KR20170012806A - 다이렉트 용리 반응에 의한 핵산 추출 및 증폭 방법 - Google Patents

다이렉트 용리 반응에 의한 핵산 추출 및 증폭 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산 추출 및 증폭 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다이렉트 용리반응에 의한 핵산 추출 및 증폭 방법에 관한 것이고, 더욱더 상세하게는 다이렉트 용리반응을 이용하여 핵산 추출 및 증폭을 원스텝으로 수행할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 용리 및 증폭 시약을 이용한 핵산의 다이렉트 용리 및 증폭 방법을 이용하면, 핵산 추출 전과정 및 핵산 증폭을 하나의 구동부를 이용하여 원스텝(one step) 방식으로 수행할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 핵산 추출 및 증폭 자동화 장비에 적용되기에 용이하다.

Description

다이렉트 용리 반응에 의한 핵산 추출 및 증폭 방법{METHOD OF EXTRACTING AND AMPLIFYING NUCLEIC ACIDS USING DIRECT ELUTION}
본 발명은 핵산 추출 및 증폭 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다이렉트 용리반응에 의한 핵산 추출 및 증폭 방법에 관한 것이고, 더욱더 상세하게는 다이렉트 용리반응을 이용하여 핵산 추출 및 증폭을 원스텝으로 수행할 수 있는 방법에 관한 것이다.
최근 세포, 박테리아 또는 바이러스와 같은 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하고 증폭하기 위한 기술에 관하여 많은 연구가 이루어지고 있다. 생물학적 시료로부터 핵산, 단백질등을 분리하는 방법은 다양한 방법들이 개발되어 왔다. 침전법, 액상추출법, 전기영동, 크로마토그래피 등이 전통적으로 많이 사용되어 왔으며 이러한 조작을 좀 더 간단히 하기위해 고상추출법이 개발되어 왔다. 이 고상추출법은 선택성을 가지는 고체를 이용하거나 또는 고도의 선택성을 가지는 리간드를 고체상에 붙여 제조된 고체입자들을 이용하는 방법이다. 이 방법은 먼저 타겟물질이 선택적으로 부착되는 용액에 생물학적 시료를 녹인 후 타겟물질을 고체상에 부착시키고 고체를 용액에서 분리시키고 고체상에 남아 있는 잔여 액체를 세척하여 다른 불순물을 제거한 후 원하는 타겟물질이 떨어지는 용액으로 다시 떼어내는 원리이다. 고상추출법은 칼럼에 고체입자들을 충진 하거나 필터용막을 칼럼에 충진하여 사용해 왔다. 이 경우 부착용량을 늘리기 위해 넓은 표면적을 가지는 미세한 입자나 시료가 적은 경우 필터형태의 막을 사용한다. 그런데 이러한 미세입자로 충진 하거나 필터형태의 막을 사용하면 미세한 공극사이로 용액이 아주 천천히 흐르는 문제점이 있다. 그래서 용액을 빠르게 흘려주기 위해 원심분리기를 이용해 중력값을 늘려주거나 가압이나 진공을 걸어 압력차를 주는 방식을 사용하고 있다. 또한, 표면적이 넓은 미세한 자성입자들을 이용하여, 용액의 서스펜션 상태에서 빠르게 생화학 물질들을 부착시키고 자기장을 가해 타겟 물질이 부착된 자성입자들을 응집시킨 다음, 용액을 제거하여 주는 방법 및 장비들이 개발되고 있다.
종래 핵산 추출 기술의 일 예로서는 세포를 포함하는 시료를 SDS나 프로테이나아제(proteinase) K로 처리하여 가용화한 후 페놀로 단백질을 변성 제거하여 핵산을 정제하는 방법이 있었다. 그러나, 페놀 추출법은 많은 처리 단계를 수행해야 하기 때문에 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라 핵산 추출 효율이 연구자의 경험과 노련성에 의해 크게 좌우되어 신뢰성이 크게 떨어지는 문제점이 있었다. 최근에는 이러한 문제를 해소하기 위해 핵산과 특이적으로 결합하는 실리카나 유리섬유를 이용하는 키트가 사용되기도 한다. 상기 실리카나 유리섬유는 단백질, 세포 대사 물질들과 결합 비율이 낮으므로 상대적으로 높은 농도의 핵산을 얻을 수 있다. 이와 같은 방법은 페놀법과 비교했을 때 간편하다는 장점은 있지만, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 등의 효소 반응을 강하게 저해시키는 카오트로픽 시약이나 에탄올을 이용하기 때문에 이들 물질을 완전히 제거해야 한다.(특허 WO2013118990 A1)
핵산을 추출하는 종래의 기술은 세포 분쇄 시약, 세척 시약, 용리 시약 등 핵산 추출에 필요한 각각의 시약을 서로 다른 용기에 담고 자석을 이용하여 자성 비드와 결합된 핵산을 각 용기를 옮겨 다니며 반응을 시키거나, 피펫과 자석을 이용하여 하나의 용기에 시약을 주입하고 반응시킨 후 시약을 제거하는 방식을 사용한다. 자성 입자를 이용한 핵산 추출 자동화 장비는 이런 종래의 기술을 단순히 자동화한 것으로 자동화 기기의 제작이 용이하다는 점에서 널리 이용되고 있다. 그러나 이 경우 핵산이 용리된 시료를 핵산 증폭을 위한 시약에 따로 주입해야 하는 불편함이 있기 때문에 진정한 의미의 자동화라고 보기는 힘들다. 이에 용리된 핵산을 따로 증폭을 위한 시약 튜브에 옮겨주는 자동화 장비가 구현되어 있기는 하지만, 핵산 추출 구동부 외에 리퀴드 핸들링(liquid handling)이라고 하는 정량의 시료를 옮겨주는 구동부가 따로 구성되야 하고, 시료를 주입한 후 증발을 방지하기 위하여 증폭 튜브에 캡핑을 해주거나 오일로 실링을 해주는 등의 구동부가 따로 필요하게 되어 장비 구현이 매우 제한적이다. 본 발명에 관련된 배경 기술로는 대한민국 공개특허공보 제10-2013-0051647호(2013.05.21. 공개)에 개시된 자성 입자를 이용한 핵산의 분석 방법이 있다.
일반적으로 실리카 지지체(Bead)와 핵산과의 결합은 1가 양이온이 핵산의 인산부와 실리카 지지체를 연결함으로 인해 결합하게 된다. 상기 1가 양이온, 예를 들어 K+, Na+, CH6N3 +, NH4 + 등의 농도가 부족하면 실리카에 고정된 핵산이 다시 용리되는데, 이 때문에 핵산 추출후 세척시 NaCl 또는 상기 1가 양이온 등을 500mM에서 1500mM의 고농도로 사용하게 된다. 또한 PCR 버퍼에서는 PCR 용액의 이온 환경(ionic condition)을 중성으로 바꾸기 위하여 1가 양이온을 사용하게 된다. 만일 다이렉트 용리 반응(Direct elution)을 적용할 경우, PCR 버퍼에 있는 1가 양이온과 비드에서 흡착되어온 1가 양이온이 더해져서 PCR이 저해되는 환경을 만들거나 경우에 따라 용리가 전혀 이루어지지 않고 PCR 시약 조성의 프라이머/프로브(primer/probe)가 비드에 결합하게 된다. 그러므로, 다이렉트 용리 반응 후 증폭시, 증폭량이 일반적인 qPCR에서 진행한 증폭 효율과 다르게 되어 다이렉트 용리 반응이 곤란한 문제가 있다.
본 발명의 목적은 다이렉트 용리 반응이 가능한 용리 및 증폭 시약을 제공하여, 바이오 샘플의 세포분쇄 및 이의 운반 매개체가 되는 자성입자를 이용한 핵산 추출의 전 과정 및 핵산의 증폭을 원스텝 방식으로 수행할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 기존의 다이렉트 용리 반응이 어려웠던 문제를 해결하므로서 다이렉트 용리 반응이 가능하도록 하여 핵산의 추출에서 증폭까지 원스텝으로 이루어질 수 있는 전자동화 방법을 제공한다. 즉, 종래에 세척후 용리 시약에서 용리 반응이 이루어진 다음 PCR 반응을 위해 용기를 옮겨 새로운 시약에서 수행해야 했던 공정을 일체화 하여 핵산의 추출에서 증폭까지 원스텝 전자동화를 가능하도록 하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 핵산 추출 및 증폭 방법에 있어서, (a) 제1 용기에 바이오 샘플, 분쇄(lysis) 시약, 및 자성비드를 혼합하여 핵산을 분리하고 핵산-자성비드 복합체를 형성하는 단계; (b) 상기 핵산-자성비드 복합체를 제2 용기로 옮겨 세척하는 단계; (c) 상기 세척된 핵산-자성비드 복합체를 제3 용기로 옮겨 용리 및 증폭 시약과 혼합하고 핵산을 용리시키는 단계; 및 (d) 상기 제3 용기에서 상기 용리된 핵산을 75 mM 이하의 1가 양이온을 포함하는 용리 및 증폭 시약에서 증폭시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 자성 비드는 200nm 내지 5㎛의 사이즈를 갖는 것이 바람직하고, 분쇄 시약 내에서 20 내지 90 g/L 로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 제 2용기는 복수개인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 제1 용기와 제2 용기 사이, 및 상기 제2 용기와 제3 용기 사이에는 소수성 물질로 채널층이 형성될 수 있다. 상기 소수성 물질은 파라핀 왁스, 폴리에틸렌 왁스, 및 글루로 이루어진 군 중에서 하나 이상을 선택하여 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 하나의 구동부에 의하여 제1 용기, 제2 용기 및 제3 용기 각각에 포함된 물질이 이동할 수 있다. 이때, 상기 (a) 단계의 결과물이 상기 구동부에 의해 상기 제2 용기로 이동하고, 상기 (b) 단계의 결과물이 상기 구동부에 의해 상기 제3 용기로 이동할 수 있다. 또한, 상기 구동부는 상기 자성 비드의 이동을 위한 자석을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 자성 비드는 친수성 자성 비드이고, 상기 제 3 용기에는 오일 커버층이 형성되는 것이 바람직하다. 상기 친수성 자성 비드는 자성 비드 표면에 친수성 코팅층이 형성된 것일 수 있다. 이때, 상기 친수성 코팅층은 알데히드, 아민, 알코올, 에폭시, NHS(N-hydroxysuccinimide) 중 1종 이상의 친수성 작용기를 갖는 유기물로 형성되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 (b) 단계의 세척된 핵산-자성비드 복합체가 상기 제3 용기로 이동할 때 상기 오일 커버층에 의하여 상기 친수성 자성 비드에 결합된 핵산 이외의 바이오물질이 추가 제거되고, 상기 (d) 단계에서 상기 오일 커버층에 의해 상기 용리 및 증폭 시약의 증발이 억제 될 수 있다. 이 경우, 상기 (d) 단계에서 상기 용리 및 증폭 시약의 증발이 5vol% 미만일 수 있다. 또한, 상기 오일 커버층의 부피가 상기 용리 및 증폭 시약 부피의 0.5배 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 측면은 핵산의 다이렉트 용리 및 증폭 방법에 있어서, 핵산-자성비드 복합체로부터 핵산이 용리된 후 75 mM 이하의 1가 양이온을 포함하는 핵산 증폭용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 용리 및 증폭 시약을 이용한 핵산의 다이렉트 용리 및 증폭 방법을 이용하면, 핵산 추출 전과정 및 핵산 증폭을 하나의 구동부를 이용하여 원스텝(one step) 방식으로 수행할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 핵산 추출 및 증폭 자동화 장비에 적용되기에 용이하다.
특히, 본 발명에 따른 핵산 추출 및 증폭 방법은 오일 커버층이 형성된 PCR pre-mixture(용리 및 증폭 시약)에서 핵산의 용리를 수행함으로써, 핵산의 용리와 증폭을 하나의 용기 내에서 수행할 수 있기 때문에 유체 이동 모듈을 생략하여 장치를 간소화 할 수 있다. 또한 오일 커버층을 이용함으로써 핵산 증폭시 별도의 튜브 캐핑(capping) 공정 혹은 실링 공정을 생략할 수 있다.
도 1은 종래의 핵산 추출 및 증폭 방법을 개략적으로 나타낸 공정도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 핵산 추출 및 증폭 방법을 개략적으로 나타낸 공정도이다.
도 3은 핵산 용리 공정 및 핵산 증폭 공정이 수행되는 제3 용기의 예를 나타낸 것이다.
도 4는 자석 및 프로텍터를 포함하는 구동부의 예를 나타낸 것이다.
도 5는 각 용기와 용기 사이에 소수성 채널층이 형성된 일 실시예를 나타낸 것이다.
도 6은 자성비드의 사용량에 따른 PCR 효율을 나타낸 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성요소를 지칭한다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 핵산 추출 및 증폭 방법에 관하여 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 종래의 핵산 추출 및 증폭 방법을 개략적으로 나타낸 공정도이다. 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 핵산 추출 및 증폭 방법을 개략적으로 나타낸 공정도이다. 도 1 및 도 2를 참조하면, 핵산 추출 및 증폭 방법은 세포 분쇄를 통해 핵산을 분리하고 자성 비드를 결합시키는 라이시스(lysis) 공정, 자성 비드와 결합된 핵산 이외의 다른 물질을 제거하는 세척 공정, 핵산 용해를 통해 자성 비드를 분리하는 용리(elution) 공정, 핵산을 증폭하는 핵산 증폭 공정을 포함한다.
도 1에 도시된 예와 같이, 종래의 경우, 용리 공정을 수행한 이후에 핵산 증폭을 위한 PCR 용기에 시료를 주입하고, 시료 주입 후 PCR 용기 캐핑(capping) 혹은 실링을 수행하는 과정이 요구되었다. 이에 따라, 종래의 경우, 자기력에 의해 자성 비드와 결합된 핵산 이동을 위한 자석 모듈, PCR 용기로 시료 주입을 위한 유체 이동 모듈, PCR 용기 캐핑 등을 위한 모듈, 또는 로보틱스 등의 다수의 구동부가 필수적이었다.
그러나, 도 2에 도시된 예와 같이, 본 발명의 경우, 오일 커버층이 형성된 PCR pre-mixture(용리 및 증폭 시약)에서 용리 및 증폭 공정이 동일한 용기에서 수행됨으로써 종래에 비하여 공정을 단순화시킬 수 있고, 또한 유체 이동 모듈이나 로보틱스 등의 구동부를 요하지 않을 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 추출 및 증폭 방법의 경우, 자기력을 제공하는 하나의 구동부에 의해 핵산 추출 전 과정 및 증폭이 가능하여, 원 스텝(one step) 핵산 추출 및 증폭 자동화 시스템 적용이 가능하다.
이하, 본 발명에 따른 다이렉트 용리 및 증폭 반응을 이용한 핵산 추출 및 증폭 방법에 대하여 도면과 일 실시예를 들어 보다 상세히 설명하기로 한다.
도 2에 도시된 예와 같이, 본 발명에 따른 핵산 추출 및 증폭 방법은 바이오 샘플 주입 공정, 라이시스(lysis) 공정, 세척 공정, 용리(elution) 및 증폭 공정을 포함한다.
바이오 샘플 주입 공정에서는 세포 분쇄 시약 및 자성 비드가 저장되어 있는 제1 용기에 바이오 샘플을 주입한다.
다음으로, 라이시스(lysis) 공정은 제1 용기에서 수행되며, 본 공정에서는 세포 분쇄를 통하여 바이오 샘플에서 핵산이 분리되고, 이어서 핵산과 친수성 자성 비드가 결합된 핵산-자성비드 복합체가 형성된다. 핵산과 자성 비드의 결합은 상온 이상에서 수행되는 것이 바람직하다. 핵산과의 효율적 결합을 위하여, 상기 자성 비드는 200nm 내지 5㎛ 의 사이즈를 갖는 것이 바람직하다. 상기 자성 비드가 200nm 미만이면 자성에 의해 이동이 어려워 질 수 있고, 5㎛ 초과이면 중량 대비 표면적이 감소하고 비드의 코어에 있는 자성 금속의 전자기력에 의한 핵산의 결합 조건이 달라질 수 있어서 핵산 검출 효율이 감소할 우려가 있다.
상기 라이시스 공정에서 형성된 핵산-자성 비드 복합체는 제 2 용기로 옮겨진 후, 세척된다. 세척 공정에서는 세척 버퍼가 저장되어 있는 하나 이상의 제2 용기에서 세척을 수행하여, 자성 비드와 결합된 핵산 이외의 다른 바이오 물질을 제거한다. 이때, 핵산의 순도를 증가시키기 위하여, 제2 용기는 복수개로 구비되는 것이 보다 바람직하다.
상기 세척된 핵산-자성비드 복합체는 제 3 용기로 옮겨진 후, 상기 제 3 용기내에서 용리 및 증폭 반응이 순차적으로 수행된다. 본 발명에서는 핵산의 용리 및 증폭이 하나의 용기(제 3 용기)에서 수행되는 것을 특징으로 한다.
상기 제 3 용기에는 용리 및 증폭 시약이 저장되어 있을 수 있다. 상기 용리 및 증폭 시약에 핵산을 용리시킴으로써 핵산을 자성 비드와 분리하는 용리(elution) 공정이 수행된다. 상기 분리된 핵산은 제3 용기에서 다른 용기로 이동하지 않고 동일한 용기에서 증폭 반응을 하게 된다. 따라서, 상기 용리 및 증폭 시약이 저장되어 있는 제3 용기에서 용리 반응이 일어나고 이어서 순차적으로 증폭 반응이 일어날 수 있으며, 제3 용기의 내용물의 변화없이 용리시 밀폐된 용기 상태를 그대로 유지하면서 용리후 이어서 증폭 반응이 수행될 수 있다.
핵산의 용리 및 증폭을 모두 최적화하기 위해, 본 발명은 용리와 증폭 반응을 모두 수행할 수 있는 용리 및 증폭 시약을 제공한다. 따라서, 세척된 핵산-자성 비드 복합체는 상기 용리 및 증폭 시약에서 용리된 다음, 상기 용리된 핵산은 동일한 용기 및 동일한 시약(용리 및 증폭 시약)에서 증폭될 수 있다. 상기 용리 및 증폭 시약은 핵산이 용리된 후 75 mM 이하의 1가 양이온을 포함하는 것이 바람직하고, 50 mM 이하의 1가 양이온을 포함하는 것이 가장 바람직하다. 상기 1가 양이온이 없는 경우에도 다이렉트 용리 반응 및 증폭 반응이 수행될 수 있으나, 1가 양이온이 75 mM을 초과하면 증폭 반응의 효율이 감소될 수 있다.
본 발명에 따르면, 핵산-자성비드 복합체가 세척액에서 세척된 후, 독립된 용리 버퍼가 포함된 용기를 거치지 않고, PCR 버퍼(용리 및 증폭 시약)가 포함된 용기로 직접 넣어져서 핵산을 해리시킨 후 PCR을 수행한다. 이 때, 핵산이 비드에서 떨어지지 않도록 세척액에 포함되어 있는 고농도의 1가 양이온이 핵산-자성비드 복합체와 함께 상기 용리 및 증폭 시약에 유입된다. 이 같은 1가 양이온, 예를 들면, NH4 +, K+, Na+ 등은, 세척액에서 자성 비드의 표면과 핵산 사이를 연결하는 양이온 다리를 보호해주는 역할을 하고, PCR 버퍼에서는 프라이머/프로브(primer/probe)와 타겟 핵산이 안정적으로 결합하여 PCR을 수행하도록 하는 역할을 해주는데, 상기 1가 양이온이 PCR 버퍼에 과량 존재하게 될 경우 신장된 타겟 핵산의 이중사슬이 변성(denature)되는 것을 저해시켜 PCR 효율을 오히려 감소시키는 원인이 된다.
본 발명에 따르면, 다이렉트 용리 및 증폭 반응을 위해서는, 비드에서 유입되는 1가 양이온의 농도와 PCR 버퍼에 존재하는 1가 양이온의 농도를 더하여 75 mM 이하, 더욱 바람직하게는 50mM 이하의 1가 양이온을 포함하는 용리 및 증폭 시약을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 통상적으로 사용되는 PCR 버퍼에서 1가 양이온의 농도를 75 mM 이하로 하면 PCR 버퍼에서도 핵산의 용리 및 증폭 반응이 모두 충분히 수행될 수 있음을 발견하여 완성된 것이다. 따라서, 본 발명은 분자실험과정에서 용리 반응 후 유체시료를 PCR 버퍼에 다시 첨가해주는 단계를 거치지 않고, 세척된 핵산-자성비드 복합체를 상기 용리 및 증폭 시약에서 다이렉트 핵산 용리 및 증폭 반응을 할 수 있는 다이렉트 용리 및 증폭 방법을 제공한다.
PCR 버퍼의 1가 양이온의 농도는 핵산 추출시 사용하는 비드의 사용 중량에 따라 달라질 수 있다. 자성 비드의 사용량은 추출 및 증폭하고자 하는 핵산의 종류나 양에 따라 달라질 수 있으나, 분쇄 시약내에서 20~90g/L로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 자성 비드가 20g/L 미만이면 추출되는 핵산량이 부족하여 유전자 검출이 어려워 질 수 있다. 또, 상기 자성 비드가 90g/L를 초과하면, 용리 반응시 자성 비드로부터 유리되는 1가 양이온의 량이 증가하여, 핵산의 증폭 반응이 저해될 수 있고 다이렉트 용리 및 증폭 반응이 어려워 질 수 있다.
일반적으로 핵산의 용리가 이루어진 후에 용리된 유체시료를 정량하여 핵산 증폭 용기에 주입해야 하나, 본 발명에서는 최종적으로 PCR 증폭이 이루어지는 제3 용기 내에서 핵산을 용리시킴으로써 용리 및 증폭 반응을 하나의 용기내로 일체화하여 수행할 수 있도록 한 것이다. 본 발명에 따르면 종래에 비하여 공정을 단순화할 수 있고, 용리후 증폭시 별도 유체 이동 모듈을 요하지 않아 장치가 소형화 및 간소화 될 수 있으며, 용리후 증폭을 위한 분리된 공정이 필요하지 않으므로 핵산 추출부터 핵산 증폭까지 원스텝으로 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 제 3 용기에 오일 커버층이 형성될 수 있다. 세척 공정후 이동되는 핵산-자성비드 복합체는 상기 오일 커버층을 통과하여 제 3 용기에 투입되게 되며, 상기 핵산-자성비드 복합체가 제 3 용기에서 용리 및 증폭 반응을 하는 동안 오일 커버층이 제 3 용기를 밀폐할 수 있고 반응 시약의 증발을 방지할 수 있다. 또한, 상기 오일층에 의해 핵산-자성비드 복합체에 결합된 타겟 핵산 이외의 물질이 한번 더 세척되는 필터링 효과가 나타날 수 있다.
오일은 수용액과 섞이지 않는 것이라면 특별한 제한없이 사용 가능하다. 오일의 사용량은 증폭 시약에 따라 달라지며, 오일 커버층의 부피가 용리 및 증폭시약 부피의 0.5배 이상이 되도록 하는 것이 바람직하다. 오일 커버층의 부피가 용리 및 증폭시약 부피의 0.5배 미만일 경우 필터링 효과가 저하 될 수 있고 용리 및 증폭 시약이나 시료가 증발될 수 있다.
도 3은 핵산 용리 공정 및 핵산 증폭 공정이 수행되는 제3 용기의 예를 나타낸 것이다. 제3 용기(301)는 용리 및 증폭 시약(310)이 저장되어 핵산의 증폭이 수행될 수 있는 용기이며, 이른바 PCR (polymerase chain reaction) pre-mixture(용리 및 증폭 시약)가 저장된 용기일 수 있다. 오일 커버층(320)은 친수성 자성 비드에 직접적으로 결합된 핵산 이외의 물질을 필터해 주는 역할을 하며, 또한 증폭시 시약이나 시료 등의 증발을 방지하는 역할을 한다. 오일 커버층(320)에 의하여, 증폭 과정에서 증폭 시약의 증발이 5vol% 미만일 수 있다. 또한, 상기 오일 커버층이 있기 때문에, 별도의 PCR 용기 캐핑 공정 등이 생략될 수 있다.
또한, 시료가 제 3 용기 내로 이동하기 위해서 오일 커버층을 통과하게 되므로, 상기 자성비드는 오일과 섞이지 않도록 친수성 자성 비드를 이용하는 것이 바람직하다. 친수성 자성 비드를 사용할 경우, 세척공정 후 용리 및 증폭 공정이 수행되는 제3 용기에 이동시, 상기 제3 용기에 형성된 오일 커버층에 의해 한 번 더 세척되는 효과를 가질 수 있다.
친수성 자성 비드는 자성 비드 표면에 친수성 물질로 친수성 코팅층이 형성된 형태가 될 수 있다. 이때 친수성 코팅층을 형성하는 친수성 물질은 알루미나 또는 실리카 등과 같은 무기물이거나, 알데히드, 아민, 알코올, 에폭시, NHS(N-hydroxysuccinimide) 로 이루어진 군 중에서 1종 이상의 친수성 작용기를 갖는 유기물이 될 수 있다. 핵산과의 결합에 있어서, 상기 친수성 물질은 상기 친수성 작용기를 갖는 유기물이 더욱 바람직하다. 상기 친수성 작용기를 갖는 유기물은 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알콜(PVA) 등 일 수 있다.
다음으로, 제3 용기에서 핵산의 증폭반응이 수행된다. 상기 용리 단계에서 용리 반응이 끝난 핵산은 통상적인 증폭 반응을 하게 된다. 제3 용기에는 증폭을 위한 열교환기가 배치될 수 있다. 또한 증폭을 실시간으로 확인하기 위해 형광 물질이 용리 및 증폭 시약에 제공될 수 있으며, 제3 용기 부근에 형광 물질을 검출하는 광학부가 추가로 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 하나의 구동부에 의하여 제1 용기, 제2 용기 및 제3 용기 각각에 포함된 물질을 이동시킬 수 있다. 라이시스 공정의 결과물이 구동부에 의해 제2 용기로 이동하고, 세척 공정의 결과물이 구동부에 의해 제3 용기로 이동될 수 있다. 이때, 구동부는 자성 비드의 이동을 위한 자석을 포함할 수 있다. 자석은 용기 외부에서 이동하는 방식 또는 용기 내부에서 삽탈되는 방식으로 이동이 제어될 수 있다. 한편, 자석이 용기 내부에서 삽탈되는 방식으로 이동이 제어될 때, 구동부는 자성 비드가 자석에 직접적으로 결합되지 않도록 하는 프로텍터를 포함할 수 있으며, 프로텍터 내에서 자석이 이동할 수 있다.
도 4는 자석 및 프로텍터를 포함하는 구동부의 예를 나타낸 것이다. 도 4의 (a)를 참조하면, 교반이 수행될 경우에는 자석(410)이 용기(401) 외부에 위치하여, 자성 비드(402)가 자석(410)에 들러붙지 않도록 할 수 있다. 이에 반하여, 도 4의 (b)를 참조하면, 교반이 종료된 후 다음 용기로 교반 결과물을 이동시킬 경우에는 자석(410)이 용기(401) 내에 위치하여, 자성 비드(402)가 들러 붙도록 할 수 있다. 이 때, 자석(410)을 감싸는 형태의 프로텍터(420)에 의하여 자석(410)에 자성 비드(402)가 직접 들러붙지 않고 프로텍터(420)에 흡착되어 있는 상태가 되도록 하여, 다음 용기에서는 다시 도 4의 (a)와 같은 상태가 되도록 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 원 스텝 공정을 위하여, 각 용기에 저장된 물질들이 다른 용기에 저장된 물질들과 섞이지 않도록, 제1 용기와 제2 용기 사이, 및 제2 용기와 제3 용기 사이에는 소수성 물질로 채널층이 형성되어 있을 수 있다. 또한, 제2 용기가 복수 개일 경우 제2 용기들 사이에도 소수성 물질로 채널층이 형성되어 있을 수 있다. 소수성 물질은 파라핀 왁스(paraffin wax), 폴리에틸렌 왁스(polyethylene wax) 및 글루로 이루어진 군 중에서 하나 이상을 선택하여 포함하는 것이 바람직하다.
도 5는 각 용기와 용기 사이에 소수성 채널층이 형성된 일 실시예를 나타낸 것이다. 도 5를 참조하면, 소수성 채널층이 형성된 핵산 추출, 세척, 용리 및 증폭용 용기는 몸체부(510), 복수의 버퍼 저장부(520), 복수의 채널부(530) 및 바닥부(540)를 포함할 수 있다. 버퍼 저장부에는 생물학적 시료로부터 핵산을 추출, 세척, 용리 및 증폭하기 위한 버퍼들을 각각 포함할 수 있다. 상기 버퍼 저장부(520)의 버퍼들은 채널부(530)를 채우고 있는 소수성 채널층(530)에 의해 분리될 수 있다. 상기 소수성 채널층은 상온에서 고체로 존재하는 무극성 상변화 물질일 수 있고, 상온에서 유동성이 없기 때문에 높은 분리 안정성을 가질 수 있다. 상기 무극성 상변화 물질들은 파라핀 왁스(paraffin wax), 폴리에틸렌 왁스(polyethylene wax) 및 글루로 이루어진 군 중에서 하나 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 무극성 상변화 물질은 가열부(550)에 의해 액체상으로 변할 수 있다. 이 경우, 상변화 물질은 유동성을 갖게 되어, 채널부(530)를 통한 물질의 이동이 가능하게 된다. 따라서, 핵산이 부착된 자성입자를 자기력을 이용하여, 채널부(530)를 통과시켜 인접한 다른 버퍼 저장부(520)로 이동시킬 수 있다. 이때, 친수성의 핵산은 무극성 상변화 물질과 섞이지 않기 때문에, 자성 입자의 이동시 일어날 수 있는 채널부(530)에서의 핵산의 손실을 방지할 수 있다. 그리고, 상기 가열부(550)로부터 열 공급이 없으면, 액체상의 무극성 상변화 물질은 다시 고체상으로 변하게 된다. 따라서, 반응 후 버퍼들이 다시 섞이는 것을 방지할 수 있다.
이상에서는 본 발명의 실시예를 중심으로 설명하였으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 기술자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다.
따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 아래의 특허청구범위에 의해서 정하여져야 할 것이다.
1) 자성비드 사용량 별 PCR 효율
인간의 혈액 샘플 50 ㎕를 분쇄 시약(고센바이오 비드사) 200㎕ 에서 분쇄한 후, 실리카로 코팅된 300nm 의 자성비드 0.2mg, 1mg, 2mg 및 4mg과 각각 혼합하여 핵산-자성비드 복합체를 만들었다. 상기 핵산-자성비드 복합체를 자석 막대로 분리하여 세척액(고센바이오 비드사) 300 ㎕에 각각 넣어 세척하였다. 상기 세척된 핵산-자성비드 복합체를 다시 자석 막대로 분리하여 PCR 버퍼(솔젠트사) 50 ㎕에 각각 넣고 교반하였다. 상기 PCR 버퍼에서 자성입자와 바인딩한 핵산을 용리시킨 후, 별도의 처리과정 없이 바로 증폭을 진행하였다. 증폭은 human whole genomic DNA에 존재하는 베타 액틴(beta actine) 부위를 타겟으로 사용하였고, 프라이머 및 프로브는 하기와 같이 자체 디자인한 서열을 사용하였다.
Forward primer 서열(서열번호 1): 5‘ CATGTACGTTGCTATCCAGGC 3’
Reverse primer 서열(서열번호 2): 5‘ CTCCTTAATGTCACGCACGAT 3’
probe 서열(서열번호 3): 5‘ GTACCACTGGCATCGTGATG 3’
3%의 아가로스 겔에 증폭산물을 5㎕ 씩 각각 로딩하였고, 마커는 100bp의 ladder를 사용하였다. 양성 대조군(PC)는 표준 검체로 사용하기 위해 임의로 합성된 DNA를 사용하였다. 자성비드 1 - 4mg을 사용한 실험에서는 증폭이 제대로 이루어지지 않았으며, 통상적으로 사용되는 추출 방법에서 사용되는 자성비드의 10 ~ 20배 적은 양인 0.2mg에서 소량 증폭이 된 것을 확인할 수 있었다(도6).
2) 종래의 PCR 버퍼에서 비드 사용량 별 qPCR 효율
다시 비드의 양을 조절하여 상기 1)과 같이 샘플을 제조한 후 qPCR 실험을 하였다. 1 mg의 비드를 사용한 실험에서 결과 값이 나오지 않았기 때문에 0.2에서 0.8mg까지 0.2 mg 간격으로 비드를 사용하였고, 정확한 비교를 하기 위하여 Real-Time PCR을 진행하고 그 결과 값을 비교하였다. 비드 사용량이 많아짐에 따라 핵산이 바인딩할 수 있는 표면적이 넓어져 핵산이 많이 해리되어야 함에도 불구하고, Ct값을 보면 오히려 qPCR 효율이 점점 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 다이렉트 용리 및 증폭 반응이 기존의 추출 및 PCR 시약에서 수행되지 못하는 것을 확인할 수 있었다.
자성비드 사용량(mg) Ct 값
0.2 25.27
0.4 25.28
0.6 25.54
0.8 28.17
3) KCl 농도별 PCR 효율
PCR 버퍼(솔젠트사)의 KCl 농도별로 qPCR 효율에 대한 실험을 진행하였다. PCR 버퍼는 KCl free 시약을 사용하여 KCl을 하기와 같이 필요한 농도로 첨가하여 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 검체는 자체적으로 제작한 상기 1)의 베타 액틴(beta actine)의 서열을 가지는 cDNA를 10^5 copies/㎕ 농도로 사용하였다.
PCR 버퍼의 KCl 농도를 0, 25, 50 및 75 mM 로 되도록 제조한 후, 10^5 copies의 베타 액틴 표준검체를 PCR 버퍼내에 투입하여 PCR 을 수행하였다.
시중에서 표준으로 사용되는 PCR 버퍼는 일반적으로 KCl의 농도가 50 mM이다. 하기 표 2를 보면, qPCR 효율이 KCl 50 mM까지는 동일한 효율을 보이다가 75mM에서 급격히 효율이 감소하는 것을 볼 수 있다. 이것은 다이렉트 용리 및 증폭 반응에 있어서, 비드의 양을 증가 시키면 타겟 핵산의 양이 많아지기 때문에 qPCR 효율이 증가하는 것이 아니라, 비드의 양이 많아지면 비드로부터 유입되는 1가 양이온의 양이 증가하기 때문에 qPCR 효율이 감소한다는 것을 보여준다.
KCl 농도(mM) Ct 값
75 36.20
50 27.70
25 27.68
0 27.92
4) KCl 을 조절한 PCR 버퍼에서의 자성비드 사용량 별 qPCR 효율
KCl 농도가 최적으로 맞춰지면 비드 사용량에 따라 PCR 효율이 증가하는 것을 증명하기 위하여, PCR의 KCl 농도를 0mM로 설정하고 비드 사용량을 0.2, 0.4, 0.6, 및 0.8 mg으로 하여 실험을 진행하였고(표 3), 그 외 실험 방법은 상기 2)의 방법과 동일하게 하였다. 그 결과, 기존의 PCR 버퍼(KCl 50mM)에서 실험한 표 1의 결과와는 다르게 비드 사용량 별로 qPCR 효율이 증가하는 것을 관찰 할 수 있었다.
자성비드 사용량(mg) Ct 값
0.2 25.78
0.4 25.18
0.6 24.94
0.8 23.07
따라서, 비드 사용량에 따라 qPCR 효율이 달라질 수 있고, 그것은 PCR 버퍼내 양이온의 최종 농도에 따라 달라진다는 것을 알 수 있다. qPCR 효율이 최적화(타겟에 특이적인 증폭 반응) 되는 조건은, 타겟 핵산에 따라 달라질 수 있으나, 상기 표 2의 결과와 같이 타겟 핵산의 해리가 끝난 상태에서 PCR 버퍼 최종 용액의 1가 양이온 농도가 75mM이하가 바람직하며, 50mM 이하의 1가 양이온 농도가 더욱 바람직하다.
301: 제3 용기(몸체부)
310: 용리 및 증폭 시약
320: 오일 커버층
401: 용기
402: 자성 비드
410: 자석
420: 프로텍터
510: 몸체부
520: 버퍼 저장부
530: 복수 채널부
540: 바닥부
550: 가열부
<110> K-MAC <120> METHOD OF EXTRACTING AND AMPLIFYING NUCLEIC ACIDS USING DIRECT ELUTION <130> k-mac-direct elution <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence <400> 1 catgtacgtt gctatccagg c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence <400> 2 ctccttaatg tcacgcacga t 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence <400> 3 gtaccactgg catcgtgatg 20

Claims (16)

  1. (a) 제1 용기에서 바이오 샘플, 분쇄(lysis)시약 및 자성비드를 혼합하여 핵산을 분리하고 핵산-자성비드 복합체를 형성하는 단계;
    (b) 상기 핵산-자성비드 복합체를 제2 용기로 옮겨 세척하는 단계;
    (c) 상기 세척된 핵산-자성비드 복합체를 제3 용기로 옮겨 용리 및 증폭 시약과 혼합하고 상기 핵산을 용리시키는 단계; 및
    (d) 상기 제3 용기에서 상기 용리된 핵산을 75 mM 이하의 1가 양이온을 포함하는 용리 및 증폭 시약에서 증폭시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출 및 증폭 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 용기와 제2 용기 사이, 및 상기 제2 용기와 제3 용기 사이에는 소수성 물질로 채널층이 형성된 것을 특징으로 하는 핵산 추출 및 증폭 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 소수성 물질은 파라핀 왁스, 폴리에틸렌 왁스, 및 글루로 이루어진 군 중에서 하나 이상을 선택하여 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출 및 증폭 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    하나의 구동부에 의하여 제1 용기, 제2 용기 및 제3 용기 각각에 포함된 물질이 이동하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출 및 증폭 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 결과물이 상기 구동부에 의해 상기 제2 용기로 이동하고,
    상기 (b) 단계의 결과물이 상기 구동부에 의해 상기 제3 용기로 이동하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출 및 증폭 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 구동부는 상기 자성 비드의 이동을 위한 자석을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출 및 증폭 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 자성 비드는 200nm 내지 5㎛ 의 사이즈를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 추출 및 증폭 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 자성 비드는 분쇄 시약내에 20 내지 90g/L 로 포함되는 것을 특징으로 하는 핵산 추출 및 증폭 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 자성 비드는 친수성 자성 비드이고, 제3 용기에는 오일 커버층이 형성된 것을 특징으로 하는 핵산 추출 및 증폭 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 친수성 자성 비드는 자성 비드 표면에 친수성 코팅층이 형성된 것을 특징으로 하는 핵산 추출 및 증폭 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 친수성 코팅층은 알데히드, 아민, 알코올, 에폭시, NHS(N-hydroxysuccinimide) 중 1종 이상의 친수성 작용기를 갖는 유기물로 형성되는 것을 특징으로 하는 핵산 추출 및 증폭 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 오일 커버층의 부피가 상기 용리 및 증폭 시약 부피의 0.5배 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 추출 및 증폭 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 (b)단계의 결과물이 상기 제3 용기로 이동할 때 상기 오일 커버층에 의하여 상기 친수성 자성 비드에 결합된 핵산 이외의 바이오 물질이 추가로 제거되고,
    상기 (d) 단계에서 상기 오일 커버층에 의해 상기 용리 및 증폭 시약의 증발이 억제되는 것을 특징으로 하는 핵산 추출 및 증폭 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 제3 용기에서 핵산이 증폭하는 단계에서, 상기 용리 및 증폭 시약의 증발이 5vol% 미만인 것을 특징으로 하는 핵산 추출 및 증폭 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 제2 용기는 복수 개인 것을 특징으로 하는 핵산 추출 및 증폭 방법.
  16. 핵산의 다이렉트 용리 및 증폭 방법에 있어서, 핵산-자성비드 복합체로부터 핵산이 용리된 후 75 mM 이하의 1가 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 조성물.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019022299A3 (ko) * 2017-07-24 2019-03-21 한국과학기술원 전자동 유전자 판별 통합칩
WO2019066363A3 (ko) * 2017-09-27 2019-06-06 고려대학교 산학협력단 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치, 추출 방법 및 추출 시스템
CN113186098A (zh) * 2021-05-28 2021-07-30 宁波康程德诺生物医药有限公司 一种一体化下开口核酸快提试管、快提检测装置及方法
CN113583803A (zh) * 2021-07-26 2021-11-02 上海思路迪生物医学科技有限公司 应用于分子诊断的核酸提取与扩增poct耗材及方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019022299A3 (ko) * 2017-07-24 2019-03-21 한국과학기술원 전자동 유전자 판별 통합칩
WO2019066363A3 (ko) * 2017-09-27 2019-06-06 고려대학교 산학협력단 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치, 추출 방법 및 추출 시스템
CN113186098A (zh) * 2021-05-28 2021-07-30 宁波康程德诺生物医药有限公司 一种一体化下开口核酸快提试管、快提检测装置及方法
CN113186098B (zh) * 2021-05-28 2024-03-26 宁波康程德诺生物医药有限公司 一种一体化下开口核酸快提试管、快提检测装置及方法
CN113583803A (zh) * 2021-07-26 2021-11-02 上海思路迪生物医学科技有限公司 应用于分子诊断的核酸提取与扩增poct耗材及方法

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