ES2294287T3 - Empleo de un material de silice en una reaccion de amplificacion. - Google Patents
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Abstract
Un método para la purificación y amplificación de un ácido nucleico diana a partir de una muestra biológica que contiene dicho ácido nucleico diana, el cual método comprende los pasos de: a) adición de un material que contiene partículas de vidrio magnéticas con una superficie de sílice sin modificar, a dicha muestra para unir dicho ácido nucleico diana a dicho material, b) separación de dicho material de dicha muestra, c) elución de dicho ácido nucleico diana de dicho material, y d) amplificación de dicho ácido nucleico diana en presencia de dicho material, en donde dichas partículas de vidrio magnéticas se obtienen por el método de sol-gel.
Description
Empleo de un material de sílice en una reacción
de amplificación.
Esta invención se refiere a un método para el
aislamiento de ácidos nucleicos empleando un material con una
superficie de sílice sin modificar, tal como partículas de vidrio
magnéticas, y subsiguiente amplificación de un ácido nucleico diana
en presencia del material con una superficie de sílice sin
modificar. El método se efectúa de preferencia como un proceso
automatizado, de preferencia en un formato de alto rendimiento. El
método se emplea de preferencia en diagnósticos.
Muchas substancias biológicas, especialmente los
ácidos nucleicos, presentan problemas importantes en el sentido de
su aislamiento de su entorno natural. Por una parte, están a menudo
presentes en muy poca concentración, y por otra parte, se
encuentran a menudo en presencia de muchas otras substancias sólidas
y disueltas, p. ej., después de la lisis de las células. Esto
dificulta su aislamiento o su medición, en particular en ensayos
bioespecíficos que permiten la detección de analitos específicos, p.
ej., ácidos nucleicos o propiedades específicas de analitos y juega
un papel importante en el campo de los diagnósticos y bioanalítica
en investigación y desarrollo.
Antes de que una substancia o compuesto
biológico, por ejemplo, un ácido nucleico, pueda ser analizado en
un ensayo bioespecífico o empleado para otros procesos, a menudo
debe ser aislado o purificado a partir de muestras biológicas que
contienen mezclas complejas de diferentes componentes como p. ej.,
componentes proteínicos y no proteínicos. Frecuentemente, la
substancia biológica está contenida en una célula bacteriana, una
célula de un hongo, una partícula vírica, o la célula de un
organismo más complejo, tal como una célula de sangre humana o una
célula vegetal. La substancia biológica para analizar recibe con
frecuencia también el nombre de substancia de interés o substancia
diana. Frecuentemente, la substancia diana es un ácido nucleico, el
cual en consecuencia, recibe el nombre de ácido nucleico diana.
Para liberar el contenido de dichas células o
partículas, puede ser tratado con enzimas o con productos químicos
para disolver, degradar o desnaturalizar las paredes de las células
y/o las membranas de las células. Este proceso se conoce
habitualmente con el nombre de lisis. La solución resultante que
contiene dicho material lisado se conoce con el nombre de lisado.
Un problema que a menudo aparece durante la lisis es que las enzimas
que degradan la substancia de interés, p. ej., las
desoxirribonucleasas o ribonucleasas, que degradan los ácidos
nucleicos, entran en contacto con la substancia de interés durante
la lisis. Estas enzimas de degradación pueden estar presentes fuera
de las células o pueden haber sido separadas espacialmente en
diferentes compartimentos celulares antes de la lisis. Otros
componentes liberados durante este proceso pueden incluir por
ejemplo, endotoxinas pertenecientes a la familia de los
lipopolisacáridos las cuales son tóxicas para las células y pueden
causar problemas en el caso de productos que se pretende utilizar en
la terapia humana o animal. Existen una variedad de medios para
abordar este citado problema. Es corriente emplear agentes
caotrópicos como p. ej., las sales de guanidinio o detergentes
aniónicos, catiónicos, biónicos o no iónicos cuando se proyecta que
los ácido nucleicos estén libres. Es también una ventaja, el empleo
de proteasas, p. ej., la proteinasa K, la cual degrada rápidamente
estas enzimas o proteínas no deseadas. Sin embargo, esto puede
producir otro problema, a saber, que dichas substancias o enzimas
puedan interferir con reactivos o componentes en pasos
subsiguientes.
Si las substancias de interés son ácidos
nucleicos, normalmente se extraen, y de esta forma se separan de
las mezclas complejas de la lisis antes de ser utilizados en un
ensayo. Existen varios métodos para la extracción de ácidos
nucleicos como los métodos dependientes de la secuencia o métodos
bioespecíficos (cromatografía de afinidad, hibridación a sondas
inmovilizadas) o los métodos independientes de la secuencia o
métodos físico-químicos (extracción
líquido-líquido con p. ej.,
fenol-cloroformo, precipitación con p. ej., etanol
puro, extracción con papel de filtro, extracción con agentes
formadores de micelas como el bromuro de
cetil-trimetil-amonio, unión a
colorantes intercalados, inmovilizados, p. ej., derivados de
acridina, adsorción a silica gel o tierras de diatomeas, adsorción
a partículas de vidrio magnéticas (MGPs) ó partículas de
organosilanos en condiciones caotrópicas. La extracción empleando
fases sólidas comprende habitualmente los pasos de adición del
lisado a la fase sólida en condiciones que permiten la unión de la
substancia de interés a la fase sólida, eliminación del resto de
lisado de la substancia unida a la fase sólida y subsiguiente
liberación de la substancia de interés de la fase sólida en un
eluato líquido (algunas veces llamado también elución). El resultado
del proceso de extracción es habitualmente una solución que
contiene la substancia de interés en estado disuelto.
Particularmente interesante para la finalidad de la extracción es
la adsorción del ácido nucleico a una superficie de vidrio, en
particular las superficies de vidrio MGP. En los últimos años, han
sido propuestos muchos procedimientos para el aislamiento de ácidos
nucleicos a partir de su entorno natural, mediante el empleo de su
comportamiento de unión a las superficies de vidrio.
Después del paso de extracción, la solución que
contiene la substancia de interés, p. ej., el ácido nucleico, se
analiza mediante un ensayo bioespecífico para ver si la substancia
de interés está presente en la muestra original. Ejemplos de
ensayos bioespecíficos son los ensayos de hibridación para ácidos
nucleicos, inmunoensayos o ensayos de
receptor-ligando para proteínas. Los ensayos de
hibridación emplean el emparejamiento específico de las bases para
la detección molecular de analitos de ácido nucleico, por ejemplo,
ARN ó ADN. Así por ejemplo, sondas de oligonucleótidos con una
secuencia de una longitud de aproximadamente 18 a aproximadamente 20
nucleótidos pueden permitir el reconocimiento específico de una
secuencia complementaria seleccionada, por ejemplo, en el genoma
humano. Otro ensayo que supone la unión selectiva de dos cebadores
oligonucleótidos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
descrita en la patente US 4.683.195. Este método permite la
amplificación selectiva de una región específica de ácido nucleico
hasta niveles detectables mediante una polimerasa termoestable en
presencia de desoxidonucleótido trifosfatos en varios ciclos. A
continuación, el ácido nucleico se detecta mediante métodos ya
conocidos por el experto en la técnica. Otros métodos, como el
ensayo TaqMan® descrito en la patente WO92/02638, permite
simultáneamente la amplificación y detección de un ácido nucleico de
interés.
Normalmente, los pasos de lisis, extracción y
amplificación se realizan consecutivamente, mientras se efectúan
una variedad de diferentes operaciones, p. ej., la eliminación de
fases que contienen solamente proteína, la elución de los ácidos
nucleicos a partir del soporte empleado para la extracción y
eliminación del soporte, la transferencia de líquidos a tubos
frescos, etc. Son necesarios nuevos métodos de preparación de
muestras de ácido nucleico para mejorar la eficiencia y/o
sensibilidad de por ejemplo, métodos de detección del ácido
nucleico.
La patente EP 0389063 describe un procedimiento
para el aislamiento del ácido nucleico mezclando un material de
partida biológico complejo, una substancia caotrópica y una fase
sólida de unión al ácido nucleico que comprende sílice, separando
la fase sólida con su ácido nucleico unido a la misma, lavando el
ácido nucleico unido a la fase sólida y eluyendo el ácido nucleico
a partir de la fase sólida.
La patente WO 96/18731 proporciona un método de
aislamiento del ácido nucleico a partir de una muestra, en donde el
método comprende la puesta en contacto de la muestra con un
detergente y un soporte sólido.
La patente WO/99/39010 describe un reactivo de
elución del ADN que comprende un tampón, una base, un agente
quelante, y agua.
La presente invención proporciona métodos para
efectuar la preparación de la muestra, seguido de la amplificación
del ácido nucleico, que proporciona aumentos de la eficiencia de la
reacción y sensibilidad de la detección a la vez que reduce los
pasos de manipulación necesarios. En los métodos de la presente
invención, la preparación de la muestra de efectúa empleando una
superficie de vidrio sin modificar de partículas de vidrio
magnéticas, para capturar el ácido nucleico contenido en la
muestra, y el complejo de vidrio-ácido nucleico resultante, se
combina directamente con los reactivos de reacción de la
amplificación y se someten a las condiciones de la amplificación.
Un aspecto crítico de la invención es que la amplificación se
efectúa en presencia de partículas de vidrio magnéticas.
Los métodos de la presente invención
proporcionan varias ventajas sobre los métodos previamente descritos
empleando partículas de vidrio magnéticas. Una ventaja es que los
métodos necesitan menos pasos de manipulación, lo cual da como
resultado una disminución del tiempo y el esfuerzo requeridos y
permite una mejor automatización. Más sorprendentemente, los
presentes métodos proporcionan una mayor sensibilidad de la reacción
comparada con los métodos en los cuales el ácido nucleico
purificado se eluye del vidrio antes de la amplificación y la
amplificación se efectúa sin la presencia de vidrio.
Por lo tanto, la presente invención contempla un
método para la purificación y amplificación de un ácido nucleico
diana a partir de una mezcla biológica que contiene dicho ácido
nucleico diana, el cual método comprende los pasos de adición de un
material que contiene partículas de vidrio magnéticas con una
superficie de sílice sin modificar, a dicha muestra para unir dicho
ácido nucleico diana a dicho material, separación de dicho material
de dicha muestra, elución de dicho ácido nucleico diana de dicho
material, amplificación de dicho ácido nucleico diana en presencia
de dicho material, en donde dichas partículas magnéticas de vidrio
se han obtenido mediante el método de sol-gel. El
método contempla además un método para la amplificación de un ácido
nucleico diana en una muestra, comprendiendo dicho método los pasos
de adición de un material que contiene partículas de vidrio
magnéticas, con una superficie de sílice sin modificar, a dicha
muestra, separación de dicho material de dicha muestra, elución de
dicho ácido nucleico diana de dicho material y amplificación de
dicho ácido nucleico diana en presencia de dicho material, en donde
dichas partículas de vidrio magnéticas se han obtenido mediante el
método de sol-gel.
El ácido nucleico diana puede se un ácido
desoxirribonucleico (ADN) ó un ácido ribonucleico (ARN) y de
preferencia se amplifica mediante, por ejemplo, la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Las partículas de vidrio magnéticas
se obtienen mediante el método sol-gel, con mayor
preferencia, empleando un paso de secado por pulverización con un
secador por pulverización de dos toberas, operando en condiciones
específicas. De preferencia, el método está automatizado o se
efectúa en un formato de alto rendimiento. Con la máxima
preferencia, el método de emplea en diagnósticos o para la
exploración de sangre para detectar la presencia de un ácido
nucleico de
un virus.
un virus.
\newpage
Figura 1: Comparación de los valores C_{T} de
las reacciones PCR con y sin partículas de vidrio magnéticas que
contienen el pigmento fabricado por la compañía CERAC y fabricado de
acuerdo con la patente EP 1154443 (cp/ml: copias/ml).
Figura 2: Comparación de los valores C_{T} de
las reacciones PCR con y sin partículas de vidrio magnéticas que
contienen el pigmento MMB (Merck) (cp/ml: copias/ml).
El término "sin modificar" significará que
allí no existe ninguna modificación química más, es decir, ningún
otro grupo químico está unido ni covalentemente ni no
covalentemente. El término "superficie de sílice sin
modificar" significará que ningún otro grupo químico está unido
covalentemente o no covalentemente, que sirva como una substancia
intermediaria para la unión del ácido nucleico y en donde los ácidos
nucleicos se unen a la substancia intermediaria y no a la propia
superficie de sílice. Por lo tanto, los ácidos nucleicos son
capaces de unirse mediante enlaces hidrógeno y otras fuerzas
atómicas directamente a la "superficie de sílice sin
modificar" en presencia de por ejemplo, altas concentraciones de
sal. Un ejemplo de una superficie modificada son las superficies de
sílice a las cuales se han unido oligonucleótidos que se unen en
moléculas de ácidos nucleicos de manera secuencial específica. Otro
ejemplo de superficies de sílice modificadas son las superficies de
sílice recubiertas con estreptavidina que se une a las moléculas de
ADN biotinadas.
De acuerdo con la presente invención, un
"ácido nucleico diana" será el ácido nucleico de interés o más
generalmente la substancia de interés, es decir, un ácido nucleico
que será investigado puesto que su presencia es indicativa de una
cierta condición o enfermedad de un humano o animal. Por ejemplo, la
presencia de un ácido nucleido de un virus (p. ej., el virus de la
hepatitis B, el virus de la hepatitis C ó el virus de la
inmunodeficiencia humana) indica que el individuo respectivo está
infectado por el virus respectivo. En consecuencia, el ácido
nucleico de este virus específico sería el ácido nucleico diana.
Otros ácidos nucleicos diana son p. ej., los ácidos nucleicos que
son indicativos de una predisposición de un individuo a cierta
enfermedad, p. ej., una enfermedad heredada, como la anemia
falciforme, o ciertos tipos de cáncer.
La presente invención contempla un método para
la purificación y amplificación de un ácido nucleico diana de una
muestra biológica que contiene dicho ácido nucleico diana, el cual
método comprende los pasos de adición de un material que contiene
partículas de vidrio magnéticas con una superficie de sílice sin
modificar, a dicha muestra para unir dicho ácido nucleico diana a
dicho material, separación de dicho material de dicha muestra,
elución de dicho ácido nucleico diana de dicho material,
amplificación de dicho ácido nucleico diana en presencia de dicho
material, en donde dichas partículas de vidrio magnéticas han sido
obtenidas mediante el método de sol-gel. De
preferencia, más del 50%, con mayor preferencia más del 80%, ó
incluso el 100% del material que contiene partículas de vidrio
magnéticas con una superficie de sílice sin modificar la cual se
emplea para unir el ácido nucleico diana a la misma, está presente
en la muestra durante la amplificación del ácido nucleico diana. Es
también evidente al experto en la técnica que, debido a las ventajas
descritas más arriba, el material que contiene partículas de vidrio
magnéticas con una superficie de sílice sin modificar, puede
añadirse directamente a una mezcla de amplificación para potenciar
la sensibilidad. Por lo tanto, la invención contempla también un
método para la amplificación de un ácido nucleico diana en una
muestra, el cual método comprende los pasos de adición de un
material que contiene partículas de vidrio magnéticas con una
superficie de sílice sin modificar, a dicha muestra, separación de
dicho material de dicha muestra, elución de dicho ácido nucleico
diana de dicho material y amplificación de dicho ácido nucleico
diana en presencia de dicho material, en donde dichas partículas de
vidrio magnéticas han sido obtenidas mediante el método de
sol-gel. Las condiciones durante la amplificación en
ambos métodos de acuerdo con la invención se escogen de tal manera
que ningún ácido nucleico diana se une al material que contiene
partículas de vidrio magnéticas con una superficie de sílice sin
modificar. Sin embargo, puede unirse un pequeño porcentaje de ácido
nucleico diana dando como resultado una unión no específica, lo
cual no puede ser totalmente excluido. Ambos métodos pueden
comprender además el paso de detección del ácido nucleico diana
amplificado. En una versión preferida de la invención, el ácido
nucleico diana es el ARN ó ADN. De preferencia las condiciones de
amplificación se escogen de tal manera que los cebadores y/o el
molde no se unan al material.
En una versión de la invención, la muestra
biológica contiene un virus o células bacterianas, así como células
aisladas de organismos multicelulares como p. ej., células humanas y
animales tales como leucocitos y compuestos químicos
inmunológicamente activos de bajo y alto peso molecular tales como
haptenos, antígenos, anticuerpos y ácidos nucleicos, plasma
sanguíneo, fluido cerebral, esputos, materia fecal, especies de
biopsia, médula ósea, enjuagues orales, suero sanguíneo, tejidos,
orina o mezclas de los mismos. En una versión preferida de la
invención, la muestra biológica es un fluido del cuerpo humano o
animal. De preferencia la muestra biológica es la sangre, plasma
sanguíneo, suero sanguíneo u orina. El plasma sanguíneo es de
preferencia plasma sanguíneo tratado con EDTA, heparina o citrato.
En una versión de la invención la muestra biológica contiene células
de bacterias, células eucarióticas, virus o mezclas de los mismos.
En una versión preferida de la invención, el virus es el virus de
la hepatitis A (HAV), virus de la hepatitis B (HBV), virus de la
hepatitis C (HCV), el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV),
el virus del papiloma humano (HPV) ó el parvovirus B19. La muestra
biológica puede también ser de un tipo empleado para el análisis del
entorno, análisis de alimentos o investigación de biología
molecular, p. ej., de cultivos de bacterias o lisados de fagos. La
muestra biológica que contiene una mezcla de compuestos biológicos
que contienen ácido nucleico no diana y un ácido nucleico diana, no
necesita ser lisado cuando la muestra biológica puede emplearse sin
pretratamiento en el método de acuerdo con la invención. Sin
embargo, de preferencia, una muestra biológica que comprende ácidos
nucleicos no diana y un ácido nucleico diana, se lisa para crear
una mezcla de compuestos biológicos que contienen ácidos nucleicos
no diana y ácido nucleico diana. Por lo tanto, los compuestos
biológicos, ácidos nucleicos no diana y el ácido nucleico diana
contenido en la muestra biológica son liberados creando con ello una
mezcla de compuestos biológicos que contiene ácidos nucleicos no
diana y el ácido nucleico diana. Los procedimientos para el lisado
de muestras biológicas son ya conocidos por el experto y pueden ser
de naturaleza química, enzimática o física. Una combinación de
estos procedimientos es también aplicable. Por ejemplo, la lisis
puede efectuarse empleando ultrasonidos, presión elevada, fuerzas
de cizallamiento, álcali, detergentes o soluciones salinas
caotrópicas o proteasas o lipasas. Para el procedimiento de lisis
para obtener ácidos nucleico, hacemos una especial referencia de
Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual
("Clonación molecular. Un manual de laboratorio"), 2ª edición,
Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, y
Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology
("Protocolos corrientes en Biología Molecular"), 1987, J. Wiley
and Sons, NY.
El método de acuerdo con la invención comprende
el paso de adición de un material que contiene partículas de vidrio
magnéticas con una superficie de sílice sin modificar, a dicha
muestra para unir dicho ácido nucleico diana a dicho material. Las
condiciones para ello son básicamente ya conocidas por el experto en
la especialidad. Estos procedimientos están descritos en detalle en
varios documentos. En Proc. Natl. Acad. USA 76,
615-691 (1979), por ejemplo, se propone un
procedimiento para la unión de ácidos nucleicos a partir de geles de
agarosa en presencia de yoduro de sodio a un vidrio "flint" de
base. La purificación del ADN del plásmido a partir de bacterias
sobre polvo de vidrio en presencia de perclorato de sodio, se
describe en Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387. En
la patente DE-A 37 34 442, se describe el
aislamiento del ADN del fago M13 monocatenario sobre filtros de
fibra de vidrio por precipitación de las partículas de fago
empleando ácido acético y lisis de las partículas de fago con
perclorato. Los ácidos nucleicos unidos a los filtros de fibra de
vidrio se lavan y a continuación se eluyen con tampón de Tris/EDTA
conteniendo metanol. Un procedimiento similar para la purificación
del ADN a partir de fagos lambda se describe en Anal. Biochem. 175
(1988) 196-201. El procedimiento consiste en la
unión selectiva de los ácidos nucleicos a superficies de vidrio en
soluciones de sal caotrópica y separación de los ácidos nucleicos
de los contaminantes tales como agarosa, proteínas o residuos
celulares. Para separar las partículas de vidrio de los
contaminantes, las partículas pueden o bien centrifugarse o bien
los fluidos son eliminados a través de filtros de fibra de vidrio.
Este es sin embargo, un paso limitante, que impide que el
procedimiento se emplee para procesar grandes cantidades de
muestras. En una versión de la invención, se emplean partículas de
vidrio magnéticas para inmovilizar los ácidos nucleicos después de
la precipitación mediante
la adición de sal y etanol, como se describe p. ej., en Anal. Biochem. 201 (1992) 166-169 y PCT GB 91/00212.
la adición de sal y etanol, como se describe p. ej., en Anal. Biochem. 201 (1992) 166-169 y PCT GB 91/00212.
El procedimiento para la unión del ácido
nucleico diana (y también de los ácidos nucleicos no diana) a
partículas de vidrio, puede describirse en detalle como sigue. De
preferencia, se realiza en presencia de sales caotrópicas con una
concentración entre 1 y 8 moles/litro, y de preferencia entre 2 y 6
moles/litro. Las sales caotrópicas pueden ser el yoduro de sodio,
perclorato de sodio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de
guanidinio ó hidrocloruro de guanidinio. Un agente caotrópico de
acuerdo con la presente invención es una substancia química
cualquiera que trastorna la estructura ordenada del agua líquida y
tiene el efecto de que el ADN ó el ARN se unen a las partículas de
vidrio magnéticas si este agente está presente en la solución que
contiene el ADN ó el ARN. Otras substancias biológicas conocidas
por el experto en la especialidad, pueden estar también presentes.
Todavía otras substancias son también posibles. El efecto de
purificación resulta del comportamiento del ADN ó del ARN para unir
al material con una superficie de vidrio bajo estas condiciones, es
decir, en presencia de ciertas concentraciones de un agente
caotrópico, altas concentraciones de disolventes orgánicos o bajo
condiciones ácidas. Para pasar la mezcla de compuestos biológicos
que contienen ácidos nucleicos no diana y el ácido nucleico diana,
se añaden perlas de vidrio con una superficie de vidrio sin
modificar, a la mezcla y se incuba durante un período de tiempo
suficiente para que tenga lugar la unión. Los expertos están
habitualmente familiarizados con la duración del paso de incubación.
Este paso puede ser optimizado mediante la determinación de la
cantidad de ácidos nucleicos inmovilizados sobre la superficie en
diferentes momentos. Los tiempos de incubación entre 10 segundos y
30 minutos pueden ser apropiados para los ácidos nucleicos. Después
de la incubación los ácidos nucleicos no diana y el ácido nucleico
diana se separan del líquido. Esto puede lograrse en general por
gravedad o en el caso conveniente de ácidos nucleicos unidos a
partículas de vidrio magnéticas, por separación del material unido
a las partículas magnéticas, aplicando un campo magnético. Por
ejemplo, las partículas magnéticas pueden ser impulsadas a la pared
del recipiente en el cual tiene lugar la incubación. El líquido que
contiene los compuestos biológicos que no estaban unidos a las
partículas magnéticas puede a continuación, eliminarse. Por lo
tanto el método de acuerdo con la invención contiene el paso de
separación de dicho material con dichos ácidos nucleicos no diana
unidos y dicho ácido nucleico diana unido, de los compuestos
biológicos no unidos.
El procedimiento de eliminación empleado depende
del tipo de recipiente en el cual se ha realizado la incubación.
Los pasos adecuados incluyen la eliminación del líquido mediante
pipeteado o aspiración. El material con el ADN ó el ARN unido puede
a continuación lavarse por lo menos una vez, de preferencia con una
mezcla de 70 partes en volumen de etanol con 30 partes en volumen
de agua ("70% de etanol") ó en una solución ácida de lavado
como se describe en la patente WO 99/40098. Se emplea una solución
de lavado que no ocasiona que los ácidos nucleicos y el ácido
nucleico diana se liberen de la superficie del material, pero que
arrastran por lavado los contaminantes indeseables lo más
completamente posible. Este paso de lavado tiene lugar de
preferencia mediante la incubación de las perlas de vidrio con la
superficie de sílice modificada con los ácidos nucleicos unidos y
el ácido nucleico diana. El material, de preferencia, se resuspende
durante este paso. La solución de lavado, contaminada, se elimina
de preferencia justo en el paso de unión descrito más arriba.
Después del paso de lavado, el material puede secarse brevemente al
vacío o puede dejarse que el fluido se evapore. Puede realizarse
también un paso de pretratamiento empleando acetona.
La invención comprende además el paso de elución
de dichos ácidos nucleicos no diana unidos y dicho ácido nucleico
diana unido a partir de dicho material y amplificando después dicho
ácido nucleico diana. Para que la elución tenga lugar, el material
que contiene las partículas de vidrio magnéticas con la superficie
de sílice sin modificar, se resuspende en una solución con ninguno o
solamente con una pequeña cantidad de agente caotrópico y/o
disolvente orgánico. Alternativamente, la suspensión puede diluirse
con una solución sin nada de, o solamente con una pequeña cantidad,
de agente caotrópico y/o disolvente orgánico. Tampones de esta
naturaleza son conocidos mediante la patente DE 3724442 y Analytical
Biochemistry ("Bioquímica analítica") 175 (1988)
196-201. Los tampones de elución con un bajo
contenido de sal son en particular, tampones con un contenido menor
de 0,2 moles/litro. En una versión especialmente preferida, el
tampón de elución contiene la substancia Tris como tamponante, en
particular una solución tamponada con Tris con un pH aproximadamente
de 7 ó mayor de 7. En otra versión especial, el tampón de elución
es agua desmineralizada. La solución que contiene el ácido nucleico
diana purificado está ahora listo para ser empleado en la reacción
de amplificación, es decir, la solución con los ácidos nucleicos no
diana y el ácido nucleico diana y el material que contiene las
partículas de vidrio magnéticas con la superficie de sílice sin
modificar, son transferidos a un nuevo tubo de reacción que
contiene todos los reactivos necesarios para la amplificación. De
otra manera, una solución que contiene todos los reactivos
necesarios para la amplificación, se añade a la suspensión del
material que contiene las partículas de vidrio magnéticas con la
superficie de sílice sin modificar y los ácidos nucleicos no diana
liberados y el ácido nucleico diana.
En otra versión, el material que contiene las
partículas de vidrio magnético con la superficie de sílice sin
modificar y los ácidos nucleicos diana unidos, pueden ponerse bajo
unas condiciones en las cuales los ácidos nucleicos diana pueden
amplificarse, como se describe más adelante. En dichas versiones,
las condiciones de amplificación pueden escogerse de manera que el
ácido nucleico diana puede liberarse a partir del material con la
superficie de sílice sin modificar para facilitar la amplificación.
De preferencia, las condiciones de amplificación se escogen de
manera que los cebadores no se unen al material con la superficie de
sílice sin modificar.
Hablando en general, para los pasos de lavado y
unión, se emplean de preferencia, líquidos, que son adecuados para
los procesos de biología molecular, en particular los procesos de
purificación del ácido desoxirribonucleico (ADN) ó ácido
ribonucleico (ARN) que emplean la unión de estas substancias con
partículas de vidrio en ciertas condiciones. Los líquidos
preferidos contienen alcoholes y/o cetonas o cualquier mezcla de los
mismos con agua. Los alcoholes incluirán de acuerdo con la
invención, de preferencia alcoholes primarios, secundarios o
terciarios de fórmula general R-OH en donde R
representa la fórmula general
-(-CH_{2})_{n}-CH_{3} con n >= 0.
Sin embargo, pueden emplearse también otros alcoholes si son
adecuados para los fines de la biología molecular como p. ej., la
glicerina. Particularmente adecuados son los alcoholes isopropanol,
etanol o mezclas de los mismos con agua, de preferencia una mezcla
de 80 partes por volumen de isopropanol con 20 partes en volumen de
agua. En otra versión de la invención el líquido contiene cetonas
como p. ej., la acetona. Además se emplean soluciones acuosas
tamponadas adecuadas. Los sistemas tampón que son adecuados para los
fines de la biología molecular pueden encontrarse p. ej., en
Sambrook et al., Molecular Cloning ("Clonación
molecular"), Cold Spring Harbor University Press (1989). Las
substancias tampón preferidas son la
tris-hidroximetilamina (TRIS), fosfato, ácido
N-(2-hidroxi-etil)piperazin-N'-(2-etansulfónico)
(HEPES), sales del mismo u otras substancias adecuadas.
Adicionalmente, pueden estar presentes substancias que modifican la
fuerza iónica de las soluciones como p. ej., NaCl, KCl ó CaCl_{2}
ó los agentes complexantes de un catión metálico como p. ej., el
ácido etilen-diamina-tetraacético
(EDTA) ó las sales del mismo.
El método de acuerdo con la presente invención
es adecuado para la purificación de los ácidos nucleicos, es decir,
ARN ó ADN, a partir de las mezclas complejas con otros compuestos
biológicos que los contienen. Con ello, pueden purificarse también
mezclas de diferentes ácidos nucleicos, incluso mezclas que
contienen un ácido nucleico diana poco abundante. En una versión de
la invención se purifican mezclas de ácidos nucleicos específicos,
en las cuales el(los)
ácido(s) nucleico(s) diana pueden ser un componente poco importante en términos de concentración (o pueden estar presentes en poca cantidad).
ácido(s) nucleico(s) diana pueden ser un componente poco importante en términos de concentración (o pueden estar presentes en poca cantidad).
En una versión preferida de la invención, el
ácido nucleico diana se amplifica con la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). El método de amplificación puede ser también la
reacción en cadena de la ligasa (LCR, Wu y Wallace, Genomics 4
(1989)560-569 y Barany, Proc. Natl. Acad. Sci
USA 88 (1991)189-193); reacción en cadena de
la polimerasa ligasa (Barany, Methods PCR and Applic. 1
(1991)5-16); Gap-LCR
(publicación de la patente PCT nº WO 90/01069; Repair Chain
Reaction ("reacción en cadena de reparación") (publicación de
la patente europea nº EP 439.182 A2), 3SR (Kwoh et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86
(1989)1173-1177; Guatelli et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87
(1990)1874-1878; publicación de la patente
PCT nº WO 92/0880A), y NASBA (U.S. patente nº US 5.130.238).
Además, existe la amplificación por desplazamiento de la cadena
(SDA), amplificación mediada por la transcripción (TMA), y la
amplificación Q\beta (para una revisión, véase p. ej., Whelen y
Persing, Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373;
Abramson y Myers, Current Opinion in Biotechnology ("Opinión
corriente en Biotecnología"), 4
(1993)41-47).
En una versión preferida, el método puede
comprender además el paso de detección del ácido nucleico diana
amplificado. El ácido nucleico diana amplificado puede ser
determinado o detectado mediante métodos analíticos estándar ya
conocidos por el experto en la técnica y descritos p. ej., en
Sambrook et al., Molecular Cloning ("Clonación
molecular"), Cold Spring Harbor University Press (1989),
Lottspeich y Zorbas (eds.), "Bioanalytik"
("Bioanalítica") (1ª edición 1998), editorial Spektrum
Akademischer, Heidelberg, Berlin, Alemania, o en Ausubel et
al., Current Protocols in Molecular Biology ("Protocolos
corrientes en Biología Molecular") (1987), J. Wiley and Sons,
NY, USA. Pueden haber también más pasos de purificación antes de que
el ácido nucleico diana sea detectado p. ej., un paso de
precipitación. Los métodos de detección pueden incluir, pero no
están limitados a la unión o intercalado de colorantes específicos
como el bromuro de etidio que se intercala en el ADN de doble
cadena y cambia su fluorescencia después. Los ácidos nucleicos
purificados pueden también separarse mediante métodos
electroforéticos opcionalmente después de una digestión con enzimas
de restricción y visualizadas después. Hay también ensayos basados
en sondas que aprovechan la hibridación de oligonucleótidos con
secuencias específicas y subsiguiente detección del híbrido.
También es posible secuenciar el ácido nucleico diana después de
más pasos conocidos por el experto en la especialidad. Otros métodos
aplican una diversidad de secuencias de ácido nucleico a un chip de
silicio al cual están unidas sondas específicas, y suministran una
señal cuando se unen a secuencias complementarias.
En una versión particularmente preferida de la
invención, el ácido nucleico diana se detecta midiendo la intensidad
de la luz fluorescente durante la amplificación.
Este método comprende la monotorización de la
fluorescencia a tiempo real. Un método particularmente preferido
que aprovecha simultáneamente la amplificación y detección midiendo
la intensidad de la luz fluorescente, es el método TaqMan® descrito
en la patente WO92/02638 y las correspondientes patentes US
5.210.015, US 5.804.375, US 5.487.972. Este método aprovecha la
actividad exonucleasa de una polimerasa para generar una señal. En
detalle, el ácido nucleico diana es detectado mediante un
procedimiento que comprende la puesta en contacto de la muestra con
un oligonucleótido que contiene una secuencia complementaria a una
región del ácido nucleico diana y un oligonucleótido marcado que
contiene una secuencia complementaria a una segunda región de la
misma cadena de ácido nucleico diana, pero sin incluir la secuencia
de ácido nucleico definida por el primer oligonucleótido, para
crear una mezcla duplex durante las condiciones de hibridación, en
donde los duplex comprenden el ácido nucleico diana reasociado al
primer oligonucleótido y al oligonucleótido marcado de tal manera
que el extremo 3' del primer oligonucleótido es adyacente al
extremo 5' del oligonucleótido marcado. A continuación, se trata
esta mezcla con un ácido nucleico polimerasa dependiente del molde,
que tiene una actividad nucleasa 5' a 3' en condiciones suficientes
para permitir la actividad nucleasa 5' a 3' de la polimerasa para
escindir el oligonucleótido reasociado, marcado, y liberar los
fragmentos marcados. La señal generada por la hidrólisis del
oligonucleótido marcado es detectada y/o medida. La tecnología
Taq/Man® elimina la necesidad de formar un complejo de reacción
unido a una fase sólida, y lo haga detectable. En términos más
generales, la amplificación y/o reacción de detección del método de
acuerdo con la invención es un ensayo homo-
géneo solución-fase. Otro método preferido consiste en el formato Lightcycler^{TM} (ver p. ej., la patente US 6.174.670).
géneo solución-fase. Otro método preferido consiste en el formato Lightcycler^{TM} (ver p. ej., la patente US 6.174.670).
En una versión preferida de la presente
invención, el método está automatizado, es decir, el método efectúa
un proceso automatizado como p. ej., se describe en la patente WO
99/16781. Un proceso automatizado significa que los pasos del
proceso son adecuados para ser efectuados con un aparato o máquina
capaces de operar con poco control o ningún control o influencia
externa por un ser humano. Un método automatizado significa que los
pasos del método automatizado son efectuados con un aparato o
máquina capaces de operar con poco o ningún control o influencia
externa por un ser humano. Solamente los pasos de preparación para
el método pueden tener que hacerse a mano, p. ej., los recipientes
de almacenamiento tienen que llenarse y colocarse en su lugar, la
elección de las muestras tiene que ser hecha por un ser humano y
otros pasos conocidos por el experto en la especialidad, p. ej., la
operación con el ordenador de control. El aparato o la máquina puede
p. ej., añadir automáticamente líquidos, mezclar las muestras o
efectuar los pasos de incubación a temperatura específicas.
Típicamente, esta máquina o aparato es un robot controlado por un
ordenador que efectúa un programa en el cual están especificados
los pasos individuales y comandos. En una versión preferida de la
invención, el método es un formato de alto rendimiento, es decir,
los métodos automatizados se efectúan en un formato de alto
rendimiento lo cual significa que los métodos y la máquina o
aparato empleados están optimizados para operar una alta cantidad de
muestras en un tiempo corto.
Las partículas de vidrio magnéticas son una
dispersión sólida de pequeños núcleos magnéticos de vidrio, es
decir, son gotitas de vidrio en las cuales están dispersados una muy
pequeña cantidad de cuerpos. Estos cuerpos que reciben el nombre de
magnéticos, son atraídos por un imán, es decir, materiales ferri o
ferromagnéticos o superparamagnéticos, por ejemplo. Las substancias
paramagnéticas no son útiles puesto que son atraídas solamente por
un imán muy débil, lo cual no es suficiente para un método de
acuerdo con esta invención. Se prefieren los materiales ferri o
ferromagnéticos, en particular si todavía no han sido
premagnetizados. La premagnetización en este contexto significa la
puesta en contacto con un imán, el cual aumenta la remanencia. Los
materiales magnéticos preferidos son el hierro o el óxido de hierro
como p. ej., la magnetita (Fe_{3}O_{4}) ó el Fe_{2}O_{3},
de preferencia el \gamma-Fe_{2}O_{3}. En
principio, puede emplearse el bario ferrita, níquel, cobalto,
aleaciones
Al-Ni-Fe-Co, u otro
material ferri o ferromagnético. Particularmente preferidas de
acuerdo con la presente invención, son las partículas de vidrio
magnéticas descritas en las patentes WO96/41811 ó WO 00/32762.
En una muy preferida versión de la invención,
las partículas de vidrio magnéticas con una superficie de vidrio
sin modificar tienen un bajo lixiviado de hierro, lo cual es
esencial para el método de acuerdo con la invención cuando se
emplean partículas de vidrio magnéticas, dado que el hierro es un
inhibidor de la subsiguiente reacción de amplificación, es decir,
el hierro es un inhibidor enzimático. Por lo tanto, esto es una
importante característica de las partículas de vidrio magnéticas
con una superficie de vidrio sin modificar.
En la versión más preferida de la invención, las
partículas de vidrio magnéticas con una superficie sin modificar,
son las descritas en la solicitud de patente europea EP 1 232 502
(WO 01/32791) las cuales están también públicamente disponibles en
el kit MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (Roche, Mannheim,
Alemania). Estas partículas sedimentan lentamente y pueden por lo
tanto emplearse ventajosamente en un método automatizado de acuerdo
con la invención. La obtención de las mismas se resume a
continuación.
Las partículas de vidrio magnéticas son
substancialmente esféricas y tienen un diámetro pequeño y contienen
por lo menos un cuerpo magnético con un diámetro entre 5 y 500 nm.
Esto tiene consecuencias sorprendentes en la cinética de la
sedimentación, cuantificada por los valores del tiempo mitad,
t_{1/2} el cual es el tiempo que transcurre hasta que el 50% de
las partículas se han sedimentado a partir de un elemento de volumen
específico. El período de semi-vida para la
sedimentación de una suspensión de 3 mg/ml
peso-por-volumen de MGPs con una
superficie de vidrio sin modificar de acuerdo con la invención, en
isopropanol, es mayor de 3 minutos, de preferencia 4 minutos, con
mayor preferencia 6 minutos. Sin embargo, los valores más preferidos
para el período de semi-vida son mayores de 10
minutos o incluso mayores de 20 minutos. Los cuerpos magnéticos de
las MGPs más preferidas pueden ser p. ej., un pigmento magnético.
El tamaño de los cuerpos magnéticos es del orden de los nanometros,
es decir, entre 5 y 500 nm, de preferencia entre 10 y 200 nm y con
mayor preferencia, entre 15 y 50 nm. Son pigmentos magnéticos
adecuados los fabricados por la compañía CERAC, los cuales tienen
un diámetro medio de 23 nm y consisten en
\gamma-Fe_{2}O_{3} (superficie BET de 50
m^{2}/g, CERAC: P.O. Box 1178, Milwaukee, Wisconsin
53201-1178 USA; Artículos nº
I-2012). Las partículas de vidrio magnéticas más
preferidas de acuerdo con la presente invención, se caracterizan
además por el hecho de que las MGPs tienen un diámetro de partícula
entre 5 \mum y 5 \mum, de preferencia entre 1 \mum y 2 \mum,
determinado mediante microscopía electrónica de scanning, mientras
que los cuerpos magnéticos tienen un diámetro entre 5 y 500 nm, con
más preferencia entre 10 y 200, con la mayor preferencia en el
margen de 15 a 50 nm como se ha descrito más arriba. Por lo tanto,
las MGPs se caracterizan además, por un ratio del diámetro del
núcleo del pigmento magnético a la partícula de vidrio magnética,
inferior a de 1 a 10, determinado por microscopía electrónica de
scanning de alta resolución.
Las MGPs más preferidas son microporosas pero
tienen una superficie altamente estructurada y por lo tanto una
superficie relativamente grande con más de 6 m^{2}/g. De
preferencia, las partículas de vidrio magnéticas tienen un área de
superficie en el margen de 5 a 100 m^{2}/g, de preferencia de 5 a
90 m^{2}/g, con más preferencia en el margen de 10 a 50
m^{2}/g, y con la mayor preferencia en el margen de 15 a 30
m^{2}/g. Esto puede determinarse por el método
Braunauer-Emett-Teller empleando un
aparato automatizado comercial. Para una descripción de este método
corrientemente llamado método BET, véase S. Braunauer, The
Adsorption of Gases and Vapors ("Adsorción de gases y
vapores"), Princeton University Press 1 1943).
Las partículas de vidrio magnéticas empleadas en
la presente invención pueden suministrarse en diferentes
formulaciones, esencialmente como se ha descrito en la publicación
de la patente europea EP 1154443. Es posible proporcionar las
mismas en forma de comprimido, como un polvo, o de preferencia como
una suspensión. En una versión preferida de la invención estas
suspensiones contienen entre 5 y 60 mg/ml de partículas de vidrio
magnéticas (MGPs). En otra versión de la invención, el material que
contiene la sílice se suspende en soluciones acuosas tamponadas que
opcionalmente pueden contener un agente caotrópico en una
concentración entre 2 y 8 moles/litro, y de preferencia entre 4 y 6
moles/litro. Sales caotrópicas son el yoduro de sodio, perclorato
de sodio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio o
hidrocloruro de guanidinio. Un agente caotrópico de acuerdo con la
presente invención es cualquier substancia química que trastorne la
estructura ordenada del agua líquida y tendrá el efecto de que el
ADN ó el ARN se unirán a las MGPs de acuerdo con la presente
invención si este agente está presente en la solución que contiene
el ADN ó ARN. Otros compuestos conocidos por el experto en la
especialidad son también posibles.
En una versión de la invención, las partículas
de vidrio magnético con una superficie de vidrio sin modificar, se
obtienen mediante el método de sol-gel descrito en
las patentes EP 1154443 y WO 96/41811, en particular en donde el
método de sol-gel comprende los pasos de:
- (a)
- suspensión de los cuerpos magnéticos en un sol
- (b)
- hidrólisis del sol para recubrir los cuerpos magnéticos con un gel
- (c)
- secado por pulverización de los cuerpos magnéticos recubiertos con un gel en un secador por pulverización de dos toberas, y
- (d)
- sinterizado del polvo secado por pulverización para formar un vidrio a partir del gel por recubrimiento de los cuerpos magnéticos.
Las MPGs más preferidas de acuerdo con la
invención se obtienen de acuerdo con la solicitud de patente
internacional EP 1154443 la cual figura también en el MagNA Pure LC
ADN Isolation Kit I (Roche, Mannheim, Alemania). Se obtienen
también mediante el método de sol-gel como se
describe en la solicitud de patente internacional (EP 1154443)
empleando cuerpos metálicos o pigmentos con un diámetro de
aproximadamente 23 nm (fabricados por CERAC a base de
\gamma-Fe_{2}O_{3}; CERAC: P.O. Box 1178,
Milwaukee, Wisconsin 53201-1178 USA; artículo nº
I-2012). Después de recubrir los cuerpos magnéticos
con un gel, se genera un polvo pulverizando la dispersión a través
de dos toberas fluidas. Sistemas de secado por pulverización
adecuados están fabricados por Nubilosa Molekularzerstäubung,
Ladisch GmbH & Co. KG, Constanza, Alemania, p. ej., el
"LaborZerstäubungstrockner" (Typ LTK)'' ("secadero por
pulverización, de laboratorio (tipo LTK)") ó por Büchi AG,
Uster, Suiza p. ej., el Mini Spray Dryer (type
B-191) ("minisecadero de pulverización (tipo
B-191)"). Debido a que los ratios de los
diámetros de los núcleos magnéticos a la cápsula de vidrio son
menores que de 1 a 10, de preferencia entre 1:10 y 1:1000, la
geometría y el número de núcleos magnéticos incorporados o de sus
soportes inertes, no determinan la forma y tamaño de las partículas
pero sí las condiciones de fabricación, en particular las
condiciones durante el secado por pulverización. En otras palabras,
la elección de la presión, temperatura de entrada, temperatura de
salida y velocidad de flujo durante el procedimiento de secado por
pulverización son los grados de libertad que determinan la
distribución de tamaño, la forma de las gotas de vidrio y con ello
se modificarán las MGPs. Por lo tanto, las toberas del sistema de
secado por pulverización, se calientan. La temperatura de entrada
está entre 120ºC y 500ºC, de preferencia entre 170ºC y 230ºC ó
150ºC y 230ºC, con la mayor preferencia entre 150ºC y 200ºC ó 190ºc
y 210º ó a 200ºC ó ligeramente menor. La temperatura de salida
depende del punto de ebullición del sol y por lo tanto, del
disolvente, y puede ser superior, igual o ligeramente inferior, es
decir, menor de 10ºC el punto de ebullición del disolvente. Cuando
se emplea el etanol como disolvente, está entre 50ºC y 300ºC, de
preferencia 70ºC y 150ºC, con la mayor preferencia entre 80ºC y
110ºC. La temperatura óptima está entre 90ºC y 100ºC. La presión en
la tobera es mayor de 3 bars, de preferencia se regula de 4 a 6
bars. El experto apreciará el hecho de que los parámetros exactos
dependerán del sistema de secado por pulverización empleado. Sin
embargo, puede transferir las especificaciones de la presente
invención a cualquier otro sistema de secado por pulverización, y
deducir los parámetros tomando en consideración los descubrimientos
de esta invención. Fórmulas como se describen en las obras maestras:
Spray Drying Handbook ("Tratado de Secado por Pulverización"),
quinta edición, John Wiley & Sons (1991) Nueva York, pueden
conducirle a descubrir cuáles son los parámetros a elegir para otro
ajuste. De preferencia, consultará los manuales de este sistema de
secado por pulverización o contactará con el servicio técnico del
fabricante del sistema del secador por pulverización.
Para optimizar el rendimiento, la temperatura de
densificación o sinterización debe ser lo más alta posible, es
decir, ligeramente inferior al margen de fusión. Las temperaturas
exactas dependen de la composición del vidrio pero pueden estar
entre 400ºC a 1200ºC. En el caso de la composición de vidrio EJ
descrita en la patente EP1154443 la temperatura de sinterización es
entre 720ºC y 770ºC, de preferencia aproximadamente 750ºC. En la
habilidad del experto reside el encontrar las temperaturas para cada
composición de vidrio teniendo en cuenta las enseñanzas de la
presente invención. A continuación, el polvo se calienta durante 1
hora a 200ºC, opcionalmente se enfría a temperatura ambiente y se
calienta a 750ºC (temperatura de densificación o sinterización) en
una atmósfera de nitrógeno con una velocidad de calentamiento de 1
K/minuto, y se mantiene esta temperatura durante 1 hora. A
continuaciones se enfría el horno a 150ºC y se calienta de nuevo a
200ºC durante una hora al aire. Después de enfriar a temperatura
ambiente el polvo se transfiere a un tamiz (50 \mum) y se tamiza
durante 30 minutos. La muestra tamizada se envasa en frascos y se
esteriliza a 200ºC durante 4 horas y a continuación se enfría a
80ºC. A continuación los recipientes de vidrio se retiran del horno,
se recubren con una lámina estéril y se cierran.
De preferencia, el método de acuerdo con la
invención se emplea en diagnósticos, para análisis de diagnósticos
o para bioanalítica, o para el screening de fluidos procedentes del
cuerpo humano o incluso animal para detectar la presencia de un
ácido nucleico diana, es decir, por ejemplo un ácido nucleico de un
virus.
Además, el método de acuerdo con la invención,
se emplea para potenciar la velocidad, exactitud o sensibilidad de
la detección de un ácido nucleico diana.
Los siguientes ejemplos, referencias y figuras
se proporcionan para ayudar a comprender la presente invención,
cuya verdadera finalidad se especifica en las reivindicaciones del
apéndice. Se entiende que pueden hacerse modificaciones en los
procedimientos especificados sin apartarse del espíritu de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo describe experimentos efectuados para
medir el efecto de las partículas de vidrio magnéticas (MGP) sobre
la eficiencia de la amplificación. Las amplificaciones se efectuaron
empleando un protocolo de PCR Taqman®, como se describe más
adelante.
En un ensayo TaqMan, las sondas de detección
marcadas que hibridan dentro de la región amplificada se añaden a
la mezcla de reacción de amplificación. Las sondas se modifican de
preferencia, para evitar que las sondas actúen como cebadores para
la síntesis del ADN. La amplificación se efectúa empleando una ADN
polimerasa que posee actividad 5' a 3' exonucleasa, p. ej., ZO5 ADN
polimerasa. Durante cada paso de síntesis de la amplificación
cualquier sonda que hibrida con el ácido nucleico diana corriente
abajo extendida a partir del cebador es degradada por la actividad
5' a 3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Así, la síntesis de una
nueva cadena diana produce también como resultado la degradación de
una sonda, y la acumulación del producto de degradación proporciona
una medida de la síntesis de las secuencias diana.
El aumento de productos de amplificación durante
una reacción TaqMan® puede ser monitorizada empleando sondas
fluorescentes. Las sondas de detección están marcadas con dos
colorantes fluorescentes, uno de los cuales es capaz de extinguir
la fluorescencia del otro colorante, de manera que las sondas son
autoextinguibles cuando están próximas entre sí, es decir, cuando
están unidos a la misma sonda o al ácido nucleico. Los colorantes
están unidos a la sonda, de preferencia uno unido al terminal 5' y
el otro unido al sitio interno, de manera que la escisión de la
sonda mediante la actividad exonucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa
tiene lugar entre los dos colorantes.
\newpage
La amplificación da como resultado la escisión
de la sonda y la separación de los colorantes, con la concomitante
eliminación de la extinción y aumento de la fluorescencia
observable. Así, la acumulación del producto de degradación, la
cual constituye una medida del aumento del producto de
amplificación, se monitoriza midiendo el aumento de la reacción
fluorescente.
En los experimentos descritos en este ejemplo,
cada sonda se sintetizó para contener un colorante polimetinacianina
y una marca 6-carboxifluoresceína. Las sondas
resultantes son autoextinguibles cuando están próximas unas de
otras. Para evitar la extensión de la sonda mediante la ADN
polimerasa durante la amplificación, la sonda se sintetizó con un
bloque de 3' fosfato. La acumulación del producto amplificado se
midió en cada ciclo durante la reacción midiendo el aumento de la
fluorescencia de la reacción. Durante cada ciclo de amplificación,
las sondas fueron excitadas con luz de una longitud de onda cercana
al máximo de excitación del fluoróforo y la emisión del fluoróforo
se midió en la proximidad de su máximo de emisión.
Las mediciones de la fluorescencia se
normalizaron dividiendo por la medición inicial de la fluorescencia,
es decir, la fluorescencia de fondo, obtenida durante un ciclo
temprano de la reacción, mientras las mediciones de la
fluorescencia entre ciclos parecen ser relativamente constantes. El
número de ciclos escogido para la medición de la fluorescencia
inicial fue el mismo para todas las reacciones comparadas, de forma
que todas las mediciones representan aumentos relativos al mismo
ciclo de reacción.
En los ciclos tempranos de una amplificación de
la reacción en cadena de la polimerasa, el número de moléculas diana
puede describirse mediante la siguiente ecuación geométrica
N_{i} =
N_{o} x (1 +
E)^{i}
en donde N_{i} = número de
moléculas diana al finalizar el ciclo i avo, N_{o} = número de
moléculas diana al comienzo de la reacción, y E = eficiencia de la
amplificación (0 =< E =< 1). Durante esta fase de crecimiento
geométrico de la amplificación, el número de ciclos necesarios para
alcanzar un valor umbral particular (C_{T}) es inversamente
proporcional al logaritmo de (1 + E). Así, el valor C_{T}
representa una medida de la eficiencia de la reacción que permite
efectuar comparaciones entre las reacciones. Una disminución del
valor C_{T} el cual significa que la reacción alcanzó el valor
umbral en pocos ciclos, indica un aumento de la sensibilidad
global.
Como el aumento del producto de amplificación se
monitoriza midiendo el aumento de la fluorescencia de la reacción,
el C_{T} se define en la presente como el número de ciclos de
amplificación efectuados hasta que la fluorescencia excede un nivel
de fluorescencia arbitrario (AFL). El AFL se escogió próximo al
nivel de fluorescencia de la línea base, pero superior al margen de
fluctuaciones al azar en la fluorescencia medida, de forma que se
midió la cinética de la reacción durante la fase de crecimiento
geométrico de la amplificación. La acumulación del producto
amplificado en los últimos ciclos inhibe la reacción y conduce
eventualmente a una región plana de la reacción.
Se escogió un AFL de 1,5 para todas las
reacciones. Debido a que la amplificación PCR consiste en ciclos
discretos y las mediciones de la fluorescencia se efectúan una vez
por ciclo, la fluorescencia medida aumenta típicamente desde debajo
del AFL hasta por encima del AFL en un ciclo individual. Para
aumentar la precisión de las mediciones, se calculó un número
"exacto" de ciclos para alcanzar el umbral del AFL, que recibe
aquí el nombre de valor C_{T}, por interpolación de las
mediciones de la fluorescencia entre ciclos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones se efectuaron empleando los
componentes de la reacción que se detallan más adelante. Cada ensayo
se realizó en un ensayo umbral.
- Ensayo 1:
- 25,75 \mul de componente R1 de Mastermix
- \quad
- 24,25 \mul de componente R2 de Mastermix
- \quad
- 50 \mul de material estándar HCV (diluido en solución poli A)
- Ensayo 2:
- 25,75 \mul de componente A de MasterMix
- \quad
- 24,25 \mul de componente B de MasterMix
- \quad
- 50 \mul de material estándar HCV (diluido en solución poli A)
- \quad
- 6 mg de partículas de vidrio magnéticas (MGP "Cerac", como se han descrito más arriba).
\newpage
Formulación de los componentes
de Mastermix, R1 y
R2
Las secuencias de los cebadores ST280A y ST778AA
están descritas en la patente U.S. nº 5.837.442. El nucleótido
terminal 3' de cada cebador se modificó mediante la unión covalente
de un grupo p-terc-butilbencilo al
nucleótido terminal 3', como se describe en la solicitud de patente
europea nº 866.071 y patente U.S. nº 6.001.611.
Las secuencias de la sonda específica del HCV y
las sondas de control (IC)-específicas están
descritas más adelante en la orientación 5' a 3'. Las sondas
específicas del HCV se sintetizaron para contener un fluoróforo Cy5
unido al término 5' a través del fosfato terminal empleando una
fosforamidita comercialmente disponible (Pharmacia, Piscataway,
NJ). Se incorporó una marca 6-carboxifluoresceína
(FAM) en una posición interna entre los nucleótidos 14 y 15
empleando un engarce marcado, comercialmente adquirible, como p.
ej., una fosforamidita de BioGenex (San Ramon, CA). Las sondas
resultantes son autoextinguibles cuando están en un estado no
hibridado. Para evitar la extensión de la sonda mediante la ADN
polimerasa durante la amplificación, la sonda se sintetizó con un
bloque fosfato 3' empleando una fosforamidita comercialmente
adquirible en Glenn Research (Sterling, VA).
Sonda ST650p2 para HCV: (SEQ ID NO: 1)
(Cy5-) CGG TGT ACT CAC CG(FAM) TTC CGC
AGA CCA CTA TG
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda ST2535Cy5F15 para IC: (SEQ ID NO: 2)
(Cy5-) TGG ACT CAG TCC T(HEX)T GGT
CAT CTC ACC TTC T
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes oligonucleótidos se incluyeron en
la mezcla de reacción R2 para inhibir la actividad ADN polimerasa a
bajas temperaturas.
NTQ21-46A (SEQ ID NO: 3)
CGA TCA TCT CAG AAC ATT CTT AGC GTT TTG TTC TTG
TGT ATG ATC G
\vskip1.000000\baselineskip
El material estándar para HCV consistió en
moldes del ARN de HCV, sintetizados empleando un vector de
transcripción del ARN de HCV, como se ha descrito esencialmente en
Young et al., 1993, J, Clin. Microbiol.
31(4):882-886. Los moldes del ARN de HCV se
diluyeron en solución poli A (20 \mug/ml de Poli rA, 10 mM de
Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM de EDTA, 0,05% de azida de
sodio, agua tratada con DEPC, filtrada estéril), a una concentración
de 200 copias por 50 \mul.
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación se efectuó empleando el
siguiente perfil de temperaturas:
- Pre-reacción de incubación
- 45ºC, 10 minutos
- Desnaturalización inicial
- 94ºC, 30 segundos
- Transcripción inversa
- 58ºC, 30 minutos
- 5 ciclos
- 95ºC, 20 segundos;
- \quad
- 59ºC, 50 segundos
- 55 ciclos
- 91ºC, 15 segundos,
- \quad
- 52ºC, 50 segundos
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de las reacciones están
representados en las figuras 1 y 2. Los valores C_{T} están
indicados para cada reacción. Comparando los valores C_{T}, es
aparente que las reacciones efectuadas en presencia de partículas
de vidrio magnéticas alcanzaron el valor umbral más pronto que las
reacciones comparables efectuadas sin las partículas de vidrio
magnéticas en la reacción. Estos resultados demuestran el
sorprendente aumento en la eficiencia de la reacción obtenida
efectuando la amplificación en presencia de las partículas de vidrio
magnéticas.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda específica de HCV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggtgtactc accgttccgc agaccactat g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sondas específicas de control
interno
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggactcagt ccttggtcat ctcaccttct
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inhibidor de la actividad ADN
polimerasa a bajas temperaturas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatcatctc agaacattct tagcgttttg ttcttgtgta tgatcg
\hfill46
Claims (12)
1. Un método para la purificación y
amplificación de un ácido nucleico diana a partir de una muestra
biológica que contiene dicho ácido nucleico diana, el cual método
comprende los pasos de:
- a)
- adición de un material que contiene partículas de vidrio magnéticas con una superficie de sílice sin modificar, a dicha muestra para unir dicho ácido nucleico diana a dicho material,
- b)
- separación de dicho material de dicha muestra,
- c)
- elución de dicho ácido nucleico diana de dicho material, y
- d)
- amplificación de dicho ácido nucleico diana en presencia de dicho material, en donde dichas partículas de vidrio magnéticas se obtienen por el método de sol-gel.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método para la amplificación de un ácido
nucleico diana en una muestra, el cual método comprende los pasos
de:
- a)
- adición de un material que contiene partículas de vidrio magnéticas con una superficie de sílice sin modificar, a dicha muestra,
- b)
- separación de dicho material de dicha muestra,
- c)
- elución de dicho ácido nucleico diana a partir de dicho material, y
- d)
- amplificación de dicho ácido nucleico diana en presencia de dicho material,
en donde dichas partículas de vidrio magnéticas
se obtienen por el método de sol-gel.
\vskip1.000000\baselineskip
3. El método de la reivindicación 1, en donde
dicho ácido nucleico diana es ARN ó ADN.
4. El método de la reivindicación 1, en donde
dicho paso de amplificación se efectúa empleando una reacción en
cadena de la polimerasa.
5. El método de la reivindicación 1, en donde
dicho material que tiene una superficie de sílice sin modificar,
está presente mientras se efectúa la amplificación del ácido
nucleico diana y mientras se efectúa la detección del ácido nucleico
diana.
6. El método de la reivindicación 5, en donde
dicho ácido nucleico diana amplificado es detectado durante dicha
amplificación.
7. El método de la reivindicación 1, en donde
dicho método de sol-gel comprende los pasos de:
- a)
- suspensión de cuerpos magnéticos en un sol,
- b)
- hidrólisis del sol para recubrir los cuerpos magnéticos con un gel,
- c)
- secado por pulverización de los cuerpos magnéticos recubiertos con un gel en un secador de pulverización de dos toberas, y
- d)
- sinterización del polvo secado por pulverización para formar un vidrio a partir del gel que recubre los cuerpos magnéticos.
\vskip1.000000\baselineskip
8. El método de la reivindicación 7, en donde la
temperatura de entrada del secador de pulverización de dos toberas,
es entre 120ºC y 500ºC, la temperatura de salida se escoge de
acuerdo con el punto de ebullición del sol, y la presión de
pulverización está entre 4 y 6 bars.
9. El método de la reivindicación 8, en donde el
período de semi-vida para la sedimentación de una
suspensión de 3 mg/litro
peso-por-volumen de las partículas
de vidrio magnéticas en isopropanol, es mayor de 6 minutos.
10. El método de la reivindicación 8, en donde
las partículas de vidrio magnéticas tienen un diámetro medio entre
0,5 \mum y 5 \mum.
\newpage
11. El método de la reivindicación 8, en donde
las partículas de vidrio magnéticas con una superficie de vidrio sin
modificar contienen un cuerpo magnético con un diámetro entre 5 y
500 nm.
12. El método de la reivindicación 8, en donde
las partículas de vidrio magnéticas con una superficie de vidrio sin
modificar contienen un cuerpo magnético con un diámetro medio de 23
nm.
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