JP4723254B2 - プラスミドdnaを精製するための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、プラスミドDNAを精製するための方法に関連する。本発明は、本発明の方法によって生産されたDNA産物に関連する。このDNA産物は、医薬的な使用に適している。
プラスミドは、例えば、抗体の調製、遺伝子解析、スクリーニング、及び研究室での分析に使用されている。最近の生物学における発達は、疾患を治療するためのポリアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを使用することの可能性を供している。ヒトに対しての遺伝子デリバリーの1つの方法は、プラスミドDNA、即ち、閉環状のDNA形態を使用することである。
本発明は、DNA産物を獲得するために、宿主細胞不純物からプラスミドDNAを精製するための方法に関連し、当該方法は:(a)プラスミドDNAを含む宿主細胞を溶解させて溶解物を獲得し:(b)当該溶解物を清澄化して清澄化された溶解物を獲得し;(c)当該清澄化された溶解物を限外ろ過して、限外ろ過された清澄化した溶解物を獲得し;(d)第一の沈殿剤を、限外ろ過され清澄化した溶解物に対して、プラスミドDNAの沈殿物を獲得するために十分な量で加え;(e)当該沈殿物を溶かして第一溶液を獲得し;(f)第二の沈殿剤を、当該溶液に対して宿主細胞不純物を沈澱させ且つプラスミドDNAを含む溶質を獲得するために十分な量で加え;(g)当該溶質を他のバッファーへと移して第二の溶液を獲得し;(h)当該第二の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)物質に対して適用して、プラスミドDNAを含む溶出液を獲得し;そして(i)当該溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)物質に対して適用してDNA産物を獲得する、ことを含んで成る。
本発明は、宿主細胞不純物からDNA産物を獲得するためにプラスミドDNAを精製する方法に関連し、当該方法は:(a)プラスミDNAを含んでいる宿主細胞を溶解させて溶解物を獲得し;(b)当該溶解物を清澄化し清澄化された溶解物を獲得し;(c)当該清澄化した溶解物を限外ろ過して限外ろ過された清澄化した溶解物を獲得し;(d)第一の沈殿剤を、当該限外ろ過された清澄化した溶解物に対して、プラスミドDNAの沈殿物を獲得するために十分な量で加え;(e)当該沈殿物を溶かして第一の溶液を獲得し;(f)第二の沈殿剤を、当該溶液に対して当該宿主細胞不純物を沈殿させるため且つプラスミドDNAを含む溶出液を獲得するために十分な量で加え;(g)当該溶質を他のバッファーへと移して第二溶液を獲得し;(h)当該第二の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)物質に対して適用して、プラスミドDNAを含む溶出液を獲得し;そして(i)当該溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)物質に対して適用してDNA産物を獲得する、ことを含んで成る。
本発明の方法により精製されて良いプラスミドDNAは限定されていない。プラスミドとしては、真核ベクター及び原核ベクター、クローニング及び発現ベクター、pBR322及びpUCベクター及びそれらの誘導体が挙げられる。プラスミドは、複製の様々な開始点を組み込むために、例えば、原核複製開始点、例えば、pMB1及びColE1、又は真核の複製開始店の例えば、酵母、真菌、昆虫、及び哺乳動物細胞における複製を促すもの(例えば、SV40 ori)を含むことができる。クローニング及び発現を促すための様々な遺伝子要素を包含するために、プラスミドは、例えば、各種の遺伝子(selectable gene)、ポリリンカー、プロモーター、エンハンサー、リーダーペプチド配列、イントロン、ポリアニル化シグナル、又はそれらの組み合わせを含むことができる。ベクター、複製開始点、及び遺伝子要素の選択は、要求及び当業者に基づいて様々であろう。
プラスミドDNA含有宿主細胞を培養した後、当該宿主細胞は、例えば、実験室、パイロットプラント、又は産業スケールの遠心及び/又はろ過、例えば、マイクロフィルタレーション及び/もしくは限外ろ過によって、特異的な適用に依存して、回収されている。回収された細胞は、標準的な方法を使用することで凍結保存されて良く、又はプラスミドDNAの精製をするためにすぐに処理されて良い。本発明の実施態様を、図1の方法のフローチャートに供している。
細胞を、再懸濁技術を使用しバッファー中で再懸濁している。このバッファーは、限定されず、そしてFDAによって「一般に安全であると認識されている」(GRAS)試薬が挙げられる。かかるバッファーとしては、トリス-HCl、酢酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、一塩基又は二塩基性リン酸ナトリウム又はこれらの混合物が挙げられる。pH及びイオン強度の選択は当業者に周知である。
細胞は、DNAを当該細胞から遊離させるために、溶解技術を使用することで溶解されている。いくつかの実施態様において、細胞は、動物酵素さもなくば誘導された酵素の例えば、ライソザイムに頼らずに溶解されている。溶解は、希塩基又は希塩基及びデタージェント中で行われて良く、それらは、GRAS試薬でありうる。かかる塩基としては、限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、重炭酸ナトリウムが挙げられる。かかるデタージェントとしては、限定されないが、医薬的に許容できる非イオン性界面活性剤の例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ポリソルベート(Tween(登録商標)の下で市販されている)、ポリオキシエチレンエーテル(Union CarbideによってTriton(登録商標)として市販されている)などが使用されて良い。NaOH及びSDSの組み合わせが有利である。pH及びイオン強度を至適化することは、当業者に周知である。
細胞の溶解させる間に放出された細胞の破片及び高分子量不純物は、実験室、パイロットプラント又は産業規模の遠心及び/又はろ過によって除去されている。ろ過により、次なる陽性沈降(positive precipitation)の前に溶解物を清澄化することが確実になる。当業者に周知のように、ろ過は、例えば、セルロース、珪藻土、Celite(登録商標)ろ過支援物などの支援物質を使用することによって、異種又は粘性溶液の流動性を高めるために行われて良い。
ポリエチレングリコール(PEG)又は他の類似する高分子量ポリオールが、タンパク質及び核酸回収の両方において、沈殿剤及び抽出剤として使用されて良い。PEG沈殿剤は、DNAを製造するために有利である。それは医薬において許容できる成分である。この段階では、PEGは清澄化されたろ過物に対して、高濃度のPEGをもたらす量で加えられている。PEGの最終濃度を約8%PEG〜約12%PEG、例えば、約10%PEG(重量/体積)にすることが有利でありうる。典型的に、PEG-8000が使用されて良い。しかし、他の様々な分子量のPEG、例えば、限定されないが、PEG-3000〜PEG-2000が使用されて良い。標準的な沈殿技術の適用及びpH選択及びイオン強度の選択は当業者に周知である。
アルコール又はPEG沈殿の結果として形成されたプラスミドDNAの沈殿物は、実験室、パイロットプラント、又は産業スケールの遠心及び/もしくはろ過による通常の方法で分離されている。沈殿させることにより、上清中に維持されているエンドトキシン及び炭化水素の除去又は低減が可能になる。
プラスミド沈殿物がバッファー中で再懸濁される場合、当業者に公知の懸濁技術が使用されて良く、そしてバッファーは、限定ではないが、GRAS緩衝剤が使用されて良い。
高塩沈殿の結果として形成された不純物の沈殿は、実験室、パイロットプラント、又は産業規模の遠心及び/もしくはろ過による通常の方法で分離されている。ろ過は、不純物の沈殿を維持するために有効であり、しかもプラスミドDNAろ過物が回収可能であるような孔径の要請に見合う任意のフィルター物質により行われて良い。有効なろ過は、コンタミネーション物質の最大限の回収及びフィルター上に残るプラスミドが最小であること、即ち、産物の最適フロースルーを特徴とする。適切なフィルターは、約0.1μm〜約100μm、又が約0.1μm〜約50μmの孔径又は孔径の範囲を有して良い。この段階のろ過のためのフィルターはろ過するために上記の物理特性を有して良く、それは即ち、合成もしくは無機の物質からできていること、又は核酸成分でコンタミネーションされていない物質からできていること、オートクレーブに掛けることが可能、強靭及び可鍛性物質からできていることである。
イオン交換クロマトグラフィーは、プラスミドDNA分子を、あるpHにおける分子のイオン電荷又は等電点(pI)に基づき、コンタミネーション分子から分離するために行われている。イオン交換カラムには、イオン交換物質を作り上げる、正に帯電したビーズ(陰イオン交換体のために)又は負に帯電したビーズ(陽イオン交換体のために)が充填されている。分子の電荷密度及びpIは、分子を分離するために適している支持マトリクスのイオン容量(ionic capacity)を決定するだろう。
セラミックAEX溶出ピーク(プールした又はプールしていない)は約1M〜約2Mの硫酸アンモニウム濃度に調節され、任意にろ過され、そして疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)カラムの例えば、オクチルFF HIC (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)、フェニルFF HIC (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)、ブチルFF HIC (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)、及びヘキシルHIC(Tosoh-Haas, Montgomeryville, PA)上に、残留宿主細胞不純物のエンドトキシンなどを除去もしくは低減するために、ロードされて良い。
上記の方法によって獲得されたDNA産物は、限外ろ過によって更に濃縮されて良い。DNA産物は、硫酸アンモニウムを除去するために更にジアフィルトレーションされて良い。DNA産物は、エタノールで更に沈殿させられて良い。
いくつかの観点において、本発明は、本発明の精製方法によって獲得されたDNA産物に向けられている。本発明の方法によって獲得されたDNA産物は、直接使用されるもしくは更に精製されるもしくは処理されて良い。本発明のDNA産物は、環状プラスミドDNAを約95重量%以上含むことができる。DNA産物はRNAを約5%未満、例えば、RNAを約5重量%〜約0.00001%未満、又は0.0001%未満含むことができる。DNA産物は、DNA産物1μgあたり宿主DNAを約0.002μg未満、例えば、DNA産物1μgあたり宿主DNAを約0.002μg〜DNA産物1μgあたり宿主DNAを約0.00002μg、又はプラスミドDNA1μgあたり宿主DNAを約0.00004μg未満含んで良い。DNA産物は、DNA産物1μgあたりタンパク質を約0.001μg未満、例えば、DNA産物1μgあたりタンパク質を約0.001μg〜DNA産物1μgあたりタンパク質を約0.00000001μg含む。DNA産物は、DNA産物1μgあたり約0.01EU未満、例えば、約0.0001EU/μg〜約0.0002EU/μg含む(EU:エンドトキシンユニット;エンドトキシンの測定はUSPファイル<85>に従って達成した値)。本発明の方法によって獲得したDNA産物は、約95重量%以上の環状プラスミドDNAを含んで成り、ここで、当該DNA産物は、DNA産物1μgあたりRNAを約5重量%未満、宿主DNAを約0.002μg未満、DNA産物1μgあたりタンパク質を約0.001μg未満含み、そしてDNA産物1μgあたり約0.01EU未満である。
本発明の方法のDNA産物を獲得することにより、当該DNA産物は、限定ではないが、本発明の方法は医薬等級のDNA産物を提供することができるので、医薬として使用されて良い。DNA産物は処方バッファーの例えば、乳酸を加えられたしたリンガー0.9%生理食塩水もしくはPBS注射ビヒクルもしくは他の無害なバッファー化されたデリバリービヒクル中で希釈されて良く、又はそれは沈殿もしくは濃縮されそして当業者に公知であろう技術を使用することで製剤バッファー中に至らしめら手良い。
本発明のDNA産物の製剤は、ポリヌクレオチドを細胞の内部、及び/もしくは細胞内の所望の場所に対してデリバリーすることを促す1もしくは複数のトランスフェクション促進物質をも含むことができる。トランスフェクション促進物質の例としては、限定ではないが、脂質の例えば陽イオン脂質;無機物質の例えばリン酸カルシウム、及び金属(例えば、金又はタングステン)粒子(例えば、「粉末」型デリバリー溶液);ペプチドの例えば、陽イオンペプチド、所定の細胞又は細胞内オルガネラの例えば核又は核小体に対して選択的デリバリーするためのターゲティングペプチド、及び両親媒性ペプチド、即ち、ヘリックス形成又はポア形成ペプチド;塩基性タンパク質の例えばヒストン;アシアロタンパク質(asialoproteins);ウィルスタンパク質(例えば、センダイウィルスコートタンパク質);孔形成タンパク質;及びポリマーの例えば、デンドリマー、スターポリマー、「同種」ポリアミノ酸(例えば、ポリリジン、ポリアルキニン)、「異種」ポリアミノ酸(例えば、リジンとグリシンの混合物)、コポリマー(例えば、ブロックコポリマー及びポロキサマー)、ポリビニルピロリドン(PVP)、及びポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。
更に最後に、最終的に処方されたDNA産物は容器の例えば、ガラス容器、プラスチック容器、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、もしくは他の容器手段、又はDNA産物及び任意の他の所望の剤が配置されて、適切にアリコートされて良いプラスチックもしくは紙の一片へと詰められて良いことが更に熟考されている。更なる成分が含まれる場合、一般に、第二の容器又は他の容器であってその中に容器が配置され、個別に計画された用量の投与を可能にする容器を含んで良い。かかるキットは無菌の、医薬的に許容できるバッファー又は他の希釈剤を含むための第二/第三の容器手段を含んでも良い。キットは、本発明のDNA産物を含んで成る医薬を動物もしくは患者に対して投与するための手段、例えば、1もしくは複数のシリンジもしくはニードル、又点眼器、ピペット、又は製剤を動物に対して注射できるかあるいは体の所望の場所に対して適用できうる装置をも含んで良い。本発明のキットは、典型的に、バイアルなどの容器、並びに他の要素を、市販するために密接に閉じ込めた状態において含むための手段の例えば、射出成型もしく噴射成型されたプラスチック容器(所望の容器及び他の装置が配置されて維持される)をも含むだろう。いくつかの実施態様において、本発明のキットは、1つのバイアル中で処方されたDNA物質を、密接に閉じ込めた状態で含むための手段及び他の処方剤(例えば、担体、希釈剤、賦形剤、トランスフェクション促進物質)又は使用前に組み合わされて良い医薬的に許容できる剤を伴う他のバイアルのための手段を含んで良い。
実施例1
細菌細胞の溶解及びプラスミドの回収
図1において本方法の1つの実施態様の概要を示している。
約60mgのIPA沈殿させたDNAを取り出して遠心によって回収した。DNAのペレットを50mMのトリス(pH 8.0)、1mMのEDTA、0.65MのNaCl(pH8.0)中に溶かした。
VCL-1005の説明、構築、及び培養は米国特許第5,561,064号に記載されている。VCL-1005プラスミドDNA(4900bp)を含有する凍結した大腸菌細胞を25mMのトリスHCl、10mMのEDTA、及び55mMのグルコース(pH 8.0)中で再懸濁させた。溶解が、0.2MのNaOH、1%のSDSを加えて8分に渡りインキュベーションした後に起こった。細胞片の沈殿が、3Mの酢酸カリウム(pH5.5)を加えて、更なる8分のインキュベーション後に生じた。この細胞片の除去及び体積の減少を、珪藻土添加深層ろ過、しかる後の限外ろ過及びダイアフィルタレーションによって達成した。
pBR322の部分を含む6800bpのプラスミドDNAを含む凍結させた大腸菌細胞を25mMのトリスHCl、10mMのEDTA、及び55mMのグルコース(pH 8.0)中で再懸濁させた。溶解は、0.2MのNaOH、1%のSDSを加えて8分に渡りインキュベーションした後に起こった。細胞片の沈殿が、3Mの酢酸カリウム(pH5.5)を加えて、更なる8分のインキュベーション後に生じた。この細胞片の除去及び体積の減少を、珪藻土添加深層ろ過、しかる後の限外ろ過及びダイアフィルタレーションによって達成した。
VCL-1005プラスミドDNA(4900bp)を含有する凍結した大腸菌細胞を25mMのトリスHCl、10mMのEDTA、及び55mMのグルコース(pH 8.0)中で再懸濁させた。溶解が、0.2MのNaOH、1%のSDSを加えて8分に渡りインキュベーションした後に起こった。細胞片の沈殿が、3Mの酢酸カリウム(pH5.5)を加えて、更なる8分のインキュベーション後に生じた。この細胞片の除去及び体積の減少を、珪藻土添加深層ろ過、しかる後に限外ろ過及びダイアフィルタレーションによって達成した。
プラスミドDNA(6694bp)を含有する凍結した大腸菌細胞を25mMのトリスHCl、10mMのEDTA、及び55mMのグルコース(pH 8.0)中で再懸濁させた。溶解が、0.2MのNaOH、1%のSDSを加えて8分に渡りインキュベーションした後に起こった。細胞片の沈殿が、3Mのリン酸カリウム(pH5.5)を加えて、更なる8分のインキュベーション後に生じた。この細胞片の除去及び体積の減少を、珪藻土添加深層ろ過、しかる後に限外ろ過及びダイアフィルタレーションによって達成した。
大規模細菌細胞溶解物及びプラスミド回収
VR-4700プラスミドDNA(6400bp)(Sankarら、Oral Disease vol.8:pp.275〜281(2002))を含有する凍結した大腸菌細胞720gを、1”ID12エレメント静電ミキサー及びぺリスターポンプを連続循環モードで使用することでを使用し、30LのASME316L加圧容器中、4320mLの25mMのトリスHCl、10mMのEDTA、及び55mMのグルコース(pH 8.0)中で再懸濁させた。溶解が、8640mLの0.2M NaOH、1%のSDSを加えて8分に渡り再循環させた後に起こった。細胞片の中和と沈殿が、3Mの酢酸カリウム(pH5.5)を6480mL加えて、更なる8分に渡り再循環させた後に生じた。
1000mgのIPA沈殿させたDNAを遠心によって回収した。ペレットを50mMのトリス(pH8)、1mM のEDTA、0.65MのNaCl中に溶かして、最終濃度を2mg/mL(±0.2)にした。次いで、この溶かしたDNAペレットを0.45μMのフィルターに通した。
Claims (20)
- DNA産物を獲得するために、宿主細胞不純物からプラスミドDNAを精製するための方法であって、当該方法は:
(a)プラスミドDNAを含んでいる宿主細胞を溶解させて溶解物を獲得し;
(b)当該溶解物を深層ろ過により清澄化して清澄化された溶解物を獲得し;
(c)当該清澄化された溶解物を限外ろ過して、限外ろ過された清澄化した溶解物を獲得し;
(d)第一の沈殿剤を、当該限外ろ過された清澄化した溶解物に対して、プラスミドDNAの沈殿物を獲得するために十分な量で加え;
(e)当該沈殿物を溶かして第一の溶液を獲得し;
(f)第二の沈殿剤を、当該溶液に対して、当該宿主細胞不純物を沈殿させるために十分な量で加え、そして前記プラスミドDNAを含んでいる溶質を獲得し;
(g)当該溶質を他のバッファー中へと移して第二の溶液を獲得し;
(h)当該第二の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)物質に対して適用して、プラスミドDNAを含んでいる溶出液を獲得し;そして
(i)当該溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)物質に対して適用してDNA産物を獲得する、
ことを含んで成る方法。 - 前記AEX物質がセラミックマトリクスを含んで成る、請求項1に記載の方法。
- 前記セラミックマトリクスの平均粒径が10μm〜200μmである、請求項2に記載の方法。
- 前記セラミックマトリクスの平均孔径が750Å〜3000Åである、請求項2に記載の方法。
- 前記AEX物質の平均孔径が10Å〜100Åである、請求項2に記載の方法。
- 前記HIC物質のための樹脂の平均粒径が50μm〜150μmである、請求項1に記載の方法。
- 前記HIC物質のための樹脂の平均孔径が25nm〜100nmである、請求項1に記載の方法。
- 前記(a)における溶解がアルカリ溶解による、請求項1に記載の方法。
- 前記(b)における清澄化が珪藻土深層ろ過(depth filtration)による、請求項1に記載の方法。
- 前記(c)における限外ろ過が中空糸限外ろ過による、請求項1に記載の方法。
- 前記(d)における第一の沈殿剤がポリエチレングリコール(PEG)である、請求項1に記載の方法。
- 前記(f)における第二の沈殿剤が酢酸アンモニウムである、請求項1に記載の方法。
- 前記(h)における溶出液を1M〜2Mの硫酸アンモニウム濃度に調節している、請求項1に記載の方法。
- 前記(i)におけるHIC物質が架橋されたアガロース樹脂を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記(i)におけるDNA産物を限外ろ過によって濃縮することを更に含んで成る、請求項1に記載の方法。
- 前記(i)におけるDNA産物を、硫酸アンモニウムを除去するためにダイアフィルタレーションすることを含んで成る、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA産物をエタノールで沈殿させている、請求項1に記載の方法。
- 酵素、有機抽出物、又は突然変異誘発物質の添加をせずに行っている、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA産物を、滅菌し、処方し、そして滅菌容器内に詰めることを更に含んで成る、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞が細菌である、請求項1に記載の方法。
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