CN111647596A - 一种基于3d打印功能体的微孢子虫dna的提取方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于3D打印功能体的微孢子虫DNA的提取方法、试剂盒及其应用，属于核酸提取方法及应用技术领域。本发明用裂解液对样本进行裂解处理，通过手持或机器持3D打印特形功能体在裂解液、清洗液、洗脱液中快速转移来实现DNA提取，无需移液、离心等耗时繁琐步骤，人工劳动密度低、成本低、通量高、DNA品质高、对设备和操作空间需求小，具有自动化和高通量下游应用前景。本发明还提供了该核酸提取方法的应用试剂盒及其在动植物宿主中微孢子虫病原PCR快速诊断中应用，本发明解决了现行微孢子虫体外PCR诊断技术靶标核酸制备复杂、耗时、通量低等问题，可以广泛应用于各种微孢子虫的快速检测中，显著提高检测通量、操作便利性、检测灵敏度与准确度。

Description

一种基于3D打印功能体的微孢子虫DNA的提取方法、试剂盒及 其应用

技术领域

本发明属于核酸提取方法及应用技术领域，具体涉及一种基于3D打印功能体的微孢子虫DNA的提取方法、试剂盒及其应用。

背景技术

微孢子虫，是一种多样化的门，几乎能寄生所有类型的动物，其中昆虫和鱼类是其最主要的寄主。有报道指出，致病性微孢子虫通过食物链对人类健康存在潜在风险，它们在经济昆虫(蚕和蜜蜂)间、鱼类之间的传播，不仅会引起病害的爆发而带来生产上的减产，同时也影响下游产品(蚕蛹、蜂蜜、鱼肉)作为食物来源的食品安全性。

通过微孢子虫诊断技术，及时发现微孢子虫并切断其传播，对于经济昆虫饲养和渔业均具有重要防控、增产意义。目前的微孢子虫诊断技术主要有：显微镜检查技术(镜检，Microscopy)，免疫学手段和分子检测技术(PCR诊断技术)。镜检简单实用，但对操作人员而言工作量大、经验要求高，检测灵敏度因人而异，漏检风险高；免疫学手段稳定性差、灵敏度不高、操作繁琐、实用性较差；镜检和免疫学手段的低灵敏度带来高漏检风险，漏检的微孢子虫引起持续传播，带来生产减产和食品安全。

核酸PCR诊断是一种重要的病原检测方法，相比镜检和免疫学手段，核酸PCR诊断具有高修改灵活性、高检测灵敏度以及可以更快、更早地获得检测结果等优势，在农业病害控制、畜牧业疫病检验和食品安全领域发挥着重要作用。然而，PCR诊断技术包含多个环节：模板核酸提取，PCR扩增，结果读出；而模板核酸提取过程存在着诸多问题，如操作繁琐复杂、通量低、交叉污染风险高、提取过程干扰因素多等，大大制约了柞蚕病原分子检测技术的检测通量、灵敏度、时效性，成为PCR诊断方法生产应用的关键瓶颈。

从复杂的生物体样本中提取核酸，尤其从动物组织样本中提取核酸，传统液相提取手段因污染重、样本需求量大而逐渐被淘汰。固相分离大多集中于磁力分离，虽然磁力分离被认为具有下游高通量和自动化应用的前景。Li P.等人也报道了高效、高通量的磁力分离在微孢子虫PCR诊断中的应用前景。但方法过于单一，非磁力分离的固相核酸分离，如传统柱式提取等，将结合核酸的固相载体从裂解液体系中分离，仍然需要依赖多步离心或反复移液等繁琐操作，存在劳动密集、通量低的局限性，是目前核酸固相提取技术亟待解决的关键问题。

为解决上述问题，开发一种过程简单、高通量、快捷的核酸提取技术具有重要意义。

发明内容

本发明针对现行微孢子虫核酸提取过程繁琐复杂、通量低等问题，本发明首先提供了一种基于3D打印特形功能体的微孢子虫DNA提取方法，包括如下步骤：

(1)用裂解液对待测微孢子虫样本或微孢子虫宿主样本进行裂解处理；

(2)通过手持或机器持将3D打印特形功能体的核酸结合区伸入步骤(1)所得溶液中，进行DNA的结合；

(3)通过手持或机器持将完成步骤(2)的3D打印特形功能体的核酸结合区转移至清洗液中，进行清洗；

(4)将完成步骤(3)的3D打印特形功能体取出、干燥；

(5)通过手持或者机器持将完成步骤(4)的3D打印特形功能体的核酸结合区置入洗脱液中，进行洗脱，所得洗脱液即为微孢子虫DNA溶液。

具体的，上述技术方案中，所述步骤(1)中的待测微孢子虫样本包括微孢子虫细胞培养液、微孢子虫虫体，所述待测微孢子虫宿主样本包括微孢子虫寄生的动物组织、动物血液或动物身体的任意部位。

具体的，上述技术方案中，所述步骤(1)中的裂解液是指能将组织中的核酸释放到溶液中的缓冲液，包括：CTAB裂解液、NaHCO₃裂解液、Chelex裂解液、蛋白酶K裂解液或SDS裂解液等。

具体的，上述技术方案中，所述CTAB裂解液包括：1～3wt％的CTAB、0.5～5M NaCl、0.01～0.05M EDTA、0.05～0.5M Tris-HCl、0.05～0.5％的巯基乙醇，所述NaHCO₃裂解液包括：0.05-1.00M的NaHCO₃、0.5～10％SDS，所述Chelex裂解液包括：0.5～20wt％的Chelex-100和0.2～5M的DTT，所述蛋白酶K裂解液包括：20～500mmol的Tris-HCl、10～50mmol的EDTA、100～1000mmol的NaCl，0.1～10％的SDS，和5～30μg/mL的蛋白酶K；所述SDS裂解液包括如下组分：1～10％SDS，0-30μg/mL的蛋白酶K。所述裂解液中还有0～30μg/mL RNA消化酶。所述裂解过程的处理时间为1min-24h，处理温度为0-100℃。

具体的，对于上文所述的技术方案中，所述步骤(2)中的3D打印特形功能体为以光敏树脂或热塑性塑料为原料，通过3D打印技术获得的具有“伞”型结构的微元件，包括核酸结合区和手柄区；所述3D打印特形功能体含有1个或至少两个核酸结合区，为至少两个核酸结合区时，手柄区依靠连接区并排连接在一起；所述核酸结合区为圆锥体，尺寸为：2-5mm(锥底直径)×5-20mm(高)；所述手柄区为圆柱体或长方体，手柄区的一端与核酸结合区的锥底中心位置连接，构成“伞”型结构；所述核酸结合区表面平整或具有不平整微观结构，所述不平整微观结构可以是任意形状并分布在核酸结合区外表面的任意部位，包括螺纹衬托结构、凹槽结构、多孔结构、凸起结构等；所述多孔结构可以是纳米、微米等尺寸，形状可以是球体、方体或不规则形状。所述核酸结合区负载或不负载颗粒材料，所述颗粒材料包括二氧化硅、二氧化钛、二氧化锰等无机盐颗粒和金属颗粒；所述核酸结合区有或者没有表面官能团修饰，所述表面官能团包括羟基、羧基、氨基等；所述手柄区的形状为圆柱体或长方体，圆柱体的直径为2-5mm，长方体的长度为2-5mm，宽度为1-5mm；所述连接区为长方体，尺寸为6.5-10cm(长)×2-10mm(宽)×1-5mm(高)；所述3D打印特形功能体的整体高度h为20mm-100mm。

进一步的，利用3D打印技术在打印机上精准制备出特形功能体，核酸结合区、手柄区、连接区可以是一体制备，也可以是分体制备；当各部分分体制备时，可以通过粘合进行核酸结合区和手柄区的组装。

上文所述的技术方案中，所述步骤(2)中DNA的结合，加入或不加入辅助结合溶剂，所述辅助结合溶剂可以为异丙醇、无水乙醇中的一种或两者的混合溶液，辅助结合溶剂的体积为裂解液体积的0.6-0.8倍；所述3D打印特形功能体进行核酸的结合，摇动3D打印特形功能体结合时间为5s-5min。

上文所述的技术方案中，所述步骤(3)通常伴有摇动3D打印特形功能体搅动清洗液的操作。所述步骤(3)中的清洗一般为1-3次；所述清洗时间为每次2s-1min；优选的，所述清洗液包括70-80％的酒精；

上文所述的技术方案中，所述步骤(4)的干燥过程可在室温或加热下进行，干燥过程时间为1min-2h；

上文所述的技术方案中，所述步骤(5)的洗脱时间为5s-5min，洗脱液可以是适宜浓度或者便于储存的高浓度的水、PBS、TE缓冲液和下游PCR反应液等，优选的，本发明采用TE缓冲液，TE缓冲液的具体组分为：10mMTris-HCl，1mM EDTA(PH＝8.0)。

本发明还提供了上述微孢子虫DNA提取方法的应用试剂盒。具体的，试剂盒中包含如下组分：

(1)3D打印特形功能体；

(2)裂解液；

(3)蛋白酶K；

(4)RNA消化酶

(5)清洗液；

(6)洗脱液；

(7)操作说明书；

(8)固定架；

所述3D打印特形功能体为以光敏树脂或热塑性塑料为原料，通过3D打印技术获得的由核酸结合区和手柄区组成的、具有“伞”型结构的微元件，并通过连接区将若干“伞”型结构的微元件并排连接；所述裂解液包括CTAB裂解液、NaHCO₃裂解液、Chelex裂解液、蛋白酶K裂解液或SDS裂解液中的一种；所述清洗液包括70-80％的酒精；所述洗脱液包括水、PBS、TE缓冲液和下游PCR反应液中的一种；所述固定架为可以固定、排布若干个3D打印特形功能体的结构。

优选的，所述3D打印特形功能体为含有8个核酸结合区、匹配8联排管使用的结构；所述固定架为可以固定、排布12个8联排3D打印特形功能体的、匹配96孔板使用的刚性结构，使得12个3D打印特形功能体随着固定架移动可以同时移动，从而匹配96孔板使用时，将单次提取通量提高至96个样本。

进一步，本发明还提供了上述微孢子虫DNA提取方法在鉴定动植物宿主中的微孢子虫病原中的应用，具体的为，基于非疾病的诊断和治疗目的(即：并非以有生命的人体或动物体为对象，同时不以获得疾病诊断结果或健康状况为直接目的)，通过上述技术方案，从动物宿主样本中提取微孢子虫DNA，并将提取的DNA作为模板，通过设计目标病原微生物的特异性扩增引物和选择合适的PCR扩增技术，对模板核酸进行扩增，判断该动植物组织中是否存在目标微孢子虫病原。

所述PCR扩增技术包括常规PCR，巢式PCR(Nested-PCR)，重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)，环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)及实时荧光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)，反转录PCR等。

有益效果：

本发明所提供的微孢子虫DNA的提取方法，能够高效、简便、快速、高通量的提取、分离目标核酸，具有明显先进于现行技术的优势：

1)本发明所提供的微孢子虫DNA的提取方法操作简便、节约劳动力、通量高。采用3D打印特形功能体进行核酸的分离与纯化，通过机械力快速转移功能体完成，不需要移液、离心等繁琐耗时的操作，避免了传统非磁力核酸固相分离依赖多步离心与移液操作的瓶颈制约，显著节约劳动力；同时，3D打印特形功能体可以匹配8联排管、96孔板使用，通量高，这是对现行提取技术普遍通量低的一个重要突破；

2)本发明所提供的微孢子虫DNA提取方法快速。采用3D打印特形功能体进行核酸的分离与纯化，是一种固相核酸分离方法，最快1min内可以从裂解液中分离、纯化出核酸，比现行普遍使用的固相分离技术——磁力分离(通常需要14.5min左右，且需要多次移液操作[PLoS Biol,2017,15(11):e2003916.])快近15倍。

3)本发明所提供的3D打印特形功能体的原材料便宜、易得；打印过程方便、快速，能显著降低经济成本；

4)本发明所提供的微孢子虫DNA的提取方法，具有自动化应用前景。通过设计程序化的设备提供机械驱动力，完成3D打印特形功能体在各种溶液之间的转移从而实现自动化核酸提取。自动化应用将进一步降低人力成本，将有利于推动下游PCR诊断技术的发展；

5)本发明所提供的微孢子虫DNA的提取方法，不依赖离心、移液等繁琐操作，可以实现人工低劳动密度高通量核酸分离，且整个过程能够在1m²的操作环境下完成，节约空间，使用灵活性高，有利于野外随时取样操作，对于农作物、海鲜产品、经济昆虫组织采样和PCR诊断具有重要意义。

附图说明

图1是本发明3D打印特形功能体的结构示意图，(a)为单体3D打印特形功能体，(b)为八联3D打印特形功能体。

图2是本发明实施例1的琼脂糖凝胶电泳图，图中泳道1-4为感染微孢子虫的柞蚕蛾1-4#样本，泳道5-8为柞蚕微孢子虫细胞培养液5-8#样本，泳道M为DL2000 Marker。

图3是本发明实施例2的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M为DL2000 Marker，泳道1为阴性参照，泳道2为微孢子虫DNA。

图4是本发明实施例3的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M为DL2000 Marker，泳道1为阴性参照，泳道2分别为2#样本，泳道3为1#样本。

图中，1、核酸结合区；2、手柄区；3、连接区。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述。应该指出，以下说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语与本发明所属技术领域人员通常理解的含义相同。

本发明实施例所涉及的材料、实际和实验设备，如无特别说明，均符合核酸提取和病原微生物分子诊断领域的市售产品。

本发明实施例所涉及的引物均由委托生物工程公司合成，具体引物信息如下：

SEQ ID NO:1：

5’-GACGGAAGAATACCACAAGGAGT-3’

SEQ ID NO:2：

5’-CTATATGAGGGTCTCACATCTTGT-3’

SEQ ID NO:3：

5’-ACGGCTCAGTAATGTTGC-3’

SEQ ID NO:4：

5’-TACGACTACGGACCCTTT-3’

实施例1

以光敏树脂(PAA)为原料，采用DLP数码影像投射3D打印技术在400-800nm光照下发生光固化反应，从而制得如图1b所示规则结构的3D打印特形功能体：3D打印特形功能体为类似于伞状的结构，八联3D打印特形功能体由核酸结合区1、手柄区2和连接区3构成，核酸结合区1为圆锥体，手柄区2为圆柱体，连接区3为长条形，核酸结合区1锥底中心位置与手柄区2的一个底面连接，手柄区2的另一个底面与连接区3连接，在连接区3上并排连接8个单3D打印特形功能体，形成八联3D打印特形功能体。具体包括具有8个核酸结合区1的八联功能体，核酸结合区1宽度3.8mm，高度10mm，核酸结合区1外表面具有螺纹与凹槽结构，手柄区2高度20mm。八联3D打印特形功能体如图1(b)所示。

选取感染微孢子虫的柞蚕蛾1只，取4份脂肪体，置于8联排EP管的1-4#样品孔中；另取柞蚕微孢子虫细胞培养液，离心后，挑取4份置于8联排EP管的5-8#样品孔中。在EP管中分别加入裂解液(10％的SDS，蛋白酶K溶液5μL)80μL，震荡混匀，室温放置30分钟，加入无水乙醇60mL并放入3D打印特形功能体，使3D打印特形功能体的核酸结合区伸入溶液，手持或机械持手柄区，轻轻摇动3D打印特形功能体混匀溶液，10秒后将3D打印特形功能体转移至预置有清洗buffer(75％的酒精)100μL的8联排EP管中，使核酸结合区伸入清洗buffer，手持或机械持手柄区，轻轻上下摇动3D打印特形功能体5s，重复在清洗buffer中转移2-3次；从清洗buffer中取出3D打印特形功能体，甩去3D打印特形功能体上残留液滴，于37℃鼓风培养箱内干燥1分钟，置于40μL洗脱Buffer(TE)中，使核酸结合区伸入洗脱Buffer，手持或机械持手柄区，轻轻摇动30s进行洗脱。所得洗脱液即为微孢子虫DNA提取液，所提微孢子虫DNA提取液-20℃冻存待用。

以所提微孢子虫DNA提取液为模板DNA，采用常规PCR技术进行柞蚕微孢子虫分子诊断：

每25μL体系含如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物(10pM)各0.5μL、模板DNA2μL、rTaq 0.25μL，10×Buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，去离子水17.25μL。PCR条件为95℃4min；以95℃30秒，60℃30秒,72℃1分钟进行40个循环，再在72℃下延伸5min，得到的PCR产物加入核酸染色剂，用2％的琼脂糖进行凝胶电泳，电泳结束后在紫外光下观测结果，如图2所示。图2中泳道1-4为感染微孢子虫的柞蚕蛾1-4#样本，泳道5-8为柞蚕微孢子虫细胞培养液5-8#样本，泳道M为DL2000 Marker。

结果说明：8例本发明提取的核酸在172bp处出现特异性条带，说明本发明方法提取的柞蚕微孢子虫核酸样本具有较高品质，能应用于柞蚕微孢子虫的分子检测中。

此实施例同时还说明，3D打印特形功能体从裂解液中分离出核酸的操作过程简单，通过手动在裂解液、清洗液、洗脱液中快速转移功能体，无需移液、离心等耗时繁琐步骤，人工劳动密度低，分离、纯化过程耗时不足2min，快速且通量高；整个操作过程能够在1m²的操作环境下完成，节约空间，使用灵活性高，有利于开展野外采样与核酸提取。

实施例2

以光敏树脂(PAA)为原料，采用DLP数码影像投射3D打印技术在400-800nm光照下发生光固化反应，从而制得如图1a所示规则结构的3D打印特形功能体：3D打印特形功能体为类似于伞状结构，单3D打印特形功能体由核酸结合区1和手柄区2构成，核酸结合区1为圆锥体，手柄区2为圆柱体，核酸结合区1锥底中心位置与手柄区2的一个底面连接。具体包括具有单个核酸结合区1的单体功能体1个，核酸结合区1宽度5mm，高度10mm，核酸结合区1外表面具有螺纹与凹槽结构，手柄区2高度35mm。

取感染肠道上皮细胞微孢子虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)的对虾，取肠道组织少许置于EP管中，加入裂解液(100mmol的Tris-HCl、25mmol的EDTA、500mmol的NaCl及1％的SDS)80μL，蛋白酶K溶液5μL，震荡混匀，室温放置30分钟，加入无水乙醇60mL并放入3D打印特形功能体，使3D打印特形功能体的核酸结合区伸入溶液，手持手柄区，轻轻摇动3D打印特形功能体混匀溶液，10秒后将3D打印特形功能体转移至预置有清洗buffer(75％的酒精)100μL的8联排EP管中，使核酸结合区伸入清洗buffer，手持手柄区，轻轻上下摇动3D打印特形功能体5-10s，重复在清洗buffer中转移2-3次；从清洗buffer中取出3D打印特形功能体，甩去3D打印特形功能体上残留液滴，于37℃鼓风培养箱内干燥2分钟，置于50μL洗脱Buffer(TE)中，使核酸结合区伸入洗脱Buffer，手持手柄区，轻轻摇动30s进行洗脱，得到DNA模板；取得到的DNA模板配置25μL PCR反应液：含如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物(10pM)各0.5μL、ExTaq 0.25μL，10×Ex Buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，DNA模板2μL，去离子水17.25μL；混匀后进行PCR：95℃4min；以95℃30秒，50℃35秒，72℃60秒进行35个循环，再在72℃下延伸10min，得到的PCR产物用于2％的琼脂糖进行凝胶电泳，电泳结束后在紫外光下观测结果，如图3所示。

对结果的说明如下：电泳孔道从左至右为DNA marker，阴性水参照和，本发明提取的微孢子DNA样本；如图3，本发明所提核酸在384bp处出现特异性条带，说明本发明方法从对虾组织中提取的DNA样本具有较高品质，含有足够量的微孢子虫DNA用于PCR扩增。

实施例3

以光敏树脂(PAA)为原料，采用DLP数码影像投射3D打印技术在固定波长的紫外光下发生光固化反应，从而制得如图1a所示规则结构的3D打印特形功能体：3D打印特形功能体为类似于伞状结构，单3D打印特形功能体由核酸结合区1和手柄区2构成，核酸结合区1为圆锥体，手柄区2为圆柱体，核酸结合区1锥底中心位置与手柄区2的一个底面连接。具体包括具有单个核酸结合区1的单体功能体2个，核酸结合区1宽度5mm，高度10mm，核酸结合区1外表面具有螺纹与凹槽结构，手柄区2高度35mm。

取10倍梯度稀释的低浓度微孢子虫PBS悬浮液1#和2#，离心去掉PBS，加入裂解液(100mmol的Tris-HCl、25mmol的EDTA、500mmol的NaCl及1％的SDS)80μL，蛋白酶K溶液5μL，震荡混匀，室温放置30分钟，加入异丙醇60mL并放入3D打印特形功能体，使3D打印特形功能体的核酸结合区伸入溶液，手持手柄区，轻轻摇动3D打印特形功能体混匀溶液，10秒后将3D打印特形功能体转移至预置有清洗buffer(75％的酒精)100μL的8联排EP管中，使3D打印特形功能体的核酸结合区伸入清洗buffer，手持手柄区，轻轻上下摇动3D打印特形功能体5-10s，重复在清洗buffer中转移2-3次；从清洗buffer中取出3D打印特形功能体，甩去3D打印特形功能体上残留液滴，于37℃鼓风培养箱内干燥2分钟，将3D打印特形功能体的核酸结合区伸入50μL PCR反应液中(含如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物(10pM)各1μL、ExTaq 0.5μL，10×Ex Buffer 5μL，dNTPs 4μL，去离子水38.5μL)混匀后将洗脱液用于PCR扩增，95℃4min；以95℃30秒，55℃35秒，72℃60秒进行35个循环，再在72℃下延伸10min，得到的PCR产物用于2％的琼脂糖进行凝胶电泳，电泳结束后在紫外光下观测结果，如图4所示。

结果说明，图4所示，从右至左依次是1#、2#、阴性水参照、marker；1#和2#出现目标条带，说明成功扩增出微孢子虫目标基因。

本实施例说明，当样本浓度低的时候，可以通过PCR直接作为洗脱液，能有效保障微孢子虫的下游PCR检测准确度与灵敏度。

本发明的方法已经通过较好的实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神的范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合来实现被发明技术。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动：如裂解剂、清洗液、洗脱液成分的合理改变，如合理的3D打印特形功能体的形状、大小、表面、内部结构的调整，如PCR类型的合理选择，PCR引物的合理变更、扩增条件的合理调整等，对本领域技术人员来说是显而易见的，它们被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

SEQUENCE LISTING

<110> 辽宁省海洋水产科学研究院

<120> 一种基于3D打印功能体的微孢子虫DNA的提取方法、试剂盒及其应用

<130> 2020

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

gacggaagaa taccacaagg agt 23

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

ctatatgagg gtctcacatc ttgt 24

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

acggctcagt aatgttgc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

tacgactacg gacccttt 18

Claims (10)

1.一种基于3D打印特形功能体的微孢子虫DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)用裂解液对待测微孢子虫样本或微孢子虫宿主样本进行裂解处理；

(2)通过手持或机器持将3D打印特形功能体的核酸结合区伸入步骤(1)所得溶液中，进行DNA的结合；

(3)通过手持或机器持将完成步骤(2)的3D打印特形功能体的核酸结合区转移至清洗液中，进行清洗；

(4)将完成步骤(3)的3D打印特形功能体取出、干燥；

(5)通过手持或者机器持将完成步骤(4)的3D打印特形功能体的核酸结合区置入洗脱液中，进行洗脱，所得洗脱液即为微孢子虫DNA溶液。

所述待测微孢子虫样本包括微孢子虫细胞培养液、微孢子虫虫体，所述微孢子虫宿主样本包括微孢子虫寄生的动物组织、动物血液或动物身体的任意部位。

2.根据权利要求1所述的微孢子虫DNA提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述的裂解液包括：CTAB裂解液、NaHCO₃裂解液、Chelex裂解液、蛋白酶K裂解液或SDS裂解液。

3.根据权利要求2所述的微孢子虫DNA提取方法，其特征在于，所述SDS裂解液包括如下组分：1～10％SDS，0-30μg/mL的蛋白酶K。

4.根据权利要求1所述的微孢子虫DNA提取方法，其特征在于，所述裂解液中加入或不加入RNA消化酶；所述裂解处理的时间为1min-24h，温度为0-100℃。

5.根据权利要求1所述的微孢子虫DNA提取方法，其特征在于，所述3D打印特形功能体为以光敏树脂或热塑性塑料为原料，通过3D打印技术获得的具有“伞”型结构的微元件，包括核酸结合区和手柄区；所述3D打印特形功能体含有1个或至少两个核酸结合区，为至少两个核酸结合区时，手柄区依靠连接区并排连接在一起；所述核酸结合区为圆锥体；所述手柄区为圆柱体或长方体，手柄区的一端与核酸结合区的锥底中心位置连接，构成“伞”型结构；所述核酸结合区表面为平整或不平整微观结构，所述不平整微观结构包括螺纹衬托结构、凹槽结构、多孔结构、凸起结构；所述多孔结构可以是纳米、微米尺寸，多孔结构的形状可以是球体、方体或不规则形状；所述核酸结合区负载或不负载颗粒材料，所述颗粒材料包括无机盐颗粒和金属颗粒，所述无机盐颗粒包括二氧化硅、二氧化钛、二氧化锰；所述核酸结合区有或者没有表面官能团修饰，所述表面官能团包括羟基、羧基、氨基。

6.根据权利要求5所述的微孢子虫DNA提取方法，其特征在于，核酸结合区、手柄区、连接区可以是一体制备，也可以是分体制备；当各部分分体制备时，可以通过粘合进行核酸结合区和手柄区的组装。

7.根据权利要求1所述的微孢子虫DNA提取方法，其特征在于，步骤(2)中DNA的结合，加入或不加入辅助结合溶剂，所述辅助结合溶剂包括异丙醇、无水乙醇中的一种或两者的混合溶液，辅助结合溶剂的体积为裂解液体积的0.6-0.8倍；结合时间为5s-5min；步骤(3)所述清洗为1-3次；所述清洗时间为每次2s-1min；所述清洗液包括70-80％的酒精；步骤(4)所述的干燥在室温或加热下进行，干燥时间为1min-2h；步骤(5)所述洗脱液包括水、PBS、TE缓冲液和下游PCR反应液，洗脱时间为5s-5min。

8.一种基于3D打印特形功能体的微孢子虫DNA提取方法的试剂盒，其特征在于，包括如下组分：

(1)3D打印特形功能体；

(2)裂解液；

(3)蛋白酶K；

(4)RNA消化酶

(5)清洗液；

(6)洗脱液；

(7)操作说明书；

(8)固定架；

所述3D打印特形功能体为以光敏树脂或热塑性塑料为原料，通过3D打印技术获得的由核酸结合区和手柄区组成的、具有“伞”型结构的微元件，并通过连接区将若干“伞”型结构的微元件并排连接；所述裂解液包括CTAB裂解液、NaHCO₃裂解液、Chelex裂解液、蛋白酶K裂解液或SDS裂解液中的一种；所述清洗液包括70-80％的酒精；所述洗脱液包括水、PBS、TE缓冲液和下游PCR反应液中的一种；所述固定架为可以固定、排布若干个3D打印特形功能体的结构。

9.基于3D打印特形功能体的微孢子虫DNA提取方法的应用，其特征在于，所述应用为根据权利要求1-7中任一项所述的方法提取微孢子虫DNA，再结合PCR扩增技术鉴定动植物宿主中的微孢子虫病原中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增技术包括常规PCR、巢式PCR、重组酶聚合酶扩增、环介导等温扩增、实时荧光定量PCR、反转录PCR。

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