DE102019118332B4

DE102019118332B4 - Verfahren und testkit zur bisulfitmodifizierung von dna

Info

Publication number: DE102019118332B4
Application number: DE102019118332.4A
Authority: DE
Inventors: Timo Hillebrand; Magdalena Grunt; Vipulkumar Patel
Original assignee: IST Innuscreen GmbH
Current assignee: IST Innuscreen GmbH
Priority date: 2019-07-07
Filing date: 2019-07-07
Publication date: 2022-04-07
Anticipated expiration: 2039-07-08
Also published as: EP3994277A1; WO2021013534A1; DE102019118332A1

Abstract

Verfahren zur Umwandlung einer Cytosinbase in einer Nukleinsäure durch Bisulfitbehandlung in eine Uracilbase, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure nach der Bisulfitbehandlung und einer Inkubation an eine nicht-mineralische feste Phase gebunden ist, die eine raue Oberfläche aufweist.

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft ein Verfahren und ein Testkit zur Durchführung einer Reaktion zur Bisulfitmodifizierung von DNA zur Bestimmung der Methylierungsmuster der DNA, dadurch gekennzeichnet, dass nach erfolgter Desaminierungsreaktion unter Verwendung von Bisulfit (z.B. Natriumbisulfit oder Ammoniumbisulfit) die modifizierte DNA an eine raue feste Phase gebunden wird und alle weiteren notwendigen Prozessschritte an dieser rauen festen Phase durchgeführt werden. Final erfolgt die Ablösung der modifizierten hochreinen DNA von dieser festen Phase. Das Verfahren kann manuell oder auch automatisiert durchgeführt werden.
Bei der rauen festen Phase handelt es sich um ein nicht-mineralisches Material mit einer rauen Oberfläche. Unter einer rauen Oberfläche versteht man eine nicht glatte oder strukturierte Oberfläche eines Materials, das vorzugsweise aus Metall, Kunststoff oder Gummi besteht. Auch kann eine Anordnung z.B. von Kunststoffgranulaten in einem Hohlraum eine Struktur erzeugen, welche als nichtglatte Oberfläche fungiert und damit ebenso gemäß der Erfindung eingesetzt werden kann.
DNA-Methylierung ist ein epigenetischer Mechanismus, der in den meisten Organismen gefunden wird. Seine Hauptfunktionen in Prokaryonten richten sich auf den Schutz gegen parasitäre DNA und die Kontrolle der Replikationsgenauigkeit. In Wirbeltieren ist die vorherrschende Methylierungsstelle der 5-Kohlenstoff von Cytosin innerhalb der CpG-Dinukleotidstellen. Mehr als die Hälfte der Gene enthält kurze (~ 1 kb) CpG-reiche Regionen, die als CpG-Inseln bezeichnet werden, während der Rest des Genoms keine CpGs vorweist. Während CpG-Stellen in CpG-Inseln überwiegend unmethyliert sind, werden die meisten CpG-Stellen außerhalb von CpG-Inseln normalerweise methyliert. Die Aufklärung der Funktion der CpG-Methylierung hat sich als schwierig herausgestellt und scheint mit dem Kontext zu variieren. Die CpG-Methylierung ist an mehreren fundamentalen Mechanismen beteiligt, d.h. an der Genregulation, der Inaktivierung von X-Chromosomen, dem Imprinting von Genomen und der Aufrechterhaltung der Chromosomenstabilität. Darüber hinaus ist eine anomale DNA-Methylierung ein Kennzeichen bösartiger Tumore und stellt ein frühes Ereignis während der Karzinogenese dar. Bei Tumoren nimmt die globale Genommethylierung ab (genomweite Hypomethylierung), während mehrere spezifische Gene methyliert werden (genspezifische Hypermethylierung). Hypomethylierung betrifft typischerweise repetitive DNA-Elemente, während Hypermethylierung normalerweise innerhalb von CpG-Inseln auftritt. Heutzutage ist die DNA-Methylierungsanalyse zu einem wichtigen Instrument für die Untersuchung von Krebs, Genexpression, genetischen Erkrankungen und vielen anderen wichtigen Aspekten der Biologie geworden. Die Untersuchung der DNA-Methylierung ist auch in der medizinischen Diagnostik immer wichtiger geworden.
Die meisten Techniken zur Untersuchung der DNA-Methylierung hängen von einer vorangehenden Desaminierung von Cytosin mittels Bisulfit (Natriumbisulfit oder Ammoniumbisulfit) ab. In Gegenwart von Bisulfit wird unmethyliertes Cytosin zu Uracil umgewandelt, während methyliertes Cytosin nicht beeinflusst wird. Dementsprechend wird die epigenetische Information in DNA-Sequenzinformation umgewandelt und kann daher durch molekularbiologische Standardverfahren wie PCR und DNA-Sequenzierung bestimmt werden.
Dies wird gegenwärtig durch die „Bisulfitmodifizierungs“ - Technik erreicht, die von Frommerm M., et al., Proc Natl Acad Sci U S A 89 (1992) 1827-31 beschrieben wurde. In diesem Protokoll wurde DNA mit NaOH denaturiert und anschließend für 16 Stunden in Gegenwart von 3,1 M Natriumbisulfit und 0,5 M Hydrochinon inkubiert, um eine Desaminierung von Cytosin zu Uracil zu erreichen, während methyliertes Cytosin nicht beeinflusst wird. Nachfolgend werden die epigenetischen Informationen der DNA in Sequenzinformationen umgewandelt, die über PCR und andere auf Hybridisierung basierende Methoden untersucht werden können. In letzter Zeit wurden mehrere technische Verbesserungen der Bisulfit-Methoden entwickelt WO 01/98528 ( DE 100 29 915 ; US Application 10/311,661 ), EP 1 294 945 B1 , US 7,118,868 B2 , US 7,968,295 B2 , US 8,241,855 B2 , US 8,257,950 B2 . Diese Patentschriften beschreiben eine Bisulfitumwandlung, bei der die DNA mit einer Bisulfitlösung eines Konzentrationsbereichs zwischen 0,1 mol / 1 bis 6 mol / 1 in Gegenwart eines denaturierenden Reagens und /oder Lösungsmittels und mindestens eines Radikalfängers inkubiert wird. In dieser Patentanmeldung werden mehrere geeignete denaturierende Reagenzien und Radikalfänger beschrieben.
In der US 9,868,756 B2 wird DNA nach der Bisulfitbehandlung an eine Oberfläche auf der Basis eines silikatischen Materials gebunden. Die nachfolgenden Schritte (Waschen der gebundenen DNA, Desulfonierung der DNA, weitere Waschschritte) erfolgen an der festen Phase. Bei diesem Material (feste Phase) handelt es sich um ein Glasflies oder eine Glasmembran, um magnetische Glaspartikel oder auch um Hydroxylapatit. In der Patentschrift EP 1394173 wird die DNA bereits vor der Inkubation mit einem Bisulfitreagenz an eine mineralische feste Phase gebunden und alle Schritte zur Bisulfitmodifizierung (Deaminierung, Waschschritte, Desulfonierung, Waschschritte) erfolgen an der festen Phase. Auch bei diesem Material handelt es sich um ein Glasflies oder eine Glasmembran, um magnetische Glaspartikel oder auch um Hydroxylapatit. In US 9,868,756 B2 wird in Spalte 6, Zeilen 15-18 explizit beschrieben, dass paramagnetische Substanzen für die Durchführung nicht geeignet sind. („Paramagnetic substances are not useful as they are only drawn to a magnetic very weakly which is not sufficient for a method according to this invention.“)
Diese Materialien verkörpern alle sogenannte mineralische feste Phasen. Daraus folgt, dass gemäß des bekannten Stands der Technik die mineralischen Eigenschaften der festen Phase - einschließlich der Poren, die diese Materialien bilden - entscheidend sind für die Anbindung der Bisulfit-behandelten DNA.
Diese Prozesse lassen sich manuell relativ einfach durchführen. Die automatisierte Umsetzung ist jedoch extrem schwierig. Darüber hinaus sind die benutzen festen Phasen teuer und haben insbesondere bei magnetischen Glaspartikeln auch das Problem, dass sie sich oftmals sehr schlecht separieren lassen bzw. oftmals stark verklumpen, was die Effizienz der Bisulfitmodifizierung stark negativ beeinflusst.
Aufgabe der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen Lösungen zu beseitigen. Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Bisulfitmodifizierung von DNA bereitzustellen, welches einfach in der Durchführung ist und welches insbesondere für eine automatisierte Durchführung bestens geeignet sein soll und in diesem Zusammenhang gänzlich auf bekannte mineralische Materialien zur Anbindung und Bisulfitmodifizierung von DNA verzichtet.
Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.
Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgaben in all den definierten Punkten. Der Kern der Erfindung ist die Erkenntnis, dass freie oder durch Lyse freigesetzte Nukleinsäuren unter spezifischen Bindungsbedingungen an eine feste Phase mit einer rauen Oberfläche gebunden werden können, dort gewaschen und final von dieser rauen Oberfläche eluiert werden. Der Begriff „raue Oberfläche“ ist so zu verstehen, dass durch Berühren der Oberfläche erkennbar ist, das diese nicht glatt ist (Offenlegungsschrift WO 2016/169677 A1 ). Vorzugsweise können als nichtmineralische feste Phasen Materialien aus Kunststoff, Metall, Nichtmetall eingesetzt wird. Nichtmineralische feste Phasen im Sinn dieser Erfindung sind Materialien, die nicht aus Glas, Siliziumdioxid, einem Ionenaustauscher oder Hydroxylapatit bestehen. Auch kann eine Anordnung von per se nicht rauen Materialien in einem Hohlraum dazu führen, dass durch sich ausbildende Ecken oder Kanten eine „raue“ bzw. strukturierte Oberfläche entsteht.
Der Begriff „raue Oberfläche“ ist so zu verstehen, dass durch Berühren oder durch Ansicht der Oberfläche erkennbar ist, dass diese nicht glatt ist. Dabei kann es sich aber auch um eine Oberfläche handeln, die eine Struktur aufweist (z.B. Rillen). Durch diese Struktur ist die Glattheit der Oberfläche aufgehoben, auch wenn die Struktur, also die Rillen, selbst glatt sein kann. Erfindungsgemäß werden solche Oberflächen als „strukturierte Oberflächen“ bezeichnet. Falls durch Ansicht oder Berühren der Oberfläche nicht erkennbar ist, ob eine Oberfläche glatt oder rau ist, kann ein Test durchgeführt werden, bei dem ein Laserstrahl auf diese Oberfläche gerichtet wird. Bei einer glatten Oberfläche wird der Laser nur in Hauptrichtung an der Oberfläche reflektiert. Bei rauen Oberflächen erfolgt eine Streuung in alle Raumrichtungen. Ein solcher Test ist auf der Web-Seite der Universität Kiel beschrieben worden (http://www.tf.uni-kiel.de/matwis/amat/semitech_en/kap_3/illustr/oberflaechenstrukture.pdf), Seite 7.
Überraschenderweise zeigte sich, dass nach erfolgter Deaminierungsreaktion alle notwendigen weiteren Prozessschritte zur Bisulfitmodifizierung von DNA, welche bisher unter der Verwendung von mineralischen Festphasen durchgeführt wurden, sehr einfach und schnell mittel der rauen Oberflächen durchgeführt werden können. Angesichts der Offenbarung von WO 2016/169677 A1 war dies keinesfalls zu erwarten, da dort im Absatz [0012] darauf hingewiesen wurde, dass eine Eluierung der angebundenen Nukleinsäuren von der festen Phase mittels eines Niedrigsalzpuffers möglich ist. Es wäre daher auch möglich gewesen, dass das Bisulfit wie ein solcher Niedrigsalzpuffer wirkt und die Anbindung an eine nichtmineralische feste Phase verhindert. Umso überraschender ist es, dass die bekannten Reagenzien für die Bisufitmodifizierung der DNA dabei beibehalten werden können. Idealerweise kann das Verfahren sowohl manuell als auch automatisiert durchgeführt werden. Gerade in Bezug auf eine automatisierte Bisulfitmodifizierung von DNA gibt es zurzeit keine geeigneten Lösungen.
Das erfindungsgemäße manuelle Verfahren zur Bisulfitmodifizierung von DNA wird in einer Vorzugsvariante wie folgt durchgeführt. Anstelle klassischer mineralischer Materialien zur Bindung der DNA wird ein Kunststoffgranulat mit rauer Oberfläche eingesetzt, welches vorzugsweise paramagnetisch ist. Mehrere Kunststoffgranulate, deren Oberfläche mechanisch angeraut wurde (Größe ca. 1-2 mm x 0.5 - 1mm), werden dazu in ein 2.0 ml Reaktionsgefäß verbracht. Die Bisulfitmodifizierungsreaktion (Desaminierungs- und/oder Desulfonierungsschritts sowie notwendige Waschschritte) werden mit Reagenzien aus einem kommerziell verfügbaren Kit zur Bisulfitmodifizierung von DNA durchgeführt (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG). Mittels der erfindungsgemäßen neuartigen festen Phase auf der Basis einer rauen Oberfläche werden nachfolgend folgende Verfahrensschritte durchgeführt:

1. Nach erfolgter Bisulfitbehandlung einer DNA durch Mischen der DNA mit den Reagenzien aus dem kommerziellen Kit (Conversion Reagent und Conversion Buffer) und einer nachfolgenden Inkubation des Reaktionsansatzes bei 85°C für 45 Minuten wird der Reaktionsansatz in das 2.0 ml Reaktionsgefäß mit den Granulaten überführt. Die Bindung der DNA an die Oberfläche der rauen Kunststoffgranulate wird durch die Zugabe eines Bindungspuffers, welcher eine alkoholische Komponente und weitere Zusätze enthält, oder durch die Zugabe nur eines Alkohols initiiert. Nach einer kurzen Inkubation wird der Überstand vom Kunststoff-Granulat entfernt, indem man das Reaktionsgefäß in eine Magnetfalle stellt.
2. Die gebundene modifizierte DNA wird mit einem alkoholischen Waschpuffer gewaschen und der Waschpuffer danach vollständig entfernt.
3. Es folgt die Desulfonierungsreaktion der am Kunststoff-Granulat gebundenen DNA. Dazu wird dem Reaktionsgefäß mit dem Granulat ein Desulfonation-Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG) zugegeben und der Ansatz für einige Minuten inkubiert. Nach der Inkubationszeit wird der Überstand vom Kunststoff-Granulat vollständig entfernt.
4. Es folgen weitere Waschschritte mit alkoholischen Waschpuffern und nachfolgend die Trocknung des Kunststoff-Granulates.
5. Final wird die modifizierte DNA durch Zugabe eines Niedrigsalzpuffers vom erfindungsgemäßen Granulat abgelöst.

Wie das erfindungsgemäße Verfahren in seiner manuellen Ausführungsvariante zeigt, ist es auf einfache Weise möglich, dass nach der Behandlung einer DNA mit einem Bisulfitreagenz alle Verfahrensschritte, die für eine Bisulfitmodifierung von DNA notwendig sind, der Art durchführt, dass keine der bisher Verwendung findenden mineralischen Materialien in Form von Glasfließ oder Glasmembran, Glaspartikel oder Hydroxylapatit mehr benötigt werden. Ausreichend für alle notwendigen Prozessschritte ist die Verwendung von Plastikmaterial, dessen Oberfläche eine Rauigkeit aufweist.
Das erfindungsgemäße Mittel und Verfahren offenbart noch weitere Vorteile. Für die Bearbeitung von größeren Probenumfängen ist es notwendig, Prozesse zu parallelisieren und im effektivsten Fall zu automatisieren. In Bezug auf das Verfahren der Bisulfitmodifikation von DNA gibt es eine Vielzahl von kommerziell verfügbaren Produkten zur manuellen Bearbeitung, jedoch für die Bearbeitung von großen Probenumfängen nur sehr wenige Produkte. Automatisierte Lösungen sind kommerziell nicht zu finden und müssen individuell von Anwendern auf Automationsplattformen implementiert werden.
Verfahren zur parallelen Probenbearbeitung basieren auf der Nutzung von magnetischen Glaspartikeln, an welchen die Bisulfitmodifizierungsreaktion stattfindet.
Es ist bekannt, dass die Handhabung magnetischer Partikel multiple Prozessschritte benötigt und insbesondere der jeweilige Schritt der magnetischen Separation der Partikel zeitaufwendig ist. Darüber hinaus sind diese Partikel sehr teuer.
Überaschenderweise zeigt sich, dass das erfindungsgemäße Mittel in idealer Weise geeignet ist, eine automatisierte Bisulfitmodifizierung von DNA durchzuführen.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante befindet sich das Material mit der rauen Oberfläche innerhalb einer Pipettenspitze, so dass Reagenzien an diesem Material vorbeiströmen können. Zum Beispiel kann dasselbe Material, welches für die manuelle Bisulfitmodifizierung verwendet wurde, auch in eine Pipettenspitze verbracht werden.
Nach erfolgter Bisulfitbehandlung der DNA werden alle weiteren Schritte des Bisulfitmodifizierungs-Prozesses innerhalb einer Pipettenspitze automatisiert durchgeführt, wobei die DNA an der Oberfläche des erfindungsgemäßen rauen Materials gebunden ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren läuft in Form eines „walk-away-Prozesses“ wie folgt ab:

1. Nach erfolgter Bisulfitbehandlung einer DNA durch Mischen der DNA mit den Reagenzien aus dem kommerziellen Kit (Conversion Reagent und Conversion Buffer) und einer nachfolgenden Inkubation des Reaktionsansatzes bei 85°C für 45 Minuten wird der Reaktionsansatz mit einem Bindungspuffer versetzt.
2. Der Reaktionsansatz wird mit einem Alkohol und/oder einem Alkohol und weiteren Komponenten gemischt. Die Mischung wird mit einer Pipettenspitze, in welcher sich das raue Material vertikal angeordnet befindet, aufgezogen und die Flüssigkeit durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren am rauen Material vorbeibewegt. Nach letztem Auspipettieren ist die erfindungsgemäße Pipettenspitze leer. Die zuvor Bisulfit-behandelte DNA befindet sich jetzt an der Oberflächen des in der Pipettenspitze befindlichen rauen Plastikgranulates.
3. Entfernen der erfindungsgemäßen Pipettenspitze aus der Probe.
4. Eintauchen der erfindungsgemäßen Pipettenspitze in eine Waschpufferlösung. Mehrmaliges Auf- und Abpipettieren (die Flüssigkeit bewegt sich dabei am Material vorbei). Nach letztem Auspipettieren ist die erfindungsgemäße Pipettenspitze leer.
5. Danach erfolgt die Desulfonierungsreaktion der am Kunststoff-Granulat gebundenen DNA innerhalb der Pipettenspitze. Dies erfolgt wiederum über Auf- und Abpipettieren eines Desulfonation-Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG).
6. Es folgen weitere Waschschritte mit alkoholischen Waschpuffern und nachfolgend die Trocknung des Kunststoff-Granulates, immer nur durch ein mehrmaliges Auf - und Abpipettieren.
7. Final wird die modifizierte DNA durch Zugabe eines Niedrigsalzpuffers vom erfindungsgemäßen Granulat abgelöst

Die ausgewählten und vertikal in die Pipettenspitze verbrachten Materialien zur Anbindung der bisulfitbehandelten DNA für alle weiteren notwendigen Verfahrensschritte können extrem unterschiedlich sein. Es können raue Materialien eingesetzt werden, modifizierte Plastikmaterialien, deren Oberflächen nicht glatt, sondern strukturiert sind. Dazu zählen auch sogenannte Kompositmaterialien, die Mischungen aus Polymeren und z.B. organischen Komponenten oder metallischen Komponenten darstellen. Wesentlich ist nur die Bereitstellung einer angerauten bzw. strukturierten Oberfläche (keine glatte Oberfläche). Die Architektur des Plastikmaterials ist ebenfalls nicht limitierend (rund, rechteckig, etc.). Wichtig ist nur, dass das Material in eine Pipettenspitze verbracht werden kann und auch an dieser Position verbleibt und jederzeit von einer Flüssigkeit umspült werden kann, ohne dass die Flüssigkeit durch das eingebrachte Material hindurch muss. Auch kann eine Pipettenspitze eingesetzt werden, in welcher sich (aus einem Spritzgussteil gefertigt), dass Bindungsmaterial schon befindet und dieses nicht mehr in die Spitze verbracht werden muss.
Überaschenderweise kann auch eine weitere automatisierte Bisulfitmodifierung durchgeführt werden. Hier wird keine Pipettenspitze genutzt.
Verwendet und zweckendfremdet wird eine Geräte-Plattform, bei welcher es sich um einen kommerziell verfügbaren Magntepartikelprozessor handelt (z.B. KingFisher Flex für die DNA/RNA Extraktion und die Bearbeitung von 96 Proben).
Es handelt sich dabei um ein Gerät zur Extraktion von Nukleinsäuren mittels magnetischer Partikel. Das Gerät verwendet dabei Plastikkämme, in welche Magnetstäbe einfahren, welche dann in einem walk-away-Prozess Magnetpartikel bewegen und in die für eine Standardextraktion notwendigen Puffer eintauchen. Diese Plastikkämme wurden für das erfindungsgemäße Verfahren zweckentfremdet eingesetzt, indem ihr unteres Ende mechanisch angeraut wurde. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bisulfitmodifizierug von DNA wurde mittels des Gerätes dann automatisiert umgesetzt. Im Unterschied zur Pipettenspitzen-Variante bindet die DNA diesmal an die raue Oberfläche der Plastikkämme und durchläuft in einem walk-away-Worklflow nacheinander alle notwendigen Schritte, die der initialen Deaminierungsreaktion folgen. Das Verfahren ist extrem einfach und erlaubt es, bis zu 96 Proben parallel zu bearbeiten.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht damit in idealster Weise die Umsetzung der schon aufgeführten Zielstellung. Für die Methode der Bisulfitmodifizierung von DNA incl. aller dafür notwendigen Prozessschritte benötigt man keine aus dem Stand der Technik bekannten mineralischen Materialien, sondern lediglich angeraute Oberflächen.
Mit der Erfindung steht damit eine völlig neuartige Plattformtechnologie für die Bisulfitmodifizierung von DNA zur Verfügung, welche eine Vielzahl von ganz deutlichen Vorteilen gegenüber den bekannten Verfahren, welche mineralische Materialien für die Methode einsetzen, aufweist. Vor allem die automatisierte Umsetzung ist erstmals ganz einfach und schnell möglich.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erklärt, wobei die aufgeführten Beispiele keine Limitationen der Erfindung darstellen.
Ausführungsbeispiele
Ausführungsbeispiel 1:
Automatisierte Bisulfitmodifizierung von DNA mittels einer Pipettenspitze mit enthaltenem rauen Plastik-Granulat und unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Extraktions automaten
Die automatisierte Bisulfitmodifizierung wurde mit dem Extraktionsautomaten InnuPure C16 (Analytik Jena AG) durchgeführt. Dieser Extraktionsautomat basiert auf einer Magnetpartikel-Nukleinsäureextraktion, wurde aber für das Verfahren „zweckentfremdet“ ohne Magnetpartikel eingesetzt.
Für die Durchführung der Reaktion wurde das erfindungsgemäße raue Kunststoffmaterial in das untere Drittel einer 1 ml-Pipettenspitze vertikale eingebracht. Die für die Bisulfitmodifizierung der DNA notwendigen Reagenzien wurden dabei teilweise aus dem kommerziell verfügbaren Kit (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG)genommen.
Für die Bisulfit- Modifizierung wurde 5 µg genomische DNA mit 70 µl Conversion Reagent und 30 µl Coversion Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG) in einem 2.0 ml Reaktionsgefäß gemischt und für 45 Minuten bei 85°C und 800 rpm inkubiert.
Während der Inkubation wurde eine Deep Well-Platte mit folgenden Reagenzien befüllt:

Kavität 1: 250 µl Ethanol
Kavität 2: 1 ml Washing Solution HS (Analytik Jena AG)
Kavität 3: 1 ml Desulfonation Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG)
Kavität 4: 1 ml Washing Solution LS (Analytik Jena AG)
Kavität 5: 1 ml 80 %iger Ethanol
Kavität 6: 1 ml 80 %iger Ethanol
Kavität 7: 100 µl Elution Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG)

Der oben beschriebene Reaktionsansatz wurde nach der Inkubation in die Kavität 1 gegeben, die mit 250 µl 99,8 %igem Ethanol befüllt war. Zu diesem Reaktionsansatz wurden weiterhin noch 5 µl Binding Optimizer (Analytik Jena AG) gegeben. Nachfolgend wurde das automatisierte Verfahren auf dem Innupure C16 durchgeführt.
Der Reaktionsansatz der Kavität 1 wurde mittels der erfindungsgemäßen Pipettenspitze durch Auf- und Abpipettieren derart durchmischt, dass die Lösung seitlich an den in der Spitze eingebrachten rauen Kunststoffgranulaten vorbeiströmt. Es wurden 100 Wiederholungen durchgeführt. Bei diesem Schritt bindet die Bisulfit-modifizierte DNA an die raue Kunststoffoberfläche der in der Pipettenspitze verbrachten Granulate. Nach Bindung der DNA wurde die gebundene DNA gewaschen. Dies erfolgte in der Kavität 2, welche mit einem alkoholischen Waschpuffer (Washing Solution HS) befüllt war. Gewaschen wurde durch 10-maliges Auf- und Abpipettieren.
Für die Desulfonierungsreaktion wurde die an den rauen Kunststoffgranulaten gebundene DNA mit Desulfonation Buffer in Kontakt gebracht (4-maliges Auf- und Abpipettieren). Dabei wurde eine Inkubationszeit mit Desulfonation Buffer von 2 Minuten bei jedem Pipettierschritt eingehalten.
Danach wurde sukzessive in drei weiteren Kavitäten, die alkoholische Waschpuffer (Washing Solution LS, 80 %iger Ethanol, 80 %iger Ethanol) enthielten, die an den Kunststoffgranulaten gebundene DNA durch Auf- und Abpipettieren gewaschen.
Im Anschluss an den letzten Waschschritt wurde die erfindungsgemäße Spitze und die in ihr enthaltenen rauen Kunststoffgranulate durch 60-maliges Auf- und Abpipettieren von Luft getrocknet und damit der restliche Ethanol entfernt. Die Elution der Nukleinsäuren erfolgte durch 150-maliges Auf- und Abpipettieren mit 100 µl Elution Buffer, der durch das Gerät zuvor auf 50 °C temperiert worden war. Das Gesamtvolumen an Elution Buffer betrug 100 µl.
Das Verfahren ist extrem einfach und schnell und zeigt, dass kommerziell verfügbare Extraktionsautomaten für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem dazu korrespondierenden erfindungsgemäßen Mittel eingesetzt werden können. Der zeitliche Aufwand im Vergleich zu einer Spin Säulen-basierten Extraktion ist geringer.
Um das erfindungsgemäße Verfahren mit einem kommerziell verfügbaren Produkt, welches auf der Basis von mineralischen Materialien beruht, zu vergleichen, wurde ein Bisulfitmodifizierungs Kit (Spin Filter Säulen basiert) der Firma Stratec Molecular (InviGene Bisulfite Conversion Kit) getestet. Dabei wurde die Anleitung wie im Kit-Manual beschrieben exakt eingehalten.
Nach durchgeführten Bisulitmodifizierungsreaktionen erfolgte der Nachweis einer erfolgreichen Bisulfitmodifizierung mittels verschiedener Real-Time PCR Assays.
Ein für den Actin Beta-Genlocus spezifisches Real-Time-PCR-Assay wurde verwendet, um die Gesamtmenge an Bisulfit-modifizierter DNA zu quantifizieren. Der Actin Beta Genlocus enthält keine CpG-Stellen daher werden alle Cytosine von diesem Genlocus nach der Bisulfitmodifizierungsreaktion in Uracile umgewandelt und diese werden in Real-Time-PCR-Assay als Thymine detektiert. Mit diesem Assay wurde überprüft, ob die genomische DNA Bisulfit-modifiziert ist.
Dafür wurden folgende Primer und Taq-man Sonden genutzt.

Forward Primer: 5'-CCCTTAAAAATTACAAAAACCACAA-3'
Reverse Primer: 5'- GGAGGAGGTTTAGTAAGTTTTTTG -3'
Taq-man Sonde: 5'-FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ-1-3'

Real-Time PCR Ansatz:
Forward Primer (50 pmol/µl):	0,1 µl
Reverse Primer (50 pmol/µl):	0,1 µl
Taq-man Sonde (25 pmol/µl):	0,1 µl
InnuMIX qPCR MasterMix Probe (Analytik Jena):	7,5 µl
Bisulfit- modifizierte bzw. genomische DNA:	1,5 µl
PCR- Grade H₂O:	5,7 µl

Die Real-Time PCR wurde im CFX96 Real-Time System von der Firma Biorad durchgeführt.
Amplifikationskonditionen:

Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen (95 °C/4"; 57 °C /40" )

Methode	Ct-Werte (Mittelwert)
automatisierte Durchführung mit InnuPure C16	25,39(blaue Kurven)
Säule-basierten Extraktion Kit von der Firma Statec	27,36 (grüne Kurven)

Die 1 zeigt eine Real-Time-PCR vom β-Actin Assay. (graue Kurven: genomische DNA, magenta Kurven: No Template Control; Blaue und grüne Kurven-Proben DNA nach jeweiliger Bisulfitmodifizierungsreaktion).
Die Ergebnisse zeigen, dass die genomische DNA erfolgreich mit Hilfe des automatisierten Verfahrens mit dem Extraktionsautomaten InnuPure C16 und einem erfindungsgemäßen rauen Kunststoffmaterial modifiziert werden konnte und die recovery-Rate der modifizierten DNA deutlich besser war, als beim Vergleichsverfahren der Firma Stratec Molecular.
Der Cytosine free fragment (CFF-1) Assay amplifiziert genomische und Bisulfit-modifizierte DNA mit gleicher Effizient und ist daher geeignet für die Quantifizierung der Ausbeute von Bisulfit- modifizierter DNA. Er ermöglicht den direkten Vergleich von Input-DNA und Output-DNA der Bisulitmodifizierungsreaktion. Bei genomischer DNA dienen der sense-und der antisence-Strang als Template. Dagegen dient nur der sense-Strang bei Bisulfit-modifizierter DNA als Template, weil der antisense-Strang (enthält Cytosine) nach der Bisuifit-Modifikation nicht für die Amplifikationsreaktion zur Verfügung steht. Deswegen hat man den theoretischen Verlust von einem Ct-Wert bei der Bisulfit-modifizierter DNA, da sich das Template nach der Bisulfit-Modifikation halbiert.
Die Sequenz des Primems und Taq-man Sonde sind wie folgt.

Forward Primer: 5'-TAAGAGTAATAATGGATGGATGATG-3'
Reverse Primer: 5'-CCTCCCATCTCCCTTCC-3'
Taq-man Sonde: 5'- FAM-ATGGATGAAGAAAGAAAGGATGAGT-BHQ-1-3'

Real-Time PCR Ansatz:
Forward Primer (50 pmol/µl)	0,1 µl
Reverse Primer (50 pmol/µl)	0,1 µl
Taq-man Sonde (25 pmol/µl)	0,1 µl
InnuMIX qPCR MasterMix Probe (Analytik Jena)	7,5 µl
Bisulfit- modifizierte e bzw. genomische DNA	1,5 µl
PCR- Grade H₂O	5,7 µl

Die Real-Time PCR wurde im CFX96 Real-Time System von der Firma Biorad durchgeführt:

Amplifikationskonditionen:
- Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
- Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen (95 °C/4"; 52 °C /40")

Methode	Ct-Werte (Mittelwert)
automatisierte Durchführung mit InnuPure C16	23,71 (blaue Kurven)
Säule-basierten Extraktion Kit von der Firma Statec	24,66 (grüne Kurven)
genomische DNA	22,08 (graue Kurven)

Die 2 zeigt eine Real-Time-PCR vom CFF-1 Assay. (magenta Kurven : No Template Control; graue Kurven: genomische DNA; blaue und grüne Kurven Proben DNA nach Bisulfitmodifizierungsreaktion). Auch hier sind die Ergebnisse besser, als mit dem Vergleichsverfahren.
Als weitere Analyse wurde ein CFP 415 bp- Assay (Cytosine-free primer binding site) mit Bisulfit-modifizierter DNA durchgeführt. Da mit diesem Assay lange DNA-Sequenz amplifiziert wird, liefert dieses Assay Information über die abgebaute DNA während der Bisulfit-Modifizierung und während der Aufreinigung von Bisulfit-modifizierter DNA. Die Sequenzen von den Primern sind wie folgt:

Forward Primer: 5'-ATGGGTAAGGATATGAAGTTAAT-3'
Reverse Primer: 5'- TATCACTTAATCACCTCCTAAACTA-3'

Real-Time PCR Ansatz:

Forward Primer (50 pmol/µl):	0,1 µl
Reverse Primer (50 pmol/µl):	0,1 µl
innuMix qPCR DSgreen Standard (Analytik Jena):	7,5 µl
Bisulfit- modifizierte e bzw. genomische DNA:	1,5 µl
PCR- Grade H₂O:	5,8 µl

Amplifikationskonditionen:
- Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
- Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen (95 °C/4"; 58 °C /40" )

Methode	Ct-Werte (Mittelwert)
automatisierte Durchführung mit InnuPure C16	25,32(blaue Kurven)
Säule-basierten Extraktion Kit von der Firma Statec	27,93 (grüne Kurven)

Die 3 zeigt eine Real-Time-PCR des CFP 415 bp- Assay. (magenta Kurven: No Template Control, grüne und blauen Kurven: Proben DNA nach Bisulfitmodifizierungsreaktion).
Die Ergebnisse zeigen weniger abgebaute DNA nach der Bisulfit-Modifizierung mit automatisierter Durchführung mit dem InnuPure C16 im Vergleich mit dem Spin Filterbasierten Kit der Fa. Stratec Molecular.
Wie die Ergebnisse zeigen, ist es mit dem erfindungsgemäßen Mittel und dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, allein unter Verwendung von Standard Reagenzien, welche für die Durchführung von Bisulfitmodifizierungsreaktionen eingesetzt werden, mittels weniger Pipettierschritte mit einem Pipettierautomaten, welcher normalerweise mit Magnetpartikeln arbeitet, Bisulfit-modifizierter DNA zu binden, zu desulfonieren und aufzureinigen. Es zeigt sich, dass die Ausbeuten nahezu 100 % sind und damit im Vergleich zu kommerziellen Produkt deutlich bessere Ergebnisse erzielt werden können.
Ausführungsbeispiel 2: Automatisierte Bisulfitmodifizierung von DNA unter Verwendung eines KingFisher Flex Magnetpartikelprozessors und der Verwendung angerauter Plastik-Kämme
Die automatisierte Aufreinigung wurde mit dem Magnetpartikelprozessor KingFisher Flex (ThermoFisher Scientific) durchgeführt. Dieses Instrument verwendet Kunststoffkämme, in die Magnetstäbe eindringen und die dann in einem walk-away-Prozess Magnetpartikel bewegen, die zur Isolierung von Nukleinsäuren verwendet werden. Diese Kunststoffkämme wurden außerhalb ihres normalen Verwendungszwecks zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet. Das Kunststoffmaterial der Kämme ist Polypropylen. Erfindungsgemäß wurden die Kunststoffkämme mittels einer Schleifmaschine aufgeraut. Die für die Bisulfitmodifizierung der Nukleinsäuren eingesetzten Reagenzien wurden dabei teilweise aus dem kommerziellen Kit „innuCONVERT Bisulfite Basic Kit“; Analytik Jena AG, genommen.
Für die Bisulfitmodifizierung wurden 5 µg genomische DNA mit 70 µl Conversion Reagent und 30 µl Coversion Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG) in einem 2.0 ml Reaktionsgefäß zusammengemischt und für 45 Minuten bei 85 °C und bei 800 rpm inkubiert.
Während der Inkubation wurden die Deep Well-Platten für den Einsatz im KingFisher Flex-Automaten mit folgenden Reagenzien befüllt:

Deep Well-Platte 1: 250 µl Ethanol
Deep Well-Platte 2: 1 ml Washing Solution HS (Analytik Jena AG)
Deep Well-Platte 3: 1 ml Desulfonation Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG)
Deep Well-Platte 4: 1 ml Washing Solution LS (Analytik Jena AG)
Deep Well-Platte 5: 1 ml 80 %iger Ethanol
Deep Well-Platte 6: 1 ml 80 %iger Ethanol
Deep Well-Platte 7: 100 µl Elution Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG)

Der oben beschriebene Reaktionsansatz wurde nach der Inkubation in die Kavität 1 gegeben, die mit 250 µl 99,8 %igem Ethanol befüllt war. Zu diesem Reaktionsansatz wurden weiterhin noch 5 µl Binding Optimizer (Analytik Jena AG) gegeben. Nachfolgend wurde das automatisierte Verfahren auf dem KingFisher Flex-Automaten durchgeführt.
Der Reaktionsansatz der Kavität 1 wurde mittels der erfindungsgemäßen rauen Plastik-Kämme durch sich wiederholende Vertikalbewegungen (Ein und Auftauchen innerhalb der Deep-Well-Platten-Kavität) durchmischt. Bei diesem Schritt bindet die Bisulfit-modifizierte DNA an die raue Kunststoffoberfläche der Plastik-Kämme. Nach erfolgter Bindung der DNA wurde diese durch vertikale Bewegung des Kammes in der Kavität der Deep-Well-Platte 2 mit enthaltener Washing Solution HS (Analytik Jena AG) gewaschen.
Für die Desulfonisierungsreaktion wurden die rauen Kunststoffkämme in Desulfonation Buffer für 8 Minuten vertikal langsam auf-- und ab bewegt.
Danach wurde die an den rauen Kunststoffkämmen gebundene Bisulfit-modifizierte DNA sukzessive in drei weiteren Deep-Well-Platten, die alkoholische Waschpuffer (Washing Solution LS, 80 %iger Ethanol, 80 %iger Ethanol) enthielten, je für 30 Sekunden durch langsames vertikales Auf- und Abbewegen gewaschen.
Im Anschluss an den letzten Waschschritt wurden die Kunststoffkämme an der Luft für 10 Minuten getrocknet und damit der restliche Ethanol entfernt. Die Elution der Bisulfitmodifizierten DNA von den rauen Kunststoffkämme erfolgte durch 10 Minuten schnelle vertikale Bewegungen der Kunststoffkämme in Elution Buffer, welcher zuvor durch das Gerät auf 80 °C temperiert worden war. Das Gesamtvolumen an Elution Buffer betrug 100 µl.
Das Verfahren ist extrem einfach und schnell und zeigt, dass mit dem kommerziell verfügbaren Extraktionsautomaten KingFisher Flex allein durch die Modifizierung der Plastik-Kämme eine automatisierte Bisulfitmodifizierung von bis zu 96 Proben-DNA's parallel durchgeführt werden kann. Die Analyse der modifizierten DNA erfolgte wiederum mittels verschiedener Real-Time-PCR-Assays. Als Vergleichsprodukt wurde wiederum der Kit der Fa. Stratec Molecular mitgeführt (InviGene Bisulfite Conversion Kit), welcher auf der Basis mineralischer Festphasen arbeitet.
Nach durchgeführten Bisulitmodifizierungsreaktionen erfolgte der Nachweis einer erfolgreichen Bisulfitmodifizierung mittels verschiedener Real-Time PCR Assays.
Ein für den Actin Beta-Genlocus spezifisches Real-Time-PCR-Assay wurde verwendet, um die Gesamtmenge an Bisulfit-modifizierter DNA zu quantifizieren. Der Actin Beta Genlocus enthält keine CpG-Stellen daher werden alle Cytosine von diesem Genlocus nach der Bisulfitmodifizierungsreaktion in Uracile umgewandelt und diese werden in Real-Time-PCR-Assay als Thymin detektiert. Mit diesem Assay wurde überprüft, ob die genomische DNA Bisulfit-modifiziert ist.
Dafür wurden folgende Primer und Taq-man Sonden genutzt.

Real-Time-PCR-Ansatz:

Forward Primer (50 pmol/µl):	0,1 µl
Reverse Primer (50 pmol/µl):	0,1 µl
Taq-man Sonde (25 pmol/µl):	0,1 µl
InnuMIX qPCR MasterMix Probe (Analytik Jena):	7,5 µl
Bisulfit- modifizierte bzw. genomische DNA:	1,5 µl
PCR- Grade H₂O:	5,7 µl

Die Real-Time-PCR wurde im CFX96 Real-Time-System von der Firma Biorad durchgeführt.
Amplifikationskonditionen:

Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen (95 °C/4"; 57 °C /40")

Methode	Ct-Werte (Mittelwert)
automatisierte Durchführung mit KingFisher Flex	25,66(gelbe Kurven)
Säule-basierten Extraktion Kit von der Firma Statec	27,36 (grüne Kurven)

Die 4 zeigt eine Real-Time-PCR vom β-Actin Assay. (graue Kurven: genomische DNA, magenta Kurven: No Template Control; Blaue und grüne Kurven-Proben DNA nach jeweiliger Bisulfitmodifizierungsreaktion).
Die Ergebnisse zeigen, dass die genomische DNA erfolgreich mit Hilfe des automatisierten Verfahrens mit dem Extraktionsautomaten KingFisher Flex und den angerauten Plastik-Kämmen einer Bisulfitmodifizierung von DNA unterzogen werden konnte. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besser in der Performance, als das kommerziell verfügbare Vergleichsverfahren.
Der Cytosine free fragment (CFF-1) Assay amplifiziert genomische und Bisulfit-modifizierte DNA mit gleicher Effizient und ist daher geeignet für die Quantifizierung der Ausbeute von Bisulfit- modifizierter DNA. Er ermöglicht den direkten Vergleich von Input-DNA und Output-DNA der Bisulitmodifizierungsreaktion. Bei genomischer DNA dienen der sense-und der antisence-Strang als Template. Dagegen dient nur der sense-Strang bei Bisulfit-modifizierter DNA als Template, weil der antisense-Strang (enthält Cytosine) nach der Bisuifit-Modifikation nicht für die Amplifikationsreaktion zur Verfügung steht. Deswegen hat man den theoretischen Verlust von einem Ct-Wert bei der Bisulfit-modifizierter DNA, da sich das Template nach der Bisulfit-Modifikation halbiert.
Die Sequenz der Primer und der Taq-man Sonde sind wie folgt.

Forward Primer: 5'- TAAGAGTAATAATGGATGGATGATG-3'
Reverse Primer: 5'-CCTCCCATCTCCCTTCC-3'
Taq-man Sonde: 5'- FAM-ATGGATGAAGAAAGAAAGGATGAGT-BHQ-1-3'

Real-Time PCR Ansatz:

Forward Primer (50 pmol/µl)	0,1 µl
Reverse Primer (50 pmol/µl)	0,1 µl
Taq-man Sonde (25 pmol/µl)	0,1 µl
InnuMIX qPCR MasterMix Probe (Analytik Jena)	7,5 µl
Bisulfit- modifizierte e bzw. genomische DNA	1,5 µl
PCR- Grade H₂O	5,7 µl

Die Real-Time-PCR wurde im CFX96 Real-Time-System von der Firma Biorad durchgeführt:

Amplifikationskonditionen:
- Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
- Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen ( 95 °C/4"; 52 °C /40" )

Methode	Ct-Werte (Mittelwert)
automatisierte Durchführung mit KingFisher Flex	24,40 (gelbe Kurven)
Säule-basierten Extraktion Kit von der Firma Statec	24,66 (grüne Kurven)
genomische DNA	22,08 (graue Kurven)

Die 5 zeigt eine Real-Time-PCR vom CFF-1 Assay. (magenta Kurven : No Template Control; graue Kurven: genomische DNA; blaue und grüne Kurven Proben DNA nach Bisulfitmodifizierungsreaktion).
Als weitere Analyse wurde ein CFP 415 bp- Assay (Cytosine-free primer binding site) mit Bisulfit-modifizierter DNA durchgeführt. Da mit diesem Assay lange DNA-Sequenz amplifiziert wird, liefert dieses Assay Information über die abgebaute DNA während der Bisulfit-Modifizierung und während der Aufreinigung von Bisulfit-modifizierter DNA. Die Sequenzen von den Primern sind wie folgt:

Forward Primer: 5'-ATGGGTAAGGATATGAAGTTAAT-3'
Reverse Primer: 5'-TATCACTTAATCACCTCCTAAACTA-3'

Real-Time PCR Ansatz:

Forward Primer (50 pmol/µl):	0,1 µl
Reverse Primer (50 pmol/µl):	0,1 µl
innuMix qPCR DSgreen Standard (Analytik Jena):	7,5 µl
Bisulfit- modifizierte bzw. genomische DNA	1,5 µl
PCR- Grade H₂O:	5,8 µl

Amplifikationskonditionen:
- Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
- Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen ( 95 °C/4"; 58 °C /40" )

Methode	Ct-Werte (Mittelwert)
automatisierte Durchführung mit KingFisher Flex	25,39(gelbe Kurven)
Säule-basierten Extraktion Kit von der Firma Statec	27,93 (grüne Kurven)

Die 6 zeigt eine Real-Time-PCR des CFP 415 bp- Assay. (magenta Kurven: No Template Control, grüne und gelbe Kurven: Proben DNA nach Bisulfitmodifizierungsreaktion).
Die Ergebnisse zeigen weniger abgebaute DNA nach der Bisulfit-Modifizierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zum kommerziellen Produkt.
Ausführungsbeispiel 3: Manuelle Bisulfitmodifizierung mittels paramagnetischer Kunststoffgranulate mit angerauter Oberflächenbeschaffenheit
Für die manuelle Durchführung der Bisulfitmodifizierungsreaktion mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden 4 mechanisch angeraute paramagnetische Kunststoffgranulate in ein 2.0 ml Reaktionsgefäß verbracht.
Die für die Bisulfit-Modifizierung der Nukleinsäuren eingesetzten Chemikalien wurden dabei teilweise aus dem kommerziellen Extraktionskit innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG genommen.
Für die Bisulfit-Modifizierung wurden 5 µg genomische DNA mit 70 µl Conversion Reagent und 30 µl Coversion Buffer (beide Lösungen aus dem innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG) in einem 2.0 ml Reaktionsgefäß gemischt und für 45 Minuten bei 85 °C und bei 800 rpm inkubiert.
Nach erfolgter Bisulfit-Modifizierung wurde der Reaktionsansatz in das 2.0 ml Reaktionsgefäß mit den Kunststoffgranulaten überführt. Für die Bindung der DNA an die Kunststoffgranulate wurden 250 µl 99,8 %iger Ethanol und 5 µl Binding Optimizer (Analytik Jena AG) zugegeben und das Gefäß für 10 Minuten bei Raumtemperatur und bei 1400 rpm geschüttelt.
Nach der Inkubation wurde das 2.0 ml Reaktionsgefäß in einer Magnetfalle platziert, die paramagnetischen Granulate separiert und der Überstand entfernt.
Danach erfolgte die Zugabe von 1 ml Washing Solution HS (Analytik Jena AG). Das Gefäß wurde dreimal invertiert. Dabei wurde das Reaktionsgefäß in der Magnetfalle gelassen. Danach wurde der Überstand von den Kunststoffgranulaten entfernt.
Danach erfolgte die Desulfonierungsreaktion der an den Kunststoffgranulaten gebundenen DNA. Dazu wurde dem 2.0 ml Reaktionsgefäß mit den Kunststoffgranulaten 1 ml Desulfonation Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG) zugegeben und für 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde der Überstand von den Kunststoffgranulaten vollständig entfernt. Dazu wurde das Reaktionsgefäß in der Magnetfalle belassen.
Zu dem 2.0 ml Reaktionsgefäß mit den Kunststoffgranulaten wurde 1 ml Washing Solution C (Puffer aus innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG) zugegeben und das Reaktionsgefäß dreimal invertiert. Dazu verblieb das 2.0 ml Reaktionsgefäß in der Magnetfalle. Danach wurde der Überstand von den Kunststoffgranulaten entfernt.
Es folgten drei weitere Waschschritte mit alkoholhaltigen Waschpuffern, 1 ml Washing Solution BS (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG), 1 ml 80 %iger Ethanol und 1 ml 80 %iger Ethanol.
Nach dem letzten Waschschritt wurde das 2.0 ml Reaktionsgefäß mit den Kunststoffgranulaten bei 65 °C für 10 Minuten und 500 rpm mit offenem Deckel inkubiert, um den restlichen Alkohol zu entfernen.
Final wurde die Bisulfit-modifizierte DNA durch Zugabe von Elution Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG) vom erfindungsgemäßen Kunststoffgranulat abgelöst. Dafür wurden 100 µl Elution Buffer zu den Kunststoffgranulaten gegeben und das Reaktionsgefäß für 10 Minuten bei 65 °C und bei 500 rpm inkubiert.
Das 2.0 ml Reaktionsgefäß mit den Kunststoffgranulaten wurde in einer Magnetfalle platziert, die Granulate wurden separiert und das Eluat in ein neues 2.0 Reaktionsgefäß überführt.
Der Spin Filter-Säulen-basierte Extraktion Kit von der Firma Stratec (InviGene Bisulfite Conversion Kit) wurde zum Vergleich genutzt. Dabei wurde die Anleitung wie im Kit-Manual beschrieben exakt eingehalten.
Nach durchgeführten Bisulitmodifizierungsreaktionen erfolgte der Nachweis einer erfolgreichen Bisulfitmodifizierung mittels verschiedener Real-Time PCR Assays.
Ein für den Actin Beta-Genlocus spezifisches Real-Time-PCR-Assay wurde verwendet, um die Gesamtmenge an Bisulfit-modifizierter DNA zu quantifizieren. Der Actin Beta Genlocus enthält keine CpG-Stellen daher werden alle Cytosine von diesem Genlocus nach der Bisulfitmodifizierungsreaktion in Uracile umgewandelt und diese werden in Real-Time-PCR-Assay als Thymine detektiert. Mit diesem Assay wurde überprüft, ob die genomische DNA Bisulfit-modifiziert ist.
Dafür wurden folgende Primer und Taq-man Sonden genutzt.

Real-Time-PCR-Ansatz:

Die Real-Time-PCR wurde im CFX96 Real-Time System von der Firma Biorad durchgeführt.
Amplifikationskonditionen:

Methode	Ct-Werte (Mittelwert)
Manuelle Durchführung	26,32(rote Kurve)
Säule-basierten Extraktion Kit von der Firma Statec	27,36 (grüne Kurve)

Die 7 zeigt eine Real-Time-PCR vom β-Actin Assay. (graue Kurven: genomische DNA, magenta Kurven: No Template Control; rote und grüne Kurven-Proben DNA nach jeweiliger Bisulfitmodifizierungsreaktion).
Die Ergebnisse zeigen, dass die genomische DNA erfolgreich mit der Hilfe des erfindungsgemäßen manuellen Verfahrens modifiziert werden konnte.
Der Cytosine free fragment (CFF-1) Assay amplifiziert genomische und Bisulfit-modifizierte DNA mit gleicher Effizient und ist daher geeignet für die Quantifizierung der Ausbeute von Bisulfit- modifizierter DNA. Er ermöglicht den direkten Vergleich von Input-DNA und Output-DNA der Bisulitmodifizierungsreaktion. Bei genomischer DNA dienen der sense-und der antisence-Strang als Template. Dagegen dient nur der sense-Strang bei Bisulfit-modifizierter DNA als Template, weil der antisense-Strang (enthält Cytosine) nach der Bisuifit-Modifikation nicht für die Amplifikationsreaktion zur Verfügung steht. Deswegen hat man den theoretischen Verlust von einem Ct-Wert bei der Bisulfit-modifizierter DNA, da sich das Template nach der Bisulfit-Modifikation halbiert.
Die Sequenz der Primer und der Taq-man Sonden sind wie folgt:

Forward Primer: 5'-TAAGAGTAATAATGGATGGATGATG-3'
Reverse Primer: 5'-CCTCCCATCTCCCTTCC-3'
Taq-man Sonde: 5'-FAM-ATGGATGAAGAAAGAAAGGATGAGT-BHQ-1-3'

Real-Time-PCR Ansatz:

Forward Primer (50 pmol/µl)	0,1 µl
Reverse Primer (50 pmol/µl)	0,1 µl
Taq-man Sonde (25 pmol/µl)	0,1 µl
InnuMIX qPCR MasterMix Probe (Analytik Jena)	7,5 µl
Bisulfit- modifizierte bzw. genomische DNA	1,5 µl
PCR- Grade H₂O	5,7 µl

Methode	Ct-Werte (Mittelwert)
Manuelle Durchführung	23,71(rote Kurve)
Säule-basierten Extraktion Kit von der Firma Statec	24,66 (grüne Kurve)
genomische DNA	22,08 (graue Kurve)

Die 8 zeigt eine Real-Time-PCR vom CFF-1 Assay. (magenta Kurven : No Template Control; graue Kurven: genomische DNA; rote und grüne Kurven Proben-DNA nach Bisulfitmodifizierungsreaktion).
Als weitere Analyse wurde ein CFP 415 bp- Assay (Cytosine-free primer binding site) mit Bisulfit-modifizierter DNA durchgeführt. Da mit diesem Assay lange DNA-Sequenz amplifiziert wird, liefert dieses Assay Information über die abgebaute DNA während der Bisulfit-Modifizierung und während der Aufreinigung von Bisulfit-modifizierter DNA. Die Sequenzen von den Primern sind wie folgt:

Real-Time-PCR Ansatz:

Amplifikationskonditionen:
- Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
- Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen (95°C/4"; 58 °C /40")

Methode	Ct-Werte (Mittelwert)
Manuelle Durchführung	25,52(rote Kurve)
Säule-basierten Extraktion Kit von der Firma Statec	27,93 (grüne Kurve)

Die 9 zeigt eine Real-Time-PCR des CFP 415 bp- Assay. (magenta Kurven: No Template Control, rote und grüne Kurven: Proben DNA nach Bisulfitmodifizierungsreaktion).
Die Ergebnisse zeigen weniger abgebaute DNA nach der Bisulfit-Modifizierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zum kommerziellen Produkt.

Claims

Verfahren zur Umwandlung einer Cytosinbase in einer Nukleinsäure durch Bisulfitbehandlung in eine Uracilbase, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure nach der Bisulfitbehandlung und einer Inkubation an eine nicht-mineralische feste Phase gebunden ist, die eine raue Oberfläche aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die raue Oberfläche aus Metall, Kunststoff oder Gummi, vorzugsweise aus Kunststoffgranulat besteht.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Kunststoffgranulat mit rauer Oberfläche paramagnetisch ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die raue Oberfläche durch 3-D-Druck erzeugt wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sich die feste Phase mit rauer Oberfläche innerhalb einer Pipettenspitze befindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase mit rauer Oberfläche den unteren Teil eines Kunststoff-Kamms darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Mischen der Nukleinsäure mit einer Bisulfit-Lösung und nachfolgende Inkubation des Reaktionsansatzes b) Zugabe eines Bindungspuffers und Anbindung an die feste Phase mit rauer Oberfläche c) Inkubation und Entfernung des Überstands von der festen Phase d) Waschen mittels eines Waschpuffers und anschließendes Entfernen des Waschpuffers e) Zugabe eines Desulfonierungspuffers und Inkubation, anschließende Entfernung des Überstands von der festen Phase f) Waschen, Trocknen und Ablösen der modifizierten Nukleinsäure von der festen Phase.
Automatisiertes Verfahren nach dem „walk-away-Prinzip“ nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte 7a) bis 7f) innerhalb einer Pipettenspitze oder an dem unteren Teil eines Kunststoff-Kamms durchgeführt werden.
Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend: • eine feste Phase mit rauer Oberfläche • eine Bisulfit-Lösung • einen Bindungspuffer • einen Desulfonierungspuffer • mindestens einen Waschpuffer • einen Ablösepuffer • ein Gefäß zur Durchführung
Verwendung einer nicht-mineralischen festen Phase mit rauer Oberfläche zur Umwandlung einer Cytosinbase in einer Nukleinsäure durch Bisulfitbehandlung in eine Uracilbase.