CN105647910A - 基于双磁珠法免离心提取质粒dna的试剂盒及使用方法 - Google Patents

Abstract

本案涉及基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，包括有分别独立分装的除杂磁珠悬浮液、提取磁珠悬浮液、细菌裂解液、结合缓冲液、清洗液和洗脱液；其中，所述除杂磁珠悬浮液中分散有除杂磁珠，所述除杂磁珠表面至少修饰有苯乙烯、二乙烯基苯和亚氨基二乙酸；所述提取磁珠悬浮液中分散有提取磁珠，所述提取磁珠表面修饰有硅羟基。本案通过开发一种除杂磁珠在菌体裂解之后，将细胞壁、蛋白等杂质去除而保留上清液中的质粒DNA，从而替代了传统过程中的离心步骤，更为高效快捷；该试剂盒使用时可以预先将缓冲液、磁珠悬浮液等分装于相应的核酸提取仪器中的孔板中，满足自动化、高通量的需求；提取的质粒DNA纯度高、片段完整。

Description

基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒及使用方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒及其使用方法。

背景技术

DNA是基本的遗传物质，在蛋白质合成和一系列重大生命的生长和变异过程中起着决定性作用。以DNA为研究对象的生物技术，包括对DNA的提取、克隆、扩增、测序等一系列技术，近年得到飞速发展。在基因工程各项研究中,质粒DNA起着重要作用，为影响下游DNA研究能否成功的重要因素之一，因此对细菌质粒DNA进行提纯非常重要。

大多数质粒DNA提取方法一般都包括细胞裂解、去除与核酸结合的物质、沉淀核酸、去除盐类、有机溶剂等杂质、纯化分离质粒DNA等步骤。传统方法主要是CTAB法和离心柱法。由于传统方法步骤繁琐、耗时，并且用到氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂，污染较大，易导致核酸降解；离心柱法虽不使用有机溶剂，却还是不能免除离心过滤等繁琐的操作步骤，不易实现自动化，难以进行高通量提取。采用磁珠为载体的分离技术，无需接触有毒试剂且操作简便，容易实现自动化，短时间就能实现样本DNA的快速、高质量的提取，是未来高通量核酸提取的重要发展方向，具有传统DNA提取方法无法比拟的优势。但是传统的磁珠法依然需要离心步骤，不适合高通量化自动化提取细菌质粒DNA的发展方向。

综述所述，现有磁珠法提取细菌质粒DNA的技术不能满足无需离心、高通量化、自动化的技术问题，所以需要开发一种更为快捷、简便、全程无离心步骤可适用于高通量、自动化的磁珠法提取细菌质粒DNA的提取方法。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供了一种基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒及使用方法。提取的质粒DNA纯度高、片段完整，提取过程方便快捷，适合高通量、自动化提取。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其包括有分别独立分装的除杂磁珠悬浮液、提取磁珠悬浮液、细菌裂解液、结合缓冲液、清洗液和洗脱液；

其中，所述除杂磁珠悬浮液中分散有除杂磁珠，所述除杂磁珠表面至少修饰有苯乙烯、二乙烯基苯和亚氨基二乙酸；

所述提取磁珠悬浮液中分散有提取磁珠，所述提取磁珠表面修饰有硅羟基。

优选的是，所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其中，所述除杂磁珠悬浮液包括有3-6mg/mL的除杂磁珠和第一分散液，所述第一分散液包括有1-3M的无机酸、2-4M的金属盐、0.02-0.05M的Tris-HCl缓冲液和0.1-0.2mg/mL的RNA酶；所述无机酸选自硫酸、盐酸、硝酸或其组合；所述金属盐选自碳酸钾、醋酸钾、碳酸钠、醋酸钠或其组合。

优选的是，所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其中，所述提取磁珠悬浮液包括有40-60mg/mL的提取磁珠和第二分散液，所述第二分散液包括有0.1-0.5M的氯化钠；且所述第二分散液的pH为5.0-7.4。

优选的是，所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其中，所述细菌裂解液包括0.2-1.5M的氢氧化钾、0.15-0.5wt％的十二烷基硫酸钠和0.01-0.025M的乙二胺四乙酸。

优选的是，所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其中，所述结合缓冲液包括0.01-0.03M的尿素、0.08-0.15M的醋酸钠、0.2-1wt％的β-巯基乙醇、4-6.5M的第一变性剂，所述第一变性剂选自盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钾、碘化钠或其组合。

优选的是，所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其中，所述清洗液包括38-72wt％的异丙醇，0.8-1.6M的第二变性剂，所述第二变性剂选自盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钾或其组合。

优选的是，所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其中，所述洗脱液包括0.005-0.02M的Tris-HCl缓冲液和0.001-0.005M的乙二胺四乙酸。

优选的是，所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其中，所述除杂磁珠的制备方法如下：

S1：将1-5份的包裹SiO₂的四氧化三铁纳米磁球加入到含800份乙醇和200份水的混合体系中，加入0.1-1份三乙胺，在惰性气体保护下，升温至40-80℃，随后加入0.5-5份硅烷偶联剂KH570(KH570的中文名：γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷)，搅拌反应4-6小时，经清洗干燥后，得到修饰有KH570的磁珠；

S2：取1-5份修饰有KH570的磁珠加入到1000份DMSO溶液中，加入0.5-1份的苯乙烯、0.2-1份的二乙烯基苯、1-2份的丙烯醇和0.05份的偶氮二异丁腈，升温至60-85℃，惰性气体保护下，搅拌反应4-6小时，加入0.5-1.5份的甲基丙烯酸缩水甘油酯，继续搅拌反应12-16小时，经洗涤干燥后，得到改性磁珠。

S3：取1-5份所述改性磁珠分散到1000份的含有0.2M的碳酸钠水溶液中，加入1-3份的亚氨基二乙酸，反应2-4小时，经洗涤干燥后，即得到除杂磁珠。

优选的是，所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其中，所述提取磁珠的粒径为100-2000nm。

除杂磁珠通过在包裹SiO₂的四氧化三铁纳米磁球外修饰双键，然后加入苯乙烯、二乙烯基苯、丙烯醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚而成，然后通过接枝亚氨基二乙酸从而制备而成。苯乙烯、二乙烯基苯的修饰可以保证磁珠不会吸附核酸，而亚氨基二乙酸可以选择性螯合二价离子，比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力，能结合许多可能影响进一步分析的其他外源物质，除杂磁珠可以将蛋白、脂类、糖类、裂解后的细胞壁等杂质吸附并除去而不会影响核酸的提取，从而避免离心过程。

一种如上述任一项所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒的使用方法，其包括：

步骤1)菌液准备：取细菌培养液1.0-2.0份，转移到孔板中，并记录；

步骤2)菌体裂解：向孔板中加入0.1-0.2份的细菌裂解液，混匀；

步骤3)质粒复性：向孔板中加入0.2-0.4份的除杂磁珠悬浮液，混匀；

步骤4)去除菌体基因组和蛋白：磁性分离弃去除杂磁珠及其吸附物，保留孔板中澄清透明的菌液；

步骤5)质粒DNA结合：向菌液中加入0.5-1.5份的结合缓冲液以及0.03-0.08份的提取磁珠悬浮液，混匀，磁性分离，去除上层清液；

步骤6)清洗：向孔板中加入0.4-0.8份清洗液，混匀，磁性分离，去除上层清液；

步骤7)除醇和洗脱：将上述含有提取磁珠的孔板放入40℃的真空干燥箱干燥5-10min，随后加入0.04-0.1份的洗脱液，混匀，磁性分离去除磁珠，在孔板的洗脱液中即含有目标质粒DNA。

本发明的有益效果是：

1、本发明通过开发一种除杂磁珠在菌体裂解之后，将细胞壁、蛋白等杂质去除而保留上清液中的质粒DNA，从而替代了传统过程中的离心步骤，更为高效快捷。

2、本发明开发的质粒DNA提取试剂盒提取方法可以预先将缓冲液、磁珠悬浮液等分装于相应的核酸提取仪器中的孔板中，满足自动化、高通量的需求。

3、本发明通过除杂磁珠先一步除杂，提取磁珠进一步结合富集，提取的质粒DNA纯度高、片段完整。

附图说明

图1是本发明的试剂盒提取质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中1-4分别是实施例2-5提取的质粒DNA条带，a-h是每个实施例平行试验所提取的质粒DNA条带。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1：除杂磁珠的制备步骤如下：

S1：1-5g的包裹SiO₂的四氧化三铁纳米磁球加入到800mL乙醇和200mL水的混合体系中，加入0.1-1g三乙胺，氮气保护下，升温至40～80℃加入0.5-5gKH570，机械搅拌反应6小时，用去离子水和乙醇清洗三次后干燥，得到修饰KH570的磁珠；

S2：1-5g修饰KH570的磁珠，加入到1000mLDMSO溶液中，加入0.5-1g的聚乙烯，0.2-1g的二乙烯基苯，1-2g的丙烯醇，加入50mg的偶氮二异丁腈，升温至60-85℃，氮气保护下反应4-6小时，加入0.5-1.5g的甲基丙烯酸缩水甘油酯，机械搅拌继续反应12-16小时，用去离子水和乙醇清洗三次后干燥，得到改性磁珠。

S3：1-5g的上述改性磁珠分散到1000mL的含有0.2M的碳酸钠水溶液中，机械搅拌，加入1-3g亚氨基二乙酸，反应2-4小时，用去离子水和乙醇清洗三次后干燥，得到除杂磁珠。

实施例2：一种免离心、双磁珠法质粒DNA提取试剂盒提取方法，其包括除杂磁珠悬浮液、提取磁珠悬浮液、细菌裂解液、结合缓冲液、清洗液和洗脱液六种组分，各组分的内容如下：

除杂磁珠悬浮液：所述的除杂磁珠悬浮液包括4mg/mL除杂磁珠和第一分散液，其中第一分散液组分如下：1.5M盐酸，3M碳酸钾，0.03MTris-HCl缓冲液，0.15mg/mLRNA酶；本案默认所用溶剂为去离子水。

除杂磁珠通过实施例1的方法制备而成；

提取磁珠悬浮液：提取磁珠悬浮液包括50mg/mL硅羟基磁珠和第二分散液，第二分散液组分如下：0.2M氯化钠，pH值设为5.0；

细菌裂解液：0.8M的氢氧化钾，0.18％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)；

结合缓冲液：0.03M尿素，0.12M醋酸钠，0.4％的β-巯基乙醇，5.5M的盐酸胍；

清洗液：55％异丙醇，1.2M异硫氰酸胍；

洗脱液：0.005MTris-HCl缓冲液，0.002MEDTA；

试剂盒的使用方法其包括如下步骤：

步骤1)菌液准备：取常规法培养过夜的细菌培养液1.5mL，转移到48孔板中，并做好记录；

步骤2)菌体裂解：向上述加入菌液的孔板中加入0.16mL细菌裂解液，将上述孔板在500rpm下涡旋混合2min；

步骤3)质粒复性：向上述孔板中的菌液中加入0.2mL的除杂磁珠悬浮液，盖严孔板硅胶片，上下轻柔翻转3～5次，使除杂磁珠悬浮液均匀分散于菌液中，将孔板于500rpm下涡旋2min；

步骤4)去除菌体基因组和蛋白：漩涡结束后，磁性分离弃去黑色沉淀，保留澄清透明菌液。

步骤5)质粒DNA结合：将菌液中加入1mL结合缓冲液以及0.05mL的提取磁珠悬浮液，严盖硅胶片，然后将孔板于1000rpm下漩涡混合4min，用磁板架至于孔板底部，磁性分离，去除上清液。

步骤6)清洗：每个孔位中加入0.6mL清洗缓冲液，将孔板于1000rpm下漩涡40s，磁性分离，去除上层清液。在每个孔位中加入0.6mL80％乙醇水溶液，将孔板于9000rpm下漩涡40s，磁性分离，去除上层清液，用80％乙醇水溶液重复清洗一次。

步骤7)除醇和洗脱：将上述含有磁珠的孔板放入40℃的真空干燥箱干燥8min，除去乙醇，在每个孔位中加入0.08mL的洗脱液，1000rpm下漩涡1min，磁性分离去除磁珠，孔板洗脱液中即含有目标质粒DNA，将此含有质粒DNA的洗脱液转移至PCR板中，-20℃下保存备用。

实施例3：一种免离心、双磁珠法质粒DNA提取试剂盒提取方法，其包括除杂磁珠悬浮液、提取磁珠悬浮液、细菌裂解液、结合缓冲液、清洗液和洗脱液六种组分，各组分的内容如下：

除杂磁珠悬浮液：除杂磁珠悬浮液包括5mg/mL除杂磁珠和第一分散液，第一分散液组分如下：1.5M硝酸，2M醋酸钠，0.025MTris-HCl缓冲液，0.1mg/mLRNA酶；

除杂磁珠通过实施例1的方法制备而成；

提取磁珠悬浮液：提取磁珠悬浮液包括40mg/mL硅羟基磁珠和第二分散液，第二分散液组分如下：0.3M氯化钠，pH＝6；

细菌裂解液：1M的氢氧化钾，0.25％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.015M乙二胺四乙酸(EDTA)；

结合缓冲液：0.01M尿素，0.08M醋酸钠，0.3％的β-巯基乙醇，6M的碘化钾；

清洗液：60％异丙醇，1M盐酸胍；

洗脱液：0.01MTris-HCl缓冲液，0.001MEDTA；

试剂盒的使用方法其包括如下步骤：

步骤1)菌液准备：取常规法培养过夜的细菌培养液1.5mL，转移到48孔板中，并做好记录；

步骤2)菌体裂解：向上述加入菌液的孔板中加入0.16mL细菌裂解液，将上述孔板在500rpm下涡旋混合3min；

步骤3)质粒复性：向上述孔板中的菌液中加入0.24mL的除杂磁珠悬浮液，盖严孔板硅胶片，上下轻柔翻转3～5次，使除杂磁珠悬浮液均匀分散于菌液中，将孔板于500rpm下涡旋2min；

步骤4)去除菌体基因组和蛋白：漩涡结束后，磁性分离弃去黑色沉淀，保留澄清透明菌液。

步骤5)质粒DNA结合：将菌液中加入1.2mL结合缓冲液以及0.06mL的提取磁珠悬浮液，严盖硅胶片，然后将孔板于1200rpm下漩涡混合5min，用磁板架至于孔板底部，磁性分离，去除上清液。

步骤6)清洗：每个孔位中加入0.7mL清洗缓冲液，将孔板于9000rpm下漩涡50s，磁性分离，去除上清液。在每个孔位中加入0.8mL75％乙醇水溶液，将孔板于1000rpm下漩涡45s，磁性分离，去除上清液，用75％乙醇水溶液重复清洗一次。

步骤7)除醇和洗脱：将上述含有磁珠的孔板放入40℃的真空干燥箱干燥7min，除去乙醇，在每个孔位中加入0.08mL的洗脱液，800rpm下漩涡1min，磁性分离去除磁珠，孔板洗脱液中即含有目标质粒DNA，将此含有质粒DNA的洗脱液转移至PCR板中，-20℃下保存备用。

实施例4：一种免离心、双磁珠法质粒DNA提取试剂盒提取方法，其包括除杂磁珠悬浮液、提取磁珠悬浮液、细菌裂解液、结合缓冲液、清洗液和洗脱液六种组分，各组分的内容如下：

除杂磁珠悬浮液：除杂磁珠悬浮液包括6mg/mL除杂磁珠和第一分散液，第一分散液组分如下：1.5M盐酸，3.5M醋酸钾，0.04MTris-HCl缓冲液，0.2mg/mLRNA酶；

除杂磁珠通过实施例1的方法制备而成；

提取磁珠悬浮液：提取磁珠悬浮液包括40mg/mL硅羟基磁珠和第二分散液，第二分散液组分如下：0.35M氯化钠，pH值为7；

细菌裂解液：0.8M的氢氧化钾，0.25％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.02M乙二胺四乙酸(EDTA)；

结合缓冲液：0.01M尿素，0.08M醋酸钠，0.2％的β-巯基乙醇，4.5M的异硫氰酸胍；

清洗液：50％异丙醇，1.2M盐酸胍；

洗脱液：0.008MTris-HCl缓冲液，0.003MEDTA；

试剂盒提取方法其包括如下步骤：

步骤1)菌液准备：取常规法培养过夜的细菌培养液1.5mL，转移到48孔板中，并做好记录；

步骤2)菌体裂解：向上述加入菌液的孔板中加入0.15mL细菌裂解液，将上述孔板在500rpm下涡旋混合3min；

步骤3)质粒复性：向上述孔板中的菌液中加入0.3mL的除杂磁珠悬浮液，盖严孔板硅胶片，上下轻柔翻转3～5次，使除杂磁珠悬浮液均匀分散于菌液中，将孔板于500rpm下涡旋2min；

步骤4)去除菌体基因组和蛋白：漩涡结束后，磁性分离弃去黑色沉淀，保留澄清透明菌液。

步骤5)质粒DNA结合：将菌液中加入0.8mL结合缓冲液以及0.06mL的提取磁珠悬浮液，严盖硅胶片，然后将孔板于900rpm下漩涡混合5min，用磁板架至于孔板底部，磁性分离，去除上清液。

步骤6)清洗：每个孔位中加入0.65mL清洗缓冲液，将孔板于800rpm下漩涡30s，磁性分离，去除上清液。在每个孔位中加入0.68mL70％乙醇水溶液，将孔板于1000rpm下漩涡30s，磁性分离，去除上清液，用70％乙醇水溶液重复清洗一次。

步骤7)除醇和洗脱：将上述含有磁珠的孔板放入40℃的真空干燥箱干燥8min，除去乙醇，在每个孔位中加入0.08mL的洗脱液，950rpm下漩涡1min，磁性分离去除磁珠，孔板洗脱液中即含有目标质粒DNA，将此含有质粒DNA的洗脱液转移至PCR板中，-20℃下保存备用。

实施例5：一种免离心、双磁珠法质粒DNA提取试剂盒提取方法，其包括除杂磁珠悬浮液、提取磁珠悬浮液、细菌裂解液、结合缓冲液、清洗液和洗脱液六种组分，各组分的内容如下：

除杂磁珠悬浮液：除杂磁珠悬浮液包括6mg/mL除杂磁珠和第一分散液，第一分散液组分如下：1.5M盐酸，1.5M醋酸钠，0.025MTris-HCl缓冲液，0.1mg/mLRNA酶；

除杂磁珠通过实施例1的方法制备而成；

提取磁珠悬浮液：提取磁珠悬浮液包括50mg/mL硅羟基磁珠和第二分散液，第二分散液组分如下：0.25M氯化钠，pH＝5.2；

细菌裂解液：1M的氢氧化钠，0.25％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.015M乙二胺四乙酸(EDTA)；

结合缓冲液：0.02M尿素，0.08M醋酸钠，0.25％的β-巯基乙醇，6M的盐酸胍；

清洗液：60％异丙醇，1M盐酸胍；

洗脱液：0.01MTris-HCl缓冲液，0.001MEDTA；

试剂盒提取方法其包括如下步骤：

步骤1)菌液准备：取常规法培养过夜的细菌培养液1.5mL，转移到48孔板中，并做好记录；

步骤2)菌体裂解：向上述加入菌液的孔板中加入0.165mL细菌裂解液，将上述孔板在500rpm下涡旋混合3min；

步骤3)质粒复性：向上述孔板中的菌液中加入0.25mL的除杂磁珠悬浮液，盖严孔板硅胶片，上下轻柔翻转3～5次，使除杂磁珠悬浮液均匀分散于菌液中，将孔板于500rpm下涡旋2min；

步骤4)去除菌体基因组和蛋白：漩涡结束后，磁性分离弃去黑色沉淀，保留澄清透明菌液。

步骤5)质粒DNA结合：将菌液中加入1.2mL结合缓冲液以及0.055mL的提取磁珠悬浮液，严盖硅胶片，然后将孔板于1200rpm下漩涡混合5min，用磁板架至于孔板底部，磁性分离，去除上清液。

步骤6)清洗：每个孔位中加入0.7mL清洗缓冲液，将孔板于1000rpm下漩涡50s，磁性分离，去除上清液。在每个孔位中加入0.8mL80％乙醇水溶液，将孔板于1000rpm下漩涡45s，磁性分离，去除上清液，用80％乙醇水溶液重复清洗一次。

步骤7)除醇和洗脱：将上述含有磁珠的孔板放入40℃的真空干燥箱干燥8min，除去乙醇，在每个孔位中加入0.08mL的洗脱液，800rpm下漩涡1min，磁性分离去除磁珠，孔板洗脱液中即含有目标质粒DNA，将此含有质粒DNA的洗脱液转移至PCR板中，-20℃下保存备用。

表一～表四分别为实施例2-5的提取效果：

表一：实施例2的提取效果

表二：实施例3的提取效果

表三：实施例4的提取效果

表四：实施例5的提取效果

从表一-表四中观察得到，实施例2-5中260/230＞1.8，且大部分在2.0附近，说明提取DNA中基本无碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂的干扰和污染，纯度较高；260/280＞1.77，且大部分都在1.8附近，说明提取DNA中基本无RNA和蛋白质的污染，纯度较高。260/230和260/280代表的是在紫外下的吸收峰，260nm处表示核酸吸收峰，230nm代表盐、糖类吸收峰，280nm代表蛋白质的吸收峰。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，包括有分别独立分装的除杂磁珠悬浮液、提取磁珠悬浮液、细菌裂解液、结合缓冲液、清洗液和洗脱液；

其中，所述除杂磁珠悬浮液中分散有除杂磁珠，所述除杂磁珠表面至少修饰有苯乙烯、二乙烯基苯和亚氨基二乙酸；

所述提取磁珠悬浮液中分散有提取磁珠，所述提取磁珠表面修饰有硅羟基。

2.如权利要求1所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，所述除杂磁珠悬浮液包括有3-6mg/mL的除杂磁珠和第一分散液，所述第一分散液包括有1-3M的无机酸、2-4M的金属盐、0.02-0.05M的Tris-HCl缓冲液和0.1-0.2mg/mL的RNA酶；所述无机酸选自硫酸、盐酸、硝酸或其组合；所述金属盐选自碳酸钾、醋酸钾、碳酸钠、醋酸钠或其组合。

3.如权利要求1所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，所述提取磁珠悬浮液包括有40-60mg/mL的提取磁珠和第二分散液，所述第二分散液包括有0.1-0.5M的氯化钠；且所述第二分散液的pH为5.0-7.4。

4.如权利要求1所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，所述细菌裂解液包括0.2-1.5M的氢氧化钾、0.15-0.5wt％的十二烷基硫酸钠和0.01-0.025M的乙二胺四乙酸。

5.如权利要求1所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，所述结合缓冲液包括0.01-0.03M的尿素、0.08-0.15M的醋酸钠、0.2-1wt％的β-巯基乙醇、4-6.5M的第一变性剂，所述第一变性剂选自盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钾、碘化钠或其组合。

6.如权利要求1所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，所述清洗液包括38-72wt％的异丙醇，0.8-1.6M的第二变性剂，所述第二变性剂选自盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钾或其组合。

7.如权利要求1所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括0.005-0.02M的Tris-HCl缓冲液和0.001-0.005M的乙二胺四乙酸。

8.如权利要求1所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，所述除杂磁珠的制备方法如下：

S1：将1-5份的包裹SiO₂的四氧化三铁纳米磁球加入到含800份乙醇和200份水的混合体系中，加入0.1-1份三乙胺，在惰性气体保护下，升温至40-80℃，随后加入0.5-5份硅烷偶联剂KH570，搅拌反应4-6小时，经清洗干燥后，得到修饰有KH570的磁珠；

S2：取1-5份修饰有KH570的磁珠加入到1000份DMSO溶液中，加入0.5-1份的苯乙烯、0.2-1份的二乙烯基苯、1-2份的丙烯醇和0.05份的偶氮二异丁腈，升温至60-85℃，惰性气体保护下，搅拌反应4-6小时，加入0.5-1.5份的甲基丙烯酸缩水甘油酯，继续搅拌反应12-16小时，经洗涤干燥后，得到改性磁珠。

S3：取1-5份所述改性磁珠分散到1000份的含有0.2M的碳酸钠水溶液中，加入1-3份的亚氨基二乙酸，反应2-4小时，经洗涤干燥后，即得到除杂磁珠。

9.如权利要求1所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，所述提取磁珠的粒径为100-2000nm。

10.一种如权利要求1-9中任一项所述的基于双磁珠法免离心提取质粒DNA的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括：

步骤1)菌液准备：取细菌培养液1.0-2.0份，转移到孔板中，并记录；

步骤2)菌体裂解：向孔板中加入0.1-0.2份的细菌裂解液，混匀；

步骤3)质粒复性：向孔板中加入0.2-0.4份的除杂磁珠悬浮液，混匀；

步骤4)去除菌体基因组和蛋白：磁性分离弃去除杂磁珠及其吸附物，保留孔板中澄清透明的菌液；

步骤5)质粒DNA结合：向菌液中加入0.5-1.5份的结合缓冲液以及0.03-0.08份的提取磁珠悬浮液，混匀，磁性分离，去除上层清液；

步骤6)清洗：向孔板中加入0.4-0.8份清洗液，混匀，磁性分离，去除上层清液；

步骤7)除醇和洗脱：将上述含有提取磁珠的孔板放入40℃的真空干燥箱干燥5-10min，随后加入0.04-0.1份的洗脱液，混匀，磁性分离去除磁珠，在孔板的洗脱液中即含有目标质粒DNA。