EP2134840A1 - Verfahren zur aufreinigung von biomolekülen - Google Patents

Verfahren zur aufreinigung von biomolekülen

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Publication number
EP2134840A1
EP2134840A1 EP08718091A EP08718091A EP2134840A1 EP 2134840 A1 EP2134840 A1 EP 2134840A1 EP 08718091 A EP08718091 A EP 08718091A EP 08718091 A EP08718091 A EP 08718091A EP 2134840 A1 EP2134840 A1 EP 2134840A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
biomolecules
centrifugation
sample
reaction vessel
acceleration value
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP08718091A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Friederike Wilmer
Anja Schultz
Claudia Fritz
Claudia Dienemann
Andreas Schäfer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen GmbH
Original Assignee
Qiagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiagen GmbH filed Critical Qiagen GmbH
Publication of EP2134840A1 publication Critical patent/EP2134840A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for the purification of biomolecules, in particular of nucleic acids, such as DNA and RNA molecules.
  • biomolecules from biological samples plays an increasingly important role in basic bio-medical research, clinical research and diagnostics, forensic analysis, population genetic research, epidemiological analytics and related fields. This applies in particular to nucleic acids such as DNA and RNA molecules, but also to amino acids, oligopeptides, polypeptides, monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, fats, fatty acids and / or lipids.
  • the analysis of the genome ie the whole of the cellular DNA, by molecular biological methods, such. As PCR, NASBA, RFLP, AFLP or sequencing allows z. As the detection of genetic defects or the determination of the HLA type and other genetic markers. Moreover, DNA fingerprinting for forensic, population genetic or food law analysis fall under this generic term.
  • the analysis of genomic DNA and RNA is also used for the direct detection of infectious agents such as viruses, bacteria, etc.
  • biomolecules e.g. Amino acids, oligopeptides, polypeptides, monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, fats, fatty acids and / or lipids
  • Amino acids, oligopeptides, polypeptides, monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, fats, fatty acids and / or lipids can be used e.g. Provide information about certain physiological states, about contamination in food, about the content of certain nutrients and so on.
  • a method for purifying nucleic acids following this principle is e.g. the so-called "boom principle" method disclosed in EP389063.
  • a sample containing nucleic acids in the vicinity of a chaotropic salt is placed in a vessel with a silicate matrix. Subsequently, the vessel is centrifuged or a vacuum is applied. This results in the nucleic acids binding to the silicate matrix while all other components of the sample (especially cell debris, organelles, proteins and the like) pass through the silicate matrix and are discarded. Subsequently, the bound nucleic acids are eluted with a suitable agent and supplied for further analysis.
  • binding mechanisms relevant to binding are e.g. in Melzak et al. (1996), Driving Forces for DNA Adsorption to Silica in Perchlorate Solutions, Journal of Colloid and Interface Science 181 (2), 635-644.
  • spin columns are often used for this process.
  • These are microreaction vessels which have a disk-shaped silicate matrix, are open at the bottom, and are placed in another microreaction vessel closed at the bottom.
  • the nucleic acid-containing sample is pipetted into the microreaction vessel together with a chaotropic salt.
  • the combination of both microreaction vessels is introduced into a centrifuge and centrifuged at an acceleration value of about 10,000 xg.
  • the nucleic acids bind to the silicate matrix, while all other constituents of the sample pass through the silicate matrix and are transferred to the second, closed micro reaction vessel. The latter is subsequently discarded, while the bound nucleic acids are eluted with a suitable agent and supplied for further analysis.
  • the present invention has for its object to overcome the described, resulting from the prior art disadvantages.
  • step c) it may be a binding step, a washing step and / or an elution step in step b).
  • the multistage step b) is a binding step in which the biomolecules are bound to the binding matrix by centrifugation.
  • this step may also be a washing step.
  • the method comprises at least one binding step, a washing step and an elution step, which consistently comprise at least one optionally multi-stage centrifugation step.
  • biomolecules are substances selected from the group consisting of nucleic acids, amino acids, oligopeptides, polypeptides, monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, fats, fatty acids and / or lipids.
  • nucleic acids is understood in particular as meaning RNA and DNA.
  • plasmidic, genomic, viral and mitochondrial DNA are suitable as DNA, while mRNA, siRNA, miRNA, rRNA, snRNA, tRNA, hnRNA and total RNA are particularly suitable as RNA.
  • the nucleic acids introduced herein may be any type of polynucleotide that is an N-glycoside or C-glycoside of a purine or pyrimidine base.
  • the nucleic acid can be single, double or multi-stranded, linear, branched or circular. It may correspond to a molecule occurring in a cell, such as genomic DNA or messenger RNA (mRNA), or be generated in vitro, such as Complementary DNA (cDNA), counterstrand RNA (aRNA), or synthetic nucleic acids.
  • the nucleic acid can consist of a few nucleotides or even of many thousands of nucleotides.
  • reaction vessel with a binding matrix is to be understood in the following as a biochemical separation principle in which a binding matrix which associates selectively with certain substances is arranged in a reaction vessel or a miniaturized column.
  • the acceleration value is also referred to as “spin speed” and does not correspond to the rotational speed of the centrifuge, which is usually measured in revolutions per minute (9.81 ms "2) .
  • the acceleration value is determined constructively by the centrifuge drum diameter (effective diameter) and the speed.
  • centrifugation step is understood below to mean a method step which is characterized by a definable duration and a definable acceleration value.
  • This bonding matrix preferably comprises an anion exchanger, a silicate substrate, a plastic substrate, or a chitosan-containing substrate.
  • silicate substrate is to be understood below as a membrane, a pellet, a packing or a disk of porous silicate, which has a large inner surface and is arranged in the reaction vessel so that a solution which is added to the reaction vessel is driven through the membrane, pellet, packing or disc upon application of a vacuum or centrifugation, such that the components in the solution contact the constituents of the matrix.
  • the silicate substrate is preferably a matrix of silica gel.
  • the silicate substrate may be made of pressed glass fibers or "glass beads.” Silicate substrates are used, for example, in the purification kits sold by the assignee under the trademarks QIAprep and RNeasy.
  • Anionenleyer are well known from the prior art.
  • a resin is used here, which, for example, interacts with the negatively charged phosphate residues of the nucleic acid backbone.
  • the salt concentration and pH of the buffers used determine whether the nucleic acid binds to the resin or is eluted from the column.
  • anion exchangers for example, by the applicant under the trademarks! QIAGEN Genomic-tip and Plasmid-tip distributed.
  • Chitosan has only recently come into contact as a binding agent for biomolecules. It is a copolymer of ß-l, 4-glycosidically linked N-acetyl-glucosamine residues and glucosamine residues. Under physiological conditions, chitosan carries net positive charges and is therefore able to bind many negatively charged biomolecules, especially nucleic acids, amino acids, oligo- and polypeptides, fats and fatty acids.
  • the binding matrix prefferably has a silicate substrate and for the sample containing the biomolecule also to be mixed with at least one chaotropic salt prior to centrifugation.
  • This embodiment is particularly suitable for nucleic acids.
  • the separation principle used is based on the "boom principle" method already discussed. In this case, a sample containing nucleic acids is placed in a vessel with a silicate matrix in the presence of a chaotropic salt. Subsequently, the vessel is centrifuged or a vacuum is applied. This results in the nucleic acids binding to the silicate matrix while all other components of the sample (especially cell debris, organelles, proteins and the like) pass through the silicate matrix and are discarded. Subsequently, the bound nucleic acids are eluted with a suitable agent and supplied for further analysis.
  • a columnar reaction vessel having a binding matrix comprising a silicate substrate in a centrifuge, wherein before or after this step, a solution or suspension of a sample containing nucleic acids and at least one chaotropic salt prepared in the reaction vessel or filled into the reaction vessel becomes; b) inserting a first centrifugation step at a first acceleration value;
  • step d) optionally introducing further centrifugation steps between step c) and step d) or after step d);
  • the multi-step centrifugation step is a binding step in which the nucleic acids are bound to the silicate matrix.
  • This embodiment leads to a considerably improved yield of nucleic acids to be purified compared to "one-step processes with silicate matrices" known from the prior art.
  • the washing and / or the elution step are designed in a multi-step manner in the sense of the above protocol.
  • washing or washing steps are preferably carried out with a washing buffer.
  • a washing buffer This may in particular contain ethanol and / or acetone.
  • the elution solution used to elute the biomolecules bound to the binding matrix, in particular nucleic acids, may be e.g. to water (including distilled water) or a low molar solution act.
  • a weakly concentrated saline solution in question.
  • the chaotropic salt is preferably already in solution.
  • the sample containing nucleic acids may be in solution or suspension and closing with a chaotropic salt.
  • sample and chaotropic salt may be present as a solid and be solubilized together.
  • reaction vessel is to be understood in the following to mean a vessel which is optionally closable at the top and optionally open at the bottom "as they eg manufactured and distributed by the applicant.
  • the reaction vessels may preferably be designed so that they fit accurately in a commercially available, slightly larger reaction vessel, as e.g. can be arranged by the company Eppendorf.
  • the larger reaction vessel serves as a collecting vessel for the liquid passing through the binding matrix.
  • the abovementioned process according to the invention has in common that the yield of the biomolecule purification is increased by up to 20% as a result of the first combination of a centrifugation step at a low acceleration value and a centrifugation step at a high acceleration value, as investigations by the Applicant have shown (see examples).
  • analytical investigations are considerably facilitated and in many cases even made possible; these are cases where e.g. the amount of nucleic acid in the sample is so low that with the conventional purification methods, the yield is insufficient to amplify and / or detect the nucleic acids.
  • the method according to the invention is carried out in an automatic and / or programmable centrifuge.
  • the centrifuge already has one or more internally stored centrifugation protocols with at least two centrifugation steps at different acceleration values.
  • Such a centrifuge is expressly within the scope of the present invention.
  • the biological sample is a material selected from the group consisting of sample material, plasma, body fluids, blood, serum, cells, leukocyte fractions, crusta phlogistica, sputum, urine, sperm, faeces, forensic specimens, smears, punctates, biopsies , Tissue samples, tissues and organs, food samples, environmental samples, plants and parts of plants, bacteria, viruses, viroids, prions, yeasts and fungi, and fragments or constituents of the aforementioned materials, and / or isolated, synthetic or modified proteins, nucleic acids, lipids, Carbohydrates, metabolites and / or metabolites.
  • all methods of analysis known to those skilled in the art may be used, preferably methods selected from the group consisting of light microscopy, electron microscopy, confocal laser scanning microscopy, laser microdissection, scanning electrochemistry - Nuclear microscopy, Western blotting, Southern blotting, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunoprecipitation, affinity chromatography, mutation analysis, polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), especially two-dimensional PAGE, HPLC, polymerase chain reaction (PCR), RFLP (Restriction Fragment Length Poly- morphism) analysis, Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) analysis, Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) analysis, mass spectrometry such as MALDI -TOFF mass spectrometry or SELDI mass spectrometry, microarray analysis, LiquiChip analysis, analysis of the activity of enzymes, HLA typing, sequencing, WGA ("whole genome amplification
  • the method is preceded by a step for the lysis of cells or tissues containing biomolecules.
  • This lysis step may be e.g. to act a physical or a chemical lysis.
  • a physical or a chemical lysis In particular, the use of ultrasound, successive freezing / thawing, the use of rotating knives, the use of oscillating microbeads, the action of a hypotonic shock, the so-called “French Press - Method "or the so-called” cell-bombing "used.
  • a special form is the alkaline lysis. This is used in particular to isolate plasmid DNA from already lysed bacteria.
  • the hydrogen bonds between the complementary DNA strands of both the chromosomal and the plasmid DNA dissolve, the plasmid DNA is due to their conformation capable of completely renaturing.
  • the chromosomal DNA After neutralization of the pH with potassium acetate and glacial acetic acid, the chromosomal DNA, which has been fragmented by the individual preparation steps, can not be renatured, DNA double strands with only short complementary regions and through the undirected connection of many individual DNA strands are formed it comes to the formation of a confused DNA mass.
  • the chaotropic salt used according to the invention is a salt or a mixture of salts selected from the group comprising guanidinium hydrochloride, guanidinium umrhodanide, guanidinium iodide, urea, ammonium sulfate, sodium iodide, potassium iodide, sodium perchlorate, sodium (iso) thiocyanate and guanidium thiocyanate.
  • Chaotropic salts are salts that have a high affinity for water and therefore form a hydration shell. In the presence of these salts, hydrophobic interactions in proteins are destabilized because the solubility of the hydrophobic side chains increases and the protein denatures. On the other hand, nucleic acids such as DNA and RNA are not impaired because no hydrophobic interactions are required to stabilize them. In addition, the cations of the chaotropic salts in high concentrations saturate the negative charges on the surface of silicates, especially in silicate matrices, and generate a net positive charge, which significantly promotes binding of the nucleic acids to the silicate matrices.
  • the first centrifugation step of the process is preferably carried out at an acceleration value in the range between 5 and 2000 g.
  • Particularly suitable acceleration values are 10 ⁇ g, 27 ⁇ g, 50 ⁇ g, 15 ⁇ g, 300 ⁇ g, 500 ⁇ g, 800 ⁇ g, 1000 ⁇ g and 1500 ⁇ g.
  • This centrifugation step may, for example, have a duration of 5 s-20 min. Particularly preferred is a duration of 10 s - 10 min. Particularly preferred is a duration of 30 s - 5 min.
  • the second centrifugation step of the process is preferably carried out at an acceleration value in the range between 100-25,000 ⁇ g.
  • Particularly suitable acceleration values are 180 ⁇ g, 610 ⁇ g, 1000 ⁇ g, 2500 ⁇ g, 8000 ⁇ g, 12000 ⁇ g and / or 17000 g.
  • This centrifugation step may also have a duration of 5 seconds to 20 minutes, for example. Particularly preferred is a duration of 10 s - 10 min. Very particular preference is a duration of 30 s - 5 min.
  • the value ranges for the acceleration values of the first and the second centrifugation step overlap.
  • it must be ensured that the acceleration value of the first centrifuging step is always below the acceleration value of the second centrifuging step.
  • the reaction vessels are centrifuged in a centrifuge rotor of the "swing-out type."
  • the required centrifugation angle only sets in when the rotor is set in motion fixed angle rotors, the above-mentioned improvements in the yield, however, centrifugal rotors of the "swing-out type" are preferably used when substances in already arranged in the rotor reactor ons or Zentrifugiergefäße to be given, for example by pipetting or using a pipetting robot.
  • the individual steps of the method are automated.
  • the applicant u.A. developed its own device that combines the functions of a pipetting robot and a programmable centrifuge. With the help of such an automated process, the laboratory throughput can be significantly increased and at the same time largely avoid allocation errors. Both factors play an important role in clinical, forensic, epidemiological and population genetic studies.
  • a reaction vessel comprising a binding matrix is provided for use in a method of purifying biomolecules, preferably nucleic acids, from a sample.
  • a reaction vessel is e.g. shown in Fig. 3.
  • a composition for use in a method for the purification of biomolecules, preferably nucleic acids is provided from a sample, the composition having at least one constituent selected from the group consisting of alkaline agents, phenol, lytic enzymes, isoamyl alcohol, chloroform, chaotropic salts , Alcohols, water, inorganic or organic salts.
  • This composition may be e.g. a lysis buffer (phenol, lytic enzymes, isoamyl alcohol, chloroform), a binding buffer (chaotropic salts), a washing buffer (alcohols, inorganic or organic salts) or an elution buffer (inorganic or organic salts).
  • a lysis buffer phenol, lytic enzymes, isoamyl alcohol, chloroform
  • a binding buffer chaotropic salts
  • washing buffer alcohols, inorganic or organic salts
  • elution buffer inorganic or organic salts
  • kit of parts comprising at least one such composition.
  • This kit particularly preferably has at least one reaction vessel as mentioned above and also reagents for analysis of biomolecules in or from a biological sample or for analysis of the morphology of a biological sample.
  • Reagents used for the analysis of biomolecules include in particular reagents for the detection and quantification of nucleic acids, amino acids, oligopeptides, polypeptides, monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, fats, fatty acids and / or lipids.
  • reagents for the detection and quantification of nucleic acids, amino acids, oligopeptides, polypeptides, monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, fats, fatty acids and / or lipids are examples of the reagents from the literature without their own inventive performance. Frequently, such reagents are already readily available as kits for the respective biomolecules to be analyzed.
  • reagents include in particular dyes for staining cells or cell components, antibodies optionally labeled with fluorescent dyes or enzymes, an absorption matrix such as DEAE cellulose or a silica membrane, substrates for enzymes, agarose gels, polyacrylamide gels, solvents such as ethanol or phenol, aqueous buffer solutions, RNase-free water, lysis reagents, alcoholic solutions and the like.
  • the composition may already be filled in the vessel.
  • the kit comprises as a further constituent a metering device which is filled with the composition and by means of which defined portions of the composition, preferably under sterile conditions, can be introduced into the vessel.
  • a dosing device can be designed, for example, in the form of a soap dispenser.
  • a device for purifying biomolecules, preferably nucleic acids, from a sample comprising a centrifuge, which is characterized in that the device has means which make it possible for at least two centrifugation steps with different heights during a centrifugation without user intervention Acceleration values are automatically inserted.
  • a microprocessor control is usually required, which has a memory device in which Multi-step centrifugation protocols are stored and / or stored.
  • a centrifuging device which comprises means for carrying out the method described above for the purification of biomolecules from a sample according to.
  • a microprocessor control is particularly conceived which makes it possible to automatically insert at least two centrifugation steps with differently high acceleration values during a centrifugation without user intervention.
  • Such a centrifuging device has means for the automated implementation of the method according to the invention. This includes u.A. in addition to the mentioned microprocessor control e.g. a pipetting robot.
  • a purified nucleic acid which can be prepared by a method, a composition, a kit and / or a device according to the present invention.
  • this nucleic acid is plasmid, genomic, viral and mitochondrial DNA or mRNA, siRNA, miRNA, rRNA, snRNA, t-RNA, and hnRNA.
  • Example 1 Basic Procedure (One-Step Method According to the Prior Art)
  • Bacterial colonies grown on an agar plate containing a plasmid to be isolated are picked, suspended in 3 ml of LB liquid culture medium and incubated overnight at 37 ° C. for multiplication.
  • the saturated 3 ml bacterial overnight cultures are pelleted in a bench centrifuge at 13000 rpm.
  • the isolation of the plasmid DNA is carried out according to a modified standard protocol of Qiagen according to the methodology of Birnboim: The supernatant of the bacterial culture is removed and discarded.
  • the pellet is mixed with 250 ⁇ l buffer Pl (Qiagen) and resuspended.
  • Example 2A Comparison of DNA yield between one-step and two-step centrifugation (binding step)
  • the main differences in the centrifugation protocol are highlighted in gray.
  • the buffers Pl, P2, N2, PE and EB are components of the QIAprep kit.
  • the yield of plasmid DNA was examined. In each case 8 parallel experiments were carried out, the results were evaluated statistically and are shown in Fig. 2A. While a DNA yield of 8454 ng was achieved with the one-step process, a yield of 9540 ng was achieved with the two-step process. The differences are significant. It can be seen throughout that the DNA yield was about 13% higher with the two-step procedure.
  • Example 2B Comparison of the DNA yield between one-step and two-step centrifugation method (washing step)
  • Example 2C Comparison of the RNA yield between one-step and two-step centrifugation method
  • Jurkat cells were lysed by a standard method (Qiagen RNeasy) and transferred to Spin Columns (model RNeasy) followed by a conventional manual standard protocol ("manual 2-step binding") centrifugation procedure.
  • the process parameters were as follows:
  • RPE, RWl and RLT are components of the RNeasy kit. Subsequently, the Yield of RNA examined. In each case 8 parallel experiments were carried out, the results were statistically evaluated and are shown in FIG. 2C.
  • RNA yield 1836 ng was achieved with the one-step procedure
  • a yield of 2011 ng was achieved with the two-step procedure. The differences are significant. It can be seen throughout that the RNA yield was about 9% higher with the two-step procedure.
  • the multi-step centrifugation step is a binding step in which the biomolecules are bound to the binding matrix by centrifugation.
  • the sample to be purified is mixed with the binding buffer and then centrifuged initially for 1 min at 500 x g. The centrifuge then accelerates until an acceleration value of 8000 x g is reached, and the sample is centrifuged at this value for a further 75 sec. During this procedure, the nucleic acids bind to the silicate matrix while all remaining components pass through the silicate matrix and can be discarded. It is then washed with a washing buffer and the nucleic acids are washed from the column with an elution buffer and collected.
  • Fig. 2 shows the results of the experiments described in Examples 2A, 2B and 2C. On the one hand, the absolute yields of nucleic acid in ng are shown, and on the other hand, the performance advantage of each two-step process is shown in%.
  • Fig. 3 shows a reaction vessel 30 comprising a silicate matrix 31 for use in a process according to the invention.
  • the reaction vessel 30 was charged with a solution or suspension of a nucleic acid-containing sample and at least one chaotropic salt or such a solution or suspension was prepared in the reaction vessel, the reaction vessel is placed in a larger sized collecting vessel 32.
  • the combination of the two vessels is then subjected to the centrifugation protocol according to the invention with a first centrifuging step at a first acceleration value and a second centrifuging step at a second acceleration value, which is higher than the first acceleration value, in a centrifuge, not shown.
  • the nucleic acids bind to the silicate matrix while all remaining components pass through the silicate matrix and can be discarded. It is then washed with a washing buffer and the nucleic acids are washed from the column with an elution buffer and collected.
  • FIG. 4 shows as a time diagram the exemplary sequence of two further centrifugation protocols according to the method according to the invention.
  • the centrifuge is briefly stopped between the individual centrifugation steps at different acceleration values.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung von Biomolekülen aus einer Probe, aufweisend die folgenden Schritte: a) Anordnen eines Reaktionsgefäßes mit einer Bindungsmatrix in einer Zentrifuge, wobei vor bzw. nach diesem Schritt eine Lösung bzw. Suspension aus einer Biomoleküle enthaltenden Probe in dem Reaktionsgefäß hergestellt bzw. in das Reaktionsgefäß eingefüllt wird; sowie b) einlegen mindestens eines mehrstufigen Zentrifugationsschritts, bestehend aus mindestens einem ersten Zentrifugationsschritt bei einem ersten Beschleunigungswert und mindestens einem zweiten Zentrifugationsschrittes bei einem zweiten Beschleunigungswert, der höher ist als der erste Beschleunigungswert; wobei c) es sich bei Schritt b) um einen Bindeschritt, einen Waschschritt und/oder einen Elutionsschritt handeln kann.

Description

VERFAHREN ZUR AUFREINIGUNG VON BIOMOLEKÜLEN
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung von Biomo Ie- külen, insbesondere von Nukleinsäuren wie DNA- und RNA-Mo lekülen.
Technischer Hintergrund
Die Aufreinigung und Analyse von Biomolekülen aus biologischen Proben spielt eine immer größere Rolle in der bio medizinischen Grundlagenforschung, der klinischen Forschung und Diagnostik, der forensischen Analytik, der Populationsgenetischen Forschung, der epidemiologischen Analytik und diesen verwandten Fachgebieten. Dies betrifft insbesondere Nukleinsäuren wie DNA- und RNA- Moleküle, aber auch Aminosäuren, Oligopeptide, Polypeptide, Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Fette, Fettsäuren und/oder Lipide.
Die Biologie hat in den letzen zwanzig Jahren hierfür ein umfassendes molekularbiologisches Instrumentarium entwickelt. Daher ist für die Zukunft mit einer noch stärkeren Verbreitung von molekularbiologischen Analysen zu rechnen, z. B. in der medizinischen und klinischen Diagnostik, in der Forensik, in der Pharmazie bei der Entwicklung und Evaluierung von Arzneimitteln, in der Lebensmittelanalytik sowie bei der Überwachung der Lebensmittelherstellung, in der Agrarwirt- schaft bei der Züchtung von Nutzpflanzen und Nutztieren sowie in der Umweltanalytik und in vielen Forschungsgebieten. Durch die Analyse des Transkriptoms, also der mRNA in Zellen, lassen sich die Aktivitäten von Genen direkt bestimmen. Die quantitative Analyse von Transkriptmustern (mRNA-Mustern) in Zellen durch moderne molekularbiologische Methoden, wie z. B. Echtzeit-Reverse-Transkriptase-PCR ("Real time RT PCR") oder Genexpressions-Chip-Analysen ermöglicht z. B. die Erkennung fehlerhaft exprimierter Gene, wodurch z. B. Stoffwechselkrankheiten, Infektionen oder eine etwaige Prädisposition für eine Krebserkrankung erkannt werden können.
Die Analyse des Genoms, also der Gesamtheit der zellulären DNA, durch moleku- larbiologische Methoden, wie z. B. PCR, NASBA, RFLP, AFLP oder Sequenzierung ermöglicht z. B. den Nachweis genetischer Defekte oder die Bestimmung des HLA-Typs sowie anderer genetischer Marker. Überdies fallen DNA- Fingerprinting zur forensischen, populationsgenetischen oder lebensmittelrechtlichen Analyse unter diesen Oberbegriff. Die Analyse genomischer DNA und RNA wird auch zum direkten Nachweis von infektiösen Erregern, wie Viren, Bakterien usw. eingesetzt.
Die Analyse anderer Biomoleküle, wie z.B. Aminosäuren, Oligopeptide, Polypeptide, Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Fette, Fettsäuren und/oder Lipide, kann z.B. Auskunft liefern über bestimmte physiologische Zu- stände, über Kontaminationen in Lebensmitteln, über den Gehalt bestimmter Nährstoffe und so weiter.
Voraussetzung all dieser Ansätze ist jedoch, dass die in einer Probe enthaltenen Biomo leküle, insbesondere Nukleinsäuren, isoliert bzw. aufgereinigt werden, um sie anschließend einem der beschriebenen nachgeordneten Verfahren zuzuführen.
Da die nachzuweisenden Biomo leküle häufig nur in sehr geringer Konzentration auftreten, ist eine effektive und ausbeutereiche Aufreinigung der in der Probe enthaltenen Biomoleküle von entscheidender Bedeutung. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren zur Aufreinigung von Biomolekülen aus biologischen Proben. Häufig wird dabei ein Zentrifugationsschritt verwendet, in dessen Rahmen eine gelöste Probe in ein Zentrifugengefäß verbracht wird, welches eine Bindungsmatrix aufweist. Bei der Zentrifugation wird die Lösung durch die Matrix befördert und die aufzureinigenden Biomo leküle verbleiben in gebundener Form an der Matrix. Sie werden dann im weiteren Verlauf aus der Matrix eluiert und aufgefangen.
Ein diesem Prinzip folgendes Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren ist z.B. das sogenannte "Boom principle"-Verfahren, das in der EP389063 offenbart ist.
Hierbei wird eine Nukleinsäuren enthaltende Probe in Anwesenweit eines cha- otropen Salzes in ein Gefäß mit einer Silikatmatrix gegeben. Anschließend wird das Gefäß zentrifugiert, oder es wird ein Vakuum angelegt. Dies führt dazu, dass die Nukleinsäuren an die Silikatmatrix binden, während alle anderen Bestandteile der Probe (insbesondere Zelltrümmer, Organelle, Proteine und dergleichen) die Silikatmatrix passieren und verworfen werden. Anschließend werden die gebundenen Nukleinsäuren mit einem geeigneten Agens eluiert und der weiteren Analyse zugeführt.
Die für die Bindung relevanten Mechansimen sind z.B. in Melzak et al. (1996), Driving Forces for DNA Adsorption to Silica in Perchlorate Solutions, Journal of Colloid and Interface Science 181 (2), 635-644, beschrieben.
Für dieses Verfahren werden häufig sogenannte "spin columns" verwendet. Dies sind Mikroreaktionsgefäße, die eine scheibenförmige Silikatmatrix aufweisen, nach unten hin offen sind, und in ein weiteres, unten geschlossenes Mikroreakti- onsgefäß platziert werden. Die Nukleinsäuren enthaltende Probe wird zusammen mit einem chaotropen Salz in das Mikroreaktionsgefäß einpipettiert. Anschließend wird die Kombination beider Mikroreaktionsgefäße in eine Zentrifuge eingebracht und bei einem Beschleunigungswert von etwa 10000 x g zentrifugiert. Die Nukleinsäuren binden dabei an die Silikatmatrix, während alle anderen Bestandteile der Probe die Silikatmatrix passieren und in das zweite, unten geschlossene Mik- roreaktionsgefäß überführt werden. Letzteres wird anschließend verworfen, wäh- rend die gebundenen Nukleinsäuren mit einem geeigneten Agens eluiert und der weiteren Analyse zugeführt werden.
Solche und ähnliche Produkte werden u.A. von der Anmelderin der vorliegenden Erfindung angeboten, aber auch von Wettbewerbern wie Promega, Ambion, Ma- cherey und Nagel sowie Invitrogen.
Kritisch bei solchen Verfahren zur Aufreinigung von Biomo lekülen ist, dass die erzielten Ausbeuten in vielen Fällen nicht ausreichen. Es sind dies insbesondere Fälle, bei denen die Biomo lekülmenge in der Probe so gering ist, dass mit den herkömmlichen Aufreinigungsmethoden die Ausbeute nicht ausreicht, um die Moleküle anschließend nachzuweisen. Bei solchen Proben handelt es sich z.B., um forensische Proben oder Proben, in denen die RNA eines schwach exprimier- ten Gens analysiert werden soll.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die beschriebenen, sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zu überwinden. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die erwähnten Verfahren so zu verbessern, dass die erzielten Biomo lekülausbeuten erhöht werden, um so auch unter ungünstigen Umständen Biomo leküle, insbesondere Nukleinsäuren, aus einer Probe aufreinigen, und sie einer anschließenden Analyse zugänglich machen zu können.
- A - Zusammenfassung der Erfindung
Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen des vorgelegten Hauptanspruchs gelöst. Die Unteransprüche geben bevorzugte Ausführungsformen an. Dabei ist zu beachten, dass die genannten Bereichsangaben durchweg einschließlich der jeweiligen Grenzwerte zu verstehen sind.
Demgemäss ist vorgesehen, ein Verfahren zur Aufreinigung von Biomo lekülen aus einer Probe bereitzustellen, das die folgenden Schritte aufweist:
a) Anordnen eines Reaktionsgefäßes mit einer Bindungsmatrix in einer Zentrifuge, wobei vor bzw. nach diesem Schritt eine Lösung bzw. Suspension aus einer Biomo leküle enthaltenden Probe in dem Reaktionsgefäß hergestellt bzw. in das Reaktionsgefäß eingefüllt wird; sowie
b) Einlegen mindestens eines mehrstufigen Zentrifugationsschritts, bestehend aus mindestens einem ersten Zentrifugationsschritt bei einem ersten Beschleunigungswert und mindestens einem zweiten Zentrifugationsschrittes bei einem zweiten Beschleunigungswert, der höher ist als der erste Beschleunigungswert; wobei
c) es sich bei Schritt b) um einen Bindeschritt, einen Waschschritt und/oder einen Elutionsschritt handeln kann.
Bevorzugt handelt es sich bei dem mehrstufigen Schritt b) um einen Bindeschritt, bei welchem die Biomo leküle durch Zentrifugation an die Bindungsmatrix gebunden werden. In diesem Fall stellen sich erheblich verbesserte Biomo lekül- Ausbeuten ein, wie in den Beispielen gezeigt ist. Ebenso bevorzugt kann es sich bei diesem Schritt aber auch um einen Waschschritt handeln.
Weiterhin kann vorgesehen sein, dass ggf. weitere Zentrifugationsschritte vor dem ersten, zwischen dem ersten und dem zweiten oder nach dem zweiten Zentrifugationsschritt eingelegt werden. In weiteren bevorzugten Ausgestaltung ist überdies vorgesehen, dass das Verfahren mindestens einen Bindeschritt, einen Waschschritt und einen Elutionsschritt umfasst, die Durchweg mindestens einen ggf. mehrstufigen Zentrifugationsschritt umfassen.
Besonders bevorzugt ist vorgesehen, dass es sich bei den Biomo lekülen um Stoffe ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Nukleinsäuren, Aminosäuren, Oligopeptide, Polypeptide, Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Fette, Fettsäuren und/oder Lipide handelt.
Unter dem Begriff "Nukleinsäuren" werden im folgenden insbesondere RNA und DNA verstanden. Als DNA kommt hier insbesondere plasmidische, genomische, virale und mitochondriale DNA in Frage, während als RNA insbesondere mRNA, siRNA, miRNA, rRNA, snRNA, t-RNA, hnRNA und totalRNA in Frage kommt.
Grundsätzlich kann es sich bei den hier eingeführten Nukleinsäuren um jeden Typ von Polynukleotid handeln, der ein N-Glykosid oder C-Glykosid einer Purin- oder Pyrimidinbase darstellt. Die Nukleinsäure kann einzel-, doppel- oder mehrsträn- gig, linear, verzweigt oder zirkulär sein. Sie kann einem in einer Zelle vorkommenden Molekül entsprechen, wie etwa genomische DNA oder Boten-RNA (mRNA), oder in vitro erzeugt werden wie Komplementär-DNA (cDNA), Gegen- strang-RNA (aRNA), oder synthetische Nukleinsäuren. Die Nukleinsäure kann aus wenigen Nukleotiden oder auch aus vielen tausend Nukleotiden bestehen.
Unter dem Begriff "Reaktionsgefäß mit einer Bindungsmatrix" sollen im folgenden biochemische Trennprinzipien verstanden werden, bei denen in einem Reaktionsgefäß oder einer miniaturisierten Säule eine selektiv bestimmte Stoffe assoziierende Bindungsmatrix angeordnet ist.
Unter dem Begriff "Beschleunigungswert" wird im Folgenden die durch die Rotationsgeschwindigkeit der Zentrifuge erzielte, auf das Zentrifugationsgut einwirkende Vielfache der Erdbeschleunigung bezeichnet. Diese wird mit der Größe g = 9.81 ms"2 gemessen. 1000 x g bezeichnet z.B. einen B eschleunigungs wert, der dem 1000-fachen der Erdbeschleunigung gleicht. Der Beschleunigungswert wird auch als "Schleuderzahl" bezeichnet und entspricht nicht der Drehzahl der Zentrifuge, die in der Regel in Umdrehungen pro Minute (upm) bezeichnet wird. Der Beschleunigungswert wird konstruktiv durch den Zentrifugen- Trommeldurchmesser (Wirkdurchmesser) und die Drehzahl bestimmt.
Unter dem Begriff "Zentrifugationsschritt" wird im folgenden ein Verfahrensschritt verstanden, der sich durch eine definierbare Dauer und einen definierbaren Beschleunigungswert auszeichnet.
Diese Bindungsmatrix weist bevorzugt einen Anionentauscher, ein Silikatsubstrat, ein Kunststoffsubstrat, oder ein Chitosan enthaltendes Substrat auf.
Unter dem Begriff "Silikatsubstrat" soll im folgenden eine Membran, ein Pellet, eine Packung oder eine Scheibe aus porösem Silikat verstanden werden, die eine große innere Oberfläche aufweist und in dem Reaktionsgefäß so angeordnet ist, dass eine Lösung , die in das Reaktionsgefäß gegeben wird, bei Anlage eines Vakuums oder bei Zentrifugation durch die Membran, das Pellet, die Packung oder die Scheibe hindurchgetrieben wird, dergestalt, dass die in der Lösung befindlichen Bestandteile mit den Bestandteilen der Matrix in Kontakt treten. Bevorzugt handelt es sich bei dem Silikatsubstrat um eine Matrix aus Kieselgel. Ebenso kann das Silikatsubstrat aus gepressten Glasfasern oder Glaskugeln („microbeads") bestehen. Silikatsubstrate werden z.B. in den von der Anmelderin unter den Handelsmarken QIAprep und RNeasy vertriebenen Aufreinigungskits verwendet.
Anionentauscher sind aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt. Hier wird in der Regel ein Harz verwendet, das z.B. mit den negativ geladenen Phosphatres- ten des Nukleinsäure-Rückgrats wechselwirkt. Die Salzkonzentration und die pH- Werte der verwendeten Puffer bestimmen, ob die Nukleinsäure an das Harz bindet oder aus der Säule eluiert wird. Solche Anionentauscher werden z.B. von der Anmelderin unter den Handelsmarken! QIAGEN Genomic-tip und Plasmid-tip vertrieben.
Chitosan ist erst in jüngerer Zeit als Bindungsagens für Biomo leküle ins Gespräch gekommen. Es handelt sich hierbei um ein Copolymer aus ß-l,4-glykosidisch verknüpften N-Acetyl-Glucosaminresten und Glucosaminresten. Unter physiologischen Bedingungen trägt Chitosan positive Nettoladungen und ist daher in der Lage, viele negative geladene Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäuren, Aminosäuren, Oligo- und Polypeptide, Fette und Fettsäuren, zu binden.
Weiterhin ist erfindungsgemäß besonders bevorzugt vorgesehen, dass die Bin- dungsmatrix ein Silikatsubstrat aufweist, und dass ferner die Biomo leküle enthaltende Probe vor der Zentrifugation mit mindestens einem chaotropen Salz vermischt wird. Diese Ausgestaltung eignet sich besonders für Nukleinsäuren. Das dabei zur Anwendung kommende Trennprinzip beruht auf dem bereits diskutierten "Boom principle"-Verfahren. Dabei wird eine Nukleinsäuren enthaltende Pro- be in Anwesenheit eines chaotropen Salzes in ein Gefäß mit einer Silikatmatrix gegeben. Anschließend wird das Gefäß zentrifugiert, oder es wird ein Vakuum angelegt. Dies führt dazu, dass die Nukleinsäuren an die Silikatmatrix binden, während alle anderen Bestandteile der Probe (insbesondere Zelltrümmer, Organelle, Proteine und dergleichen) die Silikatmatrix passieren und verworfen werden. Anschließend werden die gebundenen Nukleinsäuren mit einem geeigneten Agens eluiert und der weiteren Analyse zugeführt.
Bevorzugt sind bei dieser Ausgestaltung die folgenden Schritte vorgesehen:
a) Anordnen eines säulenartigen Reaktionsgefäßes mit einer Bindungsmatrix aufweisend ein Silikatsubstrat in einer Zentrifuge, wobei vor bzw. nach die- sem Schritt eine Lösung bzw. Suspension aus einer Nukleinsäuren enthaltenden Probe und mindestens einem chaotropen Salz in dem Reaktionsgefäß hergestellt bzw. in das Reaktionsgefäß eingefüllt wird; b) Einlegen eines ersten Zentrifugationsschrittes bei einem ersten Beschleunigungswert;
c) Einlegen eines zweiten Zentrifugationsschrittes bei einem zweiten Beschleunigungswert, der höher ist als der erste Beschleunigungswert;
d) ggf. Einlegen weiterer Zentrifugationsschritte zwischen Schritt c) und Schritt d) bzw. nach Schritt d);
e) ggf. Einlegen eines oder mehrerer Waschschritte; und
f) Elution der an das Silikatsubstrat gebundenen Nukleinsäuren mit einer E- lustionslösung.
In dieser Ausgestaltung handelt es sich bei dem mehrschrittigen Zentrifuga- tionsschritt um einen Bindungsschritt, bei welchem die Nukleinsäuren an die Silikatmatrix gebunden werden. Diese Ausgestaltung führt gegenüber aus dem Stand der Technik bekannten, einschrittigen Verfahren mit Silikatmatrices enthaltenden "Spin columns" zu einer erheblich verbesserten Ausbeute an aufzureinigenden Nukleinsäuren. Alternativ oder zusätzlich hierzu kann jedoch auch vorgesehen sein, dass der Wasch- und/oder der Elutionsschritt im Sinne des obigen Protokolls mehrschrittig ausgelegt sind.
Der oder die Waschschritte erfolgen bevorzugt mit einem Waschpuffer. Dieser kann insbesondere Ethanol und/oder Aceton enthalten.
Bei der Elutionslösung zur Elution der an die Bindungsmatrix gebundenen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäuren, kann es sich z.B. um Wasser (einschließlich Aqua dest) oder eine niedrigmolare Lösung handeln. Hier kommt z.B. eine schwach konzentrierte Kochsalzlösung in Frage.
Das chaotrope Salz liegt bevorzugt bereits in Lösung vor. Alternativ kann die Nukleinsäuren enthaltende Probe in Lösung bzw. Suspension vorliegen und an- schließend mit einem chaotropen Salz versetzt werden. Wiederum alternativ können Probe und chaotropes Salz als Feststoff vorliegen und gemeinsam in Lösung bzw. Suspension gebracht werden.
Unter dem Begriff „säulenartiges Reaktionsgefäß" soll im folgenden ein Gefäß verstanden werden, dass ggf. oben verschließbar und ggf. unten offen ist. Das Reaktionsgefäß weist oben beschriebene Silikatmatrix auf. Ein typisches Beispiel für ein Reaktionsgefäß im obigen Sinne sind die sogenannten „spin columns", wie sie z.B. von der Anmelderin hergestellt und vertrieben werden. Die Reaktionsgefäße können bevorzugt so ausgestaltet sein, dass sie passgenau in einem handels- üblichen, etwas größeren Reaktionsgefäß, wie es z.B. von der Firma Eppendorf vertrieben wird, angeordnet werden können. In diesem Fall dient das größere Reaktionsgefäß als Auffanggefäß für die die Bindungsmatrix passierende Flüssigkeit.
Den genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist gemein, dass durch die erstmali- ge Kombination aus einem Zentrifugationsschritt bei niedrigem Beschleunigungswert und einem Zentrifugationsschritt bei hohem Beschleunigungswert die Ausbeute bei der Biomo lekülaufreinigung um bis zu 20 % erhöht wird, wie Untersuchungen der Anmelderin ergeben haben (siehe Beispiele). Hierdurch werden analytische Untersuchungen erheblich erleichtert und in vielen Fällen sogar erst ermöglicht; es sind dies Fälle, bei denen z.B. die Nukleinsäuremenge in der Probe so gering ist, dass mit den herkömmlichen Aufreinigungsmethoden die Ausbeute nicht ausreicht, um die Nukleinsäuren zu amplifizieren und/oder nachzuweisen.
Die erwähnten Verbesserungen der Ausbeute sind überraschend und für den Fachmann nicht vorhersehbar gewesen. Angesichts der Tatsache, dass "column spin" -Verfahren bislang durchweg bei einem einzigen Beschleunigungswert durchgeführt werden, erscheint ein zweischrittiges Zentrifugationsverfahren bei oberflächlicher Betrachtung als sehr unattraktiv, weil dies eine längere Zeit in Anspruch nimmt als ein einschrittiges Zentrifugationsverfahren. Das erfϊndungsgemäße Verfahren kann in einer handelsüblichen, manuell bedienbaren Tischzentrifuge durchgeführt werden, wie sie z.B. von dem Laborgerätehersteller Eppendorf hergestellt wird und in jedem biowissenschaftlich arbeitenden Labor vorhanden ist. In diesem Fall wird das Zentrifugationsprotokoll mit min- destens zwei Zentrifugationsschritten bei unterschiedlichen Beschleunigungswerten „von Hand" absolviert, d.h. für das Einlegen der unterschiedlichen Zentrifuga- tionsschritte ist ein Benutzereingriff erforderlich.
Bevorzugt ist allerdings vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Verfahren in einer automatischen und/oder programmierbaren Zentrifuge durchgeführt wird. Hier kann insbesondere vorgesehen sein, dass die Zentrifuge bereits ein oder mehrere intern gespeicherte Zentrifugationsprotokolle mit mindestens zwei Zentrifugationsschritten bei unterschiedlichen Beschleunigungswerten aufweist. Eine solche Zentrifuge fällt ausdrücklich unter den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei der biologischen Probe um ein Material ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Probenmaterial, Plasma, Körperflüssigkeiten, Blut, Serum, Zellen, Leukozytenfraktionen, Crusta Phlogistica, Sputum, Urin, Sperma, Faeces, forensische Proben, Abstriche, Punktate, Biopsien, Gewebeproben, Gewebeteile und Organe, Lebensmittelproben, Umweltproben, Pflanzen und Pflanzenteile, Bakterien, Viren, Viroide, Prionen, Hefen und Pilze, sowie Fragmente oder Bestandteile der vorgenannten Materialien, und/oder isolierte, synthetische bzw. modifizierte Proteine, Nukleinsäuren, Lipide, Kohlenhydrate, Stoffwechselprodukte und/oder Metaboliten.
Zur anschließenden Analyse der Nukleinsäuren in der oder aus der biologischen Probe können dabei alle dem Fachmann bekannten und geeignet erscheinenden Analyseverfahren eingesetzt werden, vorzugsweise Verfahren ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Lichtmikroskopie, die Elektronenmikroskopie, die konfokale Laserscanningmikroskopie, die Laser-Micro -Dissection, Scanningelektro- nenmikroskopie, das Western-Blotting, den Southern-Blotting, den Enzyme- linked Immonosorbent-Assay (ELISA), die Immunpräzipitation, die Affϊni- tätschromatographie, die Mutationsanalyse, die Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE), insbesondere die zweidimensionale PAGE, die HPLC, die Polymerase- kettenreaktion (PCR), die RFLP -Analyse (Restriction Fragment Length PoIy- morphism- Analyse), die SAGE-Analyse (Serial Analysis of Gen Expression), die FPLC-Analyse (Fast Protein Liquid Chromatography), die Massenspektrometrie, beispielsweise die MALDI-TOFF-Massenspektrometrie oder die SELDI- Massenspektrometrie, die Microarray-Analyse, die LiquiChip-Analyse, die Ana- lyse der Aktivität von Enzymen, HLA-Typing, Sequenzierung, WGA („Whole Genome Amplifϊcation"), RT-PCR, Real-Time-PCR bzw -RT-PCR, RNase- Protection- Analyse oder Primer-Extension- Analyse.
Bevorzugt ist vorgesehen, dass dem Verfahren ein Schritt zur Lyse von Biomo Ie- küle enthaltenden Zellen oder Geweben vorausgeht.
Bei diesem Lyseschritt kann es sich z.B. um eine physikalische oder eine chemische Lyse handeln. Als physikalische Lyseverfahren kommen insbesondere die Verwendung von Ultraschall, ein sukzessives Einfrieren und Auftauen ("free- ze/thaw"), die Verwendung von rotierenden Messern, die Verwendung von oszillierenden Microbeads, die Einwirkung eines hypotonischen Schocks, das soge- nannte "French Press- Verfahren" oder das sogenannte "Cell-Bomb- Verfahren" zum Einsatz.
Als chemisches Lyseverfahren kommt insbesondere die Verwendung von Phenol, Chloroform und/oder Isoamylalkohol in Frage. Ebenso fallen enzymatische Verfahren unter diesen begriff, so z.B. die Verwendung von Lysozym für Bakterien oder die Verwendung von ß-Glucuronidase ("snail gut enzyme") für Hefe.
Eine Sonderform ist die alkalische Lyse. Diese wird insbesondere angewendet, um aus bereits lysierten Bakterien Plasmid-DNA zu isolieren. Durch die Zugabe von NaOH zum Zellextrakt lösen sich die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären DNA-Strängen sowohl der chromosomalen als auch der Plasmid-DNA, wobei die Plasmid-DNA aufgrund ihrer Konformation in der Lage ist, vollständig zu renaturieren. Die chromosomale DNA, die durch die ein- zelnen Präparationsschritte zerstückelt wurde, kann nach Neutralisation des pH- Wertes mit Kaliumacetat und Eisessig nicht renaturieren, es bilden sich DNA- Doppelstränge mit nur kurzen komplementären Bereichen und durch die ungerich- tete Verbindung vieler DNA-Einzelstränge kommt es zur Ausbildung einer verworrenen DNA-Masse. Diese kann relativ leicht zusammen mit dem durch die Neutralisation ausgefallenem NaOH abzentrifugiert werden. Bei diesem Zentrifu- gationsschritt setzen sich ferner Zellmembran- und Zellwandbestandteile sowie Proteine als Pellet ab. Die Plasmid-DNA befindet sich nach der Zentrifugation im Überstand.
Weiterhin ist besonders bevorzugt vorgesehen, dass es sich bei dem erfmdungs- gemäß verwendeten chaotropen Salz um ein Salz bzw. ein Gemisch von Salzen ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Guanidiniumhydrochlorid, Guanidini- umrhodanid, Guanidiniumiodid, Harnstoff, Ammoniumsulfat, Natriumiodid, Kaliumiodid, Natriumperchlorat, Natrium(iso)thiocyanat und Guanidiumthiocyanat handelt.
Chaotrope Salze sind Salze, die eine hohe Affinität zu Wasser haben und deshalb eine Hydrathülle ausbilden. In Anwesenheit dieser Salze werden die hydrophoben Interaktionen in Proteinen destabilisiert, weil die Löslichkeit der hydrophoben Seitenketten steigt, und das Protein denaturiert. Nukleinsäuren wie DNA und RNA werden hingegen nicht beeinträchtigt, weil zur Stabilisierung derselben kei- ne hydrophoben Wechselwirkungen erforderlich sind. Hinzu kommt, dass die Kationen der chaotropen Salze in hohen Konzentrationen die negativen Ladungen auf der Oberfläche von Silikaten, insbesondere in Silikatmatrices, absättigen und eine positive Nettoladung erzeugen, was die Bindung der Nukleinsäuren an die Silikatmatrices erheblich forciert.
Der erste Zentrifugationsschritt des Verfahrens wird bevorzugt bei einem Beschleunigungswert im Bereich zwischen 5 - 2000 x g durchgeführt. Besonders geeignete Beschleunigungswerte liegen bei 10 x g, 27 x g, 50 x g, 15O x g, 300 x g, 500 x g, 800 x g, 1000 x g und 1500 x g. Dieser Zentrifugationsschritt kann beispielweise eine Dauer von 5 s - 20 min haben. Besonders bevorzugt ist eine Dauer von 10 s - 10 min. Besonders bevorzugt ist eine Dauer von 30 s - 5 min.
Der zweite Zentrifugationsschritt des Verfahrens wird bevorzugt bei einem Be- schleunigungswert im Bereich zwischen 100 - 25.000 x g durchgeführt. Besonders geeignete Beschleunigungswerte liegen bei 180 x g, 610 x g, 1000 x g, 2500 x g, 8000 x g, 12.000 x g und/oder 17.000 g. Dieser Zentrifugationsschritt kann ebenfalls beispielsweise eine Dauer von 5 s - 20 min haben. Besonders bevorzugt ist eine Dauer von 10 s - 10 min. Ganz besonders bevorzugt ist eine Dauer von 30 s - 5 min.
Wie aus der obigen Darstellung ersichtlich, überschneiden sich die Wertebereiche für die Beschleunigungswerte des ersten und des zweiten Zentrifugationsschritts. Es muß erfmdungsgemäß jedoch gewährleistet sein, dass der Bescheunigungswert des ersten Zentrifugationsschritts immer unterhalb des Bescheunigungswerts des zweiten Zentrifugationsschritts liegt.
Weiterhin ist bevorzugt vorgesehen, dass die Reaktionsgefäße in einem Zentrifugenrotor vom „swing-out-Typ" zentrifugiert werden. Bei solchen Rotoren stellt sich der erforderliche Zentrifugationswinkel erst ein, wenn der Rotor in Bewegung versetzt wird. Zwar weist das erfmdungsgemäße Verfahren auch bei der Verwendung von Festwinkelrotoren die genannten Verbesserungen bei der Ausbeute auf, allerdings kommen Zentrifugenrotoren vom „swing-out-Typ" bevorzugt dann zum Einsatz, wenn Substanzen in bereits im Rotor angeordnete Reakti- ons- oder Zentrifugiergefäße gegeben werden sollen, z.B. durch Pipettieren oder mit Hilfe eines Pipettierroboters.
Besonders bevorzugt ist vorgesehen, dass die einzelnen Schritte des Verfahrens automatisiert ablaufen. Hierzu hat die Anmelderin u.A. eine eigene Vorrichtung entwickelt, die die Funktionen eines Pipettierroboters und einer programmierbaren Zentrifuge vereint. Mit Hilfe eines solchen automatisierten Verfahrens läßt sich der Labordurchsatz wesentlich erhöhen und gleichzeitig Zuordnungsfehler weitgehend vermeiden. Beide Faktoren spielen gerade in klinischen, forensischen, epidemiologischen und populationsgenetischen Untersuchungen eine wichtige Rolle.
Ferner ist ein Reaktionsgefäß, aufweisend eine Bindungsmatrix, zur Verwendung in einem Verfahren zur Aufreinigung von Biomo lekülen, bevorzugt Nukleinsäuren, aus einer Probe vorgesehen. Ein solches Reaktionsgefäß ist z.B. in Fig. 3 gezeigt.
Weiterhin ist erfmdungsgemäß eine Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Aufreinigung von Biomo lekülen, bevorzugt Nukleinsäuren, aus einer Probe vorgesehen, wobei die Zusammensetzung mindestens einen Bestandteil aufweist ausgewählt aus der Gruppe enthaltend alkalische Agenzien, Phenol, lytische Enzyme, Isoamylalkohol, Chloroform, Chaotrope Salze, Alkohole, Was- ser, anorganische oder organische Salze.
Bei dieser Zusammensetzung kann es sich z.B. um einen Lysepuffer (Phenol, lytische Enzyme, Isoamylalkohol, Chloroform), einen Bindungspuffer (Chaotrope Salze), einen Waschpuffer (Alkohole, anorganische oder organische Salze) oder um einen Elutionspuffer (anorganische oder organische Salze) handeln.
Ferner ist erfindungsgemäß ein Kit of Parts vorgesehen, aufweisend mindestens eine solche Zusammensetzung. Besonders bevorzugt weist dieser Kit mindestens ein wie oben erwähntes Reaktionsgefäß sowie weiterhin Reagenzien zur Analyse von Biomolekülen in oder aus einer biologischen Probe oder zur Analyse der Morphologie einer biologischen Probe auf.
Als Reagenzien zur Analyse von Biomo lekülen kommen hier insbesondere Reagenzien zur Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäuren, Aminosäuren, Oligopeptiden, Polypeptiden, Monosacchariden, Oligosacchariden, Polysacchariden, Fetten, Fettsäuren und/oder Lipiden zum Einsatz. Der Fachmann kann solche Reagenzien aus der Fachliteratur ohne eigene erfinderische Leistung auffinden. Häufig sind solche Reagenzien als Kits für die jeweils zu analysierenden Biomoleküle bereits fertig erhältlich. Diese Reagenzien umfassen insbesondere Farbstof- fe zum Färben von Zellen oder Zellbestandteilen, Antikörper, gegebenenfalls markiert mit Fluoreszenzfarbstoffen oder Enzymen, eine Absorptionsmatrix, wie etwa DEAE-Zellulose oder eine Silica-Membran, Substrate für Enzyme, Agarose- GeIe, Polyacrylamid-Gele, Lösungsmittel wie Ethanol oder Phenol, wässrige Pufferlösungen, RNase-freies Wasser, Lyse-Reagenzien, alkoholische Lösungen und dergleichen.
Dabei kann die Zusammensetzung bereits in dem Gefäß abgefüllt sein. Denkbar ist aber auch, dass das Kit als einen weiteren Bestandteil eine Dosierungsvorrichtung umfasst, die mit der Zusammensetzung gefüllt ist und mittels derer definierte Portionen der Zusammensetzung, vorzugsweise unter sterilen Bedingungen, in das Gefäß eingefüllt werden können. Eine solche Dosierungsvorrichtung kann beispielsweise in Form eines Seifenspenders ausgebildet sein.
Erfindungsgemäß ist überdies eine Vorrichtung zur Aufreinigung von Biomo lekülen, bevorzugt Nukleinsäuren, aus einer Probe vorgesehen, aufweisend eine Zentrifuge, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Vorrichtung Mittel aufweist, die es ermöglichen, dass während einer Zentrifugation ohne Benutzereingriff mindestens zwei Zentrifugationsschritte mit unterschiedlich hohen Beschleunigungswerten automatisiert eingelegt werden. Für diesen Zweck ist in der Regel eine Mikroprozessorsteuerung erforderlich, die eine Speichereinrichtung aufweist, in welcher mehrschrittige Zentrifugationsprotokolle abgespeichert und/oder abspeicherbar sind.
Erfindungsgemäß ist ebenso eine Zentrifugationsvorrichtung vorgesehen, die Mittel zur Durchfuhrung des oben beschriebenen Verfahrens zur Aufreinigung von Biomo lekülen aus einer Probe gemäß aufweist. Hierbei ist insbesondere an eine Mikroprozessorsteuerung gedacht, die es ermöglicht, dass während einer Zentri- fugation ohne Benutzereingriff mindestens zwei Zentrifugationsschritte mit unterschiedlich hohen B eschleunigungs werten automatisiert eingelegt werden.
Eine solche Zentrifugationsvorrichtung weist Mittel zur automatisierten Durch- führung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf. Hierzu zählt u.A. neben der erwähnten Mikroprozessorsteuerung z.B. ein Pipettierroboter.
Weiterhin ist erfindungsgemäß eine aufgereinigte Nukleinsäure vorgesehen, herstellbar mit einem Verfahren, einer Zusammensetzung, einem Kit und/oder einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung. Bei dieser Nukleinsäure handelt es sich insbesondere um plasmidische, genomische, virale und mitochondriale DNA bzw. mRNA, siRNA, miRNA, rRNA, snRNA, t-RNA, und hnRNA.
Abbildungen und Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird durch die im Folgenden gezeigten und diskutier- ten Beispiele sowie Abbildungen genauer erläutert. Dabei ist zu beachten, dass die Beispiele nur beschreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken. Beispiel 1: Grundsätzliche Vorgehensweise (einschrittiges Verfahren nach dem Stand der Technik)
Auf einer Agarplatte gewachsene Bakterienkolonien, enthaltend ein zu isolierendes Plasmid, werden gepickt, in je 3 ml LB Flüssigkulturmedium suspendiert und über Nacht bei 37°C zur Vermehrung der inkubiert. Die gesättigten 3 ml Bakteri- enübernachtkulturen werden in einer Tischzentrifuge bei 13000 rpm pelletiert. Die Isolation der Plasmid-DNA erfolgt nach einem modifizierten Standardprotokoll der Firma Qiagen nach der Methodik von Birnboim: Der Überstand der Bakterienkultur wird abgenommen und verworfen. Das Pellet wird mit 250 μl Puffer Pl (Qiagen) versetzt und resuspendiert. Durch Zugabe von 250 μl Puffer P2 (Qiagen) und 4-5 mal vorsichtigem Schütteln werden die Bakterien lysiert ("alkalische Lyse"); die Lysereaktion darf nicht länger als 5 min andauern, weil ansonsten die genomische DNA mobilisiert wird. Durch Zugabe von 350 μl Puffer N3 (Qiagen) und sofortiges leichtes Schütteln wird die Lysereaktion daher gestoppt. Die lysier- ten Bakterienwandbestandteile werden für 10 min bei 13000 rpm pelletiert.
Die im Überstand befindlichen Plasmide werden vorsichtig abgenommen und in eine vorbereitete Qiagen Spin Column pipettiert. Anschließend wird wie folgt weiter verfahren:
Beispiel 2A. Vergleich der DNA-Ausbeute zwischen einschrittigem und zweischrittigem Zentrifugationsverfahren (Bindungsschritt)
3 ml einer Bakterienkultur (DHlOB), die das Plasmid puc 19 enthält, wurden geerntet und wie oben beschrieben lysiert und in Spin Columns (Modell QIAprep) überführt, und anschließend einem herkömmlichen einschrittigen ("manual 1-step protocol") bzw. zweischrittigen ("manual 2-step binding ") Zentrifugationsverfah- ren zugeführt. Die Verfahrensparameter waren wie folgt:
Die wesentlichen Unterschiede im Zentrifugationsprotokoll sind grau hinterlegt. Die Puffer Pl, P2, N2, PE und EB sind Bestandteile des QIAprep-Kits. Anschließend wurde die Ausbeute an Plasmid-DNA untersucht. Es wurden jeweils 8 parallele Versuche durchgeführt, die Ergebnisse wurden statistisch ausgewertet und sind in Fig. 2 A gezeigt. Während mit dem einschrittigen Verfahren eine DNA- Ausbeute von 8454 ng erzielt wurde, wurde mit dem zweischrittigen Verfahren eine Ausbeute von 9540 ng erzielt. Die Unterschiede sind signifikant. Es ist durchweg erkennbar, dass die DNA- Ausbeute mit dem zweischrittigen Verfahren um ca. 13 % höher ausfiel. Beispiel 2B. Vergleich der DNA-Ausbeute zwischen einschrittigem und zweischrittigem Zentrifugationsverfahren (Waschschritt)
Ähnliche Unterscheide waren feststellbar, wenn statt des Bindungsschrittes der Waschschritt zweistufig ausgelegt war, etwa so wie in folgender Tabelle dargestellt:
Die wesentlichen Unterschiede im Zentrifugationsprotokoll sind grau hinterlegt. Es wurden jeweils 8 parallele Versuche durchgeführt, die Auswertung erfolgte ähnlich wie in obigem Beispiel. Die Ergebnisse sind in Fig. 2B gezeigt. Während mit dem einschrittigen Verfahren eine DNA- Ausbeute von 4022 ng erzielt wurde, wurde mit dem zweischrittigen Verfahren eine Ausbeute von 4803 ng erzielt. Die Unterschiede sind signifikant. Es ist durchweg erkennbar, dass die DNA- Ausbeute mit dem zweischrittigen Verfahren um ca. 19 % höher ausfiel.
Beispiel 2C. Vergleich der RNA-Ausbeute zwischen einschrittigem und zweischrittigem Zentrifugationsverfahren
Jurkat-Zellen wurden mit einem Standardverfahren (Qiagen RNeasy) lysiert und in Spin Columns (Modell RNeasy) überführt, und anschließend einem herkömmlichen einschrittigen ("manual Standard protocol") bzw. zweischrittigen ("manual 2-step binding") Zentrifugationsverfahren zugeführt. Die Verfahrensparameter waren wie folgt:
Die Unterschiede im Zentrifugationsprotokoll sind grau hinterlegt. Die Puffer
RPE, RWl und RLT sind Bestandteile des RNeasy-Kits. Anschließend wurde die Ausbeute an RNA untersucht. Es wurden jeweils 8 parallele Versuche durchgeführt, die Ergebnisse wurden statistisch ausgewertet und sind in Fig. 2C gezeigt.
Während mit dem einschrittigen Verfahren eine RNA- Ausbeute von 1836 ng er- zielt wurde, wurde mit dem zweischrittigen Verfahren eine Ausbeute von 2011 ng erzielt. Die Unterschiede sind signifikant. Es ist durchweg erkennbar, dass die RNA- Ausbeute mit dem zweischrittigen Verfahren um ca. 9 % höher ausfiel.
Fig. 1 zeigt als Zeitdiagramm den beispielhaften Ablauf eines Zentrifugationspro- tokolls gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren mit einem mehrstufigen Zentri- fugationsschritt. In dem gezeigten Beispiel handelt es sich bei dem mehrstufigen Zentrifugationsschritt um einen Bindeschritt, bei welchem die Biomo leküle durch Zentrifugation an die Bindungsmatrix gebunden werden.
Hierzu wird die aufzureinigende Probe mit dem Bindungspuffer versetzt und dann zunächst für 1 min bei 500 x g zentrifugiert. Anschließend beschleunigt die Zent- rifuge, bis ein Beschleunigungswert von 8000 x g erreicht ist, und die Probe wird bei diesem Wert weitere 75 sec. zentrifugiert. Während dieser Prozedur binden die Nukleinsäuren an die Silikatmatrix, während alle restlichen Bestandteile die Silikatmatrix passieren und verworfen werden können. Anschließend wird mit einem Waschpuffer gewaschen, und die Nukleinsäuren werden mit einem Elutionspuffer von der Säule gewaschen und aufgefangen.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der in Beispiel 2A, 2B und 2C beschriebenen Experimente. Dabei sind einerseits die absoluten Ausbeuten an Nukleinsäure in ng gezeigt, und andererseits ist der Performancevorsprung des jeweils zweischrittigen Verfahrens in % gezeigt.
Fig. 3 zeigt ein Reaktionsgefäß 30, aufweisend eine Silikatmatrix 31, zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren. Nachdem das Reaktionsgefäß 30 mit eine Lösung bzw. Suspension aus einer Nukleinsäuren enthaltenden Probe und mindestens einem chaotropen Salz beschickt bzw. eine solche Lösung bzw. Suspension in dem Reaktionsgefäß hergestellt wurde, wird das Reaktionsgefäß in ein Passgenau größeres Auffanggefäß 32 platziert. Die Kombination aus beiden Gefäßen wird nun in einer nicht dargestellten Zentrifuge dem erfmdungsgemäßen Zentrifugationsprotokoll mit erstem Zentrifugationsschritt bei einem ersten Beschleunigungswert und zweitem Zentrifugationsschritt bei einem zweiten Beschleunigungswert, der höher ist als der erste Beschleunigungswert, unterzogen. Während dieser Prozedur binden die Nukleinsäuren an die Silikatmatrix, während alle restlichen Bestandteile die Silikatmatrix passieren und verworfen werden können. Anschließend wird mit einem Waschpuffer gewaschen, und die Nukleinsäuren werden mit einem Elutionspuffer von der Säule gewaschen und aufgefangen.
Fig. 4 zeigt ähnlich wie Fig. 1 als Zeitdiagramm den beispielhaften Ablauf von zwei weiteren Zentrifugationsprotokollen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren. Im zuoberst dargestellten Protokoll wird die Zentrifuge zwischen den einzelnen Zentrifugationsschritten bei verschiedenen Beschleunigungswerten kurz angehalten. Es gelten im Übrigen die zu Fig. 1 aufgeführten Beschreibungen.
In dem zuunterst dargestellten Protokoll wird zwischen dem ersten und dem zwei- ten Zentrifugationsschritt ein weiterer Zentrifugationsschritt bei einem intermediären Beschleunigungswert eingelegt. Es ist denkbar, dass noch weitere Zentrifuga- tionsschritte eingelegt werden, dies würde dem Zeitdiagramm ein mehr oder weniger treppenförmiges Aussehen verleihen.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Ein Verfahren zur Aufreinigung von Biomo lekülen aus einer Probe, aufwei- send die folgenden Schritte:
a) Anordnen eines Reaktionsgefäßes mit einer Bindungsmatrix in einer Zentrifuge, wobei vor bzw. nach diesem Schritt eine Lösung bzw. Suspension aus einer Biomo leküle enthaltenden Probe in dem Reaktionsgefäß hergestellt bzw. in das Reaktionsgefäß eingefüllt wird; sowie
b) einlegen mindestens eines mehrstufigen Zentrifugationsschritts, bestehend aus mindestens einem ersten Zentrifugationsschritt bei einem ersten Beschleunigungswert und mindestens einem zweiten Zentrifugati- onsschrittes bei einem zweiten Beschleunigungswert, der höher ist als der erste Beschleunigungswert; wobei
c) es sich bei Schritt b) um einen Bindeschritt, einen Waschschritt und/oder einen Elutionsschritt handeln kann.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Biomo lekülen um Stoffe ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Nukleinsäuren, Aminosäuren, Oligopeptide, Polypeptide, Monosaccharide, Oligosac- charide, Polysaccharide, Fette, Fettsäuren und/oder Lipide handelt.
3. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungsmatrix einen Anionentauscher, ein Silikatsubstrat, ein Kunststoffsubstrat, oder ein Chitosan enthaltendes Substrat aufweist.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung- matrix ein Silikatsubstrat aufweist, und dass ferner die Biomo leküle enthal- tende Probe vor der Zentrifugation mit mindestens einem chaotropen Salz vermischt wird.
5. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dem Verfahren ein Schritt zur Lyse von Biomoleküle enthaltenden ZeI- len oder Geweben vorausgeht.
6. Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem chaotropen Salz um ein Salz bzw. ein Gemisch von Salzen ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Guanidiniumhydrochlorid, Guanidiniumrho- danid, Guanidiniumiodid, Harnstoff, Ammoniumsulfat, Natriumiodid, KaIi- umiodid, Natriumperchlorat, Natrium(iso)thiocyanat und Guanidiumthiocya- nat handelt.
7. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Zentrifugationsschritt bei einem Beschleunigungswert im Bereich zwischen 5 - 2000 x g durchgeführt wird.
8. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Zentrifugationsschritt bei einem Beschleunigungswert im Bereich zwischen 100 - 25000 x g durchgeführt wird.
9. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsgefäße in einem Zentrifugenrotor vom „swing-out-Typ" zentrifugiert werden.
10. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass einzelnen Schritte des Verfahrens automatisiert ablaufen.
11. Reaktionsgefäß, aufweisend eine Bindungsmatrix, zur Verwendung in einem Verfahren zur Aufreinigung von Biomo lekülen aus einer Probe gemäß einem der Ansprüche 1 - 10.
12. Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Aufreinigung von Biomolekülen aus einer Probe gemäß einem der Ansprüche 1 - 7, wobei die Zusammensetzung mindestens einen Bestandteil aufweist ausgewählt aus der Gruppe enthaltend alkalische Agenzien, Phenol, lytische Enzyme, Isoamylalkohol, Chloroform (Lysepuffer) Chaotrope Salze (Bindungspuffer), Alkohole (Bindungspuffer), anorganische oder organische Salze (Elutionspuf- fer).
13. Kit of Parts, aufweisend mindestens eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 12.
14. Kit of Parts gemäß Anspruch 13, außerdem aufweisend
(a) mindestens ein Reaktionsgefäß gemäß Anspruch 11 , sowie
(b) Reagenzien zur Analyse von Biomolekülen in oder aus einer biologischen Probe oder zur Analyse der Morphologie einer biologischen Probe.
15. Vorrichtung zur Aufreinigung von Biomo lekülen aus einer Probe, aufweisend eine Zentrifuge, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung Mittel auf- weist, die es ermöglichen, dass während einer Zentrifugation ohne Benutzereingriff mindestens zwei Zentrifugationsschritte mit unterschiedlich hohen Beschleunigungswerten automatisiert eingelegt werden.
16. Zentrifugationsvorrichtung, aufweisend Mittel zur Durchführung eines Verfahrens zur Aufreinigung von Biomo lekülen aus einer Probe gemäß einem der Ansprüche 1 - 10.
17. Zentrifugationsvorrichtung gemäß Anspruch 16, aufweisend Mittel zur automatisierten Durchfuhrung eines Verfahrens zur Aufreinigung von Biomo lekü- len aus einer Probe gemäß einem der Ansprüche 1 - 10.
18. Aufgereinigte Nukleinsäure, herstellbar mit einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 - 10, einem Reaktionsgefäß gemäß Anspruch 11, einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, einem Kit gemäß einem der Ansprüche 13 - 14 und/oder einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 15 - 17.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101515892B1 (ko) * 2009-09-01 2015-05-04 렌슬러 폴리테크닉 인스티튜트 Ｋ5 헤파로산 발효 및 정제
EP2697397B1 (de) 2011-04-15 2017-04-05 The Johns Hopkins University Sicheres sortierungssystem
AU2013338393B2 (en) 2012-10-29 2017-05-11 The Johns Hopkins University Papanicolaou test for ovarian and endometrial cancers
JP5782533B2 (ja) * 2013-03-28 2015-09-24 富士フイルム株式会社 クロマトグラフ方法及びクロマトグラフキット
US11286531B2 (en) 2015-08-11 2022-03-29 The Johns Hopkins University Assaying ovarian cyst fluid
JP7232476B2 (ja) 2017-08-07 2023-03-08 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ がんを評価及び治療するための方法及び物質

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8900725A (nl) 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
JPH07108377B2 (ja) * 1989-08-24 1995-11-22 倉敷紡績株式会社 遠心分離装置
JPH07107975A (ja) * 1993-10-12 1995-04-25 Hitachi Ltd 核酸の精製方法及び装置
JPH1019863A (ja) * 1996-07-03 1998-01-23 J I Sci Kk 冷却遠心式クロマトグラフィー装置
US6177009B1 (en) * 1998-04-03 2001-01-23 Macherey, Nagel Gmbh & Co. Apparatus for treating biomolecules
EP0969090A1 (de) * 1998-05-27 2000-01-05 QIAGEN GmbH Schnelles und einfaches Verfahren zur Isolierung von zirkulären Nucleinsäuren
DE10031236A1 (de) * 2000-06-27 2002-01-10 Qiagen Gmbh Verwendung von Carbonsäuren und anderen Additiven in Kombination mit kationischen Verbindungen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren in biologischen Materialien
EP1355710A4 (de) * 2001-01-05 2005-01-26 Pro Chem Inc Reinigungsvorrichtungen und -verfahren
DE10153957A1 (de) * 2001-11-06 2003-05-22 Quiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren
DE20218503U1 (de) * 2002-11-28 2003-03-06 Macherey Nagel Gmbh & Co Hg Trennvorrichtung zur Behandlung von Biomolekülen
JP4939000B2 (ja) * 2005-06-17 2012-05-23 日立工機株式会社 遠心分離機
JP2007244375A (ja) * 2006-02-14 2007-09-27 Toyobo Co Ltd リボ核酸の分離精製方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"SIGMA 1-14K Tischkühlzentrifuge", Retrieved from the Internet <URL:http://www.sigma-zentrifugen.de/index.php?id=656> [retrieved on 20120720] *

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