CN112044415A - 一种金属螯合磁性微珠及其制备方法和应用 - Google Patents
一种金属螯合磁性微珠及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112044415A CN112044415A CN202010928371.1A CN202010928371A CN112044415A CN 112044415 A CN112044415 A CN 112044415A CN 202010928371 A CN202010928371 A CN 202010928371A CN 112044415 A CN112044415 A CN 112044415A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- magnetic beads
- magnetic
- ligand
- protein
- stirring
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 34
- 239000002184 metal Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 239000011325 microbead Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 162
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 71
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000006087 Silane Coupling Agent Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 66
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 59
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 39
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 30
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 30
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 30
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 28
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 claims description 25
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 claims description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 25
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 22
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 22
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 22
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 19
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 18
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 16
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N ferrosoferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 14
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 13
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 12
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 10
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 9
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 claims description 9
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 8
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 8
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 6
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 claims description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 claims description 3
- WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N ethyl formate Chemical compound CCOC=O WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000001132 ultrasonic dispersion Methods 0.000 claims description 3
- 229940044631 ferric chloride hexahydrate Drugs 0.000 claims description 2
- MQLVWQSVRZVNIP-UHFFFAOYSA-L ferrous ammonium sulfate hexahydrate Chemical group [NH4+].[NH4+].O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O MQLVWQSVRZVNIP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 claims description 2
- NQXWGWZJXJUMQB-UHFFFAOYSA-K iron trichloride hexahydrate Chemical group O.O.O.O.O.O.[Cl-].Cl[Fe+]Cl NQXWGWZJXJUMQB-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 2
- HQYALQRYBUJWDH-UHFFFAOYSA-N trimethoxy(propyl)silane Chemical compound CCC[Si](OC)(OC)OC HQYALQRYBUJWDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 abstract 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 23
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 2
- -1 carboxymethyl modified aspartic acid Chemical class 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 description 2
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L nickel sulfate Chemical compound [Ni+2].[O-]S([O-])(=O)=O LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000363 nickel(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 235000019624 protein content Nutrition 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 description 2
- BPSIOYPQMFLKFR-UHFFFAOYSA-N trimethoxy-[3-(oxiran-2-ylmethoxy)propyl]silane Chemical compound CO[Si](OC)(OC)CCCOCC1CO1 BPSIOYPQMFLKFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGWWEXORQXHJJQ-UHFFFAOYSA-N [Fe].[Co].[Ni] Chemical compound [Fe].[Co].[Ni] KGWWEXORQXHJJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 150000003333 secondary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229910001428 transition metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
- B01J20/28009—Magnetic properties
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
- B01J20/06—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
- B01J20/10—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate
- B01J20/103—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate comprising silica
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
- B01J20/223—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material containing metals, e.g. organo-metallic compounds, coordination complexes
- B01J20/226—Coordination polymers, e.g. metal-organic frameworks [MOF], zeolitic imidazolate frameworks [ZIF]
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
- B01J20/28016—Particle form
- B01J20/28021—Hollow particles, e.g. hollow spheres, microspheres or cenospheres
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
本发明提供一种金属螯合磁性微珠及其制备方法和应用，该磁珠采用液液反应，先将硅烷偶联剂与配体天冬氨酸或羧甲基天冬氨酸进行连接，再将连有配基的硅烷偶联剂与二氧化硅层连接，最后螯合金属离子，制成金属螯合磁性微珠。本发明采用这种方式避免了先将二氧化硅层与硅烷偶联剂连接再与配基连接时硅烷偶联剂的脱落，提高了金属螯合磁性微珠的制备效率及修饰配体的数量，同时也使得磁珠拥有更强的组氨酸标签蛋白选择性和分散稳定性以及化学稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，特别涉及一种金属螯合磁性微珠及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白质是最重要的生物大分子之一，在生命系统中是绝大多数功能的执行者。而对目标蛋白质进行纯化和分离是研究蛋白质的基础。因此分离纯化蛋白显得尤为重要。目前分离纯化蛋白质多根据不同蛋白质的分子量、荷电状态、溶解度的不同以及官能团的差异而产生。代表方法有离子交换层析、电泳法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、超滤、凝胶层析、高效液相色谱层析、亲和层析等，此外，亲和层析中的金属螯合层析以其高效率、亲和性强、成本低、稳定性强等特点备受关注。
金属螯合层析具有很强的选择性和负载能力，是一种利用在载体上螯合过渡金属离子如Zn2+、Cu2+、Ni2+等分离纯化蛋白质的方法。金属离子存在空轨道可与目标蛋白质上的多种氨基酸如组氨酸、赖氨酸、色氨酸上的活性基团之间配位结合，从而使目标蛋白被吸附到带有金属离子的载体上，再用洗脱液将蛋白洗脱可得到纯化后的目标蛋白。水凝胶、硅胶、羟基磷灰石以及多孔玻璃是目前最常见的金属螯合层析载体，但其有分离速度较慢、选择性不够高、不能大规模生产等缺点。
与传统金属螯合层析介质相比，磁珠具有超顺磁性，良好的磁响应性和抗矫顽力。超顺磁性是指金属铁钴镍的颗粒小于临界尺寸是，当外场产生的磁取向力不足以抵抗热骚动的干扰时具有的性质。矫顽力是指当当撤去外磁场后磁感应强度并不变为0，只有在原磁化场相反方向加上一定大小的磁场才能使磁感应强度退回到0。而磁性纳米颗粒的抗矫顽力很强，当撤去磁场时，磁感应强度很容易退到0。目前的研究大多数采用由内向外的固相-液相逐步合成方法合成磁珠，这种传统方法在每一步向外合成时都需要较高温度和碱性条件，这种无法改变的反应条件使得在合成后一步时前一步合成上的物质容易脱落。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种金属螯合磁性微珠的制备方法，该制备方法使用液液合成的新方法，先将配体与硅烷偶联剂在液相中连接，再接到硅层上，反应条件相对温和，有效解决了现有金属螯合磁性微珠制备过程中配体容易脱落的问题，从而提高了磁珠制备的效率及修饰配体的数量，同时也使得磁珠拥有更强的选择性和稳定性。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种金属螯合磁性微珠的制备方法，包括以下步骤：
1)采用共沉淀法制得四氧化三铁磁珠后，包裹二氧化硅层，得到二氧化硅磁珠；
2)采用液相-液相合成方法合成配体后，与硅烷偶联剂结合，然后，再将连有配体的硅烷偶联剂连接到所述二氧化硅磁珠上，得到配体修饰的二氧化硅磁珠；
3)将所述配体修饰的二氧化硅磁珠与金属离子螯合，得到金属螯合磁性微珠。
可选地，所述步骤1)中采用共沉淀法制得四氧化三铁磁珠后，包裹二氧化硅层，得到二氧化硅磁珠，包括：
将铁盐和亚铁盐溶于除氧去离子水中，加入浓氨水水浴搅拌0.5h后，升温陈化，洗涤，得到四氧化三铁磁珠；
向所述四氧化三铁磁珠中加入去离子水和乙醇，超声分散后，加入浓氨水和正硅酸乙酯，在30℃下水浴搅拌一段时间，得到二氧化硅磁珠。
可选地，所述铁盐为六水氯化铁；所述亚铁盐为六水硫酸亚铁铵；所述铁盐和所述亚铁盐的物质的量之比为1.8∶1；所述陈化的陈化温度为80-90℃，陈化时间为65-75min；所述30℃水浴搅拌的搅拌时间为12-24h。。
可选地，所述步骤2)中采用液相-液相合成方法合成配体后，与硅烷偶联剂结合，然后，再将连有配体的硅烷偶联剂连接到所述二氧化硅磁珠上，得到配体修饰的二氧化硅磁珠，包括：
去离子水冰浴预冷后，逐滴加入硅烷偶联剂，冰浴搅拌水解，再加入氢氧化钠，磁力搅拌溶解后，加入L-天冬氨酸，调节pH至10-11后，于第一设定温度下水浴搅拌第一设定时间，得到Asp配体；
用浓盐酸调节所述Asp配体的pH至3后，加入所述二氧化硅磁珠，混合并超声分散，于第三设定温度下水浴搅拌第三设定时间后，洗涤，得到Asp磁珠。
可选地，所述步骤2)中采用液相-液相合成方法合成配体后，与硅烷偶联剂结合，然后，再将连有配体的硅烷偶联剂连接到所述二氧化硅磁珠上，得到配体修饰的二氧化硅磁珠，包括：
去离子水冰浴预冷后，逐滴加入硅烷偶联剂，冰浴搅拌水解，再加入氢氧化钠，磁力搅拌溶解后，加入L-天冬氨酸，调节pH至10-11后，于第一设定温度下水浴搅拌第一设定时间，加入溴乙酸和氢氧化钠，调节pH至10-11后，于第二设定温度下水浴搅拌第二设定时间，得到CM-Asp配体；
用浓盐酸调节所述CM-Asp配体的pH至3后，加入所述二氧化硅磁珠，混合并超声分散，于第三设定温度下水浴搅拌第三设定时间后，洗涤，得到CM-Asp磁珠。
可选地，所述冰浴搅拌水解的搅拌时间为1-2h；所述第一设定温度为60-70℃，所述第一设定时间为4-5h；所述第二设定温度为80-90℃，所述第二设定时间为6-7h；所述第三设定温度为90-95℃，所述第三设定时间为2-3h。
可选地，所述步骤2)中所述硅烷偶联剂为γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷。
可选地，所述步骤3)中所述金属离子为Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+中的一种，且所述金属离子与所述配体修饰的二氧化硅磁珠的用量比例为10-4mol∶5mg。
本发明的第二目的在于提供一种上述金属螯合磁性微珠的制备方法制得的金属螯合磁性微珠在纯化分离蛋白B或纯化绿色荧光蛋白中的应用，该应用，包括以下步骤：
将所述金属螯合磁性微珠与含分离蛋白B的蛋白溶液或含绿色荧光蛋白的蛋白溶液混合孵育，磁分离后，保留上清液，含有所述金属螯合磁性微珠的下层固体用咪唑溶液洗涤并洗脱，保留含有分离蛋白B或绿色荧光蛋白的洗涤液和洗脱液。
可选地，所述金属螯合磁性微珠与所述含分离蛋白B的蛋白溶液或所述含绿色荧光蛋白的蛋白溶液的用量比例为5mg∶1ml；所述含分离蛋白B的蛋白溶液或所述含绿色荧光蛋白的蛋白溶液的浓度为1-2mg/ml，pH为6-9；所述咪唑溶液洗涤含有所述金属螯合磁性微珠的下层固体时的浓度为10-15mM；所述咪唑溶液洗脱含有所述金属螯合磁性微珠的下层固体时的浓度为250-260mM；所述金属螯合磁性微珠与含分离蛋白B的蛋白溶液混合孵育的孵育时间为0.5-1h；所述金属螯合磁性微珠与含绿色荧光蛋白的蛋白溶液混合孵育的孵育时间为0.5-3h。
相对于现有技术，本发明所述的金属螯合磁性微珠的制备方法具有以下优势：
1、本发明采用液液合成法，先将硅烷偶联剂与配体进行连接，再将连有配基的硅烷偶联剂与包被有二氧化硅的磁珠连接，硅烷偶联剂与二氧化硅层的连接是最后一步，避免了以往方法中先将二氧化硅层与硅烷偶联剂连接再与配基连接时硅烷偶联剂的脱落，而这种脱落是必然的，因为反应条件使其容易脱落而反应条件是不可改变的；此外，以往方法中按照层层递进的顺序进行实验，耗时长且顺序不可更改，本发明改变了这种反应顺序，因而避免了脱落反应，且提高了磁珠制备的效率及修饰配体的数量，同时也使得磁珠拥有更强的选择性和稳定性。
2、本发明使用天冬氨酸和羧甲基修饰的天冬氨酸作为配体分子，可与金属离子的空轨道配位，具有良好的稳定性和选择性。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例1中螯合金属离子的Asp磁珠和实施例2中螯合金属离子的CM-Asp磁珠的模式图；
图2为本发明实施例1中螯合Ni2+的Asp磁珠和实施例2中螯合Ni2+的CM-Asp磁珠的Zeta电位的折线图；
图3为本发明实施例1中螯合Ni2+的Asp磁珠和实施例2中螯合Ni2+的CM-Asp磁珠的红外光谱图；
图4为本发明实施例3、实施例4中，未螯合Ni2+和螯合Ni2+的Asp磁珠和CM-Asp磁珠用于绿色荧光蛋白分离纯化的选择性研究的SDS-PAGE电泳图；
图5为本发明实施例5、实施例6中，未螯合Ni2+和螯合Ni2+的Asp磁珠和CM-Asp磁珠用于分离蛋白B分离纯化的选择性研究的SDS-PAGE电泳图；
图6为本发明实施例7、实施例8中，螯合Ni2+的Asp磁珠用于分离蛋白B分离纯化的pH影响因素的SDS-PAGE电泳图；
图7为本发明实施例7、实施例8中，螯合Ni2+的CM-Asp磁珠用于分离蛋白B分离纯化的pH影响因素的SDS-PAGE图；
图8为本发明实施例7、实施例8中，螯合Ni2+的Asp磁珠和CM-Asp磁珠用于分离蛋白B分离纯化的pH影响因素的蛋白质含量测定图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
一种金属螯合磁性微珠的制备方法，具体包括以下步骤：
1)将300mL的去离子水煮10min，除去离子水中的溶解氧；将1.90g Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O和2.33g FeCl3·6H2O置于三颈烧瓶中并用50mL上述除氧去离子水溶解，将30ml浓氨水加入三颈烧瓶中水浴搅拌30min后在85℃升温陈化65min，用乙醇和去离子水各洗3遍后，得到四氧化三铁磁珠，所得的四氧化三铁磁珠可用100ml去离子水重悬，即Fe3O4磁性内核悬液，密封保存待用；
2)二氧化硅磁珠的制备：取20ml(约200mg)的上述Fe3O4磁性内核悬液于三颈烧瓶中，将20mL去离子水和160mL乙醇混合溶液加入三颈烧瓶并超声分散15min后，快速加入6mL浓氨水和0.6mL正硅酸乙酯(TEOS)并于30℃水浴条件下搅拌12h，得到二氧化硅磁珠；
3)修饰配体：取100mL去离子水于锥形瓶中冰浴5min预冷，再逐滴滴加1.6mLγ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(7.0mM，KH560)，置于磁力搅拌器上冰浴搅拌1h使其水解；取0.636g氢氧化钠固体(15.92mM)加入锥形瓶，经磁力搅拌溶解后，再加入1.06g L-天冬氨酸(7.96mM)，调节pH至11后，65℃水浴搅拌4h，即得到Asp配体(天冬氨酸配体)；
4)用浓盐酸将Asp配体的pH调至3，再与200mg经SiO2包裹的磁珠，即二氧化硅磁珠，混和超声分散10min，并于95℃水浴搅拌2h后，用乙醇和去离子水各洗3遍，得到Asp磁珠，所得的Asp磁珠可用去离子水重悬于50mL离心管中，密封保存待用；
5)将5mg的Asp磁珠至于5ml离心管中，磁吸附后去掉上清液，加入1mL的0.1mol/L的硫酸镍溶液，并于25℃下采用220r/min的速度振荡30min后磁吸附去上清，用1mL去离子水洗涤三遍去除多余的金属离子(每一次均磁吸附去上清)，所得产物即为金属螯合磁性微珠，其具体为螯合Ni2+的Asp磁珠，模式图如图1所示。
实施例2
一种金属螯合磁性微珠的制备方法，具体包括以下步骤：
1)将300mL的去离子水煮10min，除去离子水中的溶解氧；将1.90g Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O和2.33g FeCl3·6H2O置于三颈烧瓶中并用50mL上述除氧去离子水溶解，将30ml浓氨水加入三颈烧瓶中水浴搅拌30min后在85℃下在85℃下升温陈化65min，用乙醇和去离子水各洗3遍后，得到四氧化三铁磁珠，所得的四氧化三铁磁珠可用100ml去离子水重悬，即Fe3O4磁性内核悬液，密封保存待用；
2)二氧化硅磁珠的制备：取20ml(约200mg)的上述Fe3O4磁性内核悬液于三颈烧瓶中，将20mL去离子水和160mL乙醇混合溶液加入三颈烧瓶并超声分散15min后，快速加入6mL浓氨水和0.6mL正硅酸乙酯(TEOS)并于30℃水浴条件下搅拌12h，得到二氧化硅磁珠；
3)修饰配体：取100mL去离子水于锥形瓶中冰浴5min预冷，再逐滴滴加1.6mLγ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(7.0mM，KH560)，置于磁力搅拌器上冰浴搅拌1h使其水解；取0.636g氢氧化钠固体(15.92mM)加入锥形瓶，经磁力搅拌溶解后，再加入1.06g L-天冬氨酸(7.96mM)，调节pH至11后，65℃水浴搅拌4h，再加入溴乙酸1.106g(7.96mM)和0.318g氢氧化钠固体(7.96mM)，混合溶解于三颈烧瓶中，置于80℃水浴搅拌6h，其中，反应全程调节pH＝10，即得到CM-Asp配体(羧甲基天冬氨酸配体)；
4)用浓盐酸将CM-Asp配体的pH调至3，再与200mg经SiO2包裹的磁珠，即二氧化硅磁珠，混和超声分散10min，并于95℃水浴搅拌2h后，用乙醇和去离子水各洗3遍，得到CM-Asp磁珠，所得的CM-Asp磁珠可用去离子水重悬于50mL离心管中，密封保存待用；
5)将5mg的CM-Asp磁珠至于5ml离心管中，磁吸附后去掉上清液，加入1mL的0.1mol/L的硫酸镍溶液，并于25℃下采用220r/min的速度振荡30min后磁吸附去上清，用1mL去离子水洗涤三遍去除多余的金属离子(每一次均磁吸附去上清)，所得产物即为金属螯合磁性微珠，其具体为螯合Ni2+的CM-Asp磁珠，模式图如图1所示。
实施例3
将实施例1步骤4)中未螯合Ni2+的Asp磁珠和步骤5)中螯合Ni2+的Asp磁珠用于绿色荧光蛋白分离纯化的选择性实验，其中，未螯合Ni2+的Asp磁珠为对照组，螯合Ni2+的Asp磁珠为实验组，具体步骤如下：
1)将5mg未螯合Ni2+的Asp磁珠、5mg螯合Ni2+的Asp磁珠分别加入至1mL含绿色荧光蛋白的悬液中，其中，含绿色荧光蛋白的悬液的浓度为1.5mg/ml，PH为7.4，共同孵育1h，使上述磁珠充分与绿色荧光蛋白结合，磁吸附后，取上清液并命名为吸附上清，保留含有上述磁珠的下层固体；
2)紧接着用1mL含500mmol NaCl，10mmol咪唑的蛋白质洗涤液与步骤1)下层固体中的磁珠共孵育3min，磁吸附后收集上清500uL，保留含有上述磁珠的下层固体，重复三次以上操作，合并三次上清液并命名为洗涤液；
3)最后用200uL含500mmolNaCl，250mmol咪唑的蛋白质洗脱液与步骤2)下层固体中的磁珠共孵育10min，磁吸附后收集上清150uL，保留含有上述磁珠的下层固体，重复三次以上操作，合并三次上清液并命名为洗脱液。
实施例4
将实施例2步骤4)中未螯合Ni2+的CM-Asp磁珠和步骤5)中螯合Ni2+的CM-Asp磁珠用于绿色荧光蛋白分离纯化的选择性实验，具体步骤与实施例3相同。
实施例5
将实施例1步骤4)中未螯合Ni2+的Asp磁珠和步骤5)中螯合Ni2+的Asp磁珠用于分离蛋白B分离纯化的选择性实验，具体步骤与实施例3相同，其中，分离蛋白B的蛋白溶液的浓度为1.5mg/ml，PH为7.4。
实施例6
将实施例2步骤4)中未螯合Ni2+的CM-Asp磁珠和步骤5)中螯合Ni2+的CM-Asp磁珠用于分离蛋白B分离纯化的选择性实验，具体步骤与实施例3相同，其中，分离蛋白B的蛋白溶液的浓度为1.5mg/ml，PH为7.4。
实施例7
选择实施例1所得产物，即螯合Ni2+的Asp磁珠用于分离蛋白B分离纯化的pH影响因素实验，具体步骤如下：
(1)制备pH梯度蛋白质悬液
碱液配置：称取5mmol咪唑、50mmol磷酸氢二钠、500mmol NaCl于锥形瓶中溶解后转移至1000mL容量瓶中，用去离子水定容；
酸液配置：称取5mmol咪唑、50mmol磷酸二氢钠、500mmol NaCl于锥形瓶中溶解后转移至1000mL容量瓶中，用去离子水定容；
以一定比例混合上述酸液碱液，用pH计调整PBS缓冲液的pH，设立4个pH梯度：6.0、7.0、8.0、9.0，得到四个pH的蛋白质悬液；
(2)pH梯度蛋白质的分离纯化
将4个pH梯度蛋白质悬液分别与实施例1中螯合Ni2+的Asp磁珠共同孵育1h，磁吸附取上清液命名为吸附上清，保留含有上述磁珠的下层固体；
用1mL洗涤液洗涤含有上述磁珠的下层固体3次，每次取上清液500uL，将三次上清液混合后保留待用并命名为洗涤液，保留含有上述磁珠的下层固体；
用0.2ml洗脱液洗脱含有上述磁珠的下层固体5次，每次取上清液150uL，将五次上清液混合后保留并命名为洗脱液。
实施例8
选择实施例2所得产物，即螯合Ni2+的CM-Asp磁珠用于分离蛋白B分离纯化的pH影响因素实验，具体步骤与实施例7基本相同。
对本发明实施例1提供的螯合Ni2+的Asp磁珠和实施例2提供的螯合Ni2+的CM-Asp磁珠进行Zeta电位测试，具体测试方法如下：
首先取约0.5mg上述磁珠加入50mL水中混匀，再加入KCl使其终浓度为0.001mol/L作为电解质；用0.1mol/L的HCl和NaOH溶液调节样品的pH，设置一个3.0、5.0、7.0、9.0、11.0的pH梯度，超声分散15min，使用alvern Zeta sizer Nano ZS90粒度仪，测试结果如图2所示。
由图2可以看出，Asp磁珠在pH为5-7之间发生了突变，由正变为负，Asp磁珠的等电点位于pH＝6左右，且随着pH向酸碱两边变化均迅速呈现非常稳定的状态；CM-Asp磁珠的等电点大约在pH为3-3.5之间，且随着pH向碱性环境移动而逐渐趋于稳定。这可能是因为CM-Asp比Asp多修饰的羧甲基使磁珠表面的质子更多导致其等电点向酸性偏移。总之，两种磁珠在pH为7-11时均具有良好的稳定性，同时也强有力地证明了两种配体均被很好地修饰到了磁珠表面。
对本发明实施例1提供的螯合Ni2+的Asp磁珠和和实施例2提供的螯合Ni2+的CM-Asp磁珠进行红外光谱测试，具体测试方法如下：
取2mg左右的上述磁珠加入200mg的干燥KBr粉末并于研钵中研磨，用压片器压成厚薄均匀的薄片直接放入红外光谱仪中测定，测试结果如图3所示。
由图3可知，两种磁珠的红外光谱非常相似，在3428.332处有一个较宽的峰为羧基，在1091.03处有明显的锐锋表示两种磁珠表面均有仲醇，在1631.483处的小峰证明了两种磁珠表面均有N-H键，证明CM-Asp磁珠中仍然有部分Asp磁珠未被羧甲基化。总体来看，Asp磁珠在各处的峰都比CM-Asp磁珠的峰更大，证明在羧甲基化这一步骤中，存在少量配体掉落的现象。
为证明实施例3中未螯合Ni2+的Asp磁珠、螯合Ni2+的Asp磁珠和实施例4中未螯合Ni2+的CM-Asp磁珠、螯合Ni2+的CM-Asp磁珠用于绿色荧光蛋白分离纯化的选择性，将蛋白质原液以及各实施例中上述两种磁珠的吸附上清、洗涤液、洗脱液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，测试结果如图4所示。
由图4可知，Asp和CM-Asp两种磁珠的规律几乎一致，且可观察到在上清液中，螯合有Ni2+的绿色荧光蛋白条带明显淡于未螯合金属离子的条带；螯合有Ni2+的洗涤液中几乎没有绿色荧光蛋白，而洗脱液中绿色荧光蛋白条带明显，未螯合Ni2+的洗脱液中没有任何明显的条带，说明螯合金属使磁性纳米颗粒拥有了选择性提取标签蛋白的能力，并能通过用高浓度咪唑溶液将螯合蛋白洗脱下来，达到从蛋白悬液中分离纯化目标标签蛋白的目的。
为证明实施例5中未螯合Ni2+的Asp磁珠、螯合Ni2+的Asp磁珠和实施例6中未螯合Ni2+的CM-Asp磁珠、螯合Ni2+的CM-Asp磁珠用于分离蛋白B分离纯化的选择性，将蛋白质原液以及两种磁珠的吸附上清、洗涤液、洗脱液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，测试结果如图5所示。
由图5可知，原液在Marker第四条下方有一条很浓的条带即为分离蛋白B，且可观察到上清液中，无论是Asp磁珠还是CM-Asp磁珠，对照组的分离蛋白B条带与原液相比变化极小，而实验组变得极细，证明在螯合过程中大多数分离蛋白B被金属离子固定在了磁珠上；在洗涤液中，两种磁珠对照组和实验组均有很浅的条带，原因是低浓度的咪唑与蛋白质竞争性结合在了金属离子上，使固定不稳定的杂蛋白和少量目标蛋白被洗涤下来；在洗脱液中，两种磁珠的对照组中只有少量非特异性结合的杂蛋白条带，而实验组中有非常明显的目标蛋白条带，杂蛋白条带相比于原液来说只剩下极少一部分。由此说明磁珠对分离蛋白B的确有良好的选择性，且具有分离纯化标签蛋白的能力。
为证明实施例7中螯合Ni2+的Asp磁珠和实施例8中螯合Ni2+的CM-Asp磁珠用于分离蛋白B分离纯化的pH的影响研究，用考马斯亮蓝测量上述吸附上清、洗涤液、洗脱液以及原液的蛋白质含量；用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法验证吸附上清、洗涤液、洗脱液以及原液中目标蛋白和杂蛋白的相对大小，测试结果如图6、图7、图8所示。
从图6、图7可以看出，两种磁珠的吸附上清分离蛋白B条带在所有pH条件下相对于原液来说均变淡变窄，洗涤液条带均不明显，洗脱液条带与预期一致出现了明显的分离蛋白B条带，且杂蛋白条带不明显。通过对比发现，洗脱液分离蛋白B条带随着在pH 6.0-9.0范围内随着pH增高而变窄，说明在各种pH条件下磁珠均有分离纯化的能力，且两种磁珠洗脱量在一定范围内均随着pH升高而降低。
从图8可以看出，先单独观察吸附量，Asp的吸附量在8.0时最高，而CM-Asp在7.0时达到最高，这有可能是因为CM-Asp多了一个酸性的羧甲基，使得其相较于Asp磁珠的吸附量峰值向酸性偏移。总体来说在pH 6.0-9.0范围内，CM-Asp的吸附量较高。再单独观察洗脱量，Asp磁珠在pH6.0和7.0时差距不大，当pH继续升高后下降明显；CM-Asp磁珠在6.0-9.0pH范围内随着pH升高洗脱量明显下降。Asp峰值为7.0，而CM-Asp峰值为6.0，CM-Asp的洗脱量峰值同吸附量一样也向酸性偏移。总体来说在pH6.0-9.0范围内，Asp的洗脱量较高。对比吸附量和洗脱量，可发现Asp磁珠相较于CM-Asp磁珠吸附量更低而洗脱量更高，吸附量和洗脱量之间的差值更小。这一现象反映出Asp磁珠可能具有更好的选择性并且与标签蛋白的结合更加稳定，而CM-Asp磁珠能吸附更多的蛋白质，非选择性吸附更多也更容易洗脱。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种金属螯合磁性微珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用共沉淀法制得四氧化三铁磁珠后，包裹二氧化硅层，得到二氧化硅磁珠；
2)采用液相-液相合成方法合成配体后，与硅烷偶联剂结合，然后，再将连有配体的硅烷偶联剂连接到所述二氧化硅磁珠上，得到配体修饰的二氧化硅磁珠；
3)将所述配体修饰的二氧化硅磁珠与金属离子螯合，得到金属螯合磁性微珠。
2.根据权利要求1所述的金属螯合磁性微珠的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中采用共沉淀法制得四氧化三铁磁珠后，包裹二氧化硅层，得到二氧化硅磁珠，包括：
将铁盐和亚铁盐溶于除氧去离子水中，加入浓氨水水浴搅拌0.5h后，升温陈化，洗涤，得到四氧化三铁磁珠；
向所述四氧化三铁磁珠中加入去离子水和乙醇，超声分散后，加入浓氨水和正硅酸乙酯，在30℃下水浴搅拌一段时间，得到二氧化硅磁珠。
3.根据权利要求2所述的金属螯合磁性微珠的制备方法，其特征在于，所述铁盐为六水氯化铁；所述亚铁盐为六水硫酸亚铁铵；所述铁盐和所述亚铁盐的物质的量之比为1.8∶1；所述陈化的陈化温度为80-90℃，陈化时间为55-65min；所述30℃水浴搅拌的搅拌时间为12-24h。。
4.根据权利要求1所述的金属螯合磁性微珠的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中采用液相-液相合成方法合成配体后，与硅烷偶联剂结合，然后，再将连有配体的硅烷偶联剂连接到所述二氧化硅磁珠上，得到配体修饰的二氧化硅磁珠，包括：
去离子水冰浴预冷后，逐滴加入硅烷偶联剂，冰浴搅拌水解，再加入氢氧化钠，磁力搅拌溶解后，加入L-天冬氨酸，调节pH至10-11后，于第一设定温度下水浴搅拌第一设定时间，得到Asp配体；
用浓盐酸调节所述Asp配体的pH至3后，加入所述二氧化硅磁珠，混合并超声分散，于第三设定温度下水浴搅拌第三设定时间后，洗涤，得到Asp磁珠。
5.根据权利要求1所述的金属螯合磁性微珠的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中采用液相-液相合成方法合成配体后，与硅烷偶联剂结合，然后，再将连有配体的硅烷偶联剂连接到所述二氧化硅磁珠上，得到配体修饰的二氧化硅磁珠，包括：
去离子水冰浴预冷后，逐滴加入硅烷偶联剂，冰浴搅拌水解，再加入氢氧化钠，磁力搅拌溶解后，加入L-天冬氨酸，调节pH至10-11后，于第一设定温度下水浴搅拌第一设定时间，加入溴乙酸和氢氧化钠，调节pH至10-11后，于第二设定温度下水浴搅拌第二设定时间，得到CM-Asp配体；
用浓盐酸调节所述CM-Asp配体的pH至3后，加入所述二氧化硅磁珠，混合并超声分散，于第三设定温度下水浴搅拌第三设定时间后，洗涤，得到CM-Asp磁珠。
6.根据权利要求4或5所述的金属螯合磁性微珠的制备方法，其特征在于，所述冰浴搅拌水解的搅拌时间为1-2h；所述第一设定温度为60-70℃，所述第一设定时间为4-5h；所述第二设定温度为80-90℃，所述第二设定时间为6-7h；所述第三设定温度为90-95℃，所述第三设定时间为2-3h。
7.根据权利要求1所述的金属螯合磁性微珠的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中所述硅烷偶联剂为γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷。
8.根据权利要求1所述的金属螯合磁性微珠的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中所述金属离子为Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+中的一种，且所述金属离子与所述配体修饰的二氧化硅磁珠的用量比例为10-4mol∶5mg。
9.权利要求1至8任一项所述的金属螯合磁性微珠的制备方法制得的金属螯合磁性微珠在纯化分离蛋白B或纯化绿色荧光蛋白中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
将所述金属螯合磁性微珠与含分离蛋白B的蛋白溶液或含绿色荧光蛋白的蛋白溶液混合孵育，磁分离后，保留上清液，含有所述金属螯合磁性微珠的下层固体用咪唑溶液洗涤并洗脱，保留含有分离蛋白B或绿色荧光蛋白的洗涤液和洗脱液。
10.根据权利要求9所述的金属螯合磁性微珠在纯化分离蛋白B或纯化绿色荧光蛋白中的应用，其特征在于，所述金属螯合磁性微珠与所述含分离蛋白B的蛋白溶液或所述含绿色荧光蛋白的蛋白溶液的用量比例为5mg∶1ml；所述含分离蛋白B的蛋白溶液或所述含绿色荧光蛋白的蛋白溶液的浓度为1-2mg/ml，pH为6-9；所述咪唑溶液洗涤含有所述金属螯合磁性微珠的下层固体时的浓度为10-15mM；所述咪唑溶液洗脱含有所述金属螯合磁性微珠的下层固体时的浓度为250-260mM；所述金属螯合磁性微珠与含分离蛋白B的蛋白溶液混合孵育的孵育时间为0.5-1h；所述金属螯合磁性微珠与含绿色荧光蛋白的蛋白溶液混合孵育的孵育时间为0.5-3h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010928371.1A CN112044415A (zh) | 2020-09-07 | 2020-09-07 | 一种金属螯合磁性微珠及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010928371.1A CN112044415A (zh) | 2020-09-07 | 2020-09-07 | 一种金属螯合磁性微珠及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112044415A true CN112044415A (zh) | 2020-12-08 |
Family
ID=73607074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010928371.1A Pending CN112044415A (zh) | 2020-09-07 | 2020-09-07 | 一种金属螯合磁性微珠及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112044415A (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5250188A (en) * | 1989-09-01 | 1993-10-05 | Brigham Young University | Process of removing and concentrating desired molecules from solutions |
| CN101323454A (zh) * | 2008-07-28 | 2008-12-17 | 陕西师范大学 | 表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球制备方法及其用途 |
| CN105628672A (zh) * | 2015-12-17 | 2016-06-01 | 东南大学 | 一种通过sers信号快速检测外泌体的方法 |
| CN109569546A (zh) * | 2018-07-05 | 2019-04-05 | 华侨大学 | 一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法及应用 |
| CN109603775A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-04-12 | 武汉理工大学 | 一种载金属离子聚丙烯酰胺磁珠及其制备方法和应用 |
| CN110215900A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-09-10 | 武汉理工大学 | 一种金属螯合磁性微珠及其制备方法 |
| CN110215901A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-09-10 | 武汉理工大学 | 一种提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠及其制备方法 |
| CN111040030A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-21 | 武汉理工大学 | 一种分离、纯化和固定化组氨酸标签蛋白及牛血红蛋白的新型磁珠的制备方法和应用 |
-
2020
- 2020-09-07 CN CN202010928371.1A patent/CN112044415A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5250188A (en) * | 1989-09-01 | 1993-10-05 | Brigham Young University | Process of removing and concentrating desired molecules from solutions |
| CN101323454A (zh) * | 2008-07-28 | 2008-12-17 | 陕西师范大学 | 表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球制备方法及其用途 |
| CN105628672A (zh) * | 2015-12-17 | 2016-06-01 | 东南大学 | 一种通过sers信号快速检测外泌体的方法 |
| CN109569546A (zh) * | 2018-07-05 | 2019-04-05 | 华侨大学 | 一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法及应用 |
| CN109603775A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-04-12 | 武汉理工大学 | 一种载金属离子聚丙烯酰胺磁珠及其制备方法和应用 |
| CN110215900A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-09-10 | 武汉理工大学 | 一种金属螯合磁性微珠及其制备方法 |
| CN110215901A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-09-10 | 武汉理工大学 | 一种提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠及其制备方法 |
| CN111040030A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-21 | 武汉理工大学 | 一种分离、纯化和固定化组氨酸标签蛋白及牛血红蛋白的新型磁珠的制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RONG LI ET AL.,: "Chromatographic Behavior of Proteins on Stationary Phase with Aminocarboxy Ligand", BULL. KOREAN CHEM. SOC, vol. 32, no. 2 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ma et al. | Superparamagnetic silica nanoparticles with immobilized metal affinity ligands for protein adsorption | |
| Xiao et al. | Development of novel molecularly imprinted magnetic solid-phase extraction materials based on magnetic carbon nanotubes and their application for the determination of gatifloxacin in serum samples coupled with high performance liquid chromatography | |
| Salimi et al. | Highly selective magnetic affinity purification of histidine-tagged proteins by Ni 2+ carrying monodisperse composite microspheres | |
| CN106552603B (zh) | pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料及其制备方法与应用 | |
| CN110215900B (zh) | 一种金属螯合磁性微珠及其制备方法 | |
| Wei et al. | Ionic liquid modified magnetic microspheres for isolation of heme protein with high binding capacity | |
| Xiong et al. | Ti 4+-immobilized multilayer polysaccharide coated magnetic nanoparticles for highly selective enrichment of phosphopeptides | |
| Zhang et al. | Boronic acid functionalized magnetic nanoparticles via thiol–ene click chemistry for selective enrichment of glycoproteins | |
| Wang et al. | Selective separation of bovine hemoglobin using magnetic mesoporous rare-earth silicate microspheres | |
| Zhao et al. | An epitope imprinting method on the surface of magnetic nanoparticles for specific recognition of bovine serum album | |
| CN108371942A (zh) | 一种复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+及其制备和应用 | |
| CN109758989B (zh) | 一种用于纯化组氨酸标记蛋白质的纳米磁珠的制备方法 | |
| Rashid et al. | Nickel-Salen supported paramagnetic nanoparticles for 6-His-target recombinant protein affinity purification | |
| CN102558463A (zh) | 一锅合成苯硼酸聚合磁性纳米复合材料及制备方法和应用 | |
| CN110215901B (zh) | 一种提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠及其制备方法 | |
| CN105837766B (zh) | 一种复合磁性纳米粒子Fe3O4/MPS/PAA/NTA-Ni2+及其制备方法和其在分离纯化组氨酸标签蛋白质中的应用 | |
| Wang et al. | Preparation of magnetic microspheres functionalized by lanthanide oxides for selective isolation of bovine hemoglobin | |
| Chang et al. | Carboxymethylated polyethylenimine modified magnetic nanoparticles specifically for purification of His‐tagged protein | |
| JP2020509076A (ja) | 高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインａ磁性ビーズ及びその使用方法 | |
| CN103980365A (zh) | 一种表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子、其制备方法及用途 | |
| CN114011376B (zh) | 一种金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料及制备方法与应用 | |
| KR20060061494A (ko) | 핵산(ｄｎａ/ｒｎａ) 분리정제용 기능성 실리카자성나노입자 및 그 제조방법 | |
| Zhang et al. | Facile synthesis of hyperbranched magnetic nanomaterials for selective adsorption of proteins | |
| CN112044415A (zh) | 一种金属螯合磁性微珠及其制备方法和应用 | |
| CN111171071B (zh) | 一种n,o型多齿功能单体及其制备方法和在离子印迹材料中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201208 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |