CN101628224B - 表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球及其制备方法和用途，采用了溶胶凝胶法制备了以四氧化三铁纳米颗粒为核，以正硅酸乙酯作硅源为壳的磁性二氧化硅微球，以此微球作模板，以环氧烷偶联剂3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)作为活化剂，二乙胺基乙基盐酸盐作为功能基团，制备成表面修饰二乙胺基乙基(DEAE)的磁性二氧化硅微球。该方法包括制备磁性二氧化硅微球、磁性二氧化硅微球的环氧基化、二乙胺基乙基表面修饰。解决了现有磁性微球与核酸结合能力不高，制备步骤繁琐等技术问题，以该方法制备出的磁性微球结合核酸能力高，可用于从生物样品中分离核酸。
Description
技术领域
本发明属于材料合成、应用领域，涉及一种用于生物样品中分离核酸的材料，具体涉及一种表面修饰二乙胺基乙基(DEAE)的磁性二氧化硅微球及其制备方法和用途。
背景技术
生物磁分离技术是在传统磁分离技术的基础上发展起来，以细胞、细菌、核酸和蛋白质等生物体为应用对象的高效分离技术。它利用磁性或磁性标记生物体在外磁场作用下做定向运动这一特性，对目标生物体进行提取、富集、分离和纯化。早期的工作主要集中于发展磁性标记物的制备技术上，包括通过在磁流体中浸渍将磁性纳米粒子吸附到琼脂糖、聚丙烯酰胺、聚戊二醛和聚乙烯醛等聚合物微球中。这种微球以颗粒大小分布均匀和磁性粒子含量均匀为特征，保证了不同生物分离过程的可重现性和可控性。生物磁分离技术与标准分离步骤相比有一定优势。首先磁分离过程通常非常简单，只涉及几个处理步骤，所有的纯化步骤都可在单个试管或者容器中发生，不需要昂贵的液相色谱系统、离心机、过滤器或者其它设备。分离过程可以在含有悬浮固体物质的粗制样品上直接进行。在某些情况下，例如细胞内蛋白质的提取，甚至可以整合裂解和分离步骤，从而缩短整个分离时间。磁分离技术对细胞、蛋白质和核酸等生物体通常是非常温和的。与高速离心和亲和色谱相比，磁分离技术具有较低的剪切力，能较好地保持被分离细胞的活力和生物分子的生物活性。
目前，生物磁分离技术正在成为生命科学研究的一个重要手段。在分子生物学领域中，核酸是现代生物学、医学研究中的重要课题。作为遗传信息的携带者，DNA是基因表达的物质基础，除在生物体正常生长、发育和繁殖等生命活动中的作用外，它与生命异常如肿瘤的发生、遗传疾病等也密切相关。因此，对核酸分离纯化是许多研究领域的重要前提和保障。
目前常见的核酸分离方法有酚提取/沉淀法、层析法、密度梯度离心法等。这些传统方法往往比较费时，步骤繁琐，需使用有机试剂，有损操作者健康。所以有必要研究一种新的快速、方便的提取基因组DNA的方法。
Levison应用一种以磁性琼脂糖微球作为基质，表面修饰二乙胺基乙基(DEAE)的磁性微球用于核酸提取。但其与核酸结合能力不高，每毫克磁粒仅能结合约3.5μg核酸。
孙敏莉通过磁性纳米粒子与葡聚糖-DEAE包裹的方法合成一种磁性葡聚糖-DEAE微球，并应用于大场杆菌中提取质粒，但未用于全血中核酸的提取。
上述两种表面修饰DEAE的磁性微球，由于DEAE直接修饰在基质的碳羟基上，功能基团DEAE与基质距离较近，核酸与DEAE结合过程中受空间位阻的影响较大，所以该磁球结合核酸能力不高。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球及其制备方法及其用途，该方法设计合理、工艺可行，依该方法制备出的微球提取核酸量大，该微球可应用于生物样品中分离核酸。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球，其化学式为：
Fe3O4/SiO2-GPTMS-DEAE
上述表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备磁性二氧化硅微球；
(2)磁性二氧化硅微球的环氧基化；
(3)二乙胺基乙基表面修饰：
(3.1)将步骤(2)制得的表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球与稀盐酸混合，边搅拌边加热反应；
(3.2)反应完毕后，磁性分离，得到沉淀物，将沉淀物用二次水洗涤；
(3.3)将二乙胺基乙基与NaOH水溶液混合溶解，加入步骤(3.2)洗涤后的沉淀物，搅拌均匀，通过调节二乙胺基乙基和NaOH水溶液的相对量使该混合溶液pH值至8～9，加热反应；
(3.4)反应完毕后，磁性分离，得到沉淀物，将沉淀物用二次水洗涤，再用STET溶液洗涤后，放入STET溶液中，制备成表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球。
上述步骤(3.1)稀盐酸的浓度为0.01～0.05mol/L，表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球与稀盐酸的质量比为1∶100～500，搅拌速度为600～800转/分钟，加热至80～100℃，反应时间为2～4小时；
步骤(3.3)NaOH水溶液的体积浓度为40～60g/L，二乙胺基乙基与NaOH水溶液的质量比为1∶0.5～3，搅拌速度为600～800转/分钟，加热至55～70℃，反应时间为4～6小时；
步骤(3.4)STET溶液的成分是：0.01M Tris，0.1M NaCl，0.001M EDTA和质量浓度为1％的Triton X-100。
上述步骤(2)磁性二氧化硅微球的环氧基化的方法是：
(2.1)取步骤(1)制得的磁性二氧化硅微球与甲苯按质量比为1∶1000～1100配成混合溶液，以50～70Hz的频率超声处理10～30分钟；
(2.2)在气体流速为2～3mL/min氮气保护下，加入3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，边滴加边以600～800转/分钟搅拌，再以90～110℃回流12～24小时，得到沉淀物，所述3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷与步骤(2.1)的混合溶液的质量比为1∶22～26；
(2.3)用外部磁铁将步骤(2.2)得到的沉淀物分离出来，将该沉淀物依次用二甲基甲酰胺、丙酮、无水乙醇、水交替洗涤后，放入真空干燥箱内，50～70℃干燥12～24小时，制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球。
上述步骤(1)磁性二氧化硅微球的制备方法是：
(1.1)将十六烷基三甲基溴化铵与甲苯按质量比为1∶12～20混合，以800～1000转/分钟将该混合物搅拌均匀；
(1.2)将FeCl2·4H2O与FeCl3·6H2O按质量比为1∶3溶解于二次水中，配制成浓度为130～150g/L的水溶液；
(1.3)在气体流速为2～3mL/min氮气保护下以4～5mL/h的速度将步骤(1.2)的水溶液滴加到步骤(1.1)的混合物中，边滴加边以600～800转/分钟持续搅拌4～6小时；
(1.4)加入质量浓度为25％的氨水，以600～800转/分钟持续搅拌2～4小时，有四氧化三铁纳米颗粒形成，所述氨水与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为0.1～0.2∶1；
(1.5)再以2～3mL/h的速度滴加正硅酸乙酯，边滴加边以600～800转/分钟搅拌反应，调节pH值至8～9，滴加完毕1～2小时后，停止通氮气，常温常压下以600～800转/分钟搅拌4～5天，得到产物，所述正硅酸乙酯与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1～1.5∶1；
(1.6)在产物中加入乙醇，以1500～2000转/分钟离心30～50分钟，得到上层液和沉淀物，所述乙醇与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为2～2.5∶1；
(1.7)弃上层液，将沉淀物在乙醇中以70～80℃回流12～24小时，得到上层亮黄色溶液和黑色沉淀物，所述乙醇与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为20～25∶1；
(1.8)弃上层亮黄色溶液，将黑色沉淀物用乙醇，水，丙酮交替洗涤后，放入真空干燥箱内，50～70℃干燥12～24小时，制备成磁性二氧化硅微球。
上述步骤(1.1)十六烷基三甲基溴化铵与甲苯的质量比为1∶12～18；步骤(1.2)配制成的水溶液浓度为140～150g/L；步骤(1.4)氨水与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为0.15～0.2∶1；步骤(1.5)正硅酸乙酯与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1.2～1.5∶1；步骤(1.6)乙醇与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为2.1～2.4∶1；步骤(1.7)乙醇与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为20～24∶1；上述步骤(2.1)磁性二氧化硅微球与甲苯的质量比为1∶1020～1080；上述步骤(3.1)表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球与稀盐酸的质量比为1∶100～300；步骤(3.3)二乙胺基乙基与NaOH水溶液的质量比为1∶1～1.2，制备出的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球用于生物样品中分离基因组DNA效果较佳。
上述步骤(1.1)中十六烷基三甲基溴化铵与甲苯质量比为1∶15；步骤(1.2)配制成的水溶液浓度为140g/L；步骤(1.4)氨水与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为0.17∶1；步骤(1.5)正硅酸乙酯与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1.25∶1；步骤(1.6)乙醇与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为2.25∶1；步骤(1.7)乙醇与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为22.5∶1；所述步骤(2.1)磁性二氧化硅微球与甲苯的质量比为1∶1050；步骤(2.2)3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷与步骤(2.1)的混合溶液的质量比为1∶25；所述步骤(3.1)表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球与稀盐酸的质量比为1∶150，该稀盐酸的浓度为0.01mol/L；步骤(3.3)NaOH水溶液的体积浓度为40g/L，二乙胺基乙基与NaOH水溶液的质量比为1∶1.2，制备出的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球用于生物样品中分离基因组DNA效果最佳。
如上述方法制备出的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球应用于生物样品中分离基因组DNA。
上述生物样品可以是全血、细菌、动物组织、真菌或植物。
上述生物样品是全血，将表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球应用于全血中分离基因组DNA的方法，包括以下步骤：
(1)红细胞的裂解
(1.1)取冻存血，加入预冷红细胞裂解液，颠倒混匀，在冰浴中孵育10～20分钟，于4℃，1000～1500g离心10～20min，弃上清；
(1.2)加入200～300μl预冷红细胞裂解液，700～800μl灭菌水，涡旋1～5分钟，于4℃，1000～1500g离心15min，弃上清；
(2)白细胞的裂解
向步骤(1.2)得到的产物中加入100～200μl白细胞裂解液，涡旋30～60秒，加入2.5～5μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，于50～60℃裂解25～60min；
(3)核酸的结合
向步骤(2)得到的产物中加入0.8～1.6ml灭菌水和1mg储存于STET溶液的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球，吹吸混匀，孵育3～5分钟；
(4)清洗
向步骤(3)得到的产物中加入0.4～0.8ml清洗液，摇匀，静置1～3分钟，磁性分离，弃上清；
(5)洗脱
向步骤(4)得到的产物中加入100～200μl洗脱液，吹吸均匀，50～65℃孵育5～10分钟，磁性分离，收集上清；
(6)除盐
(6.1)在步骤(5)收集的上清中加入200～600μl无水乙醇，混匀，静置10～20min，于4℃，10000～15000g离心20～30min，弃上清；
(6.2)加入70％乙醇50～100μL，混匀，于4℃，10000～15000g离心5～10min，弃上清；
(6.3)室温风干10～15分钟，加入100～200μL TE溶液溶解，即得到基因组DNA。
上述方法中：步骤(1.1)冻存血的用量为200μL，预冷红细胞裂解液的用量为200μL，预冷红细胞裂解液的成分为：0.01M Tris-HCl、0.32M蔗糖、0.005M MgCl2和质量浓度为1％的Triton X-100，该预冷红细胞裂解液的pH值为7.5；
步骤(2)白细胞裂解液的成分是：0.03M Tris-HCl、0.8M盐酸胍、0.03MEDTA和质量浓度为0.5％的Triton X-100，该白细胞裂解液的pH值为8.0；
步骤(3)STET溶液的成分是：0.01M Tris-HCl、0.1M NaCl、0.001M EDTA和质量浓度为1％的Triton X-100；
步骤(4)清洗液的成分是：0.01M Tris-HCl、0.4M NaCl和1mM EDTA、该清洗液的pH值为8.0；
步骤(5)洗脱液的成分是：0.05MArg和1.0M NaCl；
步骤(6.3)TE溶液的成分为：0.01M Tris和0.001M EDTA，该溶液的pH为8.0。
本发明的优点是：
1、采用该方法制备的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球提取核酸量大。
2、该方法设计合理、工艺可行性好，操作简单。
3、采用该方法制备的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球可用于生物样品中分离核酸。
附图说明
图1是实施例1磁性二氧化硅微球表面修饰DEAE前后的VSM磁滞回线。其中图a是修饰DEAE前的VSM磁滞回线；图b是修饰DEAE后的VSM磁滞回线。
图2-a是实施例1制备的磁性二氧化硅微球的扫描电子显微镜照片。
图2-b是实施例1制备的磁性二氧化硅微球的透射电子显微镜照片。
图2-c是实施例1制备的表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球的扫描电子显微镜照片。
图3是实施例1制备的表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球XPS光电子能谱图。
图4是实施例1制备的表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球XPS光电子能谱N元素的化学位移谱图。
图5是实施例1制备的表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球的全自动X-射线衍射图谱。
图6是以实例1制备的表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球纯化核酸的电泳照片。
图7是用不同量DEAE修饰磁性二氧化硅微球纯化核酸的电泳照片。
图8是二氧化硅微球经环氧化修饰后与DEAE反应的磁性微球和不经环氧化修饰直接与DEAE反应的磁性二氧化硅微球纯化核酸的电泳照片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
本发明采用了溶胶凝胶法制备了以四氧化三铁纳米颗粒为核，以正硅酸乙酯作硅源为壳的磁性二氧化硅微球，以此微球作模版以环氧烷偶联剂3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)作为活化剂，二乙胺基乙基盐酸盐作为功能基团，制备成表面修饰二乙胺基乙基(DEAE)的磁性二氧化硅微球，该微球的化学式为：
Fe3O4/SiO2-GPTMS-DEAE
该表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制备方法的具体实施例如下：
实施例1
1.制备磁性二氧化硅微球
取7.2892g十六烷基三甲基溴化铵与109.3g甲苯加入到四口烧瓶内，用搅拌机以1000转/分钟搅拌均匀，将0.329g FeCl2·4H2O与0.987g FeCl3·6H2O溶解于9.4397g二次水中配制成浓度为140g/L的水溶液，在2～3mL/min氮气保护下以4～5mL/h滴加到上述混合物中，800转/分钟持续搅拌4～6小时，再加入质量浓度为25％氨水2mL，800转/分钟持续搅拌2小时，在混合物中，有四氧化三铁纳米颗粒形成，缓慢加入正硅酸乙酯9.79mL，800转/分钟搅拌反应，调节pH至8，以2～3mL/h滴加正硅酸乙酯完毕后1小时，停止氮气保护，800转/分钟搅拌，常温常压下老化5天，在产物中加入乙醇16.4g，以2000转/分钟离心40分钟，去掉上层液，沉淀物80℃用乙醇164g回流12小时，去掉上层亮黄色溶液，黑色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗涤，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成磁性二氧化硅微球。
2.磁性二氧化硅微球的环氧基化
取磁性二氧化硅微球0.1g，甲苯105g加入三口烧瓶，用超声清洗机频率为60Hz的超声处理10分钟，在2～3mL/min N2气保护下，再加入3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷4.2g，800转/分钟搅拌，110℃回流12小时，用外部磁铁将沉淀物分离，依次用二甲基甲酰胺、丙酮、无水乙醇、水交替洗涤3次后，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球。
3.二乙胺基乙基表面修饰
将表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球0.3g与浓度为0.01mol/L稀盐酸75mL加入两口烧瓶内，800转/分钟搅拌，并加热至100℃反应3小时，反应完毕，用外部磁铁将沉淀分离，用二次水洗涤6～10次，再将5g DEAE与12g体积浓度为40g/L的NaOH水溶液混合溶解加入两口烧瓶内，用搅拌器以800转/分钟搅拌均匀，通过调节两者的相对量使溶液pH至9，加热至65℃反应5小时。反应完毕，用外部磁铁将沉淀分离，用二次水洗涤沉淀8次，再用STET溶液(0.01M Tris-HCl、0.1M NaCl、0.001M EDTA和质量浓度为1％的TritonX-1000，pH＝8.0)洗涤沉淀3次，并放入STET溶液中备用。制备成表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球。
实施例2
1.制备磁性二氧化硅微球
取7.2892g十六烷基三甲基溴化铵与87.47g甲苯加入到四口烧瓶内，用搅拌机以1000转/分钟搅拌均匀，将0.305gFeCl2·4H2O与0.916g FeCl3·6H2O溶解于9.4397g二次水中配制成浓度为130g/L的水溶液，在2～3mL/min氮气保护下以4～5mL/h滴加到上述混合物中，800转/分钟持续搅拌4～6小时，再加入质量浓度为25％的氨水1.15mL，800转/分钟持续搅拌2小时，在混合物中，有四氧化三铁纳米颗粒形成，缓慢加入正硅酸乙酯6.78mL，800转/分钟搅拌反应，调节pH至8，以2～3mL/h滴加正硅酸乙酯完毕后1小时，停止氮气保护，800转/分钟搅拌，常温常压下老化5天，在产物中加入乙醇14.58g，以2000转/分钟离心40分钟，得到上层液和沉淀物，去掉上层液，沉淀物80℃用乙醇145.8g回流12小时，去掉上层亮黄色溶液，黑色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗涤后，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成磁性二氧化硅微球。
2.磁性二氧化硅微球的环氧基化
取磁性二氧化硅微球0.1g，甲苯100g加入三口烧瓶，用超声清洗机频率为60Hz的超声处理10分钟，在2～3mL/min N2气保护下，再加入3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷4.0g，800转/分钟搅拌，110℃回流12小时，用外部磁铁将沉淀物分离，依次用二甲基甲酰胺、丙酮、无水乙醇、水交替洗涤3次后，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球。
3.二乙胺基乙基表面修饰
将表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球0.48g与浓度为0.01mol/L稀盐酸120mL加入两口烧瓶内，800转/分钟搅拌，并加热至100℃反应3小时，反应完毕，用外部磁铁将沉淀分离，用二次水洗涤6～10次，再将10g DEAE与12g体积浓度为40g/L的NaOH水溶液混合溶解加入两口烧瓶内，用搅拌器以800转/分钟搅拌均匀，通过调节两者的相对量使溶液pH至9，加热至65℃反应5小时。反应完毕，用外部磁铁将沉淀分离，用二次水洗涤沉淀8次，再用STET(0.01M Tris-HCl、0.1M NaCl、0.001M EDTA和质量浓度为1％的Triton X-1000，pH＝8.0)溶液洗涤沉淀3次，并放入STET溶液中备用。制备成表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球。
实施例3
1.制备磁性二氧化硅微球
取7.2892g十六烷基三甲基溴化铵与145.784g甲苯加入到四口烧瓶内，用搅拌机以1000转/分钟搅拌均匀，将0.354gFeCl2·4H2O与1.060g FeCl3·6H2O溶解于9.4397g二次水中配制成浓度为150g/L的水溶液，在2～3mL/min氮气保护下以4～5mL/h滴加到上述混合物中，800转/分钟持续搅拌4～6小时，再加入质量浓度为25％的氨水2.28mL，800转/分钟持续搅拌2小时，在混合物中，有四氧化三铁纳米颗粒形成，缓慢加入正硅酸乙酯11.76mL，800转/分钟搅拌反应，调节pH至8，以2～3mL/h滴加正硅酸乙酯完毕后1小时，停止氮气保护，800转/分钟搅拌，常温常压下老化5天，在产物中加入乙醇18.223，以2000转/分钟离心40分钟，得到上层液和沉淀物，去掉上层液，沉淀物80℃用乙醇182.23g回流12小时，得到上层亮黄色溶液和黑色沉淀物，去掉上层亮黄色溶液，黑色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗涤，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成磁性二氧化硅微球。
2.磁性二氧化硅微球的环氧基化
取磁性二氧化硅微球0.1g，甲苯110g加入三口烧瓶，用超声清洗机频率为60Hz的超声处理10分钟，在2～3mL/min N2气保护下，再加入3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷4.4g，800转/分钟搅拌，110℃回流12小时，用外部磁铁将沉淀物分离，依次用二甲基甲酰胺、丙酮、无水乙醇、水交替洗涤3次后，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球。
3.二乙胺基乙基表面修饰
将表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球0.5g与浓度为0.01mol/L稀盐酸125mL加入两口烧瓶内，800转/分钟搅拌，并加热至100℃反应3小时，反应完毕，用外部磁铁将沉淀分离，用二次水洗涤6～10次，再将15g DEAE与12g体积浓度为40g/L的NaOH水溶液混合溶解加入两口烧瓶内，用搅拌器以800转/分钟搅拌均匀，通过调节两者的相对量使溶液pH至9，加热至65℃反应5小时。反应完毕，用外部磁铁将沉淀分离，用二次水洗涤沉淀8次，再用STET(0.01M Tris-HCl、0.1M NaCl、0.001M EDTA和质量浓度为1％的Triton X-1000，pH＝8.0)溶液洗涤沉淀3次，并放入STET溶液中备用。制备成表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球。
为了确定最佳的工艺步骤，进行了大量的实验室研究试验，各种试验情况如下：
1、DEAE用量对表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球从人外周血提取基因组DNA的影响。
在本发明实施例1的DEAE表面修饰工艺步骤3中，分别将5g、10g和15g的DEAE与等量的NaOH水溶液分别加入等量的表面键合环氧基的磁性微球，后续工艺步骤与实例1完全相同，得到三种表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球。所得到三种表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球纯化全血gDNA的结果见图7，该图中泳道1为核酸Maker；泳道2、3和4分别为加入5g、10g和15g DEAE修饰的二氧化硅微球在200μL人全血中提取的基因组核酸，结果表明DEAE用量为10g为最佳用量。
2、GPTMS对表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球纯化全血中基因组DNA的影响。
在本发明实施例1的表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球工艺步骤2中，磁性二氧化硅微球不经GPTMS修饰成表面键合环氧基的磁性微球，而是将磁性二氧化硅微球上直接与DEAE结合，后续其它工艺步骤与实例1完全相同，制备成直接由磁性二氧化硅微球与DEAE结合的磁性微球。所制备的直接由磁性二氧化硅微球与表面修饰DEAE的磁性微球纯化分析DNA的电泳照片见图8，该图中泳道1为DNA marker、泳道2为经GPTMS修饰成表面键合环氧基后再结合DEAE的磁性微球纯化的核酸、泳道3为不经GPTMS修饰成表面键合环氧基的磁性微球直接和DEAE反应的磁性微球纯化的核酸。结果表明不经GPTMS修饰成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球不能与DEAE结合，没有纯化全血中gDNA的能力。
为了验证本发明的有益效果，将实施例1制备的表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球用VSM磁滞回线仪、XPS光电子能谱仪、全自动X-射线衍射仪、扫描电子显微镜、透射电镜、元素分析仪、原子吸收光谱仪对其进行了表征；利用琼脂糖凝胶电泳测试了表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球纯化基因组DNA的性能，各种试验情况如下：
观察物品：表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球
实验仪器：振动样品磁强计型号为vsm-9500；高分辨透射电子显微镜型号为JEM-3010；XPS光电子能谱仪型号为KRATOS AXIS ULTRA；全自动X-射线衍射仪型号为D/Max-3c；环境扫描电子显微镜型号为Quanta 200；元素分析仪；原子吸收分光度计型号为TAS 986(G)。
1、观察
按透射电镜、扫描电子显微镜使用方法对磁性二氧化硅微球修饰前后进行观察，观测结果见图2-a、图2-b和图2-c。由图2-a、图2-b可见，透射电镜观察和扫描电子显微镜观察磁性二氧化硅微球呈类球形，结构完整；由图2-c可见，扫描电子显微镜观察磁性二氧化硅微球修饰后仍呈类球形，结构完整。
2、测试
按VSM磁滞回线仪、XPS光电子能谱仪、全自动X-射线衍射仪、元素分析仪、原子吸收光谱仪，电泳分析的测试方法对表面鳌合金属离子的磁性二氧化硅微球进行测试。
3、观测结果
用VSM磁滞回线仪测试表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球结果见图1。由图1可见，表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球顺磁性好，无矫顽力，饱和磁化强度为30.081emu/g。用XPS光电子能谱仪测试的光电子能谱图见图3，由图3可见，DEAE成功的结合在磁性二氧化硅微球上，各元素的含量见表1。
表1表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球XPS光电子能谱元素含量
| 元素 | 峰面积(cts-eV/s) | 灵敏常数 | 浓度(％) |
| C 1s | 2649.0 | 0.278 | 31.52 |
| Si 2p | 2311.1 | 0.328 | 23.57 |
| O 1s | 11093.1 | 0.78 | 43.31 |
| N 1s | 238.5 | 0.477 | 1.6 |
由表1可见，所得微球含有Si、C、O、N等元素，表明表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球含有制备该微球相应成分。
表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球XPS光电子能谱N元素的化学位移谱图见图4。由图4可见，N元素峰在399.4ev，说明N元素以叔胺形式存在。
用全自动X-射线衍射仪测定表面修饰DEAE的磁性二氧化硅纳米微球的X-射线衍射图谱示于图5。由图5可见，X-射线衍射图谱2θ在18.2°、30.613°、35.690°、43.420°、53.949°和57.214°等处出现了Fe3O4的特征强衍射峰，在22.700°等处出现了SiO2的特征强衍射峰，这些衍射信号与立方晶系Fe3O4的(111)、(220)、(311)、(400)、(422)、(511)等点阵面的衍射峰[JCPDS，65-3107]相一致，在22.700°附近出现了SiO2无定型的特征衍射峰。
用元素分析仪进行测试，得到的磁性二氧化硅微球和表面修饰DEAE的磁性二氧化硅纳米微球的元素含量。测试结果见表2。
表2磁性二氧化硅微球和表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球的元素含量
由表2可见，表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球与磁性二氧化硅微球相比，C、H、N的含量显著升高，说明磁性二氧化硅微球已被相应的有机成分所修饰。
图6是以实例1制备的表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球测得的电泳照片。泳道1为DNA marker；泳道2至6为平行样，为表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球所纯化得到的gDNA。由图6可见，表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球可以有效的提取纯化得到纯的且完整性好的gDNA。
4、用表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球与核酸结合
用Tris-HCl缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH 7.5)将鲑鱼精DNA配置成10μg/200μL的溶液。取2mL离心管两个标记为1号、2号，分别加入200μL上述DNA溶液和1mg磁性微球，吹吸混匀，孵育2分钟。磁性分离，取上清液测紫外，计算磁性微球结合DNA的量。
核酸定量方法：用安捷伦8453型紫外可见分光光度剂测定DNA溶液在260nm的紫外吸光值，比色皿光程为0.2厘米，然后根据公式：260nm紫外吸光值×0.25×体积，计算DNA溶液中DNA的质量。结果见表3
表3
| 管号 | 加入DNA的量μg | 结合的量μg | 结合率％ |
| 1 | 10.00 | 9.43 | 99.26 |
| 2 | 10.00 | 9.46 | 99.58 |
用上述方法制备出的表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球用于从生物样品中分离基因组DNA。
该生物样品可以是全血、细菌、动物组织、真菌、植物。
以表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球用于从全血中分离基因组DNA为例，该方法具体实施例如下：
取2mL离心管，分别加入200μL冻存血、200μL预冷红细胞裂解液(0.01MTris-HCl、0.32M蔗糖、0.005M MgCl2、1％(w/v)Triton X-100、pH7.5)颠倒混匀于冰浴中孵育10分钟。于4℃、1300g离心15min，去上清。加入250μl预冷红细胞裂解液、750μl灭菌水，涡旋1分钟。于4℃、1300g离心15min，去上清。加入100μl白细胞裂解液(0.03M Tris-HCl、0.8M盐酸胍、0.03M EDTA、0.5％(w/v)Triton X-100、pH8.0)，涡旋30秒，加入2.5μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，于50℃裂解25min。
裂解后分别加入0.8ml灭菌水和约1mg表面修饰DEAE的磁性二氧化硅微球(储存于0.01M Tris-HCl、0.1M NaCl、0.001M EDTA、1％(w/v)TritonX-100的溶液中)。吹吸混匀，孵育5分钟，加入0.4ml清洗液(0.01MTris-HCl、0.4M NaCl、1mM EDTA、pH8.0)，摇匀静置1分钟。磁性分离去上清。
加入100μl洗脱液(0.05M Arg、1.0M NaCl)，吹吸均匀，65℃孵育5分钟，磁性分离收集上清。
加入2.5体积无水乙醇，混匀静止15分钟。4℃、15000g离心30分钟，弃上清，加入70％乙醇50μL，混匀4℃、15000g离心10分钟，弃上清。室温风干10分钟，加入100μL TE溶解。进行琼脂糖电泳。用紫外分光光度计进行核酸定量分析。
用该方法做5组平行样。实验结果见表4
表4
| 样品 | 260nm吸光值 | 280nm吸光值 | 260nm吸光值280nm吸光值 | 提取核酸的量μg |
| 1 | 0.255 | 0.147 | 1.73 | 6.375 |
| 2 | 0.236 | 0.143 | 1.65 | 5.9 |
| 3 | 0.247 | 0.138 | 1.79 | 6.175 |
| 4 | 0.261 | 0.15 | 1.74 | 6.525 |
| 5 | 0.258 | 0.154 | 1.68 | 6.45 |
| 平均 | --- | --- | --- | 6.285 |
可见该磁性微球可以从200μL全血中纯化约5-6μg基因组核酸。电泳见图6。
Claims (10)
1.表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球，其化学式为
Fe3O4/SiO2-GPTMS-DEAE
该表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球，是以磁性二氧化硅微球作模版、以环氧烷偶联剂3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷作为活化剂，二乙胺基乙基盐酸盐作为功能基团，最终制备得到的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球。
2.如权利要求1所述的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备磁性二氧化硅微球；
(2)磁性二氧化硅微球的环氧基化；
(3)二乙胺基乙基表面修饰：
(3.1)将步骤(2)制得的表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球与稀盐酸混合，边搅拌边加热；
(3.2)反应完毕后，磁性分离，得到沉淀物，将沉淀物用二次水洗涤；
(3.3)将DEAE与NaOH水溶液混合溶解，加入步骤(3.2)洗涤后的沉淀物，搅拌均匀，通过调节DEAE和NaOH水溶液的相对量使该混合溶液pH值至8～9，加热反应；
(3.4)反应完毕后，磁性分离，得到沉淀物，将沉淀物用二次水洗涤，再用STET溶液洗涤后，放入STET溶液中，制备成表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球；所述STET溶液的成分是：0.01MTris，0.1M NaCl，0.001M EDTA和质量浓度为1％的Triton X-1000。
3.根据权利要求2所述的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制备方法，其特征在于：
步骤(3.1)中所述稀盐酸的浓度为0.01～0.05mol/L，表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球与稀盐酸的质量比为1∶100～500，搅拌速度为600～800转/分钟，加热至80～100℃，反应时间为2～4小时；
步骤(3.3)NaOH水溶液的体积浓度为40～60g/L，DEAE与NaOH水溶液的质量比为1∶0.5～3，搅拌速度为600～800转/分钟，加热至55～70℃，反应时间为4～6小时；
步骤(3.4)STET溶液的成分是：0.01M Tris，0.1M NaCl，0.001MEDTA和质量浓度为1％的Triton X-1000。
4.根据权利要求2或3所述的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制备方法，其特征在于：步骤(2)磁性二氧化硅微球的环氧基化的方法是：
(2.1)取步骤(1)制得的磁性二氧化硅微球与甲苯按质量比为1∶1000～1100配成混合溶液，以50～70Hz的频率超声处理10～30分钟；
(2.2)在气体流速为2～3mL/min的氮气保护下，加入3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，边滴加边以600～800转/分钟搅拌，再以90～110℃回流12～24小时，得到沉淀物，所述3缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷与步骤(2.1)的混合溶液的质量比为1∶22～26；
(2.3)用外部磁铁将步骤(2.2)得到的沉淀物分离出来，将该沉淀物依次用二甲基甲酰胺、丙酮、无水乙醇、水洗涤后，放入真空干燥箱内，50～70℃干燥12～24小时，制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球。
5.根据权利要求4所述的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制备方法，其特征在于：步骤(1)磁性二氧化硅微球的制备方法是：
(1.1)将十六烷基三甲基溴化铵与甲苯按质量比为1∶12～20混合，以800～1000转/分钟将该混合物搅拌均匀；
(1.2)将FeCl2·4H2O与FeCl3·6H2O按质量比为1∶3溶解于二次水中，配制成浓度为130～150g/L的水溶液；
(1.3)在气体流速为2～3mL/min氮气保护下以4～5mL/h的速度将步骤(1.2)的水溶液滴加到步骤(1.1)的混合物中，边滴加边以600～800转/分钟持续搅拌4～6小时；
(1.4)加入质量浓度为25％的氨水，以600～800转/分钟持续搅拌2～4小时，有四氧化三铁纳米颗粒形成，所述氨水与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为0.1～0.2∶1；
(1.5)再以2～3mL/h的速度滴加正硅酸乙酯，边滴加边以600～800转/分钟搅拌反应，调节pH值至8～9，滴加完毕1～2小时后，停止通氮气，常温常压下以600～800转/分钟搅拌4～5天，得到产物，所述正硅酸乙酯与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1～1.5∶1；
(1.6)在产物中加入乙醇，以1500～2000转/分钟离心30～50分钟，得到上层液和沉淀物，所述乙醇与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为2～2.5∶1；
(1.7)弃上层液，将沉淀物在乙醇中以70～80℃回流12～24小时，得到上层亮黄色溶液和黑色沉淀物，所述乙醇与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为20～25∶1；
(1.8)弃上层亮黄色溶液，将黑色沉淀物用乙醇，水，丙酮交替洗涤后，放入真空干燥箱内，50～70℃干燥12～24小时，制备成磁性二氧化硅微球。
6.根据权利要求5所述的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制备方法，其特征在于：所述步骤(1.1)十六烷基三甲基溴化铵与甲苯的质量比为1∶12～18；步骤(1.2)配制成的水溶液浓度为140～150g/L；步骤(1.4)氨水与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为0.15～0.2∶1；步骤(1.5)正硅酸乙酯与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1.2～1.5∶1；步骤(1.6)乙醇与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为2.1～2.4∶1；步骤(1.7)乙醇与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为20～24∶1；所述步骤(2.1)磁性二氧化硅微球与甲苯的质量比为1∶1020～1080；所述步骤(3.1)表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球与稀盐酸的质量比为1∶100～300；步骤(3.3)DEAE与NaOH水溶液的质量比为1∶1～1.2。
7.根据权利要求6所述的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制备方法，其特征在于：所述步骤(1.1)中十六烷基三甲基溴化铵与甲苯质量比为1∶15；步骤(1.2)配制成的水溶液浓度为140g/L；步骤(1.4)氨水与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为0.17∶1；步骤(1.5)正硅酸乙酯与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1.25∶1；步骤(1.6)乙醇与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为2.25∶1；步骤(1.7)乙醇与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为22.5∶1；所述步骤(2.1)磁性二氧化硅微球与甲苯的质量比为1∶1050；步骤(2.2)3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷与步骤(2.1)的混合溶液的质量比为1∶25；所述步骤(3.1)表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球与稀盐酸的质量比为1∶150，该稀盐酸的浓度为0.01mol/L；步骤(3.3)NaOH水溶液的体积浓度为40g/L，DEAE与NaOH水溶液的质量比为1∶1.2。
8.一种如权利要求1所述的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球应用于生物样品中分离基因组DNA。
9.根据权利要求8所述的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球应用于生物样品中分离基因组DNA，其特征在于：该生物样品是全血，将表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球应用于全血中分离基因组DNA的方法，包括以下步骤：
(1)红细胞的裂解
(1.1)取冻存血，加入预冷红细胞裂解液，颠倒混匀，在冰浴中孵育10～20分钟，于4℃，1000～1500g离心10～20min，弃上清；
(1.2)加入200～300μl预冷红细胞裂解液，700～800μl灭菌水，涡旋1～5分钟，于4℃，1000～1500g离心15min，弃上清；
(2)白细胞的裂解
向步骤(1.2)得到的产物中加入100～200μl白细胞裂解液，涡旋30～60秒，加入2.5～5μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，于50～60℃裂解25～60min；
(3)核酸的结合
向步骤(2)得到的产物中加入0.8～1.6ml灭菌水和1mg储存于STET溶液的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球，吹吸混匀，孵育3～5分钟；
(4)清洗
向步骤(3)得到的产物中加入0.4～0.8ml清洗液，摇匀，静置1～3分钟，磁性分离，弃上清；
(5)洗脱
向步骤(4)得到的产物中加入100～200μl洗脱液，吹吸均匀，50～65℃孵育5～10分钟，磁性分离，收集上清；
(6)除盐
(6.1)在步骤(5)收集的上清中加入200～600μl无水乙醇，混匀，静置10～20min，于4℃，10000～15000g离心20～30min，弃上清；
(6.2)加入70％乙醇50～100μL，混匀，于4℃，10000～15000g离心5～10min，弃上清；
(6.3)室温风干10～15分钟，加入100～200μL TE溶液溶解，即得到基因组DNA。
10.根据权利要求9所述的表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球应用于生物样品中分离基因组DNA，其特征在于：该生物样品是全血，将表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球应用于全血中分离基因组DNA的方法中
步骤(1.1)冻存血的用量为200μL，预冷红细胞裂解液的用量为200μL，预冷红细胞裂解液的成分为：0.01M Tris-HCl、0.32M蔗糖、0.005M MgCl2和质量浓度为1％的Triton X-100，该预冷红细胞裂解液的pH值为7.5；
步骤(2)白细胞裂解液的成分是：0.03M Tris-HCl、0.8M盐酸胍、0.03M EDTA和质量浓度为0.5％的Triton X-100，该白细胞裂解液的pH值为8.0；
步骤(3)STET溶液的成分是：0.01M Tris-HCl、0.1M NaCl、0.001MEDTA和质量浓度为1％的Triton X-100；
步骤(4)清洗液的成分是：0.01M Tris-HCl、0.4M NaCl和1mMEDTA、该清洗液的pH值为8.0；
步骤(5)洗脱液的成分是：0.05MArg和1.0MNaCl；
步骤(6.3)TE溶液的成分为：0.01M Tris和0.001M EDTA，该溶液的pH为8.0。
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