CN110945124A - 用于从样品中富集细胞并且后续从这些细胞中分离核酸的方法 - Google Patents

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CN110945124A CN201880031846.8A CN201880031846A CN110945124A CN 110945124 A CN110945124 A CN 110945124A CN 201880031846 A CN201880031846 A CN 201880031846A CN 110945124 A CN110945124 A CN 110945124A
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Abstract

本发明涉及从样品中富集和分离生物细胞和/或从样品中富集生物细胞并且后续从这些细胞中分离核酸，其中将该样品与具有粗糙的或经结构化的表面的固相接触。

Description

用于从样品中富集细胞并且后续从这些细胞中分离核酸的 方法
本发明的主题是一种新型的且大幅度简化的方法，该方法允许从样品中富集生物细胞以及从样品中去除生物细胞，然后释放并分离细胞中包含的核酸，其方式使得用于富集细胞的介质还可以用于分离核酸。
该方法在此可以手动或全自动化地进行。它尤其简化了从较大样品体积中分离核酸并且在此背景下还减少了所需的提取试剂的使用。
在经典条件下，从细胞和组织中分离DNA如下进行：在强烈的导致变性和还原性条件下、部分地还在使用分解蛋白质的酶的情况下将包含核酸的初始物质浸软，并且通过苯酚/氯仿提取步骤来提纯析出的核酸级分，并且借助于从水相中渗析或乙醇沉淀来获得核酸(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,1989,CSH,“Molecular Cloning”)。
这种用于从细胞中且特别从组织中分离核酸的“经典方法”是非常耗时的(部分地长于48h)、需要相当高的设备成本并且此外还无法在现场条件下实现。另外，由于所使用的化学品(如苯酚和氯仿)，这类方法在不小的程度上是危害健康的。
分离核酸的经典方法在过去几年已经得到明显改进。这些“新的”方法基于由Vogelstein和Gillespie(Proc.Natl.Acad.Sei.USA,1979,76,615-619)开发且首次描述的用于从琼脂糖凝胶中制备性和分析性地提纯DNA碎片的方法。这种方法把将包含待分离DNA带的琼脂糖溶解在离液盐(NaJ)饱和溶液中与将DNA结合到玻璃颗粒上相结合。固定到玻璃颗粒上的DNA随后用清洗溶液(20mM的Tris HCl[pH 7.2]；200mM NaCl；2mM EDTA；50％v/v的乙醇)清洗并且然后与载体颗粒脱离。
这种方法直至今日仍经历一系列修改并且在现今的时间点应用于不同的提取和提纯不同来源核酸的方法(Marko,M.A.,Chipperfield,R.和Birnboim,H.G.,1982,Anal.Biochem.,121,382-387)。
此外，现在世界范围内还存在许多试剂体系，用于从琼脂糖凝胶中提纯DNA碎片以及用于从细菌溶解产物中分离质粒DNA，还有用于从血液、组织或细胞培养物中分离长链核酸(染色体DNA、细胞总RNA)。
所有这些可商购的套件都基于熟知的原理，即在不同离液盐溶液的存在下核酸对矿物质载体的结合，并且使用细研磨的玻璃粉的悬浮液(例如Glasmilk,BIO 101,LaJolla,CA)、硅藻土(Sigma公司)或二氧化硅凝胶作为载体材料。(Diagen,DE 41 39 664A1).
对于许多不同应用而言都可实现的用于分离核酸的方法在US 5,234,809(Boom)中展示。其中描述了一种用于通过用离液缓冲液和结合DNA的固相孵育含核酸的初始材料而从初始材料中分离核酸的方法。离液缓冲液不仅实现了初始物质的溶解，还实现了将核酸结合到固相。该方法良好地适合于从小的样品量中分离核酸并且特别在分离病毒核酸的领域中得到实际应用。
这种方法的特定修改涉及使用新型的载体材料，这些载体材料对于特定的问题展现出了应用上的优点(WO-A 95/34569)。其他改进的提取方式变体涉及使用新型的溶解/结合缓冲液。
专利文件EP 1135479公开了，为了将核酸吸附到本领域技术人员已知的且使用的硅酸盐型材料上，可以将所谓的反离液(antichaotrope)盐非常高效且成功地作为溶解/结合缓冲液体系的组成部分来使用。这种方法的优点是，通过绕过对离液盐的使用，实现了提取体系的明显更低的健康危害。然而，为了从复杂的生物样品中高效分离核酸，尤其在溶解缓冲液中以尽可能高的产率获取核酸方面，再次需要高的盐浓度(>1.5M)。因此该专利文件公开了，所使用的溶解缓冲液包含介于1.5M-3M之间的盐浓度。在专利文件DE 4321904中描述了一种方法，即，在将离液高盐缓冲液与醇类组分组合的情况下可以实现高效地分离核酸。
现有技术的分析明确地显示，存在许多可能性来将核酸结合到固态载体材料、尤其硅基矿物质载体材料或者还有磁性或顺磁性的硅酸盐类载体材料或者带有官能团(这些官能团对应于硅酸盐材料的相同功能)的磁性或顺磁性材料，后续地清洗核酸并且将核酸与载体材料再次脱离。在此，这些材料作为隔膜(或玻璃纤维片)存在或以微米材料或纳米材料的形式存在。为了辅助将核酸结合到载体材料，不仅使用所谓的离液盐还使用所谓的反离液盐或其混合物。所有这些方法在此与用于结合核酸的矿物质载体材料无关地按照以下相同的工艺流程工作：
1.溶解样品
2.任选地添加结合核酸所需的结合缓冲液
3.使反应混合物与结合核酸的固相(载体材料)接触并且后续将核酸结合到这种材料上
4.清洗结合到载体材料上的核酸
5.使所结合的核酸与载体材料脱离
现有技术中公开了，用于从小体积样品中分离核酸的方法非常高效地起作用。相反，如果处理大样品体积，则这些方法在效率上明显有损失并且另外还在其执行方面变得更加复杂和高耗费。这主要涉及从全血样品中分离核酸。
用于从较大的血量(>200μl)中分离DNA的解决方案变体是基于以下情况：将样品以常规方式以较大体积置于溶解缓冲液中，然后加入结合缓冲液并且将混合物例如借助于“漏斗装置(Trichtervorrichtung)”连续地引导通过过滤隔膜以便结合核酸。此类的可商购套件允许将多于1ml的样品用于分离核酸。但是这些方法需要高得多的提取试剂比例并且因此在执行时是高耗费的。
用于从大体积血样中分离核酸的另一种广泛使用的解决方案变体是基于：在第一方法步骤中选择性地破坏红细胞并且然后借助于离心使含核的细胞造粒。由此大幅度降低了样品体积。用所获得的含核的细胞进行进一步处理。此类方法的缺点是要执行溶解红细胞和将含核的细胞造粒的方法步骤。这些步骤的自动化要求离心。已知的是，在用于分离核酸的自动化过程中在技术上实现离心是高耗费且昂贵的。
以尤其从病原微生物中分离核酸为目的用于处理较大样品体积的其他可能性是基于使用所谓的免疫磁性方法。这些方法是基于使用例如与捕捉剂分子(例如具有靶向抗体)偶联的磁珠。使这些珠与生物样品进行接触并且孵育多个小时。在此靶应特异性地结合到抗体上。随后分离并且清洗这些珠。然后进行所结合的靶的脱离。在所计划的从所结合的分析物中分离核酸的情况下，将所结合的分析物溶解并且随后执行已知的核酸分离。
这些方法是高耗费的并且极为昂贵的，因为它们总是基于使用偶联到磁珠上的抗体。此外，此类方法还是不稳健的，因为这些珠与偶联的抗体总是必须被冷却。在此方面的另一种方法存在于Journal of Virology(Vol.83,No.10；2009)中。在此，该方法为在尿样中免疫磁性地富集病毒抗原。在此可以使用1.5ml的样品。该方法采用与蛋白质(ApoH)偶联的磁珠。这些珠用于结合来自样品的病毒抗原。用珠孵育样品为2h。然后将珠分离并且多次清洗。随后借助于溶解缓冲液进行病毒的溶解。然后将溶解缓冲液加到过滤柱上并且以已知的方式将核酸结合在过滤柱上、清洗并随后将病毒核酸分离。这种方法在处理中也仍然是昂贵且高耗费的。
这种方法显示出它可以处理较大的样品体积。但是还显示出，它在富集细胞以及从这些细胞中分离核酸时为两个分开的方法步骤并且为了富集细胞所使用的试剂不能用于分离核酸。
专利文件US 7,964,364公开了另一种方法。在此描述了将来自样品的细胞结合到固相上。同时这个固相设置有非特异性的捕捉剂配体。这种涂层由碳水化合物或碳水化合物衍生物组成。优选结合微生物。该固相为磁性颗粒。在结合之后将固相从样品中去除并且将细胞溶解。随后调节条件，使得所释放的核酸可以结合到磁性颗粒上。在清洗步骤之后将DNA洗脱。由此，表面改性的磁性颗粒一方面用于从样品中吸附细胞并且随后用于从先前分离的细胞中分离核酸。在专利文件US 7,776,580中以及在公开文本DE 10 2010 031 401中公开的方法和试剂也是类似的。将细胞或细胞组分结合到磁性颗粒上并且从样品中分离，将细胞溶解，并且将所释放的核酸结合到相同的磁性颗粒上并随后分离。为了结合核酸或为了分离核酸所使用的提取化学过程在此再次准确对应于现有技术。因此，这些方法是一种改进，因为为了细胞结合所使用的颗粒在另一种功能中还允许分离经结合的且经分离的细胞的核酸。但是缺点是使用磁性颗粒。因为这些颗粒毫无例外地为纳米颗粒或微米颗粒，所以分离这些颗粒是困难的且尤其在粘性样品中是非常耗时的。
因此，这些方法变得高耗费且总是要求能够实现磁性分离的硬件解决方案。另外显示出，磁性的微米颗粒或纳米颗粒具有非常受限的核酸结合能力。颗粒的表面通常必须仍另外地被化学改性，这意味着时间和成本上的更多耗费。同样非常重要地要提到，纳米材料可能造成明显的健康方面的风险。
本发明以出人意料地简单的方式解决了组合式地富集细胞和后续分离核酸的问题。
本发明以以下出人意料的结论作为基础。当将包含细胞的样品(例如血样)与具有粗糙表面的塑料材料(例如粗糙化的聚丙烯)接触时，细胞结合到塑料材料上。在材料上不存在如现有技术中已知的捕捉剂配体。
术语“粗糙表面”应理解为，通过接触或通过观察表面可以辨别出该表面是不光滑的。但是在此还可以涉及具有结构(例如沟槽)的表面。通过这种结构，即使当该结构(即沟槽)自身可以是光滑的时，也消除了该表面的光滑性。根据本发明，这样的表面被称为“经结构化的表面”。如果通过观察和接触表面不能辨别出表面是光滑还是粗糙的，则可以进行测试，在测试中将激光束指向这个表面。在表面光滑的情况下，激光在表面上仅在主方向上反射。在表面粗糙的情况下，发生在所有空间方向上的散射。这样的测试已在基尔大学的网站上说明(http://www.tf.uni-kiel.de/matwis/amat/semitech_en/kap_3/illustr/ oberflaechenstrukture.pdf)。
对于本领域技术人员而言，容易发现表面是否具有结合细胞或核酸所需的粗糙度。只需要用待测试的表面进行对应的实验，其中将带有生物细胞的水溶液与表面接触并测试细胞是否被结合。
在细胞固定到表面上之后可以将细胞与表面一起从样品中去除。
本发明的目的，即在使用同一试剂的情况下分离被包含在所固定的细胞中的核酸，如下实现：用溶解缓冲液溶解细胞并且由此释放核酸。在释放核酸之后还可以用已用于固定细胞的同一表面分离核酸。
本发明的方法在此首次把用“经结构化的表面”将样品的细胞吸附到材料上与在使用同一表面的情况下后续分离和提纯核酸相结合。在此该方法可以作为“单管工艺(Single-Tube-Prozess)”或以自动化的“走开方法(Walk-Away-Verfahrens)”的形式进行。所使用的具有“经结构化表面”的载体材料是价格低廉的并且与所使用的纳米颗粒不同是无危害的。
在样品的体积方面以及在样品的类型方面对该方法不存在任何实际的限制。正是后一点具有决定性的优势，因为由此还可以高效地处理用已知核酸分离方法只能高耗费地处理的样品、尤其具有高抑制潜势(inhibitorischen Potenzial)的样品。这个优点来源于本发明的方法。在第一方法步骤中，将来自样品的细胞吸附到“经结构化的”或粗糙的表面上。由此可以丢弃样品并在此背景下还丢弃抑制性的基质组分。此外，位于“经结构化的表面”上的细胞还可以用水清洗。于是已经获得了用于后续核酸分离的干净细胞。这尤其在从血样中分离DNA时也是关键的。
工艺流程简单、极为快速并且非常高效，并且根据本发明将细胞富集与后续的核酸提取相结合。本发明引用文件DE 10 2015 216 558、DE 10 2015 211 394和DE 10 2015211 393所公开的方法和手段。本发明是基于其中描述的特性，即可以在粗糙的或“经结构化的表面”上分离核酸。本发明出人意料地显示出，这样的材料不仅适合于分离核酸，而且还适合于结合来自样品的细胞。由此产生了本发明的方法方案，即能够以双重功能组合地使用此类材料。
本发明的核心因而在于，将样品的细胞吸附到“经结构化的表面”上并且后续地使通过溶解释放的核酸处于水性环境中，该水性环境的极性借助于有机物质来调节，使得核酸的溶解度降低并且后续地沉淀在“经结构化的表面”上并且后续地使沉淀的DNA从“经结构化的”/粗糙的表面再度溶解并且可供使用。任选地，还可以清洗沉淀在粗糙表面上的核酸并且在清洗步骤之后将其溶解。
该方法在执行时是极为简单且快速的。一般可以按如下步骤来执行：
1.将包含细胞的样品与具有“经结构化的表面”的材料接触，并且后续地使包含在样品中的细胞吸附到这个表面上。在适当时向样品中额外地加入包含氯化钙的溶液。这可以进一步提高细胞的吸附效率。将表面从样品中去除，并且在适当时清洗吸附在表面上的细胞。
2.用溶解缓冲液溶解细胞。这种溶解缓冲液可以包含离液盐或非离液盐或者这两组的混合物。此外，这种缓冲液可以包含其他的组分，如螯合剂、Tris缓冲液、润湿剂和分散剂等。但是该方法也可以用不包含盐而例如仅由洗涤剂、Tris和EDTA组成的缓冲液来工作。另外，还可以使用蛋白水解酶。
3.添加包含醇类组分和其他添加物的结合缓冲液或者单独添加醇或者还添加丙酮或石油。由此使样品的核酸沉淀在与先前吸附细胞相同的经结构化的表面上。
4.在适当时清洗并后续干燥“经结构化的表面”
5.最终用洗脱缓冲液使核酸与材料脱离
(低盐缓冲液或水)
所有这些方法步骤(细胞吸附、细胞溶解、核酸结合、所结合的核酸的清洗和最终的核酸脱离)都如下进行，使得“经结构化的表面”通过振动或通过吸液与相应的组分进行接触。
该方法可以通用并且既可自动化执行也可手动执行。
优选地，尤其对于在使用任意液体处理站的情况下的自动化流程而言，本发明的手段还可以处于用于提取核酸的设备中，该设备包括中空体，通过该中空体引导液体，其中在这个中空体中布置有粗糙的或“经结构化的表面”，使得该材料可以被液体冲刷。在优选的实施方式中移液器吸头用作中空体。具有粗糙或“经结构化的表面”的材料具有如下的尺寸，使得该材料不能从移液器吸头中落下并且因此与现有技术中描述的磁性颗粒(WO 01/05510 A1)有所不同。总而言之需要在移液器吸头之内通过所安置的材料产生二维/三维结构，首先可以将细胞吸附到该结构上并且后续在细胞溶解之后可以将所释放的核酸吸附到该结构上。
所使用的安置到移液器吸头中的用于细胞吸附和后续结合核酸的材料可以是极为不同的。可以使用改性的塑料材料，其表面不是光滑的、而是粗糙的或经结构化的。这还包括所谓的复合材料，即聚合物和例如有机组分以及无机组分的混合物。重要的只是提供粗糙化的或“经结构化的表面”(不光滑的表面)或者向移液器吸头中安置导致形成二维/三维网络的材料，其中核酸随后沉淀在这种结构上。材料的构架同样不是限制性的(圆形、矩形等)。在此还可以为多种材料(例如多种颗粒)。
重要的是，安置到移液器吸头中的材料随时可以被液体冲刷，而液体无须穿过所引入的材料。还可以使用如下的移液器吸头，(由注塑件制成的)结合材料已经位于其中并且无须再被安置到吸头中。有利的还有使用另外具有磁性或顺磁性特性的粗糙的或经结构化的材料。这样的材料于是还适合于手动处理样品，在手动处理样品时将该材料分开地加入到样品中并且该材料不位于中空体内。
借助于移液过程使带有所包含的细胞的样品在安置于移液器吸头中的本发明材料处“吸放经过(vorbei pipettiert)”。细胞吸附到材料上。在优选的实施方式中，还可以向包含细胞的样品中加入氯化钙。这表现出加速或增强了本发明材料的细胞附着效率。在细胞附着之后，将移液器吸头进入腔室中，在该腔室中存在溶解缓冲液且在适当时还存在蛋白水解酶。现在进行细胞的溶解和核酸的释放。由此细胞不再位于本发明的材料上。根据本发明，后续的方法步骤现在用于将所释放的核酸结合到与先前细胞所处的材料相同的本发明材料上。在细胞溶解之后，待分离的核酸呈水性形式。随后为了沉淀核酸调节所需的条件，由此可以使核酸沉淀到安置在移液器吸头中的材料上。借助于吸放过程，将混合物在竖直安置于移液器吸头中的本发明材料处“吸放经过”。核酸沉淀到材料上。随后可以任选地使清洗缓冲液同样在结合核酸材料处“吸放经过”。然后进行干燥步骤(例如常见的吸入和放出)。最终将洗脱剂再次多次在竖直布置的结合核酸的材料处“吸放经过”并且在此溶解所结合的核酸。核酸现在准备好用于所需的下游应用。该方法在执行中极为快速且简单并且允许以极高的产率和纯度分离核酸。
本发明除了执行简单之外还显示出另一个巨大优势。如果生物样品包含大量的包含核酸的细胞，则借助于本发明的方法和本发明的材料可以提取极为大量的核酸。由此，该方法也理想地适合于处理大样品体积。
下面应借助于实施例详细说明本发明。这些实施例在此不形成对本发明的限制。
实施例
实施例1：在使用修改的移液器吸头以及使用可商购的提取自动装置的情况下从水溶 液中富集细胞与后续提取包含在细胞中的核酸相组合
用提取自动装置InnuPure C16(Analytik Jena AG)执行自动化提取。
为了执行根据本发明方法的核酸提取，将移液器吸头改变为使其对应于本发明的器件。向移液器吸头中，向下部三分之一中竖直地松散地引入粗糙化的塑料粒料(具有约2mm-4mm直径的4个颗粒；聚丙烯)。颗粒在此不封闭移液器吸头的内腔。由此，移液器吸头的移液功能得以保留。
然后本发明的方法在自动装置InnuPure C16上如下实现：
将对于该方法必需的试剂放置在预填充的深孔板中。向深孔板的第一个腔室中放置水性细胞悬浮液。
将带有本发明材料的移液器吸头移入腔室中。通过吸入和放出(重复100次)来进行细胞结合。在这个过程中，细胞吸附到包含在吸头中的本发明材料上。在吸放过程结束之后，将吸头从腔室中移出。细胞位于吸头之内的材料上。随后将吸头移入深孔板的第二个腔室中。在这个腔室中存在可商购的溶解缓冲液以及蛋白酶K(LysisSolution CBV；innuPREPBlood DNA Kit/IPC16；Analytik Jena AG)。通过吸入和放出溶解缓冲液(重复200次)将位于材料上的细胞溶解。另外加热该腔室。在该过程结束时，细胞的所释放的核酸位于溶解缓冲液中。细胞不再位于本发明的材料上。现在将样品抽入移液器吸头中并且排出到深孔板的另一个腔室中。这个腔室是用醇(异丙醇)预填充的。
接着借助于移液器吸头将这个溶液再次吸入和放出。再次使得溶液在颗粒上流过(重复100次)。现在将所释放的核酸结合到本发明的材料上，通过该材料已经预先吸附了来自样品的细胞。在核酸结合到颗粒上之后还有清洗步骤。
用醇类清洗缓冲液填充深孔板的另外3个腔室。通过吸入和放出清洗缓冲液(分别重复10次)进行清洗。
在最后的清洗步骤之后，通过吸入空气将本发明的吸头和包含在其中的颗粒干燥并因而去除残留的乙醇。在深孔板的另一个腔室中从颗粒洗脱核酸，在该腔室中包含200μl的水作为洗脱剂。通过吸入和放出水(重复120次)使核酸与颗粒脱离。
该方法是极为简单且快速的，并且显示出，可商购的提取自动装置可以用于执行本发明的方法，即通过与之相对应的本发明器件将从起始样品中结合细胞和去除细胞与后续提取包含在细胞中的核酸组合。
借助于分光光度测量和凝胶电泳来证实所分离的核酸。
分光光度测量的结果
Figure BDA0002271308820000101
图1示出所分离的核酸的凝胶电泳分析。
展示了在0.8％的琼脂糖凝胶中电泳分开的核酸，该核酸借助于本发明的方法分离。样品从左向右从样品1开始标记。第1泳道包含DNA梯状条带。
实施例2：在使用修改的移液器吸头以及使用可商购的提取自动装置的情况下从不同 体积全血样中富集含核细胞与后续提取包含在含核细胞中的核酸相组合
再次用提取自动装置InnuPure C16(Analytik Jena AG)执行自动化提取。
为了执行根据本发明方法的核酸提取，将移液器吸头改变为使其对应于本发明的器件。向移液器吸头中，向下部三分之一中竖直地松散地引入粗糙化的塑料粒料(具有约2mm-4mm直径的4个颗粒；聚丙烯)。由此，移液器吸头的移液功能得以保留。
然后本发明的方法在自动装置InnuPure C16上如下实现。
将对于该方法必需的试剂放置在预填充的深孔板中。在深孔板的第一个腔室中安置不同的血液量(200μl、300μl、400μl和500μl)。向这些血样中分别放置800μl的可商购的红细胞溶解缓冲液(Ery Lysis Solution A；Analytik Jena AG)。另外还加入200μl的1M氯化钙溶液。
将带有本发明材料的移液器吸头移入腔室中。通过吸入和放出(重复100次)来进行细胞结合。在这个过程中，含核细胞吸附到包含在吸头中的本发明材料上。在吸放过程结束之后，将吸头从腔室中移出。细胞位于吸头之内的材料上。由此将细胞与实际的样品分离并且由此还将细胞与抑制性物质(如血红蛋白)分离。这使得后续成功提取核酸明显更容易。随后将吸头移入深孔板的第二个腔室中。在这个腔室中存在可商购的溶解缓冲液以及蛋白酶K(LysisSolution CBV；innuPREP Blood DNA Kit/IPC16；Analytik Jena AG)。通过吸入和放出溶解缓冲液(重复200次)将位于材料上的细胞溶解。另外加热该腔室。在该过程结束时，细胞的所释放的核酸位于溶解缓冲液中。细胞不再位于本发明的材料上。现在将样品抽入移液器吸头中并且放出到深孔板的另一个腔室中。这个腔室是用醇(异丙醇)预填充的。
随后借助于移液器吸头再次将这种溶液吸入和放出，使得溶液流过所填充的材料(重复100次)。现在将所释放的核酸结合到本发明的材料上，通过该材料已经预先吸附了来自样品的细胞。在核酸结合到颗粒上之后还有清洗步骤。
用醇类清洗缓冲液填充深孔板的另外3个腔室。通过吸入和放出清洗缓冲液(分别重复10次)进行清洗。
在最后的清洗步骤之后，通过吸入空气将本发明的吸头和包含在其中的材料干燥并因而去除残留的乙醇。在深孔板的另一个腔室中从颗粒洗脱核酸，在该腔室中包含200μl的水作为洗脱剂。通过吸入和放出水(重复120次)使核酸与颗粒脱离。
借助于分光光度测量和凝胶电泳来证实所分离的核酸。显示出，通过提高血液量也增加了核酸的产率。由此该方法还出色地适合于处理较大的样品体积。
分光光度测量的结果
Figure BDA0002271308820000121
图2示出所分离的核酸的凝胶电泳分析。
展示了在0.8％的琼脂糖凝胶中电泳分开的核酸，该核酸借助于本发明的方法分离。样品从左向右从样品1开始标记。第9泳道包含DNA梯状条带。
实施例3：在使用三种不同修改的移液器吸头以及使用可商购的提取自动装置的情况 下从全血样中富集含核细胞与后续提取包含在含核细胞中的核酸相组合
再次用提取自动装置InnuPure C16(Analytik Jena AG)执行自动化提取。
为了执行根据本发明方法的核酸提取，将移液器吸头改变为使其对应于本发明的器件。此外，移液器吸头如下进行修改：
1.在下部三分之一中竖直地用粗糙化的聚丙烯塑料颗粒(具有约2mm-4mm直径的4个颗粒)松散填充的移液器吸头
2.在下部三分之一中竖直地用粗糙化的聚丙烯塑料颗粒(具有约2mm-4mm直径的5个颗粒)松散填充的移液器吸头
3.在下部三分之一中竖直地用螺旋形的聚乙烯塑料材料(具有1.5cm长度，作为经结构化的材料的实例)填充的移液器吸头。
材料在移液器吸头中是松动的，由此移液器吸头的移液功能完全得以保留。根据本发明，待吸放的液体总是移动经过该材料。
然后本发明的方法在自动装置InnuPure C16上如下实现：
将对于该方法必需的试剂放置在预填充的深孔板中。向深孔板的第一个腔室中放置全血样品(500μl)。向该血样中分别放置800μl的可商购的红细胞溶解缓冲液(Ery LysisSolution A；Analytik Jena AG)。另外还加入200μl的1M氯化钙溶液。
将带有本发明材料的移液器吸头移入腔室中。通过吸入和放出(重复100次)来进行细胞结合。在这个过程中，含核细胞吸附到包含在吸头中的本发明材料上。在吸放过程结束之后，将吸头从腔室中移出。细胞位于吸头之内的材料上。由此将细胞与实际的样品分离并且由此还将细胞与抑制性物质(如血红蛋白)分离。这使得后续成功提取核酸明显更容易。随后将吸头移入深孔板的第二个腔室中。在这个腔室中存在可商购的溶解缓冲液以及蛋白酶K(LysisSolution CBV；innuPREP Blood DNA Kit/IPC16；Analytik Jena AG)。通过吸入和放出溶解缓冲液(重复200次)将位于材料上的细胞溶解。另外加热该腔室。在该过程结束时，细胞的所释放的核酸位于溶解缓冲液中。细胞不再位于本发明的材料上。现在将样品抽入移液器吸头中并且放出到深孔板的另一个腔室中。这个腔室是用醇(异丙醇)预填充的。
接着借助于移液器吸头将这个溶液再次吸入和放出。再次使得溶液在所填充的材料上流过(重复100次)。现在将所释放的核酸结合到本发明的材料上，通过该材料已经预先吸附了来自样品的细胞。在核酸结合到颗粒上之后还有清洗步骤。
用醇类清洗缓冲液填充深孔板的另外3个腔室。通过吸入和放出清洗缓冲液(分别重复10次)进行清洗。
在最后的清洗步骤之后，通过吸入空气将本发明的吸头和包含在其中的材料干燥并因而去除残留的乙醇。在深孔板的另一个腔室中从颗粒洗脱核酸，在该腔室中包含200μl的水作为洗脱剂。通过吸入和放出水(重复120次)使核酸与颗粒脱离。
借助于分光光度测量和凝胶电泳来证实所分离的核酸。显示出，通过提高血液量也增加了核酸的产率。由此该方法还出色地适合于处理较大的样品体积。
分光光度测量的结果
Figure BDA0002271308820000141
图3示出所分离的核酸的凝胶电泳分析。
展示了在0.8％的琼脂糖凝胶中电泳分开的核酸，该核酸借助于本发明的方法分离。样品从左向右从样品1开始标记。第1泳道包含DNA梯状条带。

Claims (10)

1.一种用于从样品中富集和分离生物细胞的方法，其特征在于，将该样品与具有粗糙的或经结构化的表面的固相接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行接触之前向该样品中加入二价或三价阳离子的盐、优选氯化钙。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，该粗糙表面为不光滑的塑料表面或橡胶表面。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，该不光滑的塑料表面通过3D打印或通过将塑料粗糙化来产生。
5.根据权利要求1至4之一所述的方法，其特征在于，将粗糙的复合材料用作固相。
6.根据权利要求1至5之一所述的方法，其特征在于，使用经粗糙化的移液器吸头、优选额外地具有磁性或顺磁性特性的移液器吸头作为固相。
7.根据权利要求1或2之一所述的方法，其特征在于，将具有粗糙的或经结构化的表面的固相引入到光滑的中空体、优选移液器吸头中或套接到其上，其中所套接的固相优选为环或套筒。
8.一种用于从样品中富集生物细胞并且后续从这些细胞中分离核酸的方法，其特征在于以下步骤：
a)根据权利要求1至7之一来接触包含生物细胞的样品
b)溶解这些细胞
c)将通过溶解从这些细胞中释放的核酸结合到与根据权利要求1至7结合细胞的材料相同的材料上
d)在适当时清洗并后续干燥该固相
e)最终用洗脱缓冲液、优选用低盐缓冲液或水使核酸与材料脱离。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，该方法作为“单管工艺”或以自动化的“走开方法”的形式手动或全自动化地进行。
10.具有粗糙的或经结构化的表面的固相、优选移液器吸头的用途，用于从样品中富集和分离生物细胞和/或用于从样品中富集生物细胞并且后续从这些细胞中分离核酸。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111607635A (zh) * 2020-06-23 2020-09-01 大连理工大学 一种基于3d打印特形功能体的血液基因组dna提取方法及其应用试剂盒
CN111607489A (zh) * 2020-06-23 2020-09-01 大连理工大学 一种基于3d打印微元件的核酸提取系统和方法
CN111647596A (zh) * 2020-06-23 2020-09-11 辽宁省海洋水产科学研究院 一种基于3d打印功能体的微孢子虫dna的提取方法、试剂盒及其应用
CN111778236A (zh) * 2020-06-23 2020-10-16 辽宁省海洋水产科学研究院 基于3d打印特形功能体的贝类基因组dna提取方法、试剂盒及其应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102019118332B4 (de) * 2019-07-07 2022-04-07 Ist Innuscreen Gmbh Verfahren und testkit zur bisulfitmodifizierung von dna
DE102020135124A1 (de) 2020-12-30 2022-06-30 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren und System zur schnellen Isolierung von Nukleinsäuren direkt aus Vollblutproben
DE102021130283B4 (de) * 2021-11-19 2024-03-21 Ist Innuscreen Gmbh Verfahren und testkit zur preiswerten und ressourcensparenden extraktion von nukleinsäuren
DE102022115445B4 (de) 2022-06-21 2024-07-04 Ist Innuscreen Gmbh Verfahren und kit zur manuellen und automatisierten probenvorbereitung von long-read-sequenzierungen

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1395620A (zh) * 2000-01-21 2003-02-05 简珀恩特联合股份有限公司 细胞分离方法
CN1506460A (zh) * 2002-12-09 2004-06-23 �廪��ѧ 从样品中分离细胞粒子的方法及其试剂盒
WO2017039286A1 (ko) * 2015-09-01 2017-03-09 삼성전자 주식회사 핵산 분리 방법

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5234809A (en) 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
DE4143639C2 (de) 1991-12-02 2002-10-24 Qiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren
DE4321904B4 (de) 1993-07-01 2013-05-16 Qiagen Gmbh Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen
WO1995034569A1 (de) 1994-06-14 1995-12-21 Invitek Gmbh Universelles verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren aus extrem geringen mengen sowie sehr stark verunreinigten unterschiedlichsten ausgangsmaterialien
DE19856064C2 (de) 1998-12-04 2000-11-30 Invitek Gmbh Universelles Verfahren zur Isolierung von DNA aus beliebigen Ausgangsmaterialien
JP4856831B2 (ja) 1999-07-19 2012-01-18 オルガノン・テクニカ・ベー・ヴエー 磁性粒子を流体と混合するための装置および方法
DE102010031401A1 (de) 2010-07-15 2012-01-19 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren zur Anreicherung von Bakterien, Viren sowie Zellen und zur nachfolgenden Nukleinsäureisolierung
EP3056565A1 (en) 2015-02-13 2016-08-17 Karlsruher Institut für Technologie Immobilization of cells or virus particles on protein structures using a microfluidic chamber
DE102015211394B4 (de) 2015-06-19 2022-07-28 Ist Innuscreen Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren
DE102015211393A1 (de) 2015-06-19 2016-12-22 Aj Innuscreen Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur automatisierten Extraktion von Nukleinsäuren
DE102015216558A1 (de) * 2015-04-23 2016-10-27 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren und testkit zur schnellen isolierung von nukleinsäuren mittels rauer oberflächen
JP6797185B2 (ja) 2015-04-23 2020-12-09 エイ・ジェイ イヌスクリーン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＡＪ Ｉｎｎｕｓｃｒｅｅｎ ＧｍｂＨ 核酸を自動的に抽出する装置および方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1395620A (zh) * 2000-01-21 2003-02-05 简珀恩特联合股份有限公司 细胞分离方法
CN1506460A (zh) * 2002-12-09 2004-06-23 �廪��ѧ 从样品中分离细胞粒子的方法及其试剂盒
WO2017039286A1 (ko) * 2015-09-01 2017-03-09 삼성전자 주식회사 핵산 분리 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IVO SAFARIK等: "Use of magnetic techniques for the isolation of cells" *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111607635A (zh) * 2020-06-23 2020-09-01 大连理工大学 一种基于3d打印特形功能体的血液基因组dna提取方法及其应用试剂盒
CN111607489A (zh) * 2020-06-23 2020-09-01 大连理工大学 一种基于3d打印微元件的核酸提取系统和方法
CN111647596A (zh) * 2020-06-23 2020-09-11 辽宁省海洋水产科学研究院 一种基于3d打印功能体的微孢子虫dna的提取方法、试剂盒及其应用
CN111778236A (zh) * 2020-06-23 2020-10-16 辽宁省海洋水产科学研究院 基于3d打印特形功能体的贝类基因组dna提取方法、试剂盒及其应用
WO2021259141A1 (zh) * 2020-06-23 2021-12-30 大连理工大学 一种基于 3d 打印微元件的核酸提取系统和方法
CN111607635B (zh) * 2020-06-23 2024-03-22 大连理工大学 一种基于3d打印特形功能体的血液基因组dna提取方法及其应用试剂盒
CN111607489B (zh) * 2020-06-23 2024-04-05 大连理工大学 一种基于3d打印微元件的核酸提取系统和方法
CN111778236B (zh) * 2020-06-23 2024-07-09 辽宁省海洋水产科学研究院 基于3d打印特形功能体的贝类基因组dna提取方法、试剂盒及其应用
CN111647596B (zh) * 2020-06-23 2024-07-09 辽宁省海洋水产科学研究院 一种基于3d打印功能体的微孢子虫dna的提取方法、试剂盒及其应用

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