DE102022115445B4 - Verfahren und kit zur manuellen und automatisierten probenvorbereitung von long-read-sequenzierungen - Google Patents

Verfahren und kit zur manuellen und automatisierten probenvorbereitung von long-read-sequenzierungen Download PDF

Info

Publication number
DE102022115445B4
DE102022115445B4 DE102022115445.9A DE102022115445A DE102022115445B4 DE 102022115445 B4 DE102022115445 B4 DE 102022115445B4 DE 102022115445 A DE102022115445 A DE 102022115445A DE 102022115445 B4 DE102022115445 B4 DE 102022115445B4
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
dna
addition
library
rough
until
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
DE102022115445.9A
Other languages
English (en)
Other versions
DE102022115445A1 (de
Inventor
Timo Hillebrand
Elmara Graser
Kristin Wessel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IST Innuscreen GmbH
Original Assignee
IST Innuscreen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IST Innuscreen GmbH filed Critical IST Innuscreen GmbH
Priority to DE102022115445.9A priority Critical patent/DE102022115445B4/de
Priority to PCT/EP2023/066800 priority patent/WO2023247628A1/de
Publication of DE102022115445A1 publication Critical patent/DE102022115445A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE102022115445B4 publication Critical patent/DE102022115445B4/de
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Verfahren zur Extraktion hochmolekularer DNA aus einer biologischen Probe und / oder Aufreinigung einer DNA-Library, dadurch gekennzeichnet, dass nach ggf. Lyse der biologischen Probe und / oder nach Herstellung der DNA-Library der Ansatz mit einer Kombination aus einem Polyether und mindestens einem Salz sowie in Abwesenheit einwertiger Alkohole in Kontakt gebracht wird, wobei anschließend die DNA an eine feste Phase gebunden und anschließend die DNA ohne Verwendung einwertiger Alkohole gereinigt wird.

Description

  • Stand der Technik
  • Die Technologie New Generation Sequencing (NGS) gewinnt immer stärker an Bedeutung in Naturwissenschaften, Medizin und anderen anliegenden Gebieten. Das Ziel der umfassenden Genom- Sequenzierung liegt dabei nicht nur in der Identifikation von bestimmten Zielsequenzen (Erregernachweis, Mutationsnachweis etc.), sondern auch in einer weitgehenden Aufklärung der Gesamtsequenz eines Organismus. Logischerweise steht bei solchen Fragestellungen unter Verwendung dieser neuen Sequenzierungstechnologien (z.B. Nanoporensequenzierung; Oxford Nanopore Technologies) die Länge der sequenzierten Genomabschnitte im Vordergrund: je größer die Sequenzierungs-Leseweiten sind, desto einfacher und ressourcensparender ist deren bioinformatische Analyse der erzeugten Sequenzen und deren Zuordnung zum Gesamtgenom.
  • Auf dem Markt befinden sich z.Z. eine Reihe von Sequenzierplattformen mit einer unterschiedlichen Fähigkeit, längere DNA -Fragmente zu erfassen. So können z.B. mittels der Nanopore-Sequenzierplattform der Fa. Oxford Nanopore Technologies ohne eine Pre-Amplifizierung unter der Voraussetzung qualitativ hochwertiger hochmolekularer DNA, Sequenzierungen von Fragmenten in Megabasen-Länge erfolgen (Ultra-Long DNA Sequencing Kit SQK-ULK001).
  • Für den Erfolg des gesamten Sequenzierungsprozesses reicht aber die theoretische Möglichkeit, längere Fragmente zu sequenzieren, nicht aus. Sowohl die DNA-Probe sollte ursprünglich die erforderliche DNA-Fragment-Länge beinhalten als auch sollte diese DNA in der erforderlichen Menge nach der sogenannten Tagmentation (Herstellung einer DNA-Library für die nachfolgende Nanoporensequenzierung) wieder zu gewinnen sein. Für die Vorbereitung der DNA-Probe werden von Oxford Nanopore Technologies die Monarch HMW DNA Extraction Kits (New England Biolabs) empfohlen. Der gesamte Zeitaufwand wird im Protokoll auf 100 Minuten eingeschätzt. Diese Methode ist aber nicht für die Wiederaufarbeitung der DNA nach der Tagmentation geeignet. Die Kits basieren auf der Bindung von hochmolekularer DNA an Glaskugeln. Das Verfahren benötigt aber alkoholische Komponenten (Isopropanol und Ethanol) sowohl für die Bindung der DNA als auch für die notwendigen Waschschritte. Das Problem liegt darin, dass zur Durchführung einer Sequenzierung der ultralangen DNA sog. Transposase-Fragmentierung basierte DNA-Bibliotheken (DNA-Libraries) hergestellt werden. Nach der Fragmentierung der DNA mit Transposasen, begleitet von einem simultanen Einbau von Transposon-Sequenzen, erfolgt die Anbindung der mit dem sogenannten Motor-Protein gekoppelten Adaptoren. Nach der Erzeugung dieser DNA Library müssen die nichtgebundenen Adaptoren von der Bibliothek entfernt werden, damit diese die Kapazitäten der Sequenzierporen nicht unnötig überlasten. Diese Aufreinigung muss zwingend ohne Isopropanol oder Ethanol etc. erfolgen, damit das Motor-Protein nicht zerstört wird. Das bedeutet, dass es nicht möglich ist, bekannte klassische Aufreinigungsverfahren zu nutzen, welche bekannter Weise hoch effizient und schnell funktionieren (z.B. Bindung der DNA an feste Phasen unter Vermittlung von Ethanol oder Isopropanol und unter Verwendung von Isopropanol oder Ethanol enthaltenden Waschpuffern).
  • Für die Aufreinigung einer DNA Library für eine nachfolgende Nanoporensequenzierung empfiehlt die Fa. ONP die Durchführung einer Spermin-Fällung (Zeitaufwand ca. 12 Stunden). Hierfür wird empfohlen, eine 16,8 millimolare Spermin-Lösung herzustellen und diese 1: 1 mit der vorbereiteten DNA-Bibliothek zu vermischen. Nach einer Rotator-Mixer-Inkubation wird die Probe zentrifugiert, um das DNA-Pellet zu erzeugen. Das Pellet soll mindestens 12 Stunden in einem Elution Buffer gelöst werden. Das Problem dieser Methodik liegt dabei am Verhältnis zwischen der Spermin - und DNA-Konzentration. Je niedriger die DNA -Konzentration ist, desto höher soll die Spermin-Konzentration sein (E. Raspaud et al. Precipitation of DNA by Polyamines: A Polyelectrolyte Behavior, Biophysical Journal 1998). Somit führt die geringste Abweichung der angegebenen DNA-Konzentration zu einer ineffizienten Fällungsreaktion und damit zum Verlust an DNA. Eine Erhöhung der Spermin-Konzentration führt dann wieder zum Risiko einer potenziellen „Verstopfung“ der Sequenzierporen. Darüber hinaus macht eine über 12 Stunden dauernde Resuspension der pelletierten DNA es unmöglich, das Experiment an einem Tag vorzubereiten.
  • Beschrieben sind alternative Varianten zur Aufreinigung einer DNA Library für die Nanoporensequenzierung. Kommerziell verfügbar ist ein Kit der Fa. Circulomics (Matthew W. Mitchell et al. High molecular weight DNA extraction and long-read nextgeneration sequencing of human genomic reference standards. ASHG Virtual Meeting 2020). Eine Circulomix Nanobind-Disc wird zu der vorbereiteten Bibliothek zugegeben und mittels eines alkoholfreien Bindungspuffers an die Disk gebunden, alkoholfrei gewaschen und anschießend eluiert. Auch hier soll mindestens 12 Stunden gewartet werden, bevor die DNA für die Sequenzierung eingesetzt werden kann. Dieser Kit ist sehr teuer. Darüber hinaus kann er nicht für die vorhergehende Extraktion hochmolekularen DNA eingesetzt werden. Dazu benötigt man einen weiteren Kit. Auch ist das Verfahren nicht automatisiert umgesetzt.
  • Eine weitere publiziert Methode zur Aufreinigung der DNA Library basiert auf der Verwendung von Hexamminecobalt (III) Chlorid und Glasbeads (Inswasti Cahyani et al. FindingNemo in OneDay: Ultra-Long ONT Library Preparation from Cell to Flowcell in One Day, www.protocols.io).
  • Keine dieser aufgeführten Methoden liefert aber eine ganzheitliche Lösung für die Probenvorbereitung für Nanoporensequenzierung (Extraktion hochmolekularer DNA und Aufreinigung der DNA-Library nach Tagmentation). Dies sowohl in Form einer manuellen Umsetzung als auch in Form eines automatisierten Protokolls.
  • Aufgabe der Erfindung
  • Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und vor allem schnelles Verfahren zur Aufreinigung erzeugter Bibliotheken für die Nanoporensequenzierung bereitzustellen bzw. darüber hinaus generell ein Verfahren und einen Kit zu haben, der die gesamte Probenvorbereitung für eine Nanoporensequenzierung ermöglicht (Extraktion hochmolekularer DNA und Aufreinigung der DNA Library). Dabei sollte das Verfahren manuell und auch automatisiert durchgeführt werden können.
  • Lösung der Aufgabe
  • Überraschenderweise kann die Aufgabe mittels der vorliegenden Erfindung in idealer Weise gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst werden.
  • Die Erfindung nutzt vorzugsweise die u.a. aus den Patent-Schriften ( US 10,851,368 B2 ; US 10,704,039 B2 ; US 10,936,540 B2 ) bekannte Möglichkeit der Adsorption von DNA an rauen oder strukturierten Oberflächen. Diese Patentschriften beschreiben die Adsorption von DNA an raue oder strukturierte Oberflächen von nach Lyse freigesetzter Nukleinsäure in Anwesenheit von (vorzugsweise) Ethanol oder Isopropanol, dem nachfolgenden Waschen der Nukleinsäuren mit ethanolhaltigen Puffern und der finalen Ablösung der Nukleinsäuren mittels eines Niedrigsalzpuffers bzw. mittels Wasser. Es findet sich aber kein Hinweis darauf, DNA für die Herstellung einer Bibliothek für die nachfolgende Nanoporensequenzierung mittels des Ultra-Long DNA Sequencing Kit (SQK-ULK001; Oxford Nanopore Technologies) aufzureinigen. Hierbei besteht die Schwierigkeit darin, dass alkoholische Komponenten wie Ethanol oder Isopropanol nicht eingesetzt werden dürfen, da diese Komponenten zur Denaturierung des an die Adaptoren gekoppelten Motor-Proteins führen würden. Deshalb bedurfte es eines Verfahrens, welches eine effiziente Adsorption der erzeugten langkettigen DNA-Fragmente der hergestellten DNA-Bibliothek ohne die Verwendung von Ethanol oder Isopropanol erlaubt. In den schon obig zitierten Patentschriften wird für die Adsorption der DNA immer Ethanol oder Isopropanol eingesetzt. Auch dürfen die Waschpuffer diese Komponenten nicht enthalten. Überaschenderweise eignet sich eine Kombination von Polyethylenglycol (ein Polyether) mit einem monovalenten oder auch multivalenten Salz in hervorragender Weise zur Adsorption der DNA- Fragmente an bekannte raue oder strukturierte Oberflächen. Die adsorbierten Fragmente werden mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens dann ohne die bisher Verwendung findenden alkoholhaltigen Waschpuffer gewaschen. Es zeigt sich, dass ein Waschpuffer unter Verwendung einer Tris-Lösung völlig ausreichend dafür ist. Dieser Waschpuffer hat darüber hinaus auch den Vorteil, dass eine Alkoholentfernung nicht mehr notwendig ist. Das Verfahren, welches auf den erfindungsgemäßen neuen Komponenten basiert, ist sehr einfach und schnell. Als raue oder strukturierte Oberflächen können dieselben Materialien eingesetzt werden, welche aus den aufgeführten Patentschriften bekannt sind. Dabei werden für die manuelle Durchführung vorzugsweise magnetische Plastikmaterialien unterschiedlicher Formen und Größen mit rauen Oberflächen eingesetzt. Für die automatisierte Umsetzung werden angeraute Plastikmaterialien eingesetzt, die bei kommerziell verfügbaren Extraktionsautomaten normalerweise für die Separation von magnetischen Beads Verwendung finden. Bei diesen Automaten handelt es sich um sog. Walk-Away-Plattformen, welche Plastikkämme für die Separation von magnetischen Beads nutzen. Ein weltweit bekanntes diesbezügliches System ist der sog. Magnetic Particle Processor „KingFisher“ der Firma Thermo. Es existieren weltweit eine Vielzahl ähnlicher Automaten, welche alle dasselbe Prinzip nutzen. Für das erfindungsgemäße Verfahren benötigt man keine magnetischen Beads. Die Plastikkämme werden leicht angeraut. Dies ermöglicht dann die direkte Adsorption der DNA-Fragmente an die Plastikkämme unter Nutzung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • Für die manuelle Aufreinigung der Bibliotheken wird der Reaktionsmix in einem Reaktionsgefäß mit Polyethylenglycol und einem monovalenten oder divalenten Salz versetzt und in Kontakt mit einem Material mit rauer oder strukturierter Oberfläche gebracht, welches vorzugsweise magnetisch bzw. paramagnetisch ist. Das Gefäß wird mehrmals vorsichtig invertiert, damit die langkettigen DNA-Fragmente nicht geschert werden. Die DNA-Fragmente adsorbieren an die Oberfläche. Das Gefäß wird in ein Magnetrack gestellt. Das raue Material wird fixiert und der Überstand wird abgegossen. Danach erfolgt die Zugabe eines Waschpuffers ohne Ethanol oder Isopropanol, vorzugsweise wird ein Tris-Puffer verwendet, das Gefäß wird im Magnetrack gelassen und einige Male vorsichtig invertiert. Der Überstand wird abgegossen. Der Waschschritt wird ein weiteres Mal wiederholt. Nach dem letzten Waschschritt erfolgt die Zugabe von ddH2O (doppelt-destilliertes Wasser). Nachfolgend wird das Gefäß mit den rauen Materialien einige Zeit bei leichtem Schütteln inkubiert, damit die gebundenen DNA-Fragmente in Lösung gehen können. Nach dieser Inkubation kann die DNA - Bibliothek gelagert oder auch sofort für die Nanoporensequenzierung verwendet werden.
  • Der gesamte Prozess benötigt somit weniger als eine Stunde und ist damit viel schneller als die bisher Verwendung findenden Methoden. Bei der automatisierten Methode unter Verwendung von Walk-Away-Plattformen, welche wie schon beschriebenen Plastikkämme nutzen, wird die Aufreinigung ebenfalls unter der Verwendung der beschriebenen Reagenzien durchgeführt. Die Adsorption der DNA-Fragmente an die Plastikkämme erfolgt durch eine langsame Vertikalbewegung des Kammes in die Reaktionskavität, in welcher sich der Reaktionsansatz befindet. Nach erfolgtem Adsorptionsschritt bewegt sich der Kamm in die Kavität mit dem Waschpuffer. Gewaschen wird durch ein kurzes Eintauchen des Kammes in den Puffer. Der Waschschritt wird wiederholt. Im letzten Schritt wird dann wieder die DNA in Wasser gelöst. Dies erfolgt durch eine langsame Ein- und Auftauchbewegung des Kammes. Danach kann die gelöste DNA sofort für die Nanoporensequenzierung eingesetzt werden oder wird für einen späteren Einsatz im Kühlschrank gelagert. Auch die automatisierte Aufreinigung ist in weniger als einer Stunde beendet. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und Mittel steht damit eine sehr einfache, effiziente und schnelle Möglichkeit zur Verfügung, welche es erlaubt, DNA-Fragmente einer erzeugten DNA-Bibliothek für eine nachfolgende Nanoporensequenzierung aufzureinigen. Dabei kann das Verfahren automatisiert oder manuell durchgeführt werden. Überaschenderweise offenbarte sich noch ein weiterer Vorteil, wenn man für die Adsorption von DNA an raue Oberflächen eine Mischung aus Polyethylenglycol und monovalent oder multivalenten Salzen einsetzt.
  • Das Verfahren eignet sich nicht nur für die Aufreinigung der DNA-Bibliothek, sondern auch für die Extraktion hochmolekularer DNA, welche man für die Herstellung der DNA-Bibliothek benötigt. Für die Extraktion hochmolekularer DNA gibt es kommerziell verfügbare Produkte der Firmen NEB und Circulomics. Allerdings ist in der Regel die Aufreinigung hochmolekularer DNA arbeits- und zeitaufwendig. Automatisierte Anwendungen sind kommerziell kaum zu finden. Ein weiterer wesentlicher Nachteil besteht auch darin, dass sich die verfügbaren Methoden und verwendeten Reagenzien bzw. Kits für die Extraktion der hochmolekularen DNA und der notwendigen Aufreinigung von für die Sequenzierung vorbereiteter Bibliotheken unterscheiden. Es gibt keinen Kit, welcher es erlaubt, beide Verfahren umzusetzen.
  • Auf Basis der vorliegenden Erfindung ist es möglich, mit einem Kit sowohl hochmolekulare DNA aus einer biologischen Probe zu isolieren, als auch die Aufreinigung der Bibliothek zu ermöglichen. Ein solches Produkt bzw. Verfahren gibt es weltweit nicht. Dem Fachmann wäre der Vorteil der Verfügbarkeit einer solchen Lösung bekannt. Ein solcher Kit benötigt lediglich zusätzliche Reagenzien zur Probenlyse (Lysepuffer und proteolytisches Enzym) und ggf. einen Waschpuffer, der auch eine ethanolhaltige Komponente enthalten kann. Erfindungsgemäß würde ein solcher Kit für eine manuell durchführbare Extraktion hochmolekularer DNA aus einer biologischen Probe sowie die spätere Aufreinigung der Bibliothek folgende Komponenten enthalten:
    1. 1. Lysepuffer und Proteinase K
    2. 2. Polyethylenglycol - Lösung
    3. 3. Magnesiumchlorid - Lösung (als multivalentes Salz)
    4. 4. optional ein Waschpuffer auf Ethanol-Basis
    5. 5. Tris-Lösung als ein Waschpuffer ohne alkoholische Komponenten
    6. 6. Material mit rauer Oberfläche aus Plastik, die magnetisch ist (Granulat oder Kugeln)
    7. 7. ddH2O
  • Der Ablauf der Extraktion ist nachfolgend kurz skizziert:
  • Extraktion hochmolekularer DNA
    1. 1. Lyse der Ausgangsprobe (Zellen, Gewebe, Bakterien etc.) mittels Zugabe eines Lysepuffers und Proteinase K.
    2. 2. Nach erfolgter Lyse der Ausgangsprobe erfolgt die Zugabe einer definierten Menge an Polyethylenglycol und Magnesiumchlorid sowie Zugabe des rauen Materials.
    3. 3. Mehrmaliges vorsichtiges Invertieren des Reaktionsgefäßes.
    4. 4. Platzieren des Gefäßes in ein Magnetrack. Fixierung des rauen Materials mit der adsorbieren DNA und Abgießen des Überstandes.
    5. 5. Zugabe eines ethanolhaltigen Waschpuffers und dreimaliges Invertieren des Gefäßes und Abgießen des Überstandes. Wiederholung des Schrittes.
    6. 6. Zugabe einer Tris-Lösung und dreimaliges Invertieren des Gefäßes und Abgießen des Überstandes.
    7. 7. Zugabe von Wasser und lösen der DNA durch Inkubation in einem Thermoshaker bei 300 rpm und 37°C für ca. 30 min.
  • Nach dieser Zeit kann die hochmolekulare DNA direkt für die Herstellung einer DNA - Bibliothek für die Nanoporensequenzierung eingesetzt werden. Es ist natürlich auch möglich, die DNA nachfolgend sachgemäß aufzubewahren und zu einem späteren Zeitpunkt zu nutzen.
  • Für die Nanoporensequenzierung mittels der des Kits Ultra-Long DNA Sequencing Kit SQK-ULK001 (Oxford Nanopore Technologies) wird eine definierte Menge an DNA für die Herstellung der DNA- Bibliothek eingesetzt. Nachdem dieser Schritt abgeschlossen ist, erfolgt mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und Kits die Aufreinigung der Bibliothek wie folgt:
    1. 1. Zugabe einer definierten Menge an Polyethylenglycol und Magnesiumchlorid sowie Zugabe des rauen Materials zum Reaktionsansatz mit der erzeugten Bibliothek.
    2. 2. Mehrmaliges vorsichtiges Invertieren des Reaktionsgefäßes.
    3. 3. Platzieren des Gefäßes in ein Magnetrack. Fixierung des rauen Materials mit der adsorbieren DNA und Abgießen des Überstandes.
    4. 4. Zugabe einer Tris-Lösung zum Waschen der adsorbierten DNA und dreimaliges Invertieren des Gefäßes und Abgießen des Überstandes.
    5. 5. Zugabe von Wasser und lösen der DNA durch Inkubation in einem Thermoshaker bei 300 rpm und 37°C für ca. 30 min.
  • Die DNA kann jetzt direkt für die Sequenzierung auf die Flow Cell aufgetragen werden, kann aber auch gelagert und zu einem späteren Zeitpunkt eingesetzt werden.
  • In analoger Weise kann die kombinierte Extraktion hochmolekularer DNA und die nachfolgende Aufreinigung der Bibliothek automatisiert umgesetzt werden. Dies erfolgt mittels der schon beschriebenen Nutzung von Walk-Away-Plattformen unter Verwendung von rauen Plastikkämmen. Das Verfahren ist einfach in der Durchführung und sehr schnell. Darüber hinaus können mit der Nanoporensequenzierung sehr lange Fragmente sequenziert werden. Dies ist ein sehr wichtiges Qualitätsmerkmal.
  • Die Erfindung ist nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen beschrieben.
  • Ausführungsbeispiele
  • Ausführungsbeispiel 1:
  • Manuelle Extraktion hochmolekularer DNA aus Blut für eine nachfolgende Nanoporensequenzierung mittels des Ultra-Long DNA Sequencing Kit SQK-ULK001 (Oxford Nanopore Technologies) einschließlich der Aufreinigung der erzeugten DNA-Bibliothek
  • Eingesetzt wurden 3 ml einer Vollblutprobe. Nach Lyse der Erythrozyten wurde das resultierende Zellpellet der kernhaltigen Blutzellen mit 130 µl 1 x PBS-Puffer resuspendiert und in ein 2.0 ml Reaktionsgefäß überführt. Danach erfolgte die Zugabe von 200 µl eines Lysepuffers (Lysis Solution CBV; IST Innuscreen GmbH) sowie 30 µl Proteinase K. Die Zelllyse erfolgte bei 55°C in einem Thermomixer für 15 min. Nach erfolgter Lyse wurde der Ansatz mit 3 paramagnetischen Plastik-Kugeln mit angerauter Oberfläche (Durchmesser 3 mm; Polypropylen) versetzt. Danach erfolgte die Zugabe von 200 µl einer 40%igen Polyethylenglycol-Lösung (PEG-Lösung) und von 40 µl Magnesiumchlorid (400 mM). Das Gefäß wurde dann 30-mal vorsichtig um 180° invertiert. Bei diesem Schritt adsorbiert die hochmolekulare DNA and die raue Oberfläche der paramagnetischen Kügelchen. Das Gefäß wurde anschließend zur Fixierung der Kügelchen in ein Magnet-Rack gestellt und der Lyseansatz wurde ausgegossen. Danach erfolgte die Zugabe eines Waschpuffers (Washing Solution MS; IST Innuscreen GmbH). Dass Gefäß wurde am Magnet-Rack belassen und 3 mal invertiert und der Waschpuffer abgegossen. Der Waschschritt wurde ein weiteres Mal wiederholt. Danach erfolgte die Zugabe von 800 µl einer Tris-Lösung (100 mM Tris-HCl; pH 8). Das Gefäß wurde zweimal invertiert und die Tris-Lösung wurde abgegossen. Durch diesen letzten Waschschritt mit einer nicht ethanolhaltigen Lösung ist ein finaler Trocknungsschritt zur vollständigen Ethanolentfernung nicht mehr notwendig. Die an den Kügelchen befindliche DNA wurde nach Zugabe von 200 µl ddH2O gelöst, wobei dazu das Gefäß für ca. 30 min bei 300 rpm und einer Temperatur von 37°C inkubiert wurde. Die hochmolekulare DNA wurde mittels einer Wide-Bore-Pipettenspitze in ein neues Gefäß überführt und dabei mehrmals vorsichtig auf- und abpipettiert. Die DNA wurde spektrophotometrisch vermessen und eine Menge von 45 µg DNA in einem Volumen von 400 µl für die weitere Nanoporensequenzierung mittels des Ultra-Long DNA Sequencing Kit SQK-ULK001 (Oxford Nanopore Technologies) eingesetzt. Nach erfolgter DNA-Bibliothek Herstellung ist es notwendig, überschüssigen Adaptoren zu entfernen. Dies erfolgte mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens nachfolgend. Dazu wurde der Ansatz wiederum mit einer PEG Lösung (40%) und Magnesiumchlorid-Lösung (400 mM) sowie mit angerauten paramagnetischen Plastik-Kügelchen versetzt. Das Gefäß wurde dann 30-mal vorsichtig um 180° zur Adsorption der hochmolekularen DNA an die raue Oberfläche der paramagnetischen Kügelchen invertiert. Das Gefäß wurde anschließend zur Fixierung der Kügelchen in ein Magnet-Rack gestellt und der Reaktionsansatz wurde ausgegossen. Danach erfolgte die Zugabe von 800 µl einer Tris-Lösung (100 mM Tris-HCl; pH 8). Das Gefäß wurde zweimal invertiert und die Tris-Lösung abgegossen. Der Waschschritt wurde ein weiteres Mal wiederholt. Wichtig war bei der Aufreinigung der DNA-Library, dass keine alkoholischen Komponenten als Waschpuffer oder Bindungspuffer eingesetzt werden, da dies zur Zerstörung der Bibliothek führen würde. Die an den Kügelchen befindliche DNA wurde nach Zugabe von 225 µl ddH2O gelöst, wobei dazu das Gefäß für ca. 45 min bei 300 rpm und einer Temperatur von 37°C inkubiert. Nach erfolgter DNA-Extraktion, Herstellung der DNA-Bibliothek und Aufreinigung der DNA-Bibliothek erfolgt die Überführung der Probe in das Gerät Minion (Oxford Nanopore Technologies) zur Durchführung einer Long-Read-Sequenzierung. Mittels dieser Technologie konnte gezeigt werden, dass unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit der Kombination von Extraktion hochmolekularer DNA und Aufreinigung der DNA-Bibliothek sehr hohe Leseweiten erzielbar sind (Leseweiten bis > 300.000 Basenpaare). Das gesamte Verfahren ist in ca. 2 Stunden abgeschlossen, was es erlaubt, noch am selben Arbeitstag die Sequenzierung zu starten. Darüber hinaus ist das Verfahren sehr einfach in der Durchführung.
  • Ausführungsbeispiel 2: Automatisierte Extraktion hochmolekularer DNA aus Blut für eine nachfolgende Nanoporensequenzierung mittels des Ultra-Long DNA Sequencing Kit SQK-ULK001 (Oxford Nanopore Technologies) einschließlich der Aufreinigung der erzeugten DNA-Bibliothek unter Verwendung einer Walk-Away-Plattform (KingFisher Flex; Thermo)
  • Eingesetzt wurden 3 ml einer Vollblutprobe. Nach Lyse der Erythrozyten wurde das resultierende Zellpellet der kernhaltigen Blutzellen mit 130 µl 1 x PBS-Puffer resuspendiert und in eine Kavität einer 96-Well Deep Well Platte zur Abarbeitung des automatisierten Protokolls auf dem KingFisher Flex-Geräte überführt. Bei der automatisierten Methode unter Verwendung von Walk-Away-Plattformen (wie hier unter Verwendung des Gerätes KingFisher Flex) erfolgt die Adsorption der hochmolekularen DNA an die schon beschriebenen Plastikkämme, welche diese Gerätesysteme verwenden. Die Extraktion wurde ebenfalls unter der Verwendung der für den manuellen Prozess beschriebenen Reagenzien durchgeführt. Nach erfolgter automatisierter Probenlyse auf dem Gerät erfolgte die Adsorption der DNA-Fragmente an die Plastikkämme durch eine langsame Vertikalbewegung des Kammes in der Reaktionskavität, in welcher sich der Reaktionsansatz befindet. Nach erfolgtem Adsorptionsschritt der hochmolekularen DNA bewegt sich der Kamm sukzessive in die Deep Well-Platten-Kavitäten mit den Waschpuffern, wobei bei der Extraktion der hochmolekularen DNA mit einem ethanolhaltigen Waschpuffer gewaschen wird. Der letzte Waschschritt erfolgt dann wieder mit einer Tris-Lösung. Die hochmolekulare DNA wurde mittels einer Wide-Bore-Pipettenspitze aus der Kavität der Deep-Well-Platte in ein neues Gefäß überführt und dabei mehrmals vorsichtig auf- und abpipettiert. Die DNA wurde spektrophotometrisch vermessen und eine Menge von 45 µg DNA in einem Volumen von 400 µl für die weitere Nanoporensequenzierung mittels des Ultra-Long DNA Sequencing Kit SQK-ULK001 (Oxford Nanopore Technologies) eingesetzt. Nach erfolgter DNA-Bibliothek Herstellung erfolgte dann unter Nutzung der schon im Ausführungsbeispiel 1 aufgeführten Reagenzien die die automatisierte Aufreinigung der DNA-Bibliothek, um die überschüssigen Adaptoren zu entfernen. Bei der automatisierten Aufreinigung der DNA Library wird nur mit der Tris-Lösung gewaschen. Gewaschen wird durch ein kurzes Eintauchen des Kammes in den jeweiligen Puffer. Im letzten Schritt wird dann wieder die DNA in Wasser gelöst. Dies erfolgt durch eine langsame Ein- und Auftauchbewegung des Kammes. Nach der automatisierten Extraktion hochmolekularer DNA, der Herstellung der DNA-Bibliothek und automatisierten Aufreinigung der DNA-Bibliothek erfolgt die Überführung der Probe in das Gerät Minion (Oxford Nanopore Technologies) zur Durchführung einer Long-Read-Sequenzierung. Mittels dieser Technologie konnte gezeigt werden, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens der Kombination von automatisierter Extraktion hochmolekularer DNA und Aufreinigung der DNA-Bibliothek sehr hohe Leseweiten erzielbar sind (Leseweiten bis > 300.000 Basenpaare). Das gesamte Verfahren ist in ca. 2 Stunden abgeschlossen, was es erlaubt, noch am selben Arbeitstag die Sequenzierung zu starten. Darüber hinaus ist das Verfahren sehr einfach in der Durchführung.
  • Definitionen:
  • Einwertiger Alkohol:
  • Alkohole mit nur einer OH-Gruppe wie Ethanol oder Isopropanol
  • Polyether:
  • Langkettige Verbindungen der Art
    Figure DE102022115445B4_0001
    heißen Polyether (auch Polyalkylenglycole, Polyetherpolyole, Polyalkylenoxide). Beispiele für diese Gruppe polymerer Ether sind Polyethylenglycol und Polypropylenglycol. PEG 6000 oder PEG 8000 bedeutet, dass n= 6000 bzw. 8000 ist.
  • TRIS:
  • Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Kurzbezeichnung TRIS oder THAM), auch Tromethamin, Trometamol (INN) sowie TRIS-Puffer genannt. Chemisch handelt es sich um ein primäres Amin mit drei alkoholischen Hydroxygruppen. Vorzugsweise wird dessen Salz (Hydrochlorid) verwendet mit einem pH-Wert von 7-9, vorzugsweise pH = 8.
  • Hochmolekulare DNA:
  • DNA mit größer gleich 100.000 bp.

Claims (11)

  1. Verfahren zur Extraktion hochmolekularer DNA aus einer biologischen Probe und / oder Aufreinigung einer DNA-Library, dadurch gekennzeichnet, dass nach ggf. Lyse der biologischen Probe und / oder nach Herstellung der DNA-Library der Ansatz mit einer Kombination aus einem Polyether und mindestens einem Salz sowie in Abwesenheit einwertiger Alkohole in Kontakt gebracht wird, wobei anschließend die DNA an eine feste Phase gebunden und anschließend die DNA ohne Verwendung einwertiger Alkohole gereinigt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Polyether Polyethylenglycol (PEG), vorzugsweise PEG 6000 oder PEG 8000 eingesetzt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Salz MgCl2 verwendet wird, vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 1 bis 100 mM, insbesondere zwischen 5 und 50 mM.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Polyether und Salz sich in entsprechenden Konzentrationen zusammen in einem Puffer befinden.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phase ein Material mit rauer oder strukturierter Oberfläche verwendet wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Waschpuffer ohne einwertigen Alkohol für die Reinigung der gebundenen DNA ein Aminoalkohol verwendet wird, vorzugsweise TRIS.
  7. Verfahren zur Extraktion hochmolekularer DNA aus einer biologischen Probe, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Lyse der biologischen Probe b) Zugabe von Polyethylenglycol und Magnesiumchlorid sowie Zugabe des rauen Materials c) Fixierung des rauen Materials mit der adsorbieren DNA und Abgießen des Überstandes d) Zugabe eines Waschpuffers e) Zugabe von Wasser und lösen der DNA
  8. Verfahren zur Aufreinigung einer DNA-Library, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Zugabe von Polyethylenglycol und Magnesiumchlorid sowie Zugabe des rauen Materials zum Reaktionsansatz mit der erzeugten Bibliothek b) Fixierung des rauen Materials mit der adsorbieren DNA und Abgießen des Überstandes c) Zugabe eines Waschpuffers ohne einwertigen Alkohol d) Zugabe von Wasser und lösen der DNA
  9. Automatisiertes Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei sich der Lyseansatz bzw. der Reaktionsansatz mit der erzeugten Bibliothek in einem Walk-Away-Extraktionsgerät befindet, welches Plastikstäbe verwendet, welche eine raue oder strukturierte Oberfläche aufweisen, an denen die DNA unter Zugabe von Polyethylenglycol und Magnesiumchlorid durch vertikale Bewegung der Plastikkämme innerhalb der Probe adsorbiert und sich diese Plastikkämme nach dem walk-away-Prinzip in Gefäße mit dem Waschpuffer und final in die wässrige Lösung bewegen.
  10. Kit für eine manuell durchführbare Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend: a) Lysepuffer b) Polyethylenglycol - Lösung c) Magnesiumchlorid - Lösung d) Tris-Lösung als ein Waschpuffer e) Material mit rauer Oberfläche aus Plastik, die magnetisch ist (Granulat oder Kugeln) f) ddH2O
  11. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 für eine nachfolgende Nanoporensequenzierung
DE102022115445.9A 2022-06-21 2022-06-21 Verfahren und kit zur manuellen und automatisierten probenvorbereitung von long-read-sequenzierungen Active DE102022115445B4 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102022115445.9A DE102022115445B4 (de) 2022-06-21 2022-06-21 Verfahren und kit zur manuellen und automatisierten probenvorbereitung von long-read-sequenzierungen
PCT/EP2023/066800 WO2023247628A1 (de) 2022-06-21 2023-06-21 Verfahren und kit zur manuellen und automatisierten probenvorbereitung von long-read-sequenzierungen

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102022115445.9A DE102022115445B4 (de) 2022-06-21 2022-06-21 Verfahren und kit zur manuellen und automatisierten probenvorbereitung von long-read-sequenzierungen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE102022115445A1 DE102022115445A1 (de) 2023-12-21
DE102022115445B4 true DE102022115445B4 (de) 2024-07-04

Family

ID=87556387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102022115445.9A Active DE102022115445B4 (de) 2022-06-21 2022-06-21 Verfahren und kit zur manuellen und automatisierten probenvorbereitung von long-read-sequenzierungen

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102022115445B4 (de)
WO (1) WO2023247628A1 (de)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102015216558A1 (de) 2015-04-23 2016-10-27 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren und testkit zur schnellen isolierung von nukleinsäuren mittels rauer oberflächen
DE102017204267A1 (de) 2017-03-14 2018-09-20 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren zur anreicherung von zellen aus einer probe und der nachfolgenden nukleinsäureisolierung aus diesen zellen

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090306359A1 (en) * 2002-11-08 2009-12-10 Timo Hillebrand Non-alcoholic buffer formulations for isolating, purifying and recovering long-chain and short-chain nucleic acids
US20060270843A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Hall Gerald E Jr Methods for isolation of nucleic acids
EP2954054B1 (de) * 2013-02-08 2018-12-05 Qiagen GmbH Verfahren zum trennen von dna anhand der grösse
DE102014211221A1 (de) * 2014-06-12 2015-12-17 Robert Bosch Gmbh Verfahren zur Anreicherung und/oder Aufreinigung von Nukleinsäuren
JP6797185B2 (ja) 2015-04-23 2020-12-09 エイ・ジェイ イヌスクリーン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＡＪ Ｉｎｎｕｓｃｒｅｅｎ ＧｍｂＨ 核酸を自動的に抽出する装置および方法
EP3645159A4 (de) * 2017-06-30 2021-03-31 Circulomics Inc. Reinigung durch grössenauswahl unter verwendung eines thermoplastischen kieselsäurenanomaterials
US10936540B2 (en) 2018-03-14 2021-03-02 Netapp, Inc. Methods for accelerating storage media access and devices thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102015216558A1 (de) 2015-04-23 2016-10-27 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren und testkit zur schnellen isolierung von nukleinsäuren mittels rauer oberflächen
DE102017204267A1 (de) 2017-03-14 2018-09-20 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren zur anreicherung von zellen aus einer probe und der nachfolgenden nukleinsäureisolierung aus diesen zellen

Also Published As

Publication number Publication date
DE102022115445A1 (de) 2023-12-21
WO2023247628A1 (de) 2023-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69030449T2 (de) Verfahren und kit zur reinigung von nukleinsäure
DE69817484T2 (de) Verfahren zur isolierung bestimmter biologischer stoffe mittels magnetischer silika-partikel
EP2283026B1 (de) Verfahren zur anreicherung und isolierung von biomolekülen oder viren
DE102005060738A1 (de) Verfahren zur Extraktion von Biomolekülen aus fixierten Geweben
EP3286325B1 (de) Verfahren und testkit zur schnellen isolierung von nukleinsäuren mittels rauer oberflächen
DE102008009920A1 (de) Mobiles Gerät für die Nukleinsäureisolierung
EP1995316A1 (de) Verfahren zur schonenden Zellaufreinigung, Zellgewinnung und Transfektion von Zellen
DE102017204267B4 (de) Verfahren zur anreicherung von zellen aus einer probe und der nachfolgenden nukleinsäureisolierung aus diesen zellen
WO2012084909A1 (de) Extraktion von nukleinsäuren
US6852495B2 (en) Process of extracting nucleic acid and process of simultaneously carrying out extraction and purification of nucleic acid
DE102016214909B4 (de) Tragbare Nukleinsäure-Extraktionsvorrichtung und Verfahren zu deren Verwendung
EP1560926B1 (de) Neuartige pufferformulierungen zur isolierung, reinigung und rückgewinnung lang- und kurzkettiger nukleinsäuren
EP1771242B1 (de) Verfahren zur effizienten isolierung von nukleinsäuren
EP2010672B1 (de) Formulierungen und verfahren zur isolierung von nukleinsäuren aus beliebigen komplexen ausgangsmaterialien und nachfolgende komplexe genanalytik
DE102022115445B4 (de) Verfahren und kit zur manuellen und automatisierten probenvorbereitung von long-read-sequenzierungen
DE102011054474B4 (de) System zur Stabilisierung, Aufbewahrung und Lagerung einer Nukleinsäure
DE19916534A1 (de) RNA-Isolierungs-Kit
EP2134840A1 (de) Verfahren zur aufreinigung von biomolekülen
DE10253351B4 (de) Neuartige Pufferfomulierungen zur Isolierung, Reinigung und Rückgewinnung lang- und kurzkettiger Nukleinsäuren
DE102015211715A1 (de) Verfahren zur Anreicherung von Mikrovesikeln
DE10033991A1 (de) Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren
EP1693453B1 (de) Verfahren zur Isolierung und Trennung von einzel- und doppelsträngigen Nucleinsäuren sowie Trennsäule zur Durchführung des Verfahrens
DE102015216558A1 (de) Verfahren und testkit zur schnellen isolierung von nukleinsäuren mittels rauer oberflächen
DE102015211394B4 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren
DE102010014840B4 (de) DNase-beschichtete magnetische Partikel

Legal Events

Date Code Title Description
R012 Request for examination validly filed
R016 Response to examination communication
R018 Grant decision by examination section/examining division