CN1876820A - 一种适用于大规模生产质粒dna的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种适用于大规模生产质粒DNA的纯化工艺，属于生物制药领域。通过对碱裂解后的产品进行超滤、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析、除菌过滤、无菌浓缩最终得到符合药用浓度的质粒DNA。本发明纯化的质粒DNA总回收率可达到50％以上，其产品各项检定项目均符合国家标准。

Description

一种适用于大规模生产质粒DNA的纯化方法
技术领域：
本发明涉及DNA疫苗、基因治疗、DNA检定等技术，尤其是大规模生产符合国家标准的药用级质粒DNA产品，属于生物制药领域。
背景技术：
20世纪90年代开始质粒DNA作为基因治疗和基因免疫主体得到越来越广泛的关注，科研人员发现在给小鼠注射质粒DNA后，小鼠可以产生免疫应答能力，随之科研人员开展了基因治疗和基因疫苗的研究，开发了病毒载体和非病毒载体(质粒DNA)，他们均可以将外源基因有效的转化至靶细胞从而可以产生治疗作用和免疫保护作用。但病毒载体安全性方面存在问题，已经通过临床实验证实这一点，因此它的应用受到限制。然而非病毒载体(质粒DNA)不存在安全方面的问题，可以作为基因治疗和DNA疫苗的优良载体。白1995年以后，质粒载体系统的研究每年以指数形式增加，大部分都用于基因治疗和DNA疫苗，如癌症、心血管疾病、艾滋病疫苗和乙肝疫苗等。质粒DNA转化至靶细胞后，能够影响靶细胞的生理状态，会表达一些异源蛋白质。质粒DNA携带病原基因表达的蛋白会引起机体体液免疫和细胞免疫，使机体产生对抗此种病原的保护作用。从原理上讲，此种免疫保护作用要强于传统的蛋白质疫苗或菌苗，因为质粒DNA注射后，转化至靶细胞后，会持续表达目的蛋白，因而从理论上讲注射一次DNA疫苗就可以达到终生免疫保护作用。然而质粒DNA载体与病毒载体相比，质粒载体转染效率比较低，据推测仅有干分之一的质粒DNA会转染至靶细胞，进入细胞核而表达相应的蛋白，因此注射用质粒DNA必须达到毫克级才能满足需求。
由于需要大量药用级质粒DNA，所以建立一套符合GMP的质粒DNA生产工艺是基因治疗和基因免疫的保证。但目前小规模纯化质粒DNA只是实验室中一项常规技术，最常用的方法就是碱裂解法，通过氢氧化钠和SDS作用将质粒DNA从细胞溶质中释放出来，随后通过酚氯仿抽提、乙醇沉淀得到质粒DNA或通过氯化铯梯度超速离心的方法得到质粒DNA，这些方法涉及到有机溶剂(例如酚氯仿)、有毒试剂(氯化铯)、外源性的酶(例如Rnase)及沉淀步骤(例如乙醇沉淀)，无法建立符合药用级质粒DNA生产工艺，也不符合质粒DNA的药用质量标准。所以这些实验室常规方法只能得到适合于科学实验少量样品制备，而不能作为工业化生产质粒DNA的方法。
发明内容：
本发明提供一种适用于大规模生产质粒DNA的纯化方法，以解决目前的实验室常规方法不适合工业化生产质粒DNA的时存在的纯化问题。本发明采取的技术方案是：
包括以下步骤：
、在含有5-20kb质粒DNA的裂解液中，加入氯化钙或硫酸铵溶液，使终浓度为0.2-2M/L盐析沉淀，过孔径1.0um滤膜得到澄清的裂解液；
二、使含有质粒DNA的裂解液经过超滤装置而过滤，截留分子量100-750KD之间，除去大部分RNA，并通过合适的透滤液进行透滤；
三、将超滤获得的浓缩裂解液上样到离子交换层析介质柱子后，经过浓度为0.1-0.5M的氯化钠洗脱液洗去杂质，用浓度为0.5-1M的氯化钠洗脱液洗脱后，得到含有质粒DNA的洗脱液；
四、将步骤三中得到的含有质粒DNA的洗脱液，用硫酸铵调节电导率为100-300ms/cm，上样到预先平衡好的疏水层析介质柱子后收集流穿峰；
五、将疏水流穿峰样品上样到分子筛层析介质柱子，收集第一个峰；
六、将步骤五得到的分子筛样品，经过过滤器和超滤器联动装置使样品在无菌的条件下更换合适的缓冲液及使质粒DNA浓度浓缩到符合药用标准。
本发明一个实施方式中：步骤二中的超滤装置包括中空纤维超滤器或膜包式超滤器。
本发明一个实施方式中：步骤二中的超滤装置所采用的超滤膜的截留分子量在100-750KD之间。
本发明一个实施方式中：步骤三中的平衡离子交换层析缓冲液为醋酸钾，浓度为0.1M-1M/L；其中EDTA的浓度为10-100mM，pH值为5.0-6.5，用于洗脱杂质的浓度为0.1-0.5M/L的氯化钠洗脱液和浓度为0.5-1M/L的氯化钠洗脱液的EDTA浓度为10-100mM、Tris浓度为10-100mM，该两种洗脱液的PH值为7.0-8.0。
本发明一个实施方式中：步骤四中平衡疏水层析缓冲液硫酸铵浓度为0.5M-4M/L；该平衡疏水层析缓冲液EDTA浓度为10-100mM，该平衡疏水层析缓冲液Tris浓度为10-100mM，该平衡疏水层析缓冲液的PH值为7.0-8.0。
本发明一个实施方式中：步骤六中过滤器与超滤器联动装置的结构为：样品容器经过蠕动泵连接到过滤器，过滤器的孔径为0.22um，过滤器连接一个无菌密闭容器连接蠕动泵，连接超滤器，超滤器包括中空纤维式超滤器和膜包式超滤器，超滤器所采用的超滤膜的截留分子量在100-750KD。
传统的质粒DNA纯化工艺，去除RNA的方法是加入牛Rnase来降解RNA，但是并不适用于工业化生产，原因在于既增加了成本又有传播疯牛病的可能。据文献报道，代替Rnase去除RNA最常用的方法之一是含有质粒DNA的裂解液调节电导后，直接上离子交换层析，来去除RNA。方法之二是直接上分子筛，通过分子量大小差异来去除RNA。但这两种方法都存在问题：方法一中纯化出的质粒DNA含有高分子RNA，还需要进一步去除，原因在于阴离子层析介质的无选择性和大分子物在介质孔径中的扩散抑制。所以通过离子交换很难将RNA彻底去除，还需要加入缓冲液来调节电导，使上样体积增大，生产周期变长。而且目前商业化的层析介质对于蛋白质药物吸附容量较大，针对于核酸这样的大分子来说，吸附容量较低，如果将裂解液直接上样，高分子RNA会被离子交换层析介质吸附，降低质粒DNA的吸附，严重影响离子交换层析介质效率。通过分子筛的确能去除RNA，但上样量太小(柱体积的5％)，流速慢，不适合工业化生产的要求。本发明在质粒DNA生产工艺中并没有加入专门的去除RNA的步骤，而是通过高盐沉淀，超滤浓缩，离子交换三个步骤达到去除RNA的目的。其优点在于：高盐沉淀来去除高分子RNA，超滤浓缩进一步去除低分子RNA，并减少体积更换缓冲液来调节裂解液的电导率，适合于上离子交换层析柱。前两步去除95％的RNA，最后在通过离子交换层析柱完全去除RNA。通过高盐沉淀与超滤浓缩的联合运用，同时也去除大部分的蛋白质和部分内毒素、宿主DNA。
内毒素的去除是整个质粒DNA纯化工艺的瓶颈之一，原因在于内毒素与质粒DNA相比，分子量和电荷密度很接近。内毒素的分子量从数十万到数千万，带有大量的负电荷，这就意味着，用分子筛和离子交换层析技术很难将内毒素降到很低的水平。QIAGEN公司的内毒素质量标准为小于100EU/mg。此标准对于细胞实验和动物试验是足够的，但是临床试验中，通常每剂量要达到数毫克，所以药用质粒DNA的内毒素标准是小于10EU/mg，甚至更低。为了解决此难题，我们引入了疏水层析来去除内毒素，得到了明显的效果。疏水层析的原理是在较高盐浓度下，生物大分子会通过疏水作用吸附在疏水介质的疏水基团上，当逐渐降低洗脱液浓度时，生物大分子会按疏水性强弱依次洗脱，达到纯化的目的。质粒DNA由于有很强的亲水性，上样后不与疏水基团相结合，形成了流穿峰。而内毒素等污染物有较强的疏水性，与疏水基团结合，当逐渐降低洗脱液浓度时，被洗脱下来。从而达到去除内毒素的目的。但由于疏水层析纯化质粒DNA属于负吸附，内毒素等污染物都被吸附在介质上，所以前期需要通过高盐沉淀超滤浓缩离子交换来大幅度降低样品中的污染物的浓度，以达到良好的效果。疏水层析得到的样品含有较高的盐，通过分子筛来更换合适的缓冲液并进一步去除污染物。
质粒DNA不同于蛋白质分子，其分子量可达数百万。在电镜照片下显示，与0.22um无菌滤膜大小相仿，如果质粒DNA高浓度过滤，剪切力过大，势必会造成超螺旋DNA变成开环结构且产率降低。本发明通过“过滤器和超滤器联动装置”，先将低浓度的分子筛样品进行无菌过滤，在无菌的环境下无菌超滤达到药用级浓度。乙醇沉淀是实验室浓缩质粒DNA的方法，但其并不适合大规模工业化生产，因为需要使用离心机，耗时费力，无菌操作不易控制，并使用有机试剂，需要进一步完全去除。
本发明纯化的质粒DNA总回收率可达到50％以上，其产品各项检定项目均符合国家标准，是适合工业化大生产的质粒DNA纯化方法。
附图说明
图1、离子交换层析图谱：
1.0.3NaCl洗脱峰，2.质粒DNA洗脱峰，3.CIP峰
图2、离子交换层析电泳图谱：
1.上样，2.流穿峰，3.0.3NaCl洗脱峰，4.质粒DNA洗脱峰。
图3、疏水层析图谱：1.疏水流穿峰，2.水峰。
图4、疏水层析电泳图谱：1.样品，2.疏水流穿峰，3.水峰。
图5、分子筛层析图谱：1.样品，2.质粒DNA。
图6、分子筛电泳图谱：1.样品，2.质粒DNA。
图7：过滤器与超滤器联动装置结构示意图。
具体实施方式
实施例1
2000g含有5kb质粒DNA的大肠杆菌菌体通过分子克隆指南所述方法进行裂解，加入氯化钙或硫酸铵溶液，使其终浓度为0.2M，盐析沉淀通过1.0um滤芯过滤得到澄清裂解液为60L，经过超滤装置而过滤，超滤膜截留分子量100KD，除去大部分RNA，并通过0.5MKAC进行透滤，浓缩到1/5体积12L，DNA浓度为200ug/ml；将超滤获得的浓缩液上样到离子交换层析介质柱子后，缓冲液为醋酸钾，浓度为0.1M/L；其中EDTA的浓度为10mM，pH值为5.0，经过浓度为0.1M的氯化钠洗脱液洗去杂质，再用浓度为0.5M氯化钠洗脱液洗脱后，用于洗脱杂质的浓度为0.1M/L的氯化钠洗脱液和浓度为0.5M/L的氯化钠洗脱液的EDTA浓度为10mM、Tris浓度为10mM，该两种洗脱液的PH值为7.0；得到含有质粒DNA的洗脱液样品6L，DNA浓度为290ug/ml；样品用硫酸铵调节电导率为100ms/cm，该缓冲液硫酸铵浓度为0.5M/L；该平衡疏水层析缓冲液EDTA浓度为10mM，该平衡疏水层析缓冲液Tris浓度为10mM，该平衡疏水层析缓冲液的PH值为7.0，上样到预先平衡好的疏水层析介质(Phenyl Sepharose 6Fast Flow(low sub)柱子后收集流穿峰，得到DNA样品体积7L，DNA浓度为250ug/ml；疏水样品经分子筛(Sepharose 4Fast Flow)层析更换缓冲液为PBS得到DNA体积12L，DNA浓度为150ug/ml。分子筛样品，经过“过滤器和超滤器联动装置”使样品在无菌的条件下更换缓冲液为PBS及使质粒DNA浓度浓缩到符合药用标准超滤浓缩浓度为2mg/ml，DNA体积800ml，过滤器与超滤器联动装置的结构为：样品容器经过蠕动泵连接到过滤器，过滤器的孔径为0.22um，过滤器连接一个无菌密闭容器连接蠕动泵，连接超滤器，超滤器包括中空纤维式超滤器和膜包式超滤器，超滤器所采用的超滤膜的截留分子量在100KD。
实施例2：
2000g含有13kb质粒DNA的大肠杆菌菌体通过分子克降指南所述方法进行裂解，加入氯化钙或硫酸铵溶液，使其终浓度为0.5M，盐析沉淀通过1.0um滤芯过滤得到澄清裂解液为60L，经过超滤装置而过滤，超滤膜截留分子量300KD，除去大部分RNA，并通过0.5MKAC进行透滤，浓缩到1/5体积12L，DNA浓度为200ug/ml；将超滤获得的浓缩液上样到离子交换层析介质柱子后，经过浓度为0.3M的氯化钠洗脱液洗去杂质，再用浓度为0.7M氯化钠洗脱液洗脱后，该两种洗脱液的EDTA浓度为50mM、Tris浓度为50mM，该两种洗脱液的PH值为7.5；得到含有质粒DNA的洗脱液样品6L，DNA浓度为290ug/ml。离子交换层析图谱见图1，离子交换层析电泳图谱见图2，样品用硫酸铵调节电导率为200ms/cm，该缓冲液EDTA浓度为50mM，该平衡疏水层析缓冲液Tris浓度为50mM，该平衡疏水层析缓冲液的PH值为7.5；上样到预先平衡好的疏水层析介质(Phenyl Sepharose 6Fast Flow(low sub)柱子后收集流穿峰，得到DNA样品体积7L，DNA浓度为250ug/ml，疏水层析图谱见图3，疏水层析电泳图谱见图4。疏水样品经分子筛(Sepharose 4Fast Flow)层析更换缓冲液为PBS得到DNA体积12L，DNA浓度为150ug/ml。分子筛层析图谱见图5，分子筛层析电泳图6。将得到的分子筛样品，经过“过滤器和超滤器联动装置”使样品在无菌的条件下更换缓冲液为PBS及使质粒DNA浓度浓缩到符合药用标准超滤浓缩浓度为3mg/ml，DNA体积500ml。过滤器与超滤器联动装置的结构为，见图7：样品容器经过蠕动泵连接到过滤器，过滤器的孔径为0.22um，过滤器连接一个无菌密闭容器连接蠕动泵，连接超滤器，超滤器包括中空纤维式超滤器和膜包式超滤器，超滤器所采用的超滤膜的截留分子量在100KD。
实施例3
2000g含有20kb质粒DNA的大肠杆菌菌体通过分子克隆指南所述方法进行裂解，加入氯化钙溶液，使其终浓度为2M，盐析沉淀通过1.0um滤芯过滤得到澄清裂解液为60L，经过超滤装置而过滤，超滤膜截留分子量750KD，除去大部分RNA，并通过0.5MKAC进行透滤，浓缩到1/5体积12L，DNA浓度为200ug/ml；将超滤获得的浓缩液上样到离子交换层析介质柱子后，经过浓度为0.5M的氯化钠洗脱液洗去杂质，再用浓度为1M氯化钠洗脱液洗脱后，该两种洗脱液的EDTA浓度为100mM、Tris浓度为100mM，该两种洗脱液的PH值为8.0；得到含有质粒DNA的洗脱液样品6L，DNA浓度为290ug/ml；样品用硫酸铵调节电导率为300ms/cm，该缓冲液EDTA浓度为100mM，该平衡疏水层析缓冲液Tris浓度为100mM，该平衡疏水层析缓冲液的PH值为8.0；上样到预先平衡好的疏水层析介质(Phenyl Sepharose 6Fast Flow(low sub)柱子后收集流穿峰，得到DNA样品体积7L，DNA浓度为250ug/ml；疏水样品经分子筛(Sepharose 4Fast Flow)层析更换缓冲液为PBS得到DNA体积12L，DNA浓度为150ug/ml，分子筛样品，经过“过滤器和超滤器联动装置”使样品在无菌的条件下更换缓冲液为PBS及使质粒DNA浓度浓缩到符合药用标准超滤浓缩浓度为2.5mg/ml，DNA体积650ml，过滤器与超滤器联动装置的结构为：样品容器经过蠕动泵连接到过滤器，过滤器的孔径为0.22um，过滤器连接一个无菌密闭容器连接蠕动泵，连接超滤器，超滤器包括中空纤维式超滤器和膜包式超滤器，超滤器所采用的超滤膜的截留分子量在750KD。
质粒DNA生产各环节质量表(以13kb质粒为例)
  DNA(ug/mg)   体积(L)   回收率(％)   总回收率(％)   蛋白(ug/mg)   内毒素(EU/mg)
  裂解浓缩分子筛离子交换疏水层析除菌过滤浓缩   2001502902702702000   12156770.8 93.777.38410084.6 93.772.460.860.851.4   2700123.8n.dn.dn.d   ＞2000＞500＞150＜5＜5＜1

Claims (6)

1、一种适用于大规模生产质粒DNA的纯化方法，包括以下步骤：
一、在含有5-20kb质粒DNA的裂解液中，加入氯化钙或硫酸铵溶液，使终浓度为0.2-2M/L盐析沉淀，过孔径1.0um滤膜得到澄清的裂解液；
二、使含有质粒DNA的裂解液经过超滤装置而过滤，截留分子量100-750KD之间，除去大部分RNA，并通过合适的透滤液进行透滤；
三、将超滤获得的浓缩裂解液上样到离子交换层析介质柱子后，经过浓度为0.1-0.5M的氯化钠洗脱液洗去杂质，用浓度为0.5-1M的氯化钠洗脱液洗脱后，得到含有质粒DNA的洗脱液；
四、将步骤三中得到的含有质粒DNA的洗脱液，用硫酸铵调节电导率为100-300ms/cm，上样到预先平衡好的疏水层析介质柱子后收集流穿峰；
五、将疏水流穿峰样品上样到分子筛层析介质柱子，收集第一个峰；
六、将步骤五得到的分子筛样品，经过过滤器和超滤器联动装置使样品在无菌的条件下更换合适的缓冲液及使质粒DNA浓度浓缩到符合药用标准。
2、根据权利要求1所述的适用于大规模生产质粒DNA的纯化方法，其特征在于：步骤二中的超滤装置包括中空纤维超滤器或膜包式超滤器。
3、根据权利要求1所述的适用于大规模生产质粒DNA的纯化方法，其特征在于：步骤二中的超滤装置所采用的超滤膜的截留分子量在100-750KD之间。
4、根据权利要求1所述的适用于大规模生产质粒DNA的纯化方法，其特征在于：步骤三中的平衡离子交换层析缓冲液为醋酸钾，浓度为0.1M-1M/L；其中EDTA的浓度为10-100mM，pH值为5.0-6.5，用于洗脱杂质的浓度为0.1-0.5M/L的氯化钠洗脱液和浓度为0.5-1M/L的氯化钠洗脱液的EDTA浓度为10-100mM、Tris浓度为10-100mM，该两种洗脱液的PH值为7.0-8.0。
5、根据权利要求1所述的适用于大规模生产质粒DNA的纯化方法，其特征在于：步骤四中平衡疏水层析缓冲液硫酸铵浓度为0.5M-4M/L；该平衡疏水层析缓冲液EDTA浓度为10-100mM，该平衡疏水层析缓冲液Tris浓度为10-100mM，该平衡疏水层析缓冲液的PH值为7.0-8.0。
6、根据权利要求1所述的适用于大规模生产质粒DNA的纯化方法，其特征在于：步骤六中过滤器与超滤器联动装置的结构为：样品容器经过蠕动泵连接到过滤器，过滤器的孔径为0.22um，过滤器连接一个无菌密闭容器连接蠕动泵，连接超滤器，超滤器包括中空纤维式超滤器和膜包式超滤器，超滤器所采用的超滤膜的截留分子量在100-750KD。
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Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101070543B (zh) * 2007-06-01 2010-12-29 广东药学院 超螺旋质粒分离纯化工艺
CN102191238A (zh) * 2010-03-15 2011-09-21 博尔诚（北京）科技有限公司 小分子rna的提取方法
CN103408625A (zh) * 2013-08-12 2013-11-27 深圳市职业病防治院 一种纯化dna的方法
CN105567672A (zh) * 2007-05-23 2016-05-11 Vgxi公司 包含高浓度的生物活性分子的组合物及其制备工艺
CN106554956A (zh) * 2016-12-07 2017-04-05 安徽智飞龙科马生物制药有限公司 一种产业化制备BCG‑CpG‑DNA的方法
CN106884011A (zh) * 2015-12-16 2017-06-23 固安鼎泰海规生物科技有限公司 一种规模化质粒纯化的联合液相层析分离方法
CN107488657A (zh) * 2017-08-15 2017-12-19 苏州泽科生物科技有限公司 核酸的活性染料偶联标记、检测及提纯方法
CN112391383A (zh) * 2020-12-14 2021-02-23 深圳市卫光生物制品股份有限公司 一种质粒dna的产业化纯化方法及质粒dna
CN113265396A (zh) * 2021-05-31 2021-08-17 上海碧博生物医药科技有限公司 大型质粒dna的连续化生产的工艺方法
CN113388609A (zh) * 2021-06-21 2021-09-14 上海碧博生物医药科技有限公司 大型质粒dna的纯化方法
CN113969276A (zh) * 2020-07-23 2022-01-25 西安桑尼赛尔生物医药有限公司 一种高效纯化大量pcr产物的凝胶层析方法及其应用
CN113993998A (zh) * 2019-04-15 2022-01-28 苏黎世联邦理工学院 功能性risc关联小rna的纯化方法和试剂盒
CN114907430A (zh) * 2022-06-21 2022-08-16 中国科学院过程工程研究所 一种mRNA的分离纯化方法
CN115058414A (zh) * 2022-08-09 2022-09-16 苏州赛分科技股份有限公司 一种纯化质粒dna的方法
CN115612684A (zh) * 2022-11-01 2023-01-17 北京启辰生生物科技有限公司 Gmp级质粒dna大规模简化生产方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR003122A1 (es) * 1995-05-19 1998-07-08 Merck & Co Inc Un proceso para aislacion y purificacion de plasmidos en fermentadores de gran escala y el adn aislado y purificado obtenido mediante dicho proceso.
US7026468B2 (en) * 1996-07-19 2006-04-11 Valentis, Inc. Process and equipment for plasmid purification
JP4723254B2 (ja) * 2002-12-23 2011-07-13 バイカル インコーポレイテッド プラスミドｄｎａを精製するための方法
CN1594562A (zh) * 2003-09-08 2005-03-16 本元正阳基因技术股份有限公司 超螺旋质粒的分离纯化的方法与应用

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105567672A (zh) * 2007-05-23 2016-05-11 Vgxi公司 包含高浓度的生物活性分子的组合物及其制备工艺
CN101070543B (zh) * 2007-06-01 2010-12-29 广东药学院 超螺旋质粒分离纯化工艺
CN102191238A (zh) * 2010-03-15 2011-09-21 博尔诚（北京）科技有限公司 小分子rna的提取方法
CN103408625A (zh) * 2013-08-12 2013-11-27 深圳市职业病防治院 一种纯化dna的方法
CN103408625B (zh) * 2013-08-12 2016-03-16 深圳市职业病防治院 一种纯化dna的方法
CN106884011A (zh) * 2015-12-16 2017-06-23 固安鼎泰海规生物科技有限公司 一种规模化质粒纯化的联合液相层析分离方法
CN106884011B (zh) * 2015-12-16 2020-11-17 固安鼎泰海规生物科技有限公司 一种规模化质粒纯化的联合液相层析分离方法
CN106554956A (zh) * 2016-12-07 2017-04-05 安徽智飞龙科马生物制药有限公司 一种产业化制备BCG‑CpG‑DNA的方法
CN107488657A (zh) * 2017-08-15 2017-12-19 苏州泽科生物科技有限公司 核酸的活性染料偶联标记、检测及提纯方法
CN113993998A (zh) * 2019-04-15 2022-01-28 苏黎世联邦理工学院 功能性risc关联小rna的纯化方法和试剂盒
CN113969276A (zh) * 2020-07-23 2022-01-25 西安桑尼赛尔生物医药有限公司 一种高效纯化大量pcr产物的凝胶层析方法及其应用
CN112391383A (zh) * 2020-12-14 2021-02-23 深圳市卫光生物制品股份有限公司 一种质粒dna的产业化纯化方法及质粒dna
CN113265396A (zh) * 2021-05-31 2021-08-17 上海碧博生物医药科技有限公司 大型质粒dna的连续化生产的工艺方法
CN113265396B (zh) * 2021-05-31 2024-01-09 上海碧博生物医药科技有限公司 大型质粒dna的连续化生产的工艺方法
CN113388609A (zh) * 2021-06-21 2021-09-14 上海碧博生物医药科技有限公司 大型质粒dna的纯化方法
CN113388609B (zh) * 2021-06-21 2022-09-13 上海碧博生物医药科技有限公司 大型质粒dna的纯化方法
CN114907430A (zh) * 2022-06-21 2022-08-16 中国科学院过程工程研究所 一种mRNA的分离纯化方法
CN114907430B (zh) * 2022-06-21 2023-12-01 中国科学院过程工程研究所 一种mRNA的分离纯化方法
CN115058414A (zh) * 2022-08-09 2022-09-16 苏州赛分科技股份有限公司 一种纯化质粒dna的方法
CN115612684A (zh) * 2022-11-01 2023-01-17 北京启辰生生物科技有限公司 Gmp级质粒dna大规模简化生产方法

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