,IN,Norway供应。为制备这些珠子,允许它们达到室温并且将这些珠子涡旋混合30秒,随后超声处理另外60秒。将2×140μl珠浓缩物分配至2×1.7mL微管中。将这些管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加添加420μl高氯酸铬/乙二胺溶液。在室温留置1小时伴以转动。
从转子中取出高氯酸铬/乙二胺活化的DynabeadsM-270珠并且将悬液涡旋混合30秒。将50μl溶液分配至2个管中。将这些管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向每个馆添加50μl洗涤缓冲液,50mM MES(pH5.2)或50mM MES(pH7.0)。重复涡旋混合,移出上清液并且重复MES(pH 5.2或pH 7.0)洗涤另外两(2)次。
c.山羊抗小鼠多克隆抗体与铬连接珠表面的偶联
在移出上清液后,将50mM MES(pH5.2或pH7.0)中的50μl 0.5mg/ml山羊抗小鼠Fc特异性多克隆抗体(Lampire Biological,目录号7455527,USA)添加至珠粒。将珠溶液涡旋混合30秒。将管在室温孵育1小时伴以转动。
在涡旋混合悬液30秒后,将多个管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加50μL 50mM TBS缓冲液(pH8.0),同时向管添加0.025%Proclin 300。涡旋混合并且在TBS缓冲液中反复洗涤另外2次。
d.进行抗体载量测定。
根据如实例5d中先前所述的方法进行磁珠上的抗体载量测定。
e.结果实例。
如11图中所示,在形成低聚物金属-基材络合物之后和在添加GAM多克隆抗体形式的靶分子之前通过改变pH条件对金属-基材络合物的后处理可以用来进一步调节低聚金属组合物并且随后改变靶分子的结合作用和性能。
实例7:不同表面和材料对形成最佳金属低聚物-基材络合物的影响。
使用具有大约30%单体组分的制品作为模型,以便显示基材的表面特性可以显著改变靶分子结合特性和其性能。
a.铬种类选择。
使用具有大约30%单体组分的高氯酸铬与乙二胺络合物(见实例5a)作为模型。
b.选择珠上的不同表面。
出于比较目的,将具有羟基和羧基官能团的二氧化硅珠与聚合珠比较。
ProMag-COGH(目录号PMC3N/9885)来自Bangs,IN,USA
Silica-OH(目录号SS06N)来自Bangs,IN,USA
Silica-COOH(目录号SC05H)来自Bangs,IN,USA
c.添加高氯酸铬/乙二胺至磁珠。
全部珠按照如实例5b中所述的相似方式处理。
从转子中取出铬低聚物活化的珠(250μl)并且将悬液涡旋混合30秒。将这些管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向每管添加250μl的50mM MES缓冲液(pH 5.2)。重复涡旋混合,移出上清液并且另外添加两(2)次MES。
d.山羊抗小鼠多克隆抗体与不同的铬连接珠表面的偶联
在移出上清液后,将50mM MES中的250μl 1mg/ml山羊抗小鼠Fc特异性多克隆抗体(Lampire Biological,目录号7455527,USA)添加至珠粒。将珠溶液涡旋混合30秒。将管在室温孵育1小时伴以转动。
在涡旋混合悬液30秒后,将多个管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加250μL 150mM盐水,同时向管添加0.025%Proclin 300溶液。涡旋混合并且在盐水溶液中反复洗涤另外2次。
e.进行抗体载量测定。
根据如实例5d中先前所述的方法进行磁珠上的抗体载量测定。
f.链霉亲和素与不同的铬连接珠表面的偶联
从转子中取出铬低聚物活化的珠(250μl)并且将悬液涡旋混合30秒(见实例6b)。将多个管(对于磁珠)置于磁架上1分钟或将多个管(对于非磁珠)置于微量离心机中以12,000SPR持续3分钟,并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向每管添加250μl的50mM MES缓冲液(pH 5.2)。重复涡旋混合,移出上清液并且另外添加两(2)次MES。在移出上清液后,将50mM MES中的250μl 0.5mg/ml链霉亲和素(Prozyme,目录号SA10,USA)添加至珠粒。将珠溶液涡旋混合30秒。将管在室温孵育1小时伴以转动。
在涡旋混合悬液30秒后,将多个管置于磁架上1分钟或置于微量离心机中以12,000SPR持续3分钟,并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加250μL 150mM盐水,同时向管添加0.025%Proclin 300溶液。涡旋混合并且在盐水溶液中反复洗涤另外2次。
g.进行生物素-RPE载量测定。
根据以下方法在链霉亲和素偶联的珠上进行生物素-藻红蛋白(生物素-RPE)载量测定。简言之,材料和方法如下所述。
测定法组分:
链霉亲和素偶联的珠。
检测:生物素-PE(4mgs/ml,目录号P811,Invitrogen,USA)
洗涤缓冲液:10mM PBS,pH 7.4,含有0.05%Tween 20
分析缓冲液:10mM PBS,pH 7.4,含有1%BSA,0.05%Tween 20
微板:96孔Millipore 0.42um滤板(Millipore,USA)
测定操作方案:
在25μl分析缓冲液中稀释5μl每种珠样品。在涡旋混合至少30秒后,取出20μl悬液并且在480μl分析缓冲液中再次稀释。在分析缓冲液中稀释生物素-RPE至工作浓度0.4μg/ml。
在涡旋混合稀释的珠悬液至少30秒后,向孔添加100μl链霉亲和素包被的珠。使用真空过滤设备从孔中移除珠溶液。在添加50μl检测生物素-RPE至适宜的孔后,在室温在平板摇床上于黑暗下孵育60分钟。使用真空过滤设备从孔中移除检测生物素-RPE溶液。添加200μl洗涤缓冲液至平板的每个孔并且将平板置于平板摇床上30秒。从孔中移除200μl上清液。添加100μl洗涤缓冲液至每个孔,在FACS Canto II(BDBiosciences,USA)上对珠读数。
h.结果实例。
如12图中所示,低聚金属络合物有效使抗体结合在二氧化硅表面上,无论这个表面是否具有-OH或-COOH官能团。这个实例显示使用低聚金属络合物的一种具体制品时与聚合珠的可比较性能。相同的低聚金属-基材络合物也有效结合链霉亲和素,但是性能改善曲线依赖基材和依赖低聚金属络合物(见图13)。
实例8:操纵与靶分子结合组合的低聚金属-基材络合物的水解性低聚物形成。
使用具有大约30%单体组分以形成金属-基材络合物的制品作为模型,以便确定在络合物中改变给电子条件的影响。在实例8中,通过比较pH和离子强度差异,例举靶分子偶联条件的影响。
a.铬种类选择。
使用具有大约30%单体组分的高氯酸铬与乙二胺络合物(见实例5a)。
b.添加铬低聚物至磁珠(Dynal)。
M-270羧基封端的磁珠(目录号143.16D)从Dynal,IN,Norway供应。为制备这些珠子,允许它们达到室温并且将这些珠子涡旋混合30秒,随后超声处理另外60秒。将2×170μl珠浓缩物分配至2×1.7mL微管中。将这些管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加510μL相应的铬低聚物溶液。在室温留置1小时伴以转动。
从转子中取出铬低聚物活化的DynabeadsM-270珠并且将悬液涡旋混合30秒。将50μl溶液分配至5个管中。将这些管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向每个管添加50μl不同的偶联缓冲液:25mM MES(pH 6.5)、50mM MES(pH6.0、6.5和pH7.0)和100mM MES(pH 6.5)。重复涡旋混合,移出上清液并且使用相同的MES洗涤条件额外两(2)次。
c.使用不同的偶联缓冲液pH,山羊抗小鼠多克隆抗体与铬连接珠表面的偶联
在移出上清液后,将相同的相应MES缓冲液中的50μl 0.5mg/ml山羊抗小鼠Fc特异性多克隆抗体(Lampire Biological,目录号7455527,USA)添加至珠粒。将珠溶液涡旋混合30秒。将管在室温孵育1小时伴以转动。
在涡旋混合悬液30秒后,将多个管置于磁架上1分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加50μL 50mM TBS缓冲液(pH8.0),同时向管添加0.025%Proclin 300。涡旋混合并且在TBS中反复洗涤另外2次。
d.进行抗体载量测定。
根据如实例5d中先前所述的方法进行磁珠上的抗体载量测定。
e.结果实例。
如14图中所示,针对低聚金属珠络合物使用不同的偶联缓冲液改变了山羊抗小鼠(GAM)多克隆抗体捕获小鼠单克隆抗体-荧光素的结合容量。
实例9:操纵低聚金属-基材络合物的水解性低聚物形成。形成稳定但是活跃的金属-基材络合物。
使用具有大约30%单体组分以形成金属-基材络合物的制品作为模型,以便确定在络合物中改变给电子条件的影响,及其根据贮存条件对低聚物金属-基材络合物长期贮存的后续影响。通过比较dH2O、MES缓冲液pH5.2和MES缓冲液pH7,例举不同洗涤缓冲液的影响。抗体与表面结合的铬低聚物的结合可以根据如载量测定法所测定的贮存条件而变动。
a.铬种类选择
使用具有大约30%单体组分的高氯酸铬与乙二胺络合物(见实例5a)。
b.添加铬低聚物至二氧化硅-COOH珠(Bangs)。
羧基封端的二氧化硅珠(Inv.L080722G)从Bangs,IN,USA供应。为制备这些珠子,允许它们达到室温并且将这些珠子涡旋混合30秒,随后超声处理另外60秒。将2×600μl珠浓缩物分配至2×1.7mL微管中。将全部管置于微量离心机中以2000转/分钟持续5分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加600μl铬低聚物溶液。在室温留置1小时伴以转动。将铬低聚物活化的二氧化硅珠分成3管。在管1中,将珠用含有0.025%ProClin 300的200μl dH2O洗涤并且重复额外两(2)次。将铬低聚物活化的二氧化硅珠贮存在含有0.025%ProClin 300的200μldH2O中。在管2中,将珠用含有0.025%ProClin 300的200μl 50mM MESpH5.2洗涤并且重复额外两(2)次。将铬低聚物活化的二氧化硅珠贮存在含有0.025%ProClin 300的200μl 50mM MES pH5.2中。在管3中,将珠用含有0.025%ProClin 300的200μl 10mM PBS pH7.4洗涤并且重复额外两(2)次。将铬低聚物活化的二氧化硅珠贮存在含有0.025%ProClin300的200μl 10mM PBS pH7.4中。
将铬活化的不同Bangs二氧化硅COOH珠贮存不同时间(0日、7日、30日和180日)并且监测抗体结合作用。
c.山羊抗小鼠多克隆抗体与铬连接珠表面的偶联
从转子中取出铬低聚物活化的DynabeadsM-270珠并且将悬液涡旋混合30秒。将全部管置于微量离心机中以2000转/分钟持续5分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向每个管添加50μl 50mM MES
|
峰 |
强度 |
峰 |
强度 |
比率 |
谷 |
单体Sln |
575.3 |
0.1642 |
407.6 |
0.1836 |
1.118 |
478 |
二聚体Sln |
584.1 |
0.0611 |
417.3 |
0.0608 |
0.995 |
487 |
三聚体Sln |
581 |
0.1054 |
421.1 |
0.1666 |
1.581 |
496.1 |
(pH5.2)。重复涡旋混合,移出上清液并且另外添加两(2)次MES。在移出上清液后,将50mM MES(pH5.2)中的50μl 1mg/ml山羊抗小鼠Fc特异性多克隆抗体(Lampire Biological,目录号7455527,USA)添加至珠粒。将珠溶液涡旋混合30秒。将管在室温孵育1小时伴以转动。
将悬液涡旋混合30秒后,将全部管置于微量离心机中以2000转/分钟持续5分钟并且将上清液从珠粒小心地移出并弃去。向珠粒添加50μL 150mM盐水,同时向管添加0.025%Proclin 300溶液。涡旋混合并且在盐水溶液中反复洗涤另外2次。
d.进行抗体载量测定。
根据如实例5d中先前所述的方法进行磁珠上的抗体载量测定。
e.结果实例
如15图中所示,活化的铬低聚物珠络合物是稳定的,显示与山羊抗小鼠(GAM)抗体立即或在180日贮存后偶联时相同的性能。甚至假定摧毁结合作用的PBS中贮存产生了GAM捕获小鼠单克隆抗体-荧光素的较好性能。
表1.
表1由UV/Vis光谱法所分析的铬单体、二聚体和三聚体溶液。
表2
表2.在借助不同的铬溶液与抗TSH抗体偶联的Luminex珠上的TSH测定法产生明显不同的结果。与低聚物相比,铬单体产生最差的结果。