CN111607489B - 一种基于3d打印微元件的核酸提取系统和方法 - Google Patents

一种基于3d打印微元件的核酸提取系统和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111607489B
CN111607489B CN202010585511.XA CN202010585511A CN111607489B CN 111607489 B CN111607489 B CN 111607489B CN 202010585511 A CN202010585511 A CN 202010585511A CN 111607489 B CN111607489 B CN 111607489B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
micro
component
printing
area
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010585511.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN111607489A (zh
Inventor
姜晓滨
李蒙航
李佩佩
袁志杰
贺高红
肖武
李祥村
吴雪梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian University of Technology
Original Assignee
Dalian University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian University of Technology filed Critical Dalian University of Technology
Priority to CN202010585511.XA priority Critical patent/CN111607489B/zh
Publication of CN111607489A publication Critical patent/CN111607489A/zh
Priority to US17/914,974 priority patent/US20230146223A1/en
Priority to PCT/CN2021/100752 priority patent/WO2021259141A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111607489B publication Critical patent/CN111607489B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y80/00—Products made by additive manufacturing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C64/00—Additive manufacturing, i.e. manufacturing of three-dimensional [3D] objects by additive deposition, additive agglomeration or additive layering, e.g. by 3D printing, stereolithography or selective laser sintering
    • B29C64/10—Processes of additive manufacturing
    • B29C64/106—Processes of additive manufacturing using only liquids or viscous materials, e.g. depositing a continuous bead of viscous material
    • B29C64/124—Processes of additive manufacturing using only liquids or viscous materials, e.g. depositing a continuous bead of viscous material using layers of liquid which are selectively solidified
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29K—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES B29B, B29C OR B29D, RELATING TO MOULDING MATERIALS OR TO MATERIALS FOR MOULDS, REINFORCEMENTS, FILLERS OR PREFORMED PARTS, e.g. INSERTS
    • B29K2033/00—Use of polymers of unsaturated acids or derivatives thereof as moulding material
    • B29K2033/04—Polymers of esters
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y10/00—Processes of additive manufacturing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P10/00—Technologies related to metal processing
    • Y02P10/25—Process efficiency

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于3D打印的微元件的核酸提取系统和方法，属于核酸提取技术领域。一种基于3D打印微元件的核酸提取系统，通过3D打印技术制备具有“伞”型结构的微元件，所述微元件包括核酸结合区和手柄区；所述核酸结合区的材质包括光敏树脂和热塑性塑料。一种基于3D打印微元件的核酸提取方法，通过在含有目标核酸的溶液、清洗液和洗脱液之间移动3D打印微元件，进行核酸的结合、清洗与洗脱。本发明具有更快的分离速度、更简单的操作过程和更稳定的分离效果，通过数个单体3D打印微元件并排连接使用实现高通量，并具有自动化应用前景，具有高度的调整灵活性，成本低、使用灵活度高等优点。

Description

一种基于3D打印微元件的核酸提取系统和方法
技术领域
本发明属于核酸提取技术领域，特别地涉及一种基于3D打印的微元件的核酸提取系统和方法。
背景技术
基因是遗传的主要功能单位，它们所包含的核酸碱基的特定序列能够编码生物体功能所需的大部分蛋白质。作为基因的载体，基于核酸的体外分子检测技术，成为强大的生物学研究工具。从生物体中提取核酸，需要将核酸从含有蛋白质、多糖和脂肪等多种生物大分子的复杂体系中进行分离、纯化，是PCR、测序等生物学分析的先决条件。核酸提取的质量，显著影响后续分析的准确性和灵敏度。生物样本中残留的抑制性成分(血红素、球蛋白等成分)及分离、纯化过程中残留的有机物和盐分，是影响PCR灵敏性和分析稳健性的重要因素。
传统的核酸的分离方法是基于有机溶剂萃取的液相分离，如Chomczynski’s法，碱性裂解法、酚氯抽提方法、溴化乙锭-氯化钙梯度离心法等。液相分离方法虽然有效，但存在着很大的局限性：所需样品量大、分离时间长、易受污染、降解率高。另外，液相分离方法中有机溶剂的残留显著增加了PCR抑制剂的残留风险。为了提高提取核酸样品的纯度与浓度，核酸的提取方法也在不断更新，目前固相萃取核酸的方法受到更多学者的青睐。固相萃取核酸的方法主要是采用一些对核酸有结合作用的聚合物材料，在一定条件下结合核酸然后又在适当条件下脱附，实现核酸的分离。与液相萃取方法相比，固相萃取方法减少了有机溶剂的使用，操作相对简便，分离时间短，样品在实验过程中不易污染与降解，提取的核酸无论是浓度还是纯度都相对较高。
固相核酸分离方法主要是基于一些对核酸有吸附作用的聚合物材料。随着磁性材料的发展，以磁性颗粒作为核酸结合载体的磁力分离，因具备与核酸结合后能够在外加磁场快速移动的特点，成为如今主要的核酸固相分离手段。磁力分离虽然避免传统核酸分离过程中的繁琐离心操作，市售商业化磁力分离也通常只需要15min左右(有文献报道为14.5min：Zou Y,Mason MG,Wang Y,Wee E,Turni C,Blackall PJ,et al.(2017)Nucleicacid purification from plants,animals and microbes in under 30seconds.PLoSBiol 15(11):e2003916.)，且具有下游高通量和自动化应用的前景，但是，磁力分离难以避免多次移液操作，需要依赖多联移液器，手动操作时，容易产生误差。同时，有报道指出，磁力分离中普遍存在颗粒材料解吸核酸困难、DNA提取效率偏低等问题，限制了磁力分离的发展与应用。虽然有报道指出，通过将磁性纳米粒子与DNA的复合物直接作为PCR模板可以避免这个问题，但磁性颗粒对PCR扩增过程具有强抑制作用，洗脱过程不可避免。此外，磁性纳米颗粒固有的团聚、沉降等现象，在高通量平行处理批量样本时，在很大程度上会影响分离过程的稳定性。磁力分离中，因为纳米颗粒沉降现象，核酸与磁性纳米颗粒不能充分结合而影响提取产率；因为纳米颗粒团聚则可能会引起清洗不完全与杂质包裹，影响磁力分离的提取质量。
相比磁力分离，基于非磁性材料的核酸固相分离发展较为缓慢。现行非磁力固相分离多需要通过过滤、离心、移液等繁琐操作才能将结合有核酸的非磁性固相材料从裂解液中分离出来，相比于借助外加磁场即能快速移动并实现核酸分离的磁力分离而言，往往需要更多、更密集的人力操作，效率和通量都较为低下，下游应用受阻，是制约非磁力固相分离发展和应用的关键瓶颈。
3D打印技术作为近年来快速发展的界面材料构筑技术，借助其在亚毫米，微米尺度的高加工精度的特点，能够实现灵活的结构设计、优异的成型效果的目标。
发明内容
本发明利用3D打印加工精度高的优势，针对非磁力固相分离中普遍存在依赖过滤、离心、移液等繁琐操作、通量低且难以实现自动化的瓶颈问题，本发明提供一种基于3D打印微元件的核酸提取系统和方法。
本发明的技术方案：
一种基于3D打印微元件的核酸提取系统，所述基于3D打印微元件的核酸提取系统为使用3D打印技术制备的具有“伞”型结构的核酸提取微元件，包括核酸结合区和手柄区，所述核酸结合区的材质包括光敏树脂或热塑性塑料。
3D打印微元件通过软件对微元件进行结构的设计、绘制及设置，优选的，采用3DMAX软件进行结构的设计、绘制及设置。
进一步地，上述技术方案中，所述的3D打印技术包括：FDM熔融沉积成型3D打印技术、SLA光固化快速成型3D打印技术、DLP数码影像投射3D打印技术、SLS选择性激光烧结3D打印技术。
进一步地，上述技术方案中，所述光敏树脂包括聚丙烯酸PAA、聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA、聚碳酸酯。
进一步地，上述技术方案中，所述3D打印微元件的核酸提取系统包括一个或至少两个单体3D打印微元件；所述的3D打印微元件由至少两个单体3D打印微元件组成时，至少两个单体3D打印微元件远离核酸结合区的手柄区端并排连接在连接区上；优选的，将8个单体3D打印微元件的手柄顶端通过连接区并排连接，形成如图3所示的匹配8联排管使用的特形微元件；或者进一步，将96个或384个单体3D打印微元件的手柄区端连接、排布在连接区上，匹配96孔板和384孔板使用。
所述单体3D打印微元件由核酸结合区和手柄区组成，核酸结合区包括a型、b型、c型、d型、e型、f型，其中a型为圆锥体状，圆锥体底面中心位置与手柄区结合；b型为类圆锥体状，圆锥体顶点圆滑处理，圆锥体底面中心位置与手柄区结合；c型为圆柱体状与半球体状结合，圆柱体直径与半球体直径相同，圆柱体一端底面中心位置与手柄区结合，另一端底面与半球体最大直径面结合；d型为半球体状，半球体最大直径面的中心位置与手柄区结合；e型为圆柱体与圆锥体结合，圆柱体的直径与圆锥体底面直径相同，圆柱体一端中心位置与手柄区结合，另一端与圆锥体底面结合；f型为圆柱体与类圆锥体结合，圆柱体的直径与类圆锥体的底面直径相同，圆柱体一端中心位置与手柄区结合，另一端与类圆锥体底面结合，类圆锥体顶点圆滑化处理。
所述核酸结合区的尺寸随匹配的目标EP管的尺寸变化，优选的，匹配0.2ml EP管使用的微元件，核酸结合区的尺寸为：2-5mm(宽)×5-20mm(高)；匹配0.5ml EP管使用的微元件，核酸结合区的尺寸为：2-6mm(宽)×5-26mm(高)；匹配1.5/2ml EP管使用的微元件，核酸结合区3-9mm(宽)×5-35mm(高)；核酸结合区底部为半球状的圆柱体，优选的，匹配1.5/2ml EP管使用的，半球状的高度为2-4mm，直径为7-8mm，圆柱体部分直径为7-8mm，高度为0-10mm。
进一步地，上述技术方案中，所述核酸结合区的表面光滑或粗糙，且具备或不具备微观结构；所述微观结构包括螺纹结构、凹槽结构、多孔结构、孔道结构、粗糙纹路、凸起结构中的一种或多种结构；所述螺纹结构和凹槽结构可以设置0个或至少1个；所述粗糙纹路可以是任意形状；所述多孔结构、孔道结构和凸起结构包括纳米尺寸、微米尺寸；凹槽结构和凸起结构的形状可以是任何形状，包括球体、正方体、长方体、梯形或不规则形状；所述微观结构可以分布在核酸结合区任意部位，当微观结构种类大于1个时，可以以任何方式组合、排布。
进一步地，上述技术方案中，所述手柄区的形状包括圆柱体、立方体，所述3D打印微元件的核酸提取系统匹配EP管使用，当3D打印微元件的核酸提取系统置于EP管内后，手柄区露出EP管部分高度不低于3mm；优选的，匹配单个0.2-2ml离心管使用的，微元件的尺寸：手柄b的高度为5mm-40mm；圆柱体的直径为2-5mm，长方体的长度为2-5mm，宽度为1-5mm。所述手柄区的材质包括光敏树脂或热塑性塑料，手柄区与核酸结合区的材质相同或不同。
进一步地，上述技术方案中，所述连接区的材质可以是任意材质和任意结构，当所述连接区为通过3D打印技术完成时，材质包括光敏树脂或热塑性塑料，和核酸结合区、手柄区相同或不同；当所述连接区不依赖3D打印时，为可以固定、排布若干个3D单体3D打印微元件的、有一定刚性的结构。
所述连接区、手柄区、核酸结合区通过3D打印技术一体制备或者分体制备，当为分体制备时，通过粘合组装或者卡扣方式组装。
进一步地，上述技术方案中，所述核酸结合区上负载或不负载功能基团或颗粒材料，所述功能基团包括氨基、羧基、羟基；所述颗粒材料包括无机颗粒材料或金属颗粒材料，所述无机颗粒材料包括二氧化硅、二氧化钛、二氧化锰、四氧化三铁、氧化石墨烯、碳等；所述金属颗粒材料包括金、银等。当所述核酸结合区负载功能基团或颗粒材料时，通过在核酸结合区的材料中混合具有所述功能基团的化合物或所述颗粒材料，通过3D打印技术制备。
本发明还提供了一种基于3D打印微元件的核酸提取系统的核酸提取方法，包括如下步骤：
(1)将3D打印微元件的核酸结合区伸入含有目标核酸的溶液中，进行核酸的结合；
(2)通过手持或机器持完成步骤(1)的3D打印微元件的手柄区或连接区，移动3D打印微元件，使3D打印微元件的核酸结合区伸入清洗液中，进行核酸的清洗；
(3)将完成步骤(2)的3D打印微元件取出、进行干燥；
(4)通过手持或机器持将完成步骤(3)的3D打印微元件的手柄区或连接区，使3D打印微元件的核酸结合区置入洗脱液中，进行核酸的洗脱，所得洗脱液即为目标核酸提取液。
进一步地，上述技术方案中，步骤(1)中，所述将3D打印的微元件放入含有目标核酸的溶液中，所述目标核酸可以是RNA、基因组DNA或质粒DNA的一种或多种混合物；所述含有目标核酸的溶液，可以是单一成分或者多成分的任意来源的任意溶液、使用裂解液对生物样本进行裂解而来的体系、或含有目标核酸的混合溶液或者单一成分溶液。
所述裂解液是指能将样本中核酸释放到溶液中的缓冲液，所述裂解液包括：CTAB裂解液、NaHCO3裂解液、Chelex裂解液、蛋白酶K裂解液、SDS裂解液或Trizol裂解液等。所述CTAB裂解液包括：1-3wt％的CTAB、0.5～5M NaCl、0.01～0.05M EDTA、0.05～0.5M Tris-HCl、0.05～0.5％的巯基乙醇，所述NaHCO3裂解液包括：0.05-1.00M的NaHCO3、0.5～10％SDS，所述Chelex裂解液包括：0.5～20％的Chelex-100和0.2～5M的DTT，所述蛋白酶K裂解液包括：20～500mmol的Tris-HCl、10～50mmol的EDTA、100～1000mmol的NaCl，0.1～10％的SDS，和5～30μg/mL的蛋白酶K；所述SDS裂解液包括：0.5～20％的SDS，0～30μg/mL的蛋白酶K；所述Trizol裂解液为包含Trizol的市售或者自主配置的溶液。所述裂解液中加入或不加入RNA消化酶或者DNA消化酶，所述裂解包括震荡、混匀操作。所述裂解处理时间为1min-24h，处理温度为-20～100℃。
所述生物样本包括动物样本或植物样本，包括血液、动植物组织或者混合物；所述血液包括液体全血、血细胞溶液、干血斑样本；所述动物组织可以动物身体的任意部位和任意器官；所述植物组织包括植物的任意部位的任意组分。
步骤(1)所述进行核酸的结合，具体为，将3D打印微元件的结合区伸入目标核酸的混合溶液中，加入或不加入辅助结合溶剂，所述辅助结合溶剂包括异丙醇、无水乙醇的一种或两者的混合溶液，所述辅助结合溶剂的体积为裂解液体积的0.6～0.8倍；结合时间为5s～24h；
步骤(2)所述的进行核酸的清洗，进行1-5次；清洗时间为每次2s-1min；
步骤(3)所述的干燥可在室温或加热下进行，干燥时间为1min-24h；
步骤(4)所述的洗脱液是能将结合在3D打印微元件上的核酸脱离的溶液，包括水、PBS缓冲液、TE缓冲液和下游PCR反应液；洗脱时间为5s-5min；。
发明有益效果
1.本发明首次公开了一种3D打印的微元件用于核酸提取的系统和方法，是一种非磁力核酸固相提取技术。固相核酸分离技术中，磁力分离被普遍认为快速且具有高通量，通常只需要15min左右。而本发明所述核酸提取方法可以获得比磁力分离更快的分离速度、更简单的操作过程和更稳定的分离效果。利用3D打印微元件进行核酸的分离，30s内可以完成核酸的结合与清洗，且不需要移液、离心、过滤等操作；同时，采用3D打印微元件完全不存在因磁珠颗粒沉降、聚集等问题引起的核酸结合不充分和杂质包裹等问题，有效保障了核酸提取的稳定性和质量；本发明突破了现行核酸固相提取中的瓶颈问题，是本发明重要的创新点之一。
2.本发明公开的3D打印微元件的核酸提取系统具有高通量、高效率优势。当3D打印微元件包含8个、96个、甚至384个匹配0.2mL离心管使用的单体3D打印微元件时，通过连接区的连接、排布可以匹配8联排管、96孔板和384孔板使用，平行完成多个核酸样本的分离，显著提高提取通量和效率，是本发明的另一个创新点。
3.本发明公开的基于3D打印微元件的核酸提取系统和方法具有自动化应用前景。本发明方法不依赖离心、移液等繁琐操作，通过设计自动化设备代替人工，通过机器持微元件在不同溶液之间转移，即可以实现自动化核酸提取，是本发明的另一个创新点。
4.本发明公开的基于3D打印微元件的核酸提取系统和方法具有高度的调整灵活性。首先，可以依据下游生物分子技术应用的不同需求，通过设置参数，得到不同尺寸、不同形状的微元件，匹配不同型号、规格的离心管使用，灵活满足应用需求；其次，通过调整微元件核酸结合区的结构设计、官能团修饰、颗粒负载等，可以调整3D打印微元件的核酸分离效率及选择性。
5.本发明公开的基于3D打印微元件的核酸提取系统和方法，成本低、使用灵活度高。3D打印原材料便宜、易得，打印过程方便、快速，能显著降低了经济成本；整个核酸提取过程能够在1m2的操作环境下完成，节约空间，且不依赖电器、移液器等装备，装备需求低、使用灵活性高。
附图说明
图1为本发明优选的3D打印微元件的结构示意图。
图2为本发明实施例1制备的微元件的结构示意图；图2(a)至图2(h)分别为3D打印微元件1-8。
图3为本发明实施例4的3D打印特形微元件的结构示意图。
图4为本发明实施例4的琼脂凝胶电泳图；泳道1为阴性参照，泳道2-9为8例样本，M为DL2000 marker。
图中，1、核酸结合区；2、手柄区；3、连接区。
具体实施方式
以下结合技术方案，进一步说明本发明的内容。应该指出，以下说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语与本发明所属技术领域人员通常理解的含义相同。
本发明实施案例所涉及的材料、实际和实验设备，如无特别说明，均符合相关化工、生物技术领域的市售产品。
本发明实施例所涉及的引物均由委托生物工程公司合成，具体引物信息如下：
SEQ ID NO:1：
5’-actgggataatacgatagaag-3’
SEQ ID NO:2：
5’-gtgcgttaggattagttatgt-3’
实施例1
采用3D MAX软件进行结构的设计、绘制及设置，以光敏树脂聚丙烯酸(PAA)为原料，采用DLP数码影像投射3D打印技术在400-800nm波长下进行光固化反应，从而制得3D打印微元件，结构示意图如图2(a)至2(h)所示。其中，图2(a)-图2(f)所示的3D打印微元件的手柄区为圆柱体，直径分别为3mm、3mm、5mm、4mm、4mm、6mm；高度分别为1.5cm，3.0cm，12.0cm，2.0cm，4.0cm，12cm；图2(g)-图2(h)所示的3D打印微元件的手柄区为立方柱，图2(g)所示的3D打印微元件的手柄区的长宽均为5mm，高度为6.0cm，图2(h)所示的3D打印微元件的手柄区的长宽均为6mm，高度12.0cm。图2(a)至2(h)所示的3D打印微元件的核酸结合区的直径分别为0.38cm，0.4cm，1.2cm，0.6cm，0.6cm，2.0cm，1.0cm，2.0cm，高度分别为0.8cm，1.0cm，2.0cm，1.0cm，1.0cm，2.5cm，1.0cm，2.5cm。图2(a)、图2(c)、图2(d)-图2(g)所示的3D打印微元件的核酸结合区具有螺旋结构，分别为8层、4层、6层、10层、3层和5层；图2(b)-图2(f)所示的3D打印微元件的核酸结合区具有凹槽结构，分别为6个、8个、3个、4个、20个；图2(h)所示的3D打印微元件的核酸结合区具有多孔结构。
结果说明：图2(a)至2(h)所示的3D打印微元件分别能放入0.2ml锥形离心管、0.5ml锥形离心管、15ml锥形离心管、1.5ml锥形离心管、2.0ml锥形离心管、50ml圆底离心管、5ml圆底离心管和50ml锥形离心管中。
本实例使用PAA作为原材料，原料简单易得，3D打印过程简单、快速，能显著降低了经济成本；打印的微元件，可以依据下游生物分子技术应用的不同需求，通过设置参数，得到不同尺寸、不同形状的微元件，匹配不同型号、规格的离心管使用，灵活满足应用需求，具有高度的调整灵活性。
实施例2
取蚕蛹部分组织置于1.5mL的EP管中。在EP管中加入蛋白酶K裂解液(100mmol的Tris-HCl、25mmol的EDTA、500mmol的NaCl及1％的SDS)200μL，蛋白酶K溶液5μL，震荡混匀，对提取的组织样本进行裂解，室温放置30分钟，加入无水乙醇150μL并放入图2(d)所示的3D打印微元件，使3D打印微元件的核酸结合区伸入溶液，手持或机械持手柄区，轻轻摇动3D打印微元件混匀溶液，10秒后将3D打印微元件转移至预置有清洗buffer 200μL的EP管中，使3D打印微元件的核酸结合区伸入清洗buffer，手持或机械持手柄区，轻轻摇动3D打印微元件5s，再重复在清洗buffer中转移2次；从清洗buffer中取出3D打印微元件，甩去3D打印微元件上残留液滴，于37℃鼓风培养箱内干燥1分钟，将3D打印微元件的核酸结合区置于预置有50μL洗脱Buffer的1.5mL的EP管中，轻轻摇动30s进行洗脱。
取洗脱液3uL，采用紫外分光光度计测试3次，所提取核酸样品的260/230为1.610～1.728，260/280为1.817～1.902，浓度为42.32-48.274ng/μL。
对结果的说明，本发明的3D打印微元件从动物组织样本的裂解液中提取DNA样品的质量较好，几乎没有蛋白质、盐、多糖等的污染。
本实施例说明采用微元件进行核酸提取，25s就完成了核酸的结合与清洗，且不需要移液、离心、过滤等操作，方便快速、提取质量好；
实施例3
取大肠杆菌培养液4.5ml于5ml EP管中，离心去上清，加入500ml无菌重悬液(50mmol/L葡萄糖，PH＝8.0、25mmol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)，PH8.0、10mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸))悬浮菌体，再加入1mL裂解液(0.2M NaOH,1％SDS)，上下颠倒离心管5次混匀，持续2分钟，直到溶液变粘稠但清澈可见，再加入750μL中和液(5mol/L乙酸钾，5mol/L冰乙酸)，立即上下颠倒离心管数次，至溶液出现絮状物沉淀，12000r/min离心10分钟，小心吸取上清2mL，转移到另一个新的5mL离心管中，得到含有质粒DNA的溶液。
在上述含有质粒DNA的溶液中加入无水乙醇1500μL并放入图2(g)所示的3D打印微元件，使3D打印微元件的核酸结合区伸入溶液，手持手柄区，轻轻摇动3D打印微元件混匀溶液，25-30秒后将3D打印微元件转移至预置有清洗buffer(75％的酒精)2000μL的EP管中，使3D打印微元件的核酸结合区伸入清洗buffer，手持手柄区，轻轻摇动微元件10-15s，重复在清洗buffer中转移2-3次；从清洗buffer中取出3D打印微元件，甩去3D打印微元件上残留液滴，室温风干15min，将3D打印微元件的核酸结合区置于100μL洗脱Buffer中，轻轻摇动30s进行洗脱。
所提质粒DNA采用紫外分光光度计测试3次，质粒DNA的260/230为1.723～1.789，260/280为1.857～1.931，浓度为178.30～181.464ng/μL。
对结果的说明，本发明的3D打印微元件从细菌中提取质粒DNA样品的质量高，无污染。质粒DNA分离过程不需要移液、离心、过滤等操作，方便快速、提取质量好。
实施例4
(1)特形微元件(由八个单体3D打印微元件通过连接区连接组成)的制备
采用3D MAX软件进行结构的设计、绘制及设置，以光敏树脂(PAA)为原料，采用DLP数码影像投射3D打印技术在400-800nm波长下发生光固化反应，从而制得如图3所示结构的3D打印微元件，3D打印微元件核酸结合区高度9mm，直径3.8mm，手柄区高度21mm，能放入8联排管中使用。
(2)目标核酸溶液的准备
取冷冻花蚬子1例，取重量约500mg的组织块直接放入高温高压消毒后的研钵中，加入液氮迅速研磨，待组织变软，再加入少量的液氮，再研磨，重复三次。然后，取组织样品约150-200mg加入2ml Trizol，用电动均浆器充分均浆1-2min。在12000r/min下离心五分钟，弃沉淀，加入400μL的氯仿，盖紧离心管，用手振荡混匀15s，室温放置10min。然后，在4℃下以12000g离心15min，转移水相至新的EP管中，获得含有RNA的溶液。
(3)特形微元件高通量、快速分离RNA
各取80μL RNA溶液于8联排管中各反应孔，放入特形微元件，使核酸结合区完全伸入溶液中，并分别加入异丙醇55μL，轻轻摇动特形微元件混匀溶液，5-10秒后将特形微元件转移至预置有清洗buffer(75％的酒精)200μL的EP管中，轻轻摇动特形微元件5-10s，重复在清洗buffer中转移1次；从清洗buffer中取出特形微元件，甩去特形微元件上残留液滴，室温风干5min，置于40μL洗脱Buffer中，轻轻摇动30s进行洗脱。各洗脱液采用紫外分光光度计测试RNA浓度在41-52ng/μL间，A260/230介于1.703～1.920，260/280介于1.974～2.133。
(4)所提RNA的下游应用
8联排管中各取7μL液体，通过反转录试剂盒(Takara，Code No.RR047A)按照操作指南制备cDNA，各取1μL产物作为PCR扩增模板，配置PCR反应液：每25μL体系含如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的引物(10pM)各0.5μL、模板1μL、ExTaq 0.25μL，10×ExBuffer2.5μL，dNTPs 2μL，去离子水17.25μL,无菌蒸馏水作为阴性参照模板。PCR条件为95℃4min；以95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃60秒进行35个循环，再在72℃下延伸5min，得到的PCR产物用2％的琼脂糖进行凝胶电泳，电泳结束后在紫外光下观测结果，如图4所示。
对结果的说明，如图4，从左至右分别为阴性参照、marker和8例样本PCR扩增产物,8例样本均出现目标条带，阴性参照无目标条带出现，说明8例用作模板的溶液中均含有目标核酸。
本实施例说明，通过3D打印微元件分离的RNA质量好，污染少，能充分满足下游分子技术实验要求。
本实施例同时还说明，采用特形微元件进行核酸提取，可以同时提取目标核酸，通量高，有效突破了非磁力固相分离依赖多步离心、移液等繁琐操作而分离通量低的瓶颈，同时，有利于实现自动化。
实施例5
以光敏树脂(PAA)为原料，采用DLP数码影像投射3D打印技术在400-800nm波长下进行光固化反应，制备立方体条状微元件：宽2mm，厚1mm，高4cm，立方体条状微元件无特殊微观结构设计。
取动物组织(贝类组织)，加入裂解液(100mmol的Tris-HCl、25mmol的EDTA、500mmol的NaCl及1％的SDS)和5μL蛋白酶K，55℃温浴2h后，分别取100μL加入两个0.5mL的离心管中，编号1#、2#，分别加入RNA消化酶10μL，室温静置30min，得到无RNA的含有目标DNA的溶液。
1#管中加入无水乙醇70μL并放入实施例1中制备的如图2(b)所示的3D打印微元件，2#管中加入无水乙醇70μL并放入立方体条状微元件，轻轻摇动微元件混匀溶液,15-20秒后将微元件转移至预置有清洗buffer(75％酒精)100μL的EP管中，轻轻摇动微元件15-20s，重复在清洗buffer中转移3次；从清洗buffer中取出微元件，甩去微元件上残留液滴，于37℃鼓风培养箱内干燥3分钟，置于40μL洗脱Buffer中，轻轻摇动30s进行洗脱。
所提核酸采用紫外分光光度计测试DNA浓度，1#所提取核酸样品的260/230在1.864，260/280在1.902，浓度在90.547ng/μL。2#所提取核酸样品的260/230在1.616，260/280在1.736，浓度在21.233ng/μL。
对结果的说明，本发明能快速、有效、高品质的分离DNA，分离、纯化的DNA污染低、纯度高。同时，本发明优选的微元件，尤其是含有微观结构的微元件与其他3D打印微元件相比，具有更高的核酸分离能力。
本发明的技术已经通过较好的实施案例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神的范围内对本文所述的系统与方法进行改动或适当变更与组合来实现被发明技术。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动：如合理的3D打印微元件的形状、大小、表面及结构的调整、改变与组合，如合理的裂解液、清洗液及洗脱液的成分调整、操作时间的延长与缩短及使用温度的合理变化等，对本领域技术人员来说是显而易见的，它们被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (9)

1.一种基于3D打印微元件的核酸提取系统，其特征在于，所述基于3D打印微元件的核酸提取系统为使用3D打印技术制备的具有“伞”型结构的核酸提取微元件，包括核酸结合区和手柄区，所述核酸结合区的材质为光敏树脂；
核酸结合区包括a型、b型、c型、d型、e型、f型，其中a型为圆锥体状，圆锥体底面中心位置与手柄区结合；b型为类圆锥体状，圆锥体顶点圆滑处理，圆锥体底面中心位置与手柄区结合；c型为圆柱体状与半球体状结合，圆柱体直径与半球体直径相同，圆柱体一端底面中心位置与手柄区结合，另一端底面与半球体最大直径面结合；d型为半球体状，半球体最大直径面的中心位置与手柄区结合；e型为圆柱体与圆锥体结合，圆柱体的直径与圆锥体底面直径相同，圆柱体一端中心位置与手柄区结合，另一端与圆锥体底面结合；f型为圆柱体与类圆锥体结合，圆柱体的直径与类圆锥体的底面直径相同，圆柱体一端中心位置与手柄区结合，另一端与类圆锥体底面结合，类圆锥体顶点圆滑化处理；
所述核酸结合区的表面光滑或粗糙，且具备或不具备微观结构；
所述3D打印微元件的核酸提取系统包括一个或至少两个单体3D打印微元件；所述的3D打印微元件由至少两个单体3D打印微元件组成时，至少两个单体3D打印微元件远离核酸结合区的手柄区端并排连接在连接区上。
2.根据权利要求1所述的基于3D打印微元件的核酸提取系统，其特征在于，所述微观结构包括螺纹结构、凹槽结构、多孔结构、孔道结构、粗糙纹路、凸起结构中的一种或多种结构；所述螺纹结构和凹槽结构可以设置0个或至少1个；所述粗糙纹路可以是任意形状；所述多孔结构、孔道结构和凸起结构包括纳米尺寸、微米尺寸；凹槽结构和凸起结构的形状可以是任何形状，包括球体、正方体、长方体、梯形或不规则形状；所述微观结构可以分布在核酸结合区任意部位，当微观结构种类大于1个时，可以以任何方式组合、排布。
3.根据权利要求1所述的基于3D打印微元件的核酸提取系统，其特征在于，所述手柄区的形状包括圆柱体、立方体，所述3D打印微元件的核酸提取系统匹配EP管使用，当3D打印微元件的核酸提取系统置于EP管内后，手柄区露出EP管部分高度不低于3mm；所述手柄区的材质包括光敏树脂或热塑性塑料，手柄区与核酸结合区的材质相同或不同。
4.根据权利要求1所述的基于3D打印微元件的核酸提取系统，其特征在于，所述连接区、手柄区、核酸结合区通过3D打印技术一体制备或者分体制备，当为分体制备时，通过粘合组装或者卡扣方式组装。
5.根据权利要求1所述的基于3D打印微元件的核酸提取系统，其特征在于，所述核酸结合区上负载或不负载功能基团或颗粒材料，所述功能基团包括氨基、羧基、羟基；所述颗粒材料包括无机颗粒材料或金属颗粒材料，所述无机颗粒材料包括二氧化硅、二氧化钛、二氧化锰、四氧化三铁、氧化石墨烯、碳；所述金属颗粒材料包括金和银。
6.权利要求1-5中任一项所述的基于3D打印微元件的核酸提取系统的核酸提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将3D打印微元件的核酸结合区伸入含有目标核酸的溶液中，进行核酸的结合；
(2)通过手持或机器持完成步骤(1)的3D打印微元件的手柄区或连接区，移动3D打印微元件，使3D打印微元件的核酸结合区伸入清洗液中，进行核酸的清洗；
(3)将完成步骤(2)的3D打印微元件取出、进行干燥；
(4)通过手持或机器持将完成步骤(3)的3D打印微元件的手柄区或连接区，使3D打印微元件的核酸结合区置入洗脱液中，进行核酸的洗脱，所得洗脱液即为目标核酸提取液。
7.根据权利要求6所述的核酸提取方法，其特征在于，步骤(1)所述的目标核酸包括RNA、基因组DNA或质粒DNA的一种或多种混合物；含有目标核酸的溶液包括单一成分或者多成分的任意来源的溶液、使用裂解液对生物样本进行裂解而来的体系、或含有目标核酸的混合溶液或者单一成分溶液。
8.根据权利要求7所述的核酸提取方法，其特征在于，所述生物样本包括动物样本或植物样本，包括血液、动植物组织或者混合物；所述血液包括液体全血、血细胞溶液、干血斑样本；所述动物组织可以是动物身体的任意部位和任意器官；所述植物组织包括植物的任意部位的任意组分。
9.根据权利要求6所述的核酸提取方法，其特征在于，所述裂解液包括：CTAB裂解液、NaHCO3裂解液、Chelex裂解液、蛋白酶K裂解液、SDS裂解液或Trizol裂解液；所述SDS裂解液包括：0.5～20％的SDS，0～30μg/mL的蛋白酶K；所述裂解液中加入或不加入RNA消化酶或者DNA消化酶；所述裂解处理时间为1min-24h，处理温度为-20～100℃；
步骤(1)所述进行核酸的结合，具体为，将3D打印微元件的结合区伸入目标核酸的混合溶液中，加入或不加入辅助结合溶剂，所述辅助结合溶剂包括异丙醇、无水乙醇的一种或两者的混合溶液，所述辅助结合溶剂的体积为裂解液体积的0.6～0.8倍；结合时间为5s～24h；
步骤(2)所述的进行核酸的清洗，进行1-5次；清洗时间为每次2s-1min；
步骤(3)所述的干燥可在室温或加热下进行，干燥时间为1min-24h；
步骤(4)所述的洗脱液是能将结合在3D打印微元件上的核酸脱离的溶液，包括水、PBS缓冲液、TE缓冲液和下游PCR反应液；洗脱时间为5s-5min。
CN202010585511.XA 2020-06-23 2020-06-23 一种基于3d打印微元件的核酸提取系统和方法 Active CN111607489B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010585511.XA CN111607489B (zh) 2020-06-23 2020-06-23 一种基于3d打印微元件的核酸提取系统和方法
US17/914,974 US20230146223A1 (en) 2020-06-23 2021-06-18 Nucleic acids extraction system and method based on 3d-printed microdevice
PCT/CN2021/100752 WO2021259141A1 (zh) 2020-06-23 2021-06-18 一种基于 3d 打印微元件的核酸提取系统和方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010585511.XA CN111607489B (zh) 2020-06-23 2020-06-23 一种基于3d打印微元件的核酸提取系统和方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111607489A CN111607489A (zh) 2020-09-01
CN111607489B true CN111607489B (zh) 2024-04-05

Family

ID=72199116

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010585511.XA Active CN111607489B (zh) 2020-06-23 2020-06-23 一种基于3d打印微元件的核酸提取系统和方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230146223A1 (zh)
CN (1) CN111607489B (zh)
WO (1) WO2021259141A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111647596A (zh) * 2020-06-23 2020-09-11 辽宁省海洋水产科学研究院 一种基于3d打印功能体的微孢子虫dna的提取方法、试剂盒及其应用
CN111778236A (zh) * 2020-06-23 2020-10-16 辽宁省海洋水产科学研究院 基于3d打印特形功能体的贝类基因组dna提取方法、试剂盒及其应用
CN111607489B (zh) * 2020-06-23 2024-04-05 大连理工大学 一种基于3d打印微元件的核酸提取系统和方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110945124A (zh) * 2017-03-14 2020-03-31 Aj耶拿检疫有限公司 用于从样品中富集细胞并且后续从这些细胞中分离核酸的方法
CN111004719A (zh) * 2019-12-03 2020-04-14 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 核酸检测模块、检测单元及检测系统

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105296327B (zh) * 2015-10-21 2017-10-27 陈辉 一种核酸提取装置及其提取方法
CN111647596A (zh) * 2020-06-23 2020-09-11 辽宁省海洋水产科学研究院 一种基于3d打印功能体的微孢子虫dna的提取方法、试剂盒及其应用
CN111778236A (zh) * 2020-06-23 2020-10-16 辽宁省海洋水产科学研究院 基于3d打印特形功能体的贝类基因组dna提取方法、试剂盒及其应用
CN111607489B (zh) * 2020-06-23 2024-04-05 大连理工大学 一种基于3d打印微元件的核酸提取系统和方法
CN111607635B (zh) * 2020-06-23 2024-03-22 大连理工大学 一种基于3d打印特形功能体的血液基因组dna提取方法及其应用试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110945124A (zh) * 2017-03-14 2020-03-31 Aj耶拿检疫有限公司 用于从样品中富集细胞并且后续从这些细胞中分离核酸的方法
CN111004719A (zh) * 2019-12-03 2020-04-14 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 核酸检测模块、检测单元及检测系统

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PeiPei Li et.al.3D printed integrated separator with hybrid micro-structures for high throughput and magnetic-free nucleic acid separation from organism samples.Separation andPurificationTechnology271(2021).2021,全文. *

Also Published As

Publication number Publication date
US20230146223A1 (en) 2023-05-11
CN111607489A (zh) 2020-09-01
WO2021259141A1 (zh) 2021-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111607489B (zh) 一种基于3d打印微元件的核酸提取系统和方法
JP6506371B2 (ja) 核酸を精製するための方法およびキット
US10093919B2 (en) Method and kit for purifying nucleic acids
KR100785010B1 (ko) 수소 결합을 이용하여 고체 지지체의 친수성 표면 상에서핵산 정제 방법 및 장치
US20230374488A1 (en) Size selection purification using a thermoplastic silica nanomaterial
US7560228B2 (en) Solid-phase nucleic acid isolation
US20080300397A1 (en) Modified spin column for simple and rapid plasmid dna extraction
US11702648B2 (en) Process for concentrating cells from a sample and then isolating nucleic acids from said cells
US20110124851A1 (en) Method of Isolation of Nucleic Acids
JP2022058780A (ja) 核酸を抽出する装置および方法
WO2008150838A1 (en) Improved miniprep system for simple and rapid plasmid dna extraction
CN107073474B (zh) 移液枪头及其使用方法
CN111607635B (zh) 一种基于3d打印特形功能体的血液基因组dna提取方法及其应用试剂盒
CN110088282B (zh) 用磁性颗粒分离高纯度核酸的方法
KR20170012806A (ko) 다이렉트 용리 반응에 의한 핵산 추출 및 증폭 방법
CN111647596A (zh) 一种基于3d打印功能体的微孢子虫dna的提取方法、试剂盒及其应用
US20110313145A1 (en) Isolation of rna
CN111778236A (zh) 基于3d打印特形功能体的贝类基因组dna提取方法、试剂盒及其应用
Al-Terehi et al. Role of Nanoparticles Applications as a Model in DNA Technologies; A Review.
CN106939306B (zh) 一种基于PSP的适用于高通量测序中elRNA文库构建方法
CN116376894A (zh) 一种基于磁珠技术提取血液基因组dna的试剂盒及其提取方法
KR101206039B1 (ko) 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터핵산을 분리하는 방법,상기 분리된 핵산을 주형으로 하여핵산을 증폭하는 방법 및 상기 고체 지지체를 포함하는핵산 분리 및 증폭 장치

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant