CN101709299A - 一种表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球应用于生物样品中纯化核酸的方法 - Google Patents
一种表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球应用于生物样品中纯化核酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101709299A CN101709299A CN200910219010A CN200910219010A CN101709299A CN 101709299 A CN101709299 A CN 101709299A CN 200910219010 A CN200910219010 A CN 200910219010A CN 200910219010 A CN200910219010 A CN 200910219010A CN 101709299 A CN101709299 A CN 101709299A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- magnetic
- microballoon
- magnetic silica
- biological sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球用于纯化核酸的方法。该方法包括：(1)生物样品的裂解；(2)表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球与核酸结合；(3)清洗；(4)洗脱，通过磁性分离得到纯化后的核酸样品。该磁性微球表面的阳离子功能基团的pK值介于4～8之间，在一定pH条件下带正电荷，可与带有负电荷的核酸分子结合，增加溶液pH值将中和功能基团所带电荷，降低或消除正负电荷的相互作用，核酸从磁性微球表面解离。应用该磁球建立的核酸纯化方法，无需醇沉步骤，避免了乙醇沉淀过程中核酸的损失，洗脱不需高浓度的盐溶液，并且缩减了纯化核酸所需时间，大大提高了提纯效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球用于纯化核酸的方法。
背景技术
目前，生物磁分离技术正在成为生命科学研究的一个重要手段。在分子生物学领域中，核酸是现代生物学、医学研究中的重要课题。作为遗传信息的携带者，DNA是基因表达的物质基础，除在生物体正常生长、发育和繁殖等生命活动中的作用外，它与生命异常如肿瘤的发生、遗传疾病等也密切相关。因此，对核酸分离纯化是许多研究领域的重要前提和保障。
目前常见的核酸分离方法有酚提取/沉淀法、层析法、密度梯度离心法等。这些传统方法往往比较费时，步骤繁琐，需使用有机试剂，有损操作者健康。所以有必要研究一种新的快速、方便的提取基因组DNA的方法。
Levison应用一种以磁性琼脂糖微球作为基质，表面修饰二乙胺基乙基(DEAE)的磁性微球用于核酸提取。
孙敏莉通过磁性纳米粒子与葡聚糖-DEAE包裹的方法合成一种磁性葡聚糖-DEAE微球，并应用于大场杆菌中提取质粒。
上述两种表面修饰DEAE的磁性微球与核酸结合，主要是由于磁性微球表面修饰的DEAE在水溶液中带有正电荷，可与带负电荷的核酸结合，从而达到分离纯化核酸的目的。但是DEAE与核酸结合能力强，在洗脱过程中需用高浓度的盐溶液洗脱。这给下游核酸的应用带来不便。核酸在低浓度的盐溶液中才能用于下游应用。所以Levison和孙敏莉用表面修饰DEAE的磁性微球提取核酸后，还需采用乙醇沉淀的方法除去高浓度的盐，然后在将核酸沉淀重新溶解在缓冲溶液中。因此，该核酸纯化过程费时费力，而且在乙醇沉淀的过程中造成核酸的损失。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种具有相似结构的阳离子修饰的磁性二氧化硅微球，该磁性微球表面的阳离子功能基团的pK值介于4～8之间，在一定pH条件下带正电荷，可与核酸结合，升高溶液的pH值该功能基团不带电荷，核酸从磁性微球表面脱落。应用该磁球建立的核酸纯化方法，洗脱条件不需高浓度的盐溶液，无需醇沉步骤，避免了乙醇沉淀过程中对核酸的浪费，并且缩减了纯化核酸所需时间，大大提高了提纯效率。
本发明的技术方案
一种表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球应用于生物样品中纯化核酸的方法，其特殊之处在于：该方法包括以下步骤
(1)生物样本的裂解
向生物样本加入裂解液(譬如取100～200μl)，涡旋30～60秒，加入20mg/ml蛋白酶K(譬如取2.5～5μl)，混匀，于50～60℃裂解25～60min分钟；
(2)核酸的结合
向步骤(1)得到的产物中加入灭菌水(譬如取0.8～1.6ml)和储存于预处理溶液的表面修饰有阳离子的磁性二氧化硅微球，吹吸混匀，孵育3～5分钟；
(3)清洗
向步骤(2)得到的产物中加入清洗液(譬如取0.4～0.8ml)，摇匀，静置1～3分钟，磁性分离，弃上清；
(4)洗脱
向步骤(3)得到的产物中加入洗脱液(譬如取100～200μl)，吹吸均匀，50～65℃孵育5～10分钟，磁性分离，收集上清，所得上清液为分离出的核酸；
上述步骤(2)表面修饰有阳离子的磁性二氧化硅微球是以磁性二氧化硅微球作为模板，以环氧烷偶联剂3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)作为活化剂，选择带电基团的pKa值介于4～8的一类阳离子修饰剂作为功能基团制备而成的。
上述步骤(1)裂解液的成分是：0.01～0.5M MES、0.5～2M盐酸胍、0.01～1MEDTA和质量浓度为0.1～2％的Triton X-100，该裂解液的pH值为4.0～8.0；
上述步骤(2)预处理溶液的成分是：5～20mM MES、0.1～3mM EDTA和0.5～30mM NaCl；
上述步骤(3)清洗液的成分是：1～50mM MES和0.5～10mM EDTA，pH值为5.5～8；
上述步骤(4)洗脱液的成分是：10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH值为8.5～10；
本发明的优点
1、该方法利用阳离子修饰的磁性二氧化硅微球纯化核酸时，洗脱步骤不需高浓度的盐溶液，无需乙醇沉淀步骤，避免乙醇沉淀过程造成的核酸的损失，缩短了纯化核酸所需的时间，大大提高了提纯效率。
2、该方法设计合理、工艺可行。
附图说明
图1为实施例1中产物琼脂糖电泳结果；
图2为实施例1中紫外分光光度计进行核酸定量结果图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明：
实施例1
取2mL离心管，分别加入200μL冻存血，100μl裂解液(0.03M MES、0.8M盐酸胍、0.03M EDTA和质量浓度为0.5％的Triton X-100)，涡旋30秒，加入2.5μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，于50℃裂解25min。
裂解后加入0.8ml灭菌水和约1mg表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球(储存于10mM MES、1mM EDTA、10mM NaCl的溶液中)。吹吸混匀，孵育5分钟，加入0.4ml清洗液(10mM MES、1mM EDTA、pH 6.0)，摇匀静置1分钟。磁性分离去上清。
加入100μl洗脱液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH 8.5)，吹吸均匀，孵育5分钟，磁性分离收集上清。
用收集的上清进行琼脂糖电泳，结果见图1，图中泳道1为核酸Marker，泳道2为洗脱液，即收集到的上清，该泳道条带单一，且大小约为23kb，说明得到的上清是基因组核酸。用紫外分光光度计进行核酸定量分析，结果如图2所示。该紫外图在260有特征峰。由以上结果说明用该方法得到了较纯的基因组核酸。
实施例2
取10mL离心管，分别加入2mL冻存血，1mL裂解液(0.03M MES、0.8M盐酸胍、0.03M EDTA和质量浓度为0.5％的Triton X-100)，涡旋30秒，加入2.5μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，于50℃裂解25min。
裂解后分别加入8ml灭菌水和约10mg表面修饰多聚组氨酸的磁性二氧化硅微球(储存于10mM MES、1mM EDTA、10mM NaCl的溶液中)。吹吸混匀，孵育5分钟，加入1ml清洗液(10mM MES、1mM EDTA、pH 6.0)，摇匀静置1分钟。磁性分离去上清。
加入100μl洗脱液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH 8.5)，吹吸均匀，孵育5分钟，磁性分离收集上清。
Claims (5)
1.一种表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球应用于生物样品中纯化核酸的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤
(1)生物样品的裂解
向生物样本加入裂解液，涡旋30～60秒，加入20mg/ml蛋白酶K，混匀，于50～60℃裂解25～60min分钟；
(2)核酸的结合
向步骤(1)得到的产物中加入灭菌水和储存于预处理溶液的表面修饰有阳离子的磁性二氧化硅微球，吹吸混匀，孵育3～5分钟；
(3)清洗
向步骤(2)得到的产物中加入清洗液，摇匀，静置1～3分钟，磁性分离，弃上清；
(4)洗脱
向步骤(3)得到的产物中加入洗脱液，吹吸均匀，50～65℃孵育5～10分钟，磁性分离，收集上清，所得上清液为分离出的核酸；
所述步骤(2)表面修饰有阳离子的磁性二氧化硅微球是以磁性二氧化硅微球作为模板，以环氧烷偶联剂3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷作为活化剂，选择带电基团的pKa值介于4～8的一类阳离子修饰剂作为功能基团制备而成的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)裂解液的成分是：0.01～0.5M MES、0.5～2M盐酸胍、0.01～1M EDTA和质量浓度为0.1～2％的Triton X-100，该裂解液的pH值为4.0～8.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)预处理溶液的成分是：5～20mM MES、0.1～3mM EDTA和0.5～30mM NaCl。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)清洗液的成分是：1～50mM MES和0.5～10mM EDTA，pH值为5.5～8。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)洗脱液的成分是：10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH值为8.5～10。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910219010A CN101709299A (zh) | 2009-11-17 | 2009-11-17 | 一种表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球应用于生物样品中纯化核酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910219010A CN101709299A (zh) | 2009-11-17 | 2009-11-17 | 一种表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球应用于生物样品中纯化核酸的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101709299A true CN101709299A (zh) | 2010-05-19 |
Family
ID=42402104
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200910219010A Pending CN101709299A (zh) | 2009-11-17 | 2009-11-17 | 一种表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球应用于生物样品中纯化核酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101709299A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105647910A (zh) * | 2016-04-05 | 2016-06-08 | 苏州英芮诚生化科技有限公司 | 基于双磁珠法免离心提取质粒dna的试剂盒及使用方法 |
| CN109082400A (zh) * | 2018-08-27 | 2018-12-25 | 博奥生物集团有限公司 | 一种利用deae磁纳米颗粒从生物样品中分离外泌体的方法 |
| CN113755487A (zh) * | 2021-09-30 | 2021-12-07 | 天津津科生物科技有限责任公司 | 一种提取基因组脱氧核糖核酸的方法 |
-
2009
- 2009-11-17 CN CN200910219010A patent/CN101709299A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105647910A (zh) * | 2016-04-05 | 2016-06-08 | 苏州英芮诚生化科技有限公司 | 基于双磁珠法免离心提取质粒dna的试剂盒及使用方法 |
| CN105647910B (zh) * | 2016-04-05 | 2020-08-28 | 苏州英芮诚生化科技有限公司 | 基于双磁珠法免离心提取质粒dna的试剂盒及使用方法 |
| CN109082400A (zh) * | 2018-08-27 | 2018-12-25 | 博奥生物集团有限公司 | 一种利用deae磁纳米颗粒从生物样品中分离外泌体的方法 |
| CN113755487A (zh) * | 2021-09-30 | 2021-12-07 | 天津津科生物科技有限责任公司 | 一种提取基因组脱氧核糖核酸的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE602004009022T2 (de) | Verfahren und Reagentien zur Extraktion von RNA und Verfahren zur Analyse von biologischem Material | |
| EP2066792B1 (en) | Nucleic acid purification method using anion exchange | |
| EP3286325B1 (de) | Verfahren und testkit zur schnellen isolierung von nukleinsäuren mittels rauer oberflächen | |
| CN105368820A (zh) | 一种基于磁珠法的全血dna提取试剂盒及其应用 | |
| JP2007500008A (ja) | 小型ｒｎａ分子を単離するための方法および組成物 | |
| CN105420226A (zh) | 一种基于磁珠法的动物组织dna提取试剂盒及其应用 | |
| EP2069495B1 (en) | Nucleic acid purification method | |
| CN1876820A (zh) | 一种适用于大规模生产质粒dna的纯化方法 | |
| CN101712953B (zh) | 用于评价动物肠道微生物群落多样性的dna提取方法 | |
| CN110945124A (zh) | 用于从样品中富集细胞并且后续从这些细胞中分离核酸的方法 | |
| CN105713900A (zh) | 基于磁性石墨烯纳米复合物的核酸提取方法 | |
| CN102146112A (zh) | 从福尔马林固定石蜡包埋组织中提取脱氧核糖核酸的方法 | |
| CN114196669B (zh) | 一种用于核酸提取的漂洗液 | |
| WO2009155128A1 (en) | Method for separation of double-stranded and single-stranded nucleic acids from the same sample | |
| CN101709299A (zh) | 一种表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球应用于生物样品中纯化核酸的方法 | |
| CN102031252B (zh) | 一种快速提取土壤总dna的方法 | |
| US20230203476A1 (en) | Nucleic acid extraction method and application | |
| CN113265395A (zh) | 菌体裂解液澄清试剂以及在质粒提取工艺中的应用 | |
| CN101724625B (zh) | 一种用金磁微粒纯化总核酸的方法 | |
| CN111849964A (zh) | 一种提取精液基因组dna的试剂盒及方法 | |
| CN116162618A (zh) | 一种从核酸溶液中分离dna和rna的方法及试剂组合 | |
| CN100537591C (zh) | 利用研磨法从凝胶中纯化小片段dna的方法和用途 | |
| CN106928315B (zh) | 基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法 | |
| CA2414788C (en) | Acetate-free purification of plasmid dna on hydroxyapatite | |
| CN103952400A (zh) | 一种利用金磁微粒纯化动物微量组织中总核酸的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20100519 |