DE60316660T2

DE60316660T2 - Verwendung eines silikamaterials bei der amplifikation

Info

Publication number: DE60316660T2
Application number: DE60316660T
Authority: DE
Inventors: Judith Pinsl-Ober; Peter Wenzig; Kurt Weindel; Knut Pleasanton BARTL; Ralf Moraga SCHOENBRUNNER; Khushbeer Concord MALHOTRA; Patrick Alameda O'DONNELL; Erich Antioch KYGER
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2002-01-08
Filing date: 2003-01-04
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2023-01-05
Also published as: WO2003057910A3; AU2003235767A1; WO2003057910A2; EP1466018B1; DE60316660T3; ATE374837T1; US8026068B2; ES2294287T5; US20040014070A1; JP4148900B2; DK1466018T3; JP2005514036A; EP1466018B2; DE60316660D1; ES2294287T3; EP1466018A2

Description

Technischer Hintergrund der Erfindung
Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren unter Verwendung eines Materials mit einer nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche, wie beispielsweise magnetischer Glaspartikel, und anschließende Amplifikation einer Zielnukleinsäure in Gegenwart des Materials mit einer nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche. Das Verfahren wird vorzugsweise in Form eines automatisierten Prozesses, vorzugsweise in einem Format mit hohem Durchsatz, durchgeführt. Das Verfahren wird vorzugsweise in der Diagnostik eingesetzt.
Stand der Technik
Viele biologische Substanzen, vor allem Nukleinsäuren, stellen besondere Herausforderungen hinsichtlich ihrer Isolierung aus ihrer natürlichen Umgebung dar. Einerseits liegen sie häufig in sehr geringen Konzentrationen vor und finden sich andererseits oft in Gegenwart vieler anderer fester und gelöster Substanzen, z. B. nach der Lyse von Zellen. Dadurch sind sie schwer zu isolieren oder zu messen, insbesondere in biospezifischen Testverfahren, die den Nachweis spezifischer Analyte, z. B. Nukleinsäuren, oder spezifischer Analyteigenschaften gestatten und eine wichtige Rolle auf dem Gebiet der Diagnostik und Bioanalytik in Forschung und Entwicklung spielen.
Bevor man eine biologische Substanz oder Verbindung, beispielsweise eine Nukleinsäure, in einem biospezifischen Testverfahren analysieren oder für andere Prozesse verwenden kann, muß sie häufig aus biologischen Proben, die komplexe Gemische unterschiedlicher Komponenten, wie z. B. proteinhaltiger und nichtproteinhaltiger Komponenten, enthalten, isoliert oder aufgereinigt werden. Häufig liegt die biologische Substanz in einer Bakterienzelle, einer Pilzzelle, einem Viruspartikel oder der Zelle eines komplexeren Organismus, wie beispielsweise einer menschlichen Blutzelle oder einer Pflanzenzelle, vor. Die zu analysierende biologische Substanz wird auch häufig interessierende Substanz bzw. Zielsubstanz genannt. Häufig handelt es sich bei der Zielsubstanz um eine Nukleinsäure, die daher als Zielnukleinsäure bezeichnet wird.
Zur Freisetzung des Inhalts der Zellen bzw. Partikel können diese mit Enzymen oder mit Chemikalien behandelt werden, um die Zellwände und/oder Zellmembranen aufzulösen, abzubauen oder zu denaturieren. Dieser Vorgang wird allgemein als Lyse bezeichnet. Die entstandene, ein solches lysiertes Material enthaltende Lösung wird als Lysat bezeichnet. Ein häufig während der Lyse angetroffenes Problem besteht darin, daß die interessierende Substanz abbauende Enzyme, beispielsweise Nukleinsäuren abbauende Desoxyribonukleasen oder Ribonukleasen, mit der interessierenden Substanz während der Lyse in Kontakt kommen. Diese abbauenden Enzyme können außerhalb der Zellen vorliegen oder vor der Lyse in unterschiedlichen Zellkompartimenten räumlich getrennt worden sein. Zu weiteren während dieses Vorgangs freigesetzten Komponenten könnte man beispielsweise Endotoxine zählen, die zur Familie der Lipopolysaccharide gehören, die für Zellen toxisch sind und Probleme für in der Human- oder Tiertherapie zu verwendende Produkte verursachen können. Es gibt verschiedene Mittel, um dieses obenerwähnte Problem anzugehen. Allgemein üblich ist die Verwendung chaotroper Agentien, wie beispielsweise Guanidiniumsalze oder anionischer, kationischer, zwitterionischer oder nichtionischer Detergentien, wenn Nukleinsäuren freigesetzt werden sollen. Vorteilhaft ist ebenso die Verwendung von Proteasen, z. B. Proteinase K, die diese Enzyme oder unerwünschten Proteine schnell abbauen. Allerdings kann dies zu einem weiteren Problem führen, da die genannten Substanzen oder Enzyme zu einer Störung von Reagentien oder Komponenten in nachfolgenden Schritten führen können.
Handelt es sich bei den interessierenden Substanzen um Nukleinsäuren, so werden diese normalerweise vor ihrer Verwendung in einem Testverfahren aus den komplexen Lysegemischen extrahiert und somit von diesen getrennt. Es gibt mehrere Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren in Form von sequenzabhängigen bzw. biospezifischen Verfahren (Affinitätschromatographie, Hybridisierung an immobilisierte Sonden) oder sequenzunabhängigen bzw. physiko-chemischen Verfahren (Flüssig-flüssig-Extraktion, z. B. mit Phenol-Chloroform, Präzipitation, z. B. mit reinem Ethanol, Extraktion mit Filterpapier, Extraktion mit micellenbildenden Agentien, wie Cetyltrimethylammoniumbromid, Bindung an immobilisierte, interkalierende Farbstoffe, z. B. Acridinderivate, Adsorption an Kieselgel oder Diatomeenerden, Adsorption an magnetische Glaspartikel (MGPs) oder Organosilanpartikel unter chaotropen Bedingungen. Die Extraktion unter Verwendung von Festphasen umfaßt üblicherweise die Schritte der Zugabe des Lysats an die Festphase unter Bedingungen, die die Bindung der interessierenden Substanz an die Festphase gestatten, der Abtrennung des restlichen Lysats von der an die Festphase gebundenen Substanz und der anschließenden Freisetzung der interessierenden Substanz von der Festphase in ein flüssiges Eluat (manchmal als Elution bezeichnet). Als Ergebnis des Extraktionsvorgangs erhält man üblicherweise eine die interessierende Substanz im gelösten Zustand enthaltende Lösung. Für Extraktionszwecke besonders interessant ist die Adsorption von Nukleinsäuren an eine Glasoberfläche, insbesondere die Glasoberflächen von MGPs. In den letzten Jahren wurden viele Verfahrensweisen zur Isolierung von Nukleinsäuren aus ihrer natürlichen Umgebung unter Nutzung ihres Bindungsverhaltens an Glasoberflächen vorgeschlagen.
Nach dem Extraktionsschritt wird die die interessierende Substanz enthaltende Lösung, z. B. die Nukleinsäure, in einem biospezifischen Testverfahren analysiert, um zu zeigen, ob die interessierende Substanz in der ursprünglichen Probe vorhanden war. Biospezifische Testverfahren sind beispielsweise Hybridisierungstestverfahren für Nukleinsäuren, Immuntestverfahren oder Rezeptorliganden-Testverfahren für Proteine. Bei Hybridisierungstestverfahren wird die spezifische Basenpaarung für den molekularen Nachweis von Nukleinsäureanalyten, beispielsweise RNA oder DNA, verwendet. Somit können beispielsweise Oligonukleotidsonden mit einer Sequenzlänge von etwa 18 bis etwa 20 Nukleotiden die spezifische Erkennung einer ausgewählten komplementären Sequenz, zum Beispiel im menschlichen Genom, ermöglichen. Ein weiteres Testverfahren, das die selektive Bindung von zwei Oligonukleotidprimern beinhaltet, ist die Polymerasekettenreaktion (PCR), beschrieben in US-Patent Nr. 4,683,195 . Dieses Verfahren gestattet die selektive Amplifikation eines spezifischen Nukleinsäurebereichs auf nachweisbaren Niveaus mit einer temperaturstabilen Polymerase in Gegenwart von Desoxynukleosidtriphosphaten in mehreren Zyklen. Anschließend wird die Nukleinsäure mit dem Fachmann bekannten Mitteln nachgewiesen. Weitere Verfahren, wie etwa das aus der WO 92/02638 bekannte TaqMan^®-Testverfahren, gestatten das gleichzeitige Amplifizieren und Nachweisen einer interessierenden Nukleinsäure.
Normalerweise werden die Lyse-, Extraktions- und Amplifikationsschritte nacheinander ausgeführt, während verschiedene unterschiedliche Arbeitsschritte durchgeführt werden müssen, beispielsweise die Abtrennung von nur Protein enthaltenden Phasen, die Elution der Nukleinsäuren von dem für die Extraktion verwendeten Träger sowie die Abtrennung des Trägers, die Überführung von Flüssigkeiten in frische Röhrchen usw. Zur Verbesserung der Effizienz und/oder Empfindlichkeit beispielsweise von Nukleinsäurenachweisverfahren werden neue Verfahren zur Präparation von Nukleinsäureproben benötigt.
Aus der EP 0389063 ist ein Prozeß zur Isolierung von Nukleinsäure bekannt, bei dem man ein komplexes biologisches Ausgangsmaterial, eine chaotrope Substanz sowie eine Siliciumdioxid enthaltende, Nukleinsäure bindende Festphase mischt, die Festphase mit ihrer daran gebundenen Nukleinsäure abtrennt, die an die Festphase gebundene Nukleinsäure wäscht und die Nukleinsäure von der Festphase eluiert.
Mit der WO 96/18731 wird ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäure aus einer Probe bereitgestellt, bei dem man die Probe mit einem Detergens und einem festen Träger in Kontakt bringt.
Aus der WO 99/39010 ist ein DNA-Elutionsreagens bekannt, das einen Puffer, eine Base, einen Chelatbildner sowie Wasser umfaßt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Durch die vorliegende Erfindung werden Verfahren zur Durchführung einer Probenpräparation mit anschließender Nukleinsäureamplifikation bereitgestellt, die zu Verbesserungen hinsichtlich Reaktionseffizienz und Nachweisempfindlichkeit führen und dabei gleichzeitig die benötigten Manipulierungsschritte reduzieren. In den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die Probenpräparation unter Verwendung einer nichtmodifizierten Glasoberfläche magnetischer Glaspartikel durchgeführt, um in der Probe enthaltene Nukleinsäure einzufangen, wobei der entstandene Glas-Nukleinsäure-Komplex direkt mit den Reagentien der Amplifikationsreaktion kombiniert und Amplifikationsbedingungen ausgesetzt wird. Ein kritischer Aspekt der Erfindung besteht darin, daß die Amplifikation in Gegenwart der magnetischen Glaspartikel durchgeführt wird.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung bieten mehrere Vorteile gegenüber bereits beschriebenen Verfahren, bei denen magnetische Glaspartikel verwendet werden. Ein Vorteil besteht darin, daß die Verfahren weniger Manipulierungsschritte benötigen, was zu einer Verkürzung der benötigten Zeit sowie einer Verringerung des benötigten Aufwands führt und eine verbesserte Automatisierung gestattet. Die größte Überraschung liegt darin, daß die vorliegenden Verfahren im Vergleich mit Verfahren, bei denen die gereinigte Nukleinsäure vor der Amplifikation vom Glas eluiert und die Amplifikation nicht in Gegenwart des Glases durchgeführt wird, eine verbesserte Reaktionsempfindlichkeit liefern.
Daher sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung und Amplifikation einer Zielnukleinsäure aus einer die Zielnukleinsäure umfassenden biologischen Probe vor, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Zugabe eines magnetische Glaspartikel mit einer nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche umfassenden Materials zu der Probe, um die Zielnukleinsäure an das Material zu binden, Trennen des Materials von der Probe, Eluieren der Zielnukleinsäure aus dem Material und Amplifizieren der Zielnukleinsäure in Gegenwart des Materials, wobei die magnetischen Glaspartikel nach dem Sol-Gel-Verfahren angefertigt werden. Weiterhin sieht das Verfahren ein Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure in einer Probe vor, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Zugabe eines magnetische Glaspartikel mit einer nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche umfassenden Materials zu der Probe, Trennen des Materials von der Probe, Eluieren der Zielnukleinsäure aus dem Material und Amplifizieren der Zielnukleinsäure in Gegenwart des Materials, wobei die magnetischen Glaspartikel nach dem Sol-Gel-Verfahren angefertigt werden.
Bei der Zielnukleinsäure kann es sich um Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder eine Ribonukleinsäure (RNA) handeln, die vorzugsweise beispielsweise mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert wird. Die magnetischen Glaspartikel werden mit dem Sol-Gel-Verfahren hergestellt, wobei am stärksten bevorzugt ein Sprühtrocknungsschritt mit einem unter spezifischen Bedingungen betriebenen Sprühtrockner mit zwei Düsen verwendet wird. Das Verfahren ist vorzugsweise automatisiert bzw. wird in einem Format mit hohem Durchsatz durchgeführt. Am stärksten bevorzugt wird das Verfahren in der Diagnostik oder zum Screening von Blut auf das Vorhandensein einer Zielnukleinsäure aus einem Virus verwendet.
Beschreibung der Figuren
1: Vergleich der C_T-Werte von PCR-Reaktionen mit und ohne magnetische Glaspartikel, die das von der Firma CERAC hergestellte Pigment enthalten und gemäß EP 1154443 angefertigt wurden (cp/ml:Kopien/ml).
2: Vergleich der C_T-Werte von PCR-Reaktionen mit und ohne magnetische Glaspartikel, die das MMB-Pigment (Merck) enthalten (cp/ml:Kopien/ml).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Unter dem Begriff "nichtmodifiziert" ist zu verstehen, daß keine weitere chemische Modifikation vorliegt, d. h. keine weiteren chemischen Gruppen kovalent oder nichtkovalent gebunden sind. Unter dem Begriff "nichtmodifizierte Siliciumdioxidoberfläche" ist zu verstehen, daß keine weiteren chemischen Gruppen kovalent oder nichtkovalent gebunden sind, die als vermittelnde Substanz für die Nukleinsäurebindung dienen und wobei die Nukleinsäuren an die vermittelnde Substanz und nicht an die Siliciumdioxidoberfläche selbst binden. Daher sind die Nukleinsäuren in der Lage, über Wasserstoffbrückenbindung und andere atomare Kräfte direkt an die "nichtmodifizierte Siliciumdioxidoberfläche" in Gegenwart von beispielsweise hohen Salzkonzentrationen zu binden. Ein Beispiel für eine modifizierte Oberfläche sind Siliciumdioxidoberflächen, an die Oligonukleotide gebunden sind, die Nukleinsäuremoleküle in sequenzspezifischer Weise binden. Ein weiteres Beispiel für modifizierte Siliciumdioxidoberflächen sind mit Streptavidin, das an biotinylierte DNA-Moleküle bindet, beschichtete Siliciumdioxidoberflächen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung soll eine "Zielnukleinsäure" die interessierende Nukleinsäure oder allgemeiner die interessierende Substanz bedeuten, d. h. eine Nukleinsäure, die untersucht werden soll, da ihre Gegenwart auf ein bestimmtes Leiden oder eine bestimmte Krankheit eines Menschen oder Tiers hinweist. So deutet beispielsweise das Vorhandensein einer Nukleinsäure aus einem Virus (z. B. aus Hepatitis-B-Virus, Hepatitis-C-Virus oder menschlichem Immunschwächevirus) darauf hin, daß das entsprechende Individuum mit dem entsprechenden Virus infiziert ist. Infolgedessen wäre diese Nukleinsäure aus diesem spezifischen Virus die Zielnukleinsäure. Weitere Zielnukleinsäuren sind beispielsweise Nukleinsäuren, die eine Veranlagung eines Individuums für eine bestimmte Krankheit, beispielsweise eine Erbkrankheit, wie etwa Sichelzellenanämie, oder für bestimmte Krebsarten anzeigen.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Aufreinigung und Amplifikation einer Zielnukleinsäure aus einer die Zielnukleinsäure umfassenden biologischen Probe vor, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Zugabe eines magnetische Glaspartikel mit einer nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche umfassenden Materials zu der Probe, um die Zielnukleinsäure an das Material zu binden, Trennen des Materials von der Probe, Eluieren der Zielnukleinsäure aus dem Material und Amplifizieren der Zielnukleinsäure in Gegenwart des Materials, wobei die magnetischen Glaspartikel nach dem Sol-Gel-Verfahren angefertigt werden. Vorzugsweise ist in der Probe während der Amplifikation der Zielnukleinsäure mehr als 50%, stärker bevorzugt mehr als 80% oder sogar 100% des magnetische Glaspartikel mit einer nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche umfassenden Materials, das zur Bindung der Zielnukleinsäure daran verwendet wird, vorhanden. Ebenso ist dem Fachmann ersichtlich, daß aufgrund der oben beschriebenen Vorteile das magnetische Glaspartikel mit einer nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche umfassende Material zur Verbesserung der Empfindlichkeit direkt zu einem Amplifikationsansatz gegeben werden kann. Daher sieht die Erfindung auch ein Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure in einer Probe vor, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Zugabe eines magnetische Glaspartikel mit einer nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche umfassenden Materials zu der Probe, Trennen des Materials von der Probe, Eluieren der Zielnukleinsäure aus dem Material und Amplifizieren der Zielnukleinsäure in Gegenwart des Materials, wobei die magnetischen Glaspartikel nach dem Sol-Gel-Verfahren angefertigt werden. Die Bedingungen während der Amplifikation werden bei beiden erfindungsgemäßen Verfahren so gewählt, daß keine Zielnukleinsäure an das magnetische Glaspartikel mit einer nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche umfassende Material gebunden wird. Allerdings kann aufgrund unspezifischer Bindung, die nicht vollkommen ausgeschlossen werden kann, ein geringer Prozentsatz der Zielnukleinsäure gebunden werden. Als weiteren Schritt können beide Verfahren den Nachweis der amplifizierten Zielnukleinsäure umfassen. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich bei der Zielnukleinsäure um RNA oder DNA. Vorzugsweise werden Amplifikationsbedingungen so gewählt, daß die Primer und/oder die Matrize das Material nicht binden.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die biologische Probe Viren oder Bakterienzellen ebenso wie isolierte Zellen aus mehrzelligen Organismen, wie beispielsweise menschliche und tierische Zellen, wie z. B. Leukocyten, sowie immunologisch aktive niedrig- und hochmolekulare chemische Verbindungen, wie z. B. Haptene, Antigene, Antikörper und Nukleinsäuren, Blutplasma, Liquor, Sputum, Stuhl, Biopsieproben, Knochenmark, Mundspülungen, Blutserum, Gewebe, Urin oder Gemische davon. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich bei der biologischen Probe um eine Flüssigkeit aus dem menschlichen oder tierischen Körper. Vorzugsweise handelt es sich bei der biologischen Probe um Blut, Blutplasma, Blutserum oder Urin. Bei dem Blutplasma handelt es sich vorzugsweise um mit EDTA, Heparin oder Citrat behandeltes Blutplasma. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die biologische Probe Bakterienzellen, eukaryontische Zellen, Viren oder Gemische davon. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich bei dem Virus um das Hepatitis-A-Virus (HAV), Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV), das menschliche Immunschwächevirus (HIV), das menschliche Papillomavirus (HPV) oder Parvovirus B19. Die biologische Probe kann auch in einer Art vorliegen, die für die Umweltanalyse, Lebensmittelanalyse oder molekularbiologische Forschung verwendet wird; beispielsweise kann sie aus Bakterienkulturen oder Phagenlysaten stammen. Die ein eine Nichtziel- und eine Zielnukleinsäure umfassendes Gemisch biologischer Verbindungen umfassende biologische Probe braucht nicht lysiert zu werden, wenn sich die biologische Probe ohne Vorbehandlung im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzten läßt. Allerdings wird eine Nichtzielnukleinsäuren und eine Zielnukleinsäure umfassende biologische Probe vorzugsweise lysiert, so daß ein eine Nichtziel- und ein Zielnukleinsäure umfassendes Gemisch biologischer Verbindungen erzeugt wird. Daher werden die in der biologischen Probe enthaltenen biologischen Verbindungen, Nichtzielnukleinsäuren und die Zielnukleinsäure freigesetzt, wodurch ein Nichtzielnukleinsäuren und die Zielnukleinsäure umfassendes Gemisch biologischer Verbindungen erzeugt wird. Verfahrensweisen zur Lyse biologischer Proben sind dem Fachmann bekannt und können chemischer, enzymatischer oder physikalischer Natur sein. Ebenso ist eine Kombination aus diesen Verfahrensweisen anwendbar. So läßt sich beispielsweise die Lyse mittels Ultraschall, hohem Druck, Scherkräften, Alkali, Detergentien oder chaotropen Salzlösungen oder Proteasen oder Lipasen durchführen. Für das Lyseverfahren zur Gewinnung von Nukleinsäuren wird insbesondere auf Sambrook et al: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Addition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Habour, NY und Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY verwiesen.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt als Schritt die Zugabe eines magnetische Glaspartikel mit einer nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche umfassenden Materials zu der Probe, um die Zielnukleinsäure an das Material zu binden. Die Bedingungen hierfür sind dem Fachmann im Grunde genommen bekannt. Diese Prozesse sind ausführlich in verschiedenen Dokumenten beschrieben. So wird beispielsweise in Proc. Natl. Acad. USA 76, 615–691 (1979) eine Verfahrensweise zur Bindung von Nukleinsäuren aus Agarosegelen in Gegenwart von Natriumiodid als zermahlenes Quarzglas vorgeschlagen. Die Aufreinigung von Plasmid-DNA aus Bakterien auf Glasstaub in Gegenwart von Natriumperchlorat ist in Anal. Biochem. 121 (1982) 382–387 beschrieben. In der DE-A 37 34 442 ist die Isolierung von Einzelstrang-M13-Phagen-DNA auf Glasfaserfiltern mittels Präzipitation der Phagenpartikel unter Verwendung von Essigsäure und Lyse der Phagenpartikel mit Perchlorat beschrieben. Die an die Glasfaserfilter gebundenen Nukleinsäuren werden gewaschen und anschließend mit einem methanolhaltigen Tris/EDTA-Puffer eluiert. Eine ähnliche Verfahrensweise zur Aufreinigung von DNA aus Lambda-Phagen ist in Anal. Biochem. 175 (1988) 196–201 beschrieben. Bei der Verfahrensweise erfolgt die selektive Bindung von Nukleinsäuren an Glasoberflächen in chaotropen Salzlösungen sowie die Trennung der Nukleinsäuren von Verunreinigungen, wie beispielsweise Agarose, Proteinen oder Zellrückstand. Zur Trennung der Glaspartikel von den Verunreinigungen können die Partikel entweder zentrifugiert werden oder es werden Flüssigkeiten durch Glasfaserfilter gezogen. Hierbei handelt es sich allerdings um einen limitierenden Schritt, der verhindert, daß das Verfahren zur Bearbeitung großer Probenmengen verwendet wird. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden magnetische Glaspartikel zur Immobilisierung von Nukleinsäuren nach Präzipitation durch Zugabe von Salz und Ethanol verwendet, wie beispielsweise in Anal. Biochem. 201 (1992) 166–169 und PCT GB 91/00212 beschrieben.
Die Verfahrensweise zur Bindung der Zielnukleinsäure (und ebenso der Nichtzielnukleinsäuren) an Glaspartikel läßt sich ausführlich wie folgt beschreiben. Sie wird sie vorzugsweise in Gegenwart chaotroper Salze mit einer Konzentration zwischen 1 und 8 mol/l und vorzugsweise zwischen 2 und 6 mol/l durchgeführt. Bei chaotropen Salzen kann es sich um Natriumiodid, Natriumperchlorat, Guanidiniumthiocyanat, Guanidiniumisothiocyanat oder Guanidiniumhydrochlorid handeln. Ein chaotropes Agens gemäß der vorliegenden Erfindung ist jede chemische Substanz, die die geordnete Struktur von flüssigem Wasser stört und den Effekt aufweist, daß DNA oder RNA an die magnetischen Glaspartikel bindet, falls dieses Agens in der DNA- oder RNA-haltigen Lösung vorhanden ist. Ebenso können dem Fachmann bekannte weitere biologische Substanzen vorhanden sein. Zusätzlich sind noch weitere Substanzen möglich. Der Aufreinigungseffekt rührt vom Verhalten von DNA oder RNA her, unter diesen Bedingungen, d. h. in Gegenwart bestimmter Konzentrationen eines chaotropen Agens, höheren Konzentrationen an organischen Lösungsmitteln oder unter sauren Bedingungen, an Material mit einer Glasoberfläche zu binden. Zum Bringen des Nichtzielnukleinsäuren und die Zielnukleinsäure umfassenden Gemischs biologischer Verbindungen werden die Glaskügelchen mit einer nichtmodifizierten Glasoberfläche zu dem Gemisch gegeben und über einen Zeitraum inkubiert, der ausreicht, um die Bindung stattfinden zu lassen. Dem Fachmann ist die Dauer des Inkubationsschritts üblicherweise geläufig. Dieser Schritt läßt sich optimieren, indem man die Menge an immobilisierten Nukleinsäuren auf der Oberfläche zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestimmt. Dabei können Inkubationszeiten zwischen 10 Sekunden und 30 Minuten für Nukleinsäuren geeignet sein. Nach der Inkubation werden die Nichtzielnukleinsäuren und die Zielnukleinsäure von der Flüssigkeit getrennt. Dies kann allgemein über die Schwerkraft oder, falls die Nukleinsäuren zweckmäßigerweise an magnetische Glaspartikel gebunden sind, durch Trennen des an die magnetischen Partikel gebundenen Materials mittels Anlegen eines Magnetfeldes erreicht werden. So lassen sich die magnetischen Partikel beispielsweise zur Wand des Gefäßes, in dem die Inkubation durchgeführt wurde, ziehen. Die Flüssigkeit mit den biologischen Proben, die nicht an die magnetischen Partikel gebunden waren, läßt sich dann abtrennen. Daher enthält das erfindungsgemäße Verfahren als Schritt die Trennung des Materials mit den gebundenen Nichtzielnukleinsäuren und der gebundenen Zielnukleinsäure von den nichtgebundenen biologischen Verbindungen. Das verwendete Abtrennverfahren hängt von der Art des Gefäßes, in dem die Inkubation durchgeführt wurde, ab. Zu geeigneten Schritten gehören das Abtrennen der Flüssigkeiten über Pipettieren oder Absaugen. Das Material mit der gebundenen DNA oder RNA kann dann wenigstens einmal, vorzugsweise mit einem Gemisch aus 70 Volumenteilen Ethanol mit 30 Volumenteilen Wasser (''70% Ethanol) oder in einer sauren Waschlösung wie in der WO 99/40098 beschrieben, gewaschen werden. Dabei wird eine Waschlösung verwendet, die nicht dazu führt, daß die Nukleinsäuren und die Zielnukleinsäure von der Materialoberfläche freigesetzt werden, sondern die die unerwünschten Verunreinigungen so gründlich wie möglich wegwäscht. Dieser Waschschritt erfolgt vorzugsweise dadurch, daß die Glaskügelchen mit der nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche mit den gebundenen Nukleinsäuren und der Zielnukleinsäure inkubiert werden. Das Material wird vorzugsweise während dieses Schritts resuspendiert. Die verunreinigte Waschlösung wird vorzugsweise genau wie in dem oben beschriebenen Bindungsschritt abgetrennt. Nach dem letzten Waschschritt läßt man das Material kurz im Vakuum trocknen oder die Flüssigkeit verdampfen. Ebenso kann ein Vorbehandlungsschritt mit Aceton durchgeführt werden.
Die Erfindung umfaßt weiterhin den Schritt der Elution der gebundenen Nichtzielnukleinsäuren und der gebundenen Zielnukleinsäure von dem Material und die anschließende Amplifikation der Zielnukleinsäure. Damit die Elution stattfinden kann, wird das magnetische Glaspartikel mit der nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche umfassende Material in einer Lösung resuspendiert, die kein chaotropes Agens und/oder organisches Lösungsmittel oder nur eine geringe Menge davon enthält. Als Alternative läßt sich die Suspension mit einer Lösung verdünnen, die kein chaotropes und/oder organisches Lösungsmittel oder nur eine geringe Menge davon enthält. Puffer dieser Art sind aus der DE 3724442 sowie Analytical Biochemistry 175 (1988) 196–201 bekannt. Bei den Elutionspuffern mit einem geringen Salzgehalt handelt es sich insbesondere um Puffer mit einem Gehalt von weniger als 0,2 mol/l.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält der Elutionspuffer die Substanz Tris zu Pufferzwecken, insbesondere eine Tris-gepufferte Lösung mit einem pH-Wert um 7 oder oberhalb von 7. In einer weiteren speziellen Ausführungsform handelt es sich bei dem Elutionspuffer um entmineralisiertes Wasser. Die aufgereinigte Zielnukleinsäure enthaltende Lösung steht nun zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion bereit, d. h. die Lösung mit den Nichtzielnukleinsäuren und der Zielnukleinsäure sowie das magnetische Glaspartikel mit der nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche umfassende Material werden in ein neues Reaktionsröhrchen, das alle für die Amplifikation notwendigen Reagentien enthält, überführt. Ansonsten wird eine alle für die Amplifikation notwendigen Reagentien enthaltende Lösung zu der Suspension des magnetische Glaspartikel mit der nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche umfassenden Materials und der freigesetzten Nichtzielnukleinsäuren und den Zielnukleinsäure gegeben.
In weiteren Ausführungsformen lassen sich das magnetische Glaspartikel mit der nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche umfassende Material und die gebundenen Zielnukleinsäuren unter Bedingungen bringen, bei denen die Zielnukleinsäuren amplifiziert werden können, wie unten beschrieben. In derartigen Ausführungsformen können die Amplifikationsbedingungen so gewählt werden, daß die Zielnukleinsäure aus dem Material mit der nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche zur Erleichterung der Amplifikation freigesetzt werden kann. Vorzugsweise werden Amplifikationsbedingungen so gewählt, daß Primer nicht an das Material mit der nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche binden.
Allgemein gesagt werden für die Wasch- und Bindungschritte vorzugsweise Flüssigkeiten verwendet, die für molekularbiologische Prozesse, insbesondere Aufreinigungsprozesse für Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA), bei denen die Bindung dieser Substanzen an Glaspartikel unter bestimmten Bedingungen genutzt wird, geeignet sind. Zu bevorzugten Flüssigkeiten gehören Alkohole und/oder Ketone oder beliebige Gemische davon mit Wasser. Erfindungsgemäß sind zu Alkoholen vorzugsweise primäre, sekundäre oder tertiäre Alkohole der allgemeinen Formel R-OH zu zählen, wobei das R für die allgemeine Formel -(-CH₂)n-CH₃ mit n > = 0. Andere Alkohole können jedoch auch verwendet werden, falls sie sich für molekularbiologische Zwecke eignen, wie beispielsweise Glycerin. Besonders geeignet sind die Alkohole Isopropanol, Ethanol oder Gemische davon mit Wasser, vorzugsweise ein Gemisch aus 80 Volumenteilen Isopropanol mit 20 Volumenteilen Wasser. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die Flüssigkeit Ketone, wie beispielsweise Aceton. Ferner werden geeignete wäßrige gepufferte Lösungen verwendet. Puffersysteme, die sich für molekularbiologische Zwecke eignen, finden sich beispielsweise bei Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University Press (1989). Bevorzugte Puffersubstanzen sind Trishydroxymethylamin (TRIS), Phosphat, N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure) (HEPES), Salze davon oder andere geeignete Substanzen. Darüber hinaus können Substanzen vorhanden sein, die die Ionenstärke der Lösung modifizieren, wie z. B. NaCl, KCl oder CaCl₂, oder bei denen es sich um Metallkationenkomplexierer handelt, wie beispielsweise Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder deren Salze.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eignet sich für die Aufreinigung von Nukleinsäuren, d. h. RNA oder DNA, aus diese enthaltenden komplexen Gemischen mit anderen biologischen Verbindungen. Damit können auch Gemische unterschiedlicher Nukleinsäuren und selbst eine Zielnukleinsäure mit geringer Häufigkeit enthaltende Gemische aufgereinigt werden. In einer erfindungsgemäße Ausführungsform werden Gemische spezifischer Nukleinsäuren aufgereinigt, bei denen es sich bei der (den) Zielnukleinsäure(n) um einen Nebenbestandteil hinsichtlich der Konzentration handeln kann (bzw. die Zielnukleinsäure(n) mit geringer Häufigkeit vorliegt (vorliegen)).
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Zielnukleinsäure mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert. Bei dem Amplifikationsverfahren kann es sich auch um die Ligasekettenreaktion (LCR, Wu und Wallace, Genomics 4 (1989) 560–569 und Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189–193); die Polymerase-Ligase-Kettenreaktion (Barany, PCR Methods und Applic. 1 (1991) 5–16); Gap-LCR (PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 90/01069 ), die Reparaturkettenreaktion (europäische Patentanmeldung Nr. EP 439,182 A2 ), 3SR (Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173–1177; Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874–1878; PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 92/0880A ), und NASBA ( U.S.-Patent Nr. 5,130,238 ) handeln. Ferner gibt es die Strangverdrängungsamplifikation (Strand Displacement Amplifikation, SDR), die transkriptionsvermittelte Amplifikation (transcription mediated amplification, TMA) und die Qβ-Amplifikation (hinsichtlich einer Übersicht, siehe z. B. Whelen and Persing, Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349–373; Abramson und Myers, Current Opinion in Biotechnology 4 (1993) 41–47.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Verfahren ferner als Schritt den Nachweis der amplifizierten Zielnukleinsäure umfassen. Die amplifizierte Zielnukleinsäure kann dabei mit dem Fachmann bekannten und z. B. bei Sambrook et al., Molekular Cloning, Cold Spring Harbor University Press (1989), Lottspeich und Zorbas (Hrsg.), "Bioanalytik" (1. Auflage 1998), Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Deutschland, oder in Ausubel, et al., Current Protocols in Molekular Biology (1987), J. Wiley and Sons, NY, USA beschriebenen Standardanalyseverfahren bestimmt oder nachgewiesen werden. Ferner können vor dem Nachweis der Zielnukleinsäure auch weitere Reinigungsschritte, z. B. ein Fällungsschritt erfolgen. Zu den Nachweisverfahren können, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die Bindung oder Interkalation spezifischer Farbstoffe, wie etwa Ethidiumbromid, das in die doppelsträngige DNA interkaliert und danach seine Fluoreszenz ändert, gezählt werden. Die aufgereinigten Nukleinsäuren können auch gegebenenfalls nach einer Restriktionsverdauung mit elektrophoretischen Verfahren getrennt und anschließend sichtbar gemacht werden. Ebenso gibt es auf Sonden beruhende Testverfahren, bei denen die Oligonukleotidhybridisierung an spezifische Sequenzen ausgenutzt und das Hybrid anschließend nachgewiesen wird. Ebenso besteht die Möglichkeit, die Zielnukleinsäure nach weiteren, dem Fachmann bekannten Schritten zu sequenzieren. Bei anderen Verfahren werden verschiedene Nukleinsäuresequenzen auf einen Siliciumchip aufgetragen, an den spezifische Sonden gebunden sind und bei der Bindung komplementärer Sequenzen ein Signal ergeben.
In einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Zielnukleinsäure durch Messen der Intensität von Fluoreszenzlicht während der Amplifikation nachgewiesen.
Dieses Verfahren beinhaltet die Beobachtung der Fluoreszenz in Echtzeit. Ein besonders bevorzugtes Verfahren, bei dem durch Messen der Intensität von Fluoreszenzlicht die gleichzeitige Amplifikation und Detektion ausgenutzt werden, stellt die in der WO 92/02638 sowie den entsprechenden US-Patenten 5,210,015 , 5,804,375 , 5,487,972 offenbarte TagMan^®-Methode dar. Bei dieser Methode wird die Exonukleaseaktivität einer Polymerase zur Erzeugung eines Signals ausgenutzt. Dabei wird im einzelnen die Zielnukleinsäure in einem Prozeß nachgewiesen, bei dem man die Probe mit einem eine zu einem Bereich der Zielnukleinsäure komplementäre Sequenz enthaltenden Oligonukleotid sowie einem markierten Oligonukleotid, das eine zu einem zweiten Bereich des gleichen Zielnukleinsäurestrangs komplementäre Sequenz enthält, jedoch nicht die durch das erste Oligonukleotid definierte Nukleinsäuresequenz beinhaltet, in Kontakt bringt, um ein Gemisch von Duplexen unter Hybridisierungsbedingungen zu erzeugen, wobei die Duplexe die in einer Annealing-Reaktion an das erste Oligonukleotids und an das markierte Oligonukleotid gebundene Zielnukleinsäure umfassen, so daß das 3'-Ende des ersten Oligonukleotids dem 5'-Ende des markierten Oligonukleotid benachbart ist. Anschließend wird dieses Gemisch mit einer matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase mit einer 5'- nach 3'-Nukleaseaktivität unter Bedingungen behandelt, die ausreichen, um der 5'- nach 3'-Nukleaseaktivität der Polymerase die Spaltung des im Annealing gebundenen, markierten Oligonukleotids und die Freisetzung der markierten Fragmente zu gestatten. Das durch die Hydrolyse des markierten Oligonukleotids erzeugte Signal wird nachgewiesen und/oder gemessen. Durch die TaqMan^®-Technologie entfällt die Notwendigkeit, für die Bildung und Nachweisbarmachung eines festphasengebundenen Reaktionskomplexes. Allgemeiner ausgedrückt: bei der Amplifikations- und/oder Nachweisreaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich um ein homogenes Lösungsphasen-Testverfahren. Ein weiteres bevorzugtes Verfahren liegt im Lightcycler^TM-Format vor (siehe z. B. US-Patent Nr. 6,174,670 ).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren automatisiert, d. h. das Verfahren wird als automatisierbarer Prozeß durchgeführt, wie er beispielsweise in der WO 99/16781 beschrieben ist. Automatisierbarer Prozeß bedeutet, daß die Prozeßschritte sich dazu eignen, mit einer Vorrichtung oder Maschine durchgeführt zu werden, die in der Lage ist, mit wenig oder gar keiner äußeren Kontrolle oder Beeinflussung durch einen Menschen zu arbeiten. Automatisiertes Verfahren bedeutet, daß die Schritte des automatisierbaren Verfahrens mit einer Vorrichtung oder Maschine durchgeführt werden, die in der Lage ist, mit wenig oder gar keiner äußeren Kontrolle oder Beinflussung durch einen Menschen zu arbeiten. Lediglich die Vorbereitungsschritte für das Verfahren müssen eventuell von Hand durchgeführt werden; beispielsweise müssen die Vorratsbehälter aufgefüllt und korrekt plaziert werden, und die Wahl der Proben sowie weitere, dem Fachmann bekannte Schritte z. B. der Betrieb des Kontrollrechners, müssen von einem Menschen durchgeführt werden. Die Vorrichtung oder Maschine kann beispielsweise Flüssigkeiten automatisch zugeben, die Proben mischen oder Inkubationsschritte bei bestimmten Temperaturen durchführen. Typischerweise handelt es sich bei einer solchen Maschine oder Vorrichtung um einen von einem Rechner gesteuerten Roboter, wobei ersterer ein Programm ausführt, in dem die einzelnen Schritte und Befehle beschrieben sind. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt das Verfahren in einem Format mit hohem Durchsatz vor, d. h. die automatisierten Verfahren werden ein einem Format mit hohem Durchsatz durchgeführt, was bedeutet, daß die Verfahren und die verwendete Maschine bzw. Vorrichtung für einen hohen Durchsatz von Proben innerhalb einer kurzen Zeit optimiert sind.
Bei den magnetischen Glaspartikeln handelt es sich um eine feste Dispersion kleiner Magnetkerne im Glas, d. h. um Glaströpfchen, in denen sehr kleine magnetische Objekte dispergiert sind. Diese als magnetisch bezeichneten Objekte werden zu einem Magneten, d. h. beispielsweise ferri- oder ferromagnetischen oder superparamagnetischen Materialien, hingezogen. Dabei sind paramagnetische Substanzen nicht geeignet, da sie nur sehr schwach zu einem Magneten hingezogen werden, was für ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nicht ausreicht. Bevorzugt sind ferri- oder ferromagnetische Materialien, insbesondere, wenn diese noch nicht vormagnetisiert wurden. Unter Vormagnetisierung versteht man in diesem Zusammenhang das Inkontaktbringen mit einem Magneten, wodurch die Remanenz erhöht wird. Bevorzugte magnetische Materialien sind Eisen oder Eisenoxid, wie beispielsweise Magnetit (Fe₃O₄) oder Fe₂O₃, vorzugsweise γ-Fe₂O₃. Im Prinzip könnten Bariumferrit, Nickel, Cobalt, Al-Ni-Fe-Co-Legierungen oder anderes ferri- oder ferromagnetisches Material verwendet werden. Besonders bevorzugt sind gemäß der vorliegenden Erfindung die in der WO 96/41811 oder WO 00/32762 beschriebenen magnetischen Glaspartikel.
In einer sehr bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform weisen die magnetischen Glaspartikel mit einer nichtmodifizierten Glasoberfläche ein geringes Auswaschen von Eisen auf, was für das erfindungsgemäße Verfahren bei der Verwendung magnetischer Glaspartikel essentiell ist, da Eisen ein Inhibitor der anschließenden Amplifikationsreaktion ist, d. h. Eisen einen enzymatischen Inhibitor darstellt. Dies ist daher ein wichtiges Merkmal der magnetischen Glaspartikel mit einer nicht modifizierten Glasoberfläche.
In der am stärksten bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich bei den magnetischen Glaspartikeln mit einer nichtmodifizierten Oberfläche um die in der europäischen Anmeldung EP 1 232 502 ( WO 01/32791 ) beschriebenen Partikel, die auch öffentlich in Form des MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (Roche, Mannheim, Deutschland) zur Verfügung stehen. Diese Partikel sedimentieren langsam und lassen sich daher vorteilhaft in einem automatisierten erfindungsgemäßen Verfahren einsetzen. Die Herstellung davon ist nachfolgend zusammengefaßt.
Die magnetischen Glaspartikel sind im wesentlichen kugelförmig und weisen einen geringen Durchmesser auf und enthalten wenigstens ein magnetisches Objekt mit einem Durchmesser zwischen 5 und 500 nm. Dies hat überraschende Folgen für die Sedimentationskinetik, die über die Halbwertszeiten t_1/2 quantifiziert wird, wobei es sich um diejenige Zeitspanne handelt, bei der 50% der Partikel aus einem spezifischen Volumenelement sedimentiert sind. Die Halbwertszeit für die Sedimentation einer 3 mg/ml (Gewicht pro Volumen) Suspension der MGPs mit einer nichtmodifizierten Glasoberfläche gemäß der Erfindung in Isopropanol beträgt mehr als 3 min, vorzugsweise 4 min, stärker bevorzugt 6 min. Allerdings liegen die am stärksten bevorzugten Werte für die Halbwertszeit bei mehr als 10 min oder sogar mehr als 20 min. Bei den magnetischen Objekten der am stärksten bevorzugten MGPs kann es sich beispielsweise um ein magnetische Pigment handeln. Die Größe der magnetischen Objekte liegt im Nanomaßstabsbereich, d. h. zwischen 5 bis 500 nm, vorzugsweise zwischen 10 bis 200 nm, am stärksten bevorzugt zwischen 15 bis 50 nm. Geeignete magnetische Pigmente werden von der Firma CERAC hergestellt und besitzen einen mittleren Durchmesser von 23 nm und bestehen aus γ-Fe₂O₃ (BET-Oberfläche 50 mg²/g, CERAC: P. O. Box 1178, Milwaukee, Wisconsin 53201-1178 USA; Artikel Nr. I-2012). Die am stärksten bevorzugten magnetischen Glaspartikel gemäß der vorliegenden Erfindung sind ferner dadurch gekennzeichnet, daß die MGPs einen Partikeldurchmesser zwischen 0,5 μm und 5 μm, vorzugsweise zwischen 1 μm bis 2 μm, wie mit hochauflösender Rasterelektronenmikroskopie bestimmt, aufweisen, wohingegen die magnetischen Objekte einen Durchmesser zwischen 5 bis 500 nm, vorzugsweise zwischen 10 bis 200 nm, am stärksten bevorzugt im Bereich von 15 bis 50 nm, wie oben beschrieben, ausweisen. Somit sind die MGPs ferner durch ein Verhältnis des Durchmessers des magnetischen Pigmentkerns zum Durchmesser des magnetischen Glaspartikels von weniger als 1 zu 10, wie mit hochauflösender Rasterelektronenmikroskopie bestimmt, gekennzeichnet.
Die am stärksten bevorzugten MGPs sind mikroporös, weisen jedoch eine hochstrukturierte und daher relativ große Oberfläche mit mehr als 6 m²/g auf. Vorzugsweise weisen die magnetischen Glaspartikel eine Oberfläche im Bereich von 5 bis 100 m²/g, vorzugsweise 5 bis 90 m²/g, stärker bevorzugt im Bereich von 10 bis 50 m²/g, am stärksten bevorzugt im Bereich von 15 bis 30 m²/g auf. Dies läßt sich mit dem Braunauer-Emett-Teller-Verfahren unter Verwendung eines im Handel erhältlichen automatischen Geräts bestimmen. Hinsichtlich einer Diskussion dieses Verfahrens, daß allgemein als BET-Verfahren bekannt ist, siehe S. Braunauer, The Adsorption of Gases and Vapors, Princeton University Press 1 1943).
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten magnetischen Glaspartikel können in unterschiedlichen Formulierungen bereitgestellt werden, wie sie im wesentlichen in der europäischen Patentveröffentlichung EP 1154443 beschrieben sind. Dabei besteht die Möglichkeit, diese in Form einer Tablette, als Pulver oder vorzugsweise als Suspension bereitzustellen. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthalten diese Suspensionen zwischen 5 bis 60 mg/ml magnetische Glaspartikel (MGPs). In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das siliciumdioxidhaltige Material in wäßrigen gepufferten Lösungen suspendiert, die gegebenenfalls ein chaotropes Agens in einer Konzentration zwischen 2 und 8 mol/l und vorzugsweise zwischen 4 und 6 mol/l enthalten können. Chaotrope Salze sind Natriumiodid, Natriumperchlorat, Guanidiniumthiocyanat, Guanidiniumisothiocyanat oder Guanidiniumhydrochlorid. Bei einem chaotropen Agens gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine beliebige chemische Substanz, die die geordnete Struktur von flüssigem Wasser stört und deren Effekt darin besteht, daß DNA oder RNA an die MGPs gemäß der vorliegenden Erfindung bindet, falls dieses Agens in der DNA- oder RNA-haltigen Lösung vorhanden ist. Andere dem Fachmann bekannte Verbindungen sind ebenfalls möglich.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die magnetischen Glaspartikel mit einer nichtmodifizierten Glasoberfläche mit dem in der EP 1154443 und der WO 96/41811 beschriebenen Sol-Gel-Verfahren angefertigt, wobei das Sol-Gel-Verfahren insbesondere die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Suspendieren magnetischer Objekte in einem Sol,
(b) Hydrolysieren des Sols, so daß die magnetischen Objekte mit einem Gel bedeckt werden,
(c) Sprühtrocknen der mit einem Gel bedeckten magnetischen Objekte in einem Sprühtrockner mit zwei Düsen und
(d) Sintern des sprühgetrockneten Pulvers unter Ausbildung eines Glases aus dem die magnetischen Objekte bedeckenden Gel.

Die am stärksten bevorzugten erfindungsgemäßen MGPs werden gemäß der internationalen Anmeldung EP 1154443 angefertigt und auch im MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (Roche, Mannheim, Deutschland) bereitgestellt. Ebenso werden sie mit dem in der internationalen Anmeldung ( EP 1154443 ) beschriebenen Sol-Gel-Verfahren unter Verwendung magnetischer Objekte oder Pigmente mit einem Durchmesser von etwa 23 nm (hergestellt von CERAC und bestehend aus γ-FE₂O₃; CERAC: P. O. Box 1178, Milwaukee, Wisconsin 53201-1178 USA; Artikel Nr. I-2012) produziert. Nach Bedecken der magnetischen Objekte mit einem Gel wird ein Pulver erzeugt, indem die Aufschlämmung durch eine 2-Flüssigkeiten-Düse gesprüht wird. Geeignete Sprühtrocknungssysteme werden von der Firma Nubilosa Molekularzerstäubung, Ladisch GmbH & Co. KG, Konstanz, Deutschland, z. B. der "Labor-Zerstäubungstrockner (Typ LTK)" oder von der Firma Büchi AG, Uster, Schweiz, z. B. der Mini Spray Dryer (Type B-191), produziert. Da die Durchmesserverhältnisse von Magnetkernen zur Glashülle weniger als 1 zu 10, vorzugsweise zwischen 1:10 und 1:1000 betragen, wird die Form und Größe der Partikel nicht durch die Geometrie und die Anzahl eingebauter Magnetkerne oder deren inerter Träger bestimmt, sondern durch die Anfertigungsbedingungen, insbesondere die Bedingungen während der Sprühtrocknung. Mit anderen Worten: die Wahl von Druck, Einlaßtemperatur, Auslaßtemperatur und Fließgeschwindigkeit während des Sprühtrocknungsverfahrens stellen die Freiheitsgrade dar, durch die die Größenverteilung, die Form der Glastropfen bestimmt werden und damit die MGPs modifiziert werden. Daher sind die Düsen des Sprühtrockningssystems beheizt. Die Einlaßtemperatur liegt zwischen 120°C und 500°C, vorzugsweise zwischen 170°C und 230°C oder 150°C und 230°C, am meisten bevorzugt zwischen 150°C und 200°C oder 190°C und 210°C oder bei 200°C oder geringfügig niedriger. Die Auslaßtemperatur hängt vom Siedepunkt des Sols und damit vom Lösungsmittel ab und kann oberhalb, bei oder geringfügig unterhalb, d. h. niedriger als 10°C, dem Siedepunkt des Lösungsmittels liegen. Wird Ethanol als Lösungsmittel verwendet, so liegt sie zwischen 50°C und 300°C, vorzugsweise 70°C und 150°C, am stärksten bevorzugt zwischen 80°C und 110°C. Die optimale Temperatur liegt zwischen 90°C bis 100°C. Der Düsendruck beträgt mehr als 3 bar, und wird vorzugsweise auf 4 bis 6 bar reguliert. Dem Fachmann ist bekannt, daß die genauen Parameter von dem verwendeten Sprühtrocknungssystem abhängen. Allerdings ist er in der Lage, die Lehren der vorliegenden Erfindung auf jedes andere Sprühtrocknungssystem zu übertragen und die Parameter unter Berücksichtung der Offenbarungen der vorliegenden Erfindung zu ermitteln. Formeln, wie sie in Masters: Spray Drying Handbook, Fifth Edition, John Wiley & Sons (1991) New York, beschrieben sind, zeigen ihm dabei den Weg, um zu ermitteln, welche Parameter für einen anderen Aufbau gewählt wurden. Vorzugsweise befragt er dazu die Handbücher seines Sprühtrocknungssystems oder nimmt Verbindung mit dem technischen Service des Sprühtrocknungssystemherstellers auf.
Zur Optimierung der Ausbeute sollte die Verdichtungs- oder Sintertemperatur so hoch wie möglich liegen, d. h. leicht unterhalb des Schmelzbereichs. Die genauen Temperaturen hängen von der Glaszusammensetzung ab, doch können sie zwischen 400°C bis 1200°C betragen. Im Falle der in der EP 1154443 beschriebenen EJ-Glaszusammensetzung beträgt die Sintertemperatur zwischen 720°C und 770°C, vorzugsweise um 750°C. Es liegt im Bereich des fachmännischen Könnens, die Temperaturen für jede Glaszusammensetzung unter Berücksichtigung der Lehren der vorliegenden Erfindung zu ermitteln. Anschließend wird das Pulver 1 Stunde bei 200°C erhitzt, gegebenenfalls auf Raumtemperatur abgekühlt und in einer Stickstoffatmosphäre mit einer Heizrate von 1 K/min auf 750°C (Verdichtungs- oder Sintertemperatur) erhitzt und bei dieser Temperatur 1 Stunde gehalten. Anschließend wird der Ofen auf 150°C abgekühlt und wiederum eine Stunde in Luft auf 200°C erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird das Pulver auf ein Sieb (50 μm) gegeben und 30 min gesiebt. Die gesiebte Probe wird in Flaschen abgefüllt und 4 h bei 200°C sterilisiert und anschließend auf 80°C abgekühlt. Danach werden die Glasgefäße aus dem Ofen genommen, mit steriler Folie abgedeckt und verschlossen.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren in der Diagnostik zur diagnostischen Analyse oder zur Bioanalyse oder zum Screening von Flüssigkeiten aus dem menschlichem oder sogar tierischen Körper auf das Vorhandensein einer Zielnukleinsäure, d. h. beispielsweise einer Nukleinsäure aus einem Virus, verwendet.
Ferner wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Verbesserung der Geschwindigkeit, Genauigkeit oder Empfindlichkeit des Nachweises einer Zielnukleinsäure verwendet.
Die folgenden Beispiele, Literaturangaben und Abbildungen werden als Hilfe beim Verständnis der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, deren voller Umfang in den beigefügten Ansprüchen angegeben ist. Es versteht sich, daß an den angegebenen Verfahrensweisen Modifikationen vorgenommen werden können, ohne daß dabei vom Geist der Erfindung abgewichen wird.
BEISPIELE Beispiel I
Einfluß magnetischer Glaspartikel (MGPs) auf eine TaqMan^®-PCR
Dieses Beispiel beschreibt Experimente, die zur Messung des Effekts magnetischer Glaspartikel (MGP) auf die Amplifikationseffizienz durchgeführt wurden. Die Amplifikationen wurden unter Verwendung einer TaqMan^®-PCR-Vorschrift, wie nachfolgend beschrieben, durchgeführt.
In einem TaqMan^®-Testverfahren werden markierte Nachweissonden, die innerhalb des amplifizierten Bereichs hybridisieren, zum Amplifikationsreaktionsgemisch gegeben. Dabei werden die Sonden vorzugsweise so modifiziert, daß sie daran gehindert werden, als Primer für DNA-Synthese zu fungieren. Die Amplifikation wird unter Verwendung einer DNA-Polymerase durchgeführt, die 5'- nach 3'-Exonuklease-Aktivität besitzt, beispielsweise ZO5-DNA-Polymerase. Während eines jeden Syntheseschritts der Amplifikation werden alle Sonden, die stromabwärts vom verlängerten Primer an die Zielnukleinsäure hybridisieren, von der 5'- nach 3'-Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase abgebaut. Somit führt die Synthese eines neuen Zielstrangs ebenso zum Abbau einer Sonde, wobei die Anhäufung von Abbauprodukt ein Maß für die Synthese von Zielsequenzen bereitstellt.
Der Anstieg von Amplifikationsprodukten während einer TaqMan^®-Reaktion läßt sich mit Fluoreszenzsonden verfolgen. Dabei werden die Nachweissonden mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert, von denen einer in der Lage ist, die Fluoreszenz des anderen Farbstoffs zu löschen (quenching), so daß die Sonden selbstlöschend sind, wenn sie nahe beieinander liegen, d. h. wenn sie an die gleiche Sonde oder Nukleinsäure gebunden sind. Die Farbstoffe werden an die Sonde gebunden, wobei vorzugsweise einer an den 5'-Terminus und der andere an eine innenliegende Stelle gebunden wird, so daß die Spaltung der Sonde durch die 5'- nach 3'-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase zwischen den beiden Farbstoffen erfolgt.
Die Amplifikation führt zur Spaltung der Sonde und Trennung der Farbstoffe bei gleichzeitiger Beseitigung des Quenching und Erhöhung der beobachtbaren Fluoreszenz. Somit wird die Anhäufung von Abbauprodukt, die ein Maß für den Anstieg an Amplifikationsprodukt darstellt, durch Messen der Erhöhung der Reaktionsfluoreszenz verfolgt.
In den in diesem Beispiel beschriebenen Experimenten wurde jede Sonde so synthetisiert, daß sie einen Polymethin-Cyaninfarbstoff und eine 6-Carboxyfluoreszein-Markierung enthielt. Die erhaltenen Proben sind selbstlöschend, wenn sie nahe beieinander liegen. Um die Verlängerung der Sonde durch die DNA-Polymerase während der Amplifikation zu verhindern, wurde die Sonde mit einem 3'-Phosphatblock synthetisiert. Die Anhäufung von amplifiziertem Produkt wurde bei jedem Zyklus während der Reaktion gemessen, indem die Erhöhung der Reaktionsfluoreszenz gemessen wurde. Während eines jeden Amplifikationszyklus wurden die Sonden mit Licht bei einer Wellenlänge in der Nähe des Exzitationsmaximums des Fluorophors angeregt, und die Emission des Fluorophors wurde nahe seines Emissionsmaximums gemessen.
Fluoreszenzmessungen wurden normiert, indem sie durch eine erste Fluoreszenzmessung, d. h. die Hintergrundfluoreszenz, die während eines Zyklus zu einem frühen Zeitpunkt der Reaktion, währenddessen die Fluoreszenzmessungen zwischen den Zyklen relativ konstant zu sein scheinen, ermittelt wurde, geteilt wurden. Die Nummer des für die erste Fluoreszenzmessung gewählten Zyklus war für alle miteinander verglichenen Reaktionen gleich, so daß alle Messungen Erhöhungen relativ zum gleichen Reaktionszyklus repräsentieren.
In den frühen Zyklen einer Polymerasekettenreaktionamplifikation läßt sich die Anzahl von Zielmolekülen durch die geometrische Gleichung Ni = N0 × (1 + E)i beschreiben mit N_i = die Anzahl von Zielmolekülen bei Beendigung des iten Zyklus, N₀ = die Anzahl von Zielmolekülen zu Beginn der Reaktion und E = die Effizienz der Amplifikation (0 = < E = < 1). Während dieser geometrischen Wachstumsphase der Amplifikation ist die zur Erreichung eines bestimmten Schwellenwerts (C_T) erforderliche Anzahl von Zyklen umgekehrt proportionell zum Logarithmus von (1 + E). Somit stellt der C_T ein Maß für die Reaktionseffizienz, das Vergleiche zwischen Reaktionen gestattet. Eine Abnahme des C_T-Werts, was bedeutet, daß die Reaktion den Schwellenwert in weniger Zyklen erreichte, zeigt eine Erhöhung der Gesamtempfindlichkeit an.
Da der Anstieg von Amplifikationsprodukt anhand der Messung des Anstiegs der Reaktionsfluoreszenz verfolgt wird, ist der C_T-Wert hier als Anzahl der Amplifikationszyklen definiert, die ausgeführt wurden, bis die Fluoreszenz ein willkürliches Fluoreszenzniveau (AFL [arbitrary fluorescence level]) überschritt. Der gewählte AFL-Wert lag nahe bei dem Grundlininenfluoreszenzniveau, jedoch oberhalb des Bereichs willkürlicher Schwankungen in der gemessenen Fluoreszenz, so daß die Reaktionskinetik während der geometrischen Wachstumsphase der Amplifikation gemessen wurde. Die Anhäufung von amplifiziertem Produkt in späteren Zyklen hemmt die Reaktion und führt schließlich zu einem Reaktionsplateau.
Für alle Reaktionen wurde ein AFL-Wert von 1,5 gewählt. Da eine PCR-Amplifikation aus diskreten Zyklen besteht und die Fluoreszenzmessungen einmal pro Zyklus durchgeführt werden, steigt die gemessene Fluoreszenz in einem einzelnen Zyklus typischerweise von einem Wert unterhalb des AFL-Werts bis oberhalb des AFL-Werts an. Zur Verbesserung der Genauigkeit der Messungen wurde eine "exakte" Anzahl von Zyklen zur Erreichung des AFL-Schwellenwerts, hier als C_T-Wert bezeichnet, durch Interpolieren von Fluoreszenzmessungen zwischen den Zyklen berechnet.
Reaktionsbedingungen

Reaktionen wurden unter Verwendung der nachfolgend angegebenen Reaktionskomponenten durchgeführt. Dabei wurde jeder Test in einem dreifachen Testverfahren ausgeführt.

Test 1:	25,75 μl Mastermix-Komponente R1
	24,25 μl Mastermix-Komponente R2
	50 μl HCV-Standardmaterial (verdünnt in Poly-A-Lösung)
Test 2:	25,75 μl Mastermix-Komponente A
	24,25 μl Mastermix-Komponente B
	50 μl HCV-Standardmaterial (verdünnt in Poly-A-Lösung)
	6 mg magnetische Glaspartikel ("Cerac" MGP, wie oben beschrieben)

Formulierung der Mastermix-Komponenten R1 und R2

Inhalt	Konzentration der Stammlösung	Endkonzentration in der Reaktion	μl/ Reaktion	μl/ Reaktion R_i
Reines Wasser			10,85
Mn (Ac)₂ pH = 6,5	50 mM	3 mM	6,00
KOAc pH = 7,0	2 M	100 mM	5,00
Glycerin (frei)	80%	2,8%	3,50
HVC-Sonde ST650p2	50 μM	10 pmol/100 μl	0,20
IC-Sonde ST2535Cy5F15	50 μM	10 pmol/100 μl	0,20	25,75

Primer 1 (HCV) ST280A	50 μM	15 pmol/100 μl	0,30
Primer 2 (HCV) ST778AA	50 μM	40 pmol/100 μl	0,80
Tricin pH	1 M	50 mM	5,00
dNTPs, nicht äquimolar (GAC)	100 mM	300 μM	2,50
dTNPS, nicht äquimolar (T)	100 mM	50 μM
dTNPs nicht äquimolar (U)	100 mM	500 μM
ZO5-Polymerase	10 U/μl	40 U/100 μl	4,00
Uracil-N-Glykosylase (UNG)	2,0 U/μl	10 U/100 μl	5,00
Dimethylsulfoxid DMSO	80%	5%	6,25
NTQ21-46A	50 μM	20 pmol/100 μl	0,40	24,25

Die Sequenzen der Primer ST280A und ST778AA sind in US-Patent Nr. 5,837,442 beschrieben. Die 3'-terminalen Nukleotide der Primer wurden jeweils durch die kovalente Bindung einer p-tert.-Butylbenzylgruppe an das 3'-terminale Nukleotid modifiziert, wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 866,071 und dem US-Patent Nr. 6,001,611 beschrieben.
Die Sequenzen der HCV-spezifischen Sonde und der für die interne Kontrolle (IC)-spezifischen Sonden sind nachfolgend in der 5'-3'-Orientierung angegeben. Die HCV-spezifischen Sonden wurden so synthetisiert, daß die einen über das endständige Phosphat an den 5'-Terminus gebundenen Cy5-Fluorophor enthalten, wobei ein im Handel erhältliches Phosphoramidit (Pharmacia, Piscataway, NJ) verwendet wurde. Eine 6-Carboxyfluoreszein(FAM)-Markierung wurde an einer innenliegenden Position zwischen den Nukleotiden 14 und 15 eingebaut, wobei ein im Handel erhältlicher markierter Linker in Form eines Phosphoramidits der Firma BioGenex (San Ramon, CA) verwendet wurde. Die erhaltenen Sonden sind im unhybridisierten Zustand selbstlöschend. Zur Verhinderung der Verlängerung der Sonde durch die DNA-Polymerase während der Amplifikation wurde die Sonde mit einem 3'-Phosphatblock unter Verwendung eines von der Firma Glenn Research (Sterling, VA) kommerziell erhältlichen Phosphoramidits synthetisiert. HCV-Sonde ST650p2: (SEQ ID NO: 1)
IC-Sonde ST2535Cy5F15: (SEQ ID NO: 2)
Das folgende Oligonukleotid wurde in dem Reaktionsansatz R2 mit einbezogen, um die DNA-Polymerase-Aktivität bei niedrigen Temperaturen zu hemmen.
HCV-Standard Material bestand aus unter Verwendung eines HCV-RNA-Transkriptionsvektors im wesentlichen wie bei Young et al., 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4):882-886 beschrieben synthetisierten HCV-RNA-Matrizen. Die HCV-RNA-Matrizen wurden in Poly-A-Lösung (20 μg/ml Poly-rA, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA, 0,05% Natriumazid DEPC-behandeltes Wasser und steril filtriert) auf eine Konzentration von 200 Kopien pro 50 μl verdünnt.
Amplifikationsprotokoll

Amplifikationen wurden unter Verwendung des nachfolgenden Temperaturprofils durchgeführt:

Inkubation vor Reaktion	45°C, 10 Minuten
Erste Denaturierung	94°C, 30 Minuten
Reverse Transkription	58°C, 30 Minuten
5 Zyklen	95°C, 20 Sekunden; 59°C, 50 Sekunden
55 Zyklen	91°C, 15 Sekunden, 52°C, 50 Sekunden

Ergebnisse
Die Ergebnisse der Reaktionen sind in 1 und 2 aufgeführt. Dabei sind für jede Reaktion die C_T-Werte angegeben. Vergleicht man die C_T-Werte, so zeigt sich, daß die in Gegenwart magnetischer Glaspartikel durchgeführten Reaktionen den Schwellenwert früher als die vergleichbaren, ohne die magnetischen Glaspartikel in der Reaktion durchgeführten Reaktionen erreichten. Diese Ergebnisse demonstrieren den überraschenden Anstieg der Reaktionseffizienz, der mit der Durchführung der Amplifikation in Gegenwart der magnetischen Glaspartikel erhalten wurde.
Literaturliste

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Wu and Wallace, Genomics 4 (1989) 560–569

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Aufreinigung und Amplifikation einer Zielnukleinsäure aus einer die Zielnukleinsäure umfassenden biologischen Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: a) Zugabe eines magnetische Glaspartikel mit einer nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche umfassenden Materials zu der Probe, um die Zielnukleinsäure an das Material zu binden, b) Trennen des Materials von der Probe, c) Eluieren der Zielnukleinsäure aus dem Material und d) Amplifizieren der Zielnukleinsäure in Gegenwart des Materials, wobei die magnetischen Glaspartikel nach dem Sol-Gel-Verfahren angefertigt werden.
Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure in einer Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) Zugabe eines magnetische Glaspartikel mit einer nichtmodifizierten Siliciumdioxidoberfläche umfassenden Materials zu der Probe, (b) Trennen des Materials von der Probe, (c) Eluieren der Zielnukleinsäure aus dem Material und (d) Amplifizieren der Zielnukleinsäure in Gegenwart des Materials, wobei die magnetischen Glaspartikel nach dem Sol-Gel-Verfahren angefertigt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Zielnukleinsäure um RNA oder DNA handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Amplifikationsschritt unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Amplifikation der Zielnukleinsäure und der Nachweis der amplifizierten Zielnukleinsäure in Gegenwart des eine nichtmodifizierte Siliciumdioxidoberfläche umfassenden Materials stattfinden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die amplifizierte Zielnukleinsäure während der Amplifikation nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Sol-Gel-Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) Suspendieren magnetischer Objekte in einem Sol, (b) Hydrolysieren des Sols, so daß die magnetischen Objekte mit einem Gel bedeckt werden, (c) Sprühtrocknen der mit einem Gel bedeckten magnetischen Objekte in einem Sprühtrockner mit zwei Düsen und (d) Sintern des sprühgetrockneten Pulvers unter Ausbildung eines Glases aus dem die magnetischen Objekte bedeckenden Gel.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Einlaßtemperatur des Sprühtrockners mit zwei Düsen zwischen 120°C und 500°C liegt, die Auslaßtempera tur dem Kochpunkt des Sols entsprechend gewählt wird und der Sprühdruck zwischen 4 und 6 bar liegt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Halbwertszeit für die Sedimentation einer Suspension von 3 mg/ml (Gewicht/Volumen) magnetischer Glaspartikel in Isopropanol mehr als 6 Minuten beträgt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die magnetischen Glaspartikel einen mittleren Durchmesser zwischen 0,5 μm und 5 μm aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die magnetischen Glaspartikel mit einer nichtmodifizierten Glasoberfläche ein magnetisches Objekt mit einem Durchmesser zwischen 5 und 500 nm enthalten.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die magnetischen Glaspartikel mit einer nichtmodifizierten Glasoberfläche ein magnetisches Objekt mit einem Durchmesser von 23 nm enthalten.