CN112391383A - 一种质粒dna的产业化纯化方法及质粒dna - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种质粒DNA的产业化纯化方法及质粒DNA，所述纯化方法包括以下步骤：在质粒DNA超滤浓缩液中加入辛酸钠，混匀后，常温放置一段时间，接着低温静置一定时间，然后澄清处理；然后依次进行离子交换层析、疏水层析、超滤除盐浓缩和过滤除菌，完成纯化。本发明在低温条件下，将辛酸钠应用于质粒DNA产品的纯化，不仅操作简便易放大，减少了操作步骤，同时提高了纯化质粒的总回收率，并符合药用标准；而且大大减少了硫酸铵的使用，降低了对操作人员和环境的影响。本发明纯化方法纯化效果好而且纯化过程大大减少了硫酸铵试剂的使用，重复性强，操作简单，可满足工业产业化纯化生产要求。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及了一种质粒DNA的产业化纯化方法及质粒DNA。
背景技术
目前，新冠疫情在全世界愈演愈烈，主要是因为其强烈的传染性导致的疫情反复，难以控制。目前主要依靠控制出行及隔离治疗等控制疫情的蔓延及爆发，但这并非长久之计。因此，疫苗的研发及应用受到广泛的关注。目前，科研攻关组布局了病毒的灭活疫苗、核酸疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗、减毒流感病毒载体疫苗这样五条技术路线。进入临床的主要有腺病毒载体疫苗及灭活疫苗。但灭活疫苗存在可怕的抗体依赖增强效应（ADE），造成病毒感染加重，而腺病毒载体疫苗的有效性可能不足。而DNA疫苗具有流程简单、安全性较高、免疫性强等特点，具有巨大的应用前景。
在现有技术中，碱裂解后的澄清过滤液中仍然含有大量的宿主蛋白，其对后续RNA的去除、质粒总回收率及内毒素含量的控制均有显著影响。对质粒DNA的产业化纯化带来了极大的限制。在中国发明专利ZL200610016880.7中，使用氯化钙或者硫酸铵盐析沉淀，滤膜澄清处理以分离沉淀物，其中氯化钙沉淀宿主蛋白的同时会大量沉淀质粒DNA造成回收率低，而硫酸铵用量较大，对操作人员及环境有较大的影响。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种质粒DNA的产业化纯化方法及质粒DNA。本发明人意外发现低温条件下将辛酸钠应用于质粒DNA产品的纯化，不仅操作简便易放大，减少了操作步骤，同时提高了纯化质粒的总回收率，并符合药用标准；而且大大减少了硫酸铵的使用，降低了对操作人员和环境的影响。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
第一方面，一种质粒DNA的产业化纯化方法，其包括以下步骤：在质粒DNA超滤浓缩液中加入辛酸钠，混匀后，常温放置一段时间，接着低温静置一定时间，然后澄清处理；然后依次进行离子交换层析、疏水层析、超滤除盐浓缩和过滤除菌，完成纯化。
如上述的质粒DNA的产业化纯化方法，其中，所述方法具体包括以下步骤：
（1）在质粒DNA超滤浓缩液中加入辛酸钠，混匀后，常温放置一段时间，接着低温静置一定时间，然后进行澄清处理，得到澄清的超滤浓缩液；
（2）离子交换层析：在步骤（1）获得的澄清后的超滤浓缩液中加入氯化钠，过阴离子交换柱，洗脱收集洗脱峰，得阴离子交换层析收集液；
（3）疏水层析：在步骤（2）获得的阴离子交换层析收集液中加入硫酸铵后，过疏水层析柱，收集流穿峰，得疏水层析收集液；
（4）超滤除盐浓缩：将步骤（3）获得的疏水层析收集液进行浓缩洗虑，得超滤洗虑浓缩液；
（5）过滤除菌：将步骤（4）获得的超滤洗虑浓缩液进行除菌过滤，并进行相应的稀释配制，使质粒DNA浓度符合药用标准。
如上述的质粒DNA的产业化纯化方法，其中，所述辛酸钠终浓度为0.2~0.5mol/L。
如上述的质粒DNA的产业化纯化方法，其中，所述低温静置的低温为2~8℃。
如上述的质粒DNA的产业化纯化方法，其中，所述低温静置一定时间为30~60min。
如上述的质粒DNA的产业化纯化方法，其中，所述步骤（2）中，所述氯化钠终浓度为0.2~0.5mol/L。
如上述的质粒DNA的产业化纯化方法，其中，所述步骤（2）中的阴离子交换柱为DEAE阴离子交换层析柱，其中平衡缓冲液的三羟基氨基甲烷浓度为50~100mmol/L，乙二胺四乙酸二钠浓度为1-10mmol/L，pH值为7.0~8.0。
如上述的质粒DNA的产业化纯化方法，其中，所述步骤（3）中，所述硫酸铵终浓度为2.0mol/L。
如上述的质粒DNA的产业化纯化方法，其中，所述步骤（3）中疏水层析柱为phenylsepharose 4 fast flow，其中平衡缓冲液的三羟基氨基甲烷浓度为50~100mmol/L，乙二胺四乙酸二钠浓度为1~10mmol/L，pH值为7.0~8.0。
如上述的质粒DNA的产业化纯化方法，其中所述步骤（2）中澄清处理为采用连续流离心或筒式离心机离心或采用0.5~1.0μm的过滤装置进行澄清处理。
如上述的质粒DNA的产业化纯化方法，其中所述步骤（5）中超滤装置为中空纤维或超滤膜包中的一种，截留孔径为100~300KD，所述缓冲体系为10~50mM PBS缓冲液。
如上述的质粒DNA的产业化纯化方法，其中所述步骤（6）中过滤除菌滤芯孔径为0.22μm，稀释配制用液为10~50mM PBS。
第二方面，一种质粒DNA，其经过如上述的产业化纯化方法纯化获得。
本发明具有如下有益效果：
在进行质粒DNA产业化纯化过程中，本发明人意外的发现，在低温条件下，将辛酸钠应用于质粒DNA产品的纯化，不仅操作简便易放大，减少了操作步骤，同时提高了纯化质粒的总回收率，并符合药用标准；而且大大减少了硫酸铵的使用，降低了对操作人员和环境的影响。本发明纯化方法纯化效果好而且纯化过程大大减少了硫酸铵试剂的使用，重复性强，操作简单，可满足工业产业化纯化生产要求。
附图说明
图1示出了本发明不同辛酸钠浓度对超滤浓缩液杂蛋白去除的影响示意图；
图2示出了本发明实施例二中步骤（25）DEAE阴离子交换层析色谱图；
图3示出了本发明实施例二中步骤（25）对应洗脱峰的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1是0.3MNacL洗脱峰，泳道2是1.0M NacL洗脱峰；
图4示出了本发明实施例二中步骤（26）Phenyl sepharose 4 Fast Flow疏水层析色谱图；
图5示出了本发明实施例二中步骤（26）对应的洗脱峰，泳道1是流穿峰；
图6示出了本发明实施例二纯化后的质粒DNA产品琼脂糖电泳结果，表明按本案工艺能得到符合药用要求的产品。
具体实施方式
如背景技术描述的，现有技术中质粒DNA大规模纯化方法中，使用氯化钙或者硫酸铵盐析沉淀，滤膜澄清处理以分离沉淀物，其中氯化钙沉淀宿主蛋白的同时会大量沉淀质粒DNA造成回收率低，而硫酸铵用量较大，对操作人员及环境有较大的影响。
为了解决上述技术问题，本发明提出了一种质粒DNA的产业化纯化方法，其包括以下步骤：在质粒DNA超滤浓缩液中加入辛酸钠，混匀后，常温放置一段时间，接着低温静置一定时间，然后澄清处理；然后依次进行离子交换层析、疏水层析、超滤除盐浓缩和过滤除菌，完成纯化。
本发明人经过大量试验得出，将辛酸钠应用于质粒DNA产品的产业化纯化中，可以明显降低硫酸铵的用量，提高了纯化质粒的总回收率。一般情况下，为促进辛酸钠溶解反应以及充分反应，辛酸钠处理过程尽量保持在常温状态下，如18~26℃。但发明人意外发现，辛酸钠处理质粒DNA超滤浓缩液时进一步置于低温条件下，还能够有效去除杂蛋白，明显提高浊度下降率。
本发明纯化方法是在低温条件下，将辛酸钠应用于质粒DNA产品的纯化，不仅操作简便易放大，减少了操作步骤，同时提高了纯化质粒的总回收率，并符合药用标准；而且大大减少了硫酸铵的使用，降低了对操作人员和环境的影响。本发明纯化方法纯化效果好而且纯化过程大大减少了硫酸铵试剂的使用，重复性强，操作简单，可满足工业产业化纯化生产要求。
表1示出了不同温度条件下，辛酸钠对超滤浓缩液杂蛋白去除的影响。
由表1可知：在两种温度条件下，辛酸钠处理后，质粒回收率无显著变化，但先18-26℃，再2-8℃条件下，浊度下降率较18-26℃要高18.7%。
表2及图1示出了不同辛酸钠浓度对超滤浓缩液杂蛋白去除的影响
根据表2和图1可知，随着超滤浓缩液中辛酸钠浓度的升高，在辛酸钠加到0.5mol/L以上后，浊度下降率无显著变化，但质粒回收率明显下降。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例一含新冠N蛋白质粒DNA产业化纯化
本实施例示出了一种含新冠N蛋白质粒DNA的产业化纯化方法，具体包含以下步骤：
（11）2000g含有新冠N蛋白质粒DNA的大肠杆菌湿菌体，按分子克隆指南所述方法进行裂解及中和得到混合液；
（12）采用管式离心机对上述混合液进行初步澄清后，继续用5.0μm及0.5μm的滤芯组合过滤，并用纯化水冲洗滤芯，得到碱裂解过滤澄清液58.5L；
（13）使用孔径为300KD的超滤膜包对碱裂解过滤澄清液进行超滤浓缩，再使用含有10mmol/L的三羟基氨基甲烷，1mmol/L的乙二胺四乙酸二钠，pH8.0的缓冲液进行置换洗滤，浓缩至原体积的1/10，体积为6L，质粒浓度为360μg/ml；
（14）在上述超滤浓缩液中加入终浓度为0.2mol/L的辛酸钠，混匀后，常温放置2小时后，2-8℃放置1小时后，离心收取上清并用0.5μm滤器过滤澄清处理，最终收取体积5.7L，质粒DNA的浓度为340μg/ml，得澄清的超滤浓缩液；
（15）离子交换层析：在澄清的超滤浓缩液中，补入终浓度为0.3mol/L的氯化钠；过预平衡好的DEAE阴离子交换层析柱，平衡阴离子交换层析缓冲液氯化钠浓度为0.3mol/L，乙二胺四乙酸二钠浓度为10mmol/L，三羟基氨基甲烷浓度为100mmol/L，pH值为7.5；用浓度为1.0mol/L氯化钠，10mmol/L的乙二胺四乙酸二钠，100mmol/L的三羟基氨基甲烷，pH值为7.5的洗脱液进行洗脱；收集质粒洗脱峰，洗脱峰体积3.2L，质粒浓度为438μg/ml，得离子交换层析收集液；
（16）疏水层析：在离子交换层析收集液中补入终浓度为2.0mol/L的硫酸铵，过预平衡好的Phenyl sepharose 4 Fast Flow疏水层析柱，平衡疏水层析缓冲液硫酸铵浓度为2.0mol/L，乙二胺四乙酸二钠浓度为10mmol/L，三羟基氨基甲烷浓度为100mmol/L，pH值为7.5；收集流穿峰，流穿峰体积4.0L，质粒浓度为283μg/ml，得疏水层析收集液；
（17）超滤除盐浓缩：使用中空纤维超滤柱（截留分子量：750kD）对疏水层析收集液进行超滤洗滤，洗滤液为10mmol/L的PBS缓冲液，洗滤5倍，浓缩后质粒浓度为2.2mg/ml，体积365ml，得超滤洗滤浓缩液；
（18）过滤除菌：将超滤洗滤浓缩液使用孔径为0.22μm的滤芯过滤除菌，再用无菌的PBS调节浓度至2.0mg/ml，最终产品体积为380ml。
实施例二含新冠S蛋白质粒DNA产业化纯化
本实施例示出了一种含新冠S蛋白质粒DNA的产业化纯化方法，具体包含以下步骤：
（21）2000g含有新冠S蛋白质粒DNA的大肠杆菌湿菌体，按分子克隆指南所述方法进行裂解及中和的混合液；
（22）采用管式离心机初步澄清后，继续用5.0μm及0.5μm的滤芯组合过滤，并用纯化水冲洗滤芯，得到碱裂解过滤澄清液59L；
（23）使用孔径为300KD的超滤膜包对碱裂解过滤澄清液进行浓缩，再使用含有10mmol/L的三羟基氨基甲烷，1mmol/L的乙二胺四乙酸二钠，pH8.0的缓冲液进行置换洗滤，浓缩至原体积的1/10，体积为6L，质粒浓度为280μg/ml；
（24）在上述超滤浓缩液中加入终浓度为0.5mol/L的辛酸钠，混匀后，常温放置2小时后，2-8℃放置1小时后，离心收取上清并用0.5μm滤器过滤，最终收取体积5.7L，质粒DNA 的浓度为258μg/ml，得澄清的超滤浓缩液；
（25）离子交换层析：在澄清的超滤浓缩液中，补入终浓度为0.3mol/L的氯化钠；过预平衡好的DEAE阴离子交换层析柱，平衡阴离子交换层析缓冲液氯化钠浓度为0.3mol/L，乙二胺四乙酸二钠浓度为10mmol/L，三羟基氨基甲烷浓度为100mmol/L，pH值为7.5；用浓度为1.0mol/L氯化钠，10mmol/L的乙二胺四乙酸二钠，100mmol/L的三羟基氨基甲烷，pH值为7.5的洗脱液进行洗脱；收集质粒洗脱峰，洗脱峰体积3.1L，质粒浓度为355μg/ml，得离子交换层析收集液；其中层析色谱图和琼脂凝胶电泳图见图2、3；
（26）疏水层析：在离子交换层析收集液中，补入终浓度为2.0mol/L的硫酸铵，过预平衡好的Phenyl sepharose 4 Fast Flow疏水层析柱，平衡疏水层析缓冲液硫酸铵浓度为2.0mol/L，乙二胺四乙酸二钠浓度为10mmol/L，三羟基氨基甲烷浓度为100mmol/L，pH值为7.5；收集流穿峰。流穿峰体积4.1L，质粒浓度为235μg/ml，得疏水层析收集液；其中层析色谱图和琼脂凝胶电泳图见图4、5；
（27）超滤除盐浓缩：使用中空纤维超滤柱（截留分子量：750kD）对疏水层析收集液进行超滤洗滤，洗滤液为10mmol/L的PBS缓冲液，洗滤5倍，浓缩后质粒浓度为2.3mg/ml，体积325ml，得超滤洗滤浓缩液；
（28）过滤除菌：将超滤洗滤浓缩液使用孔径为0.22μm的滤芯过滤除菌，再用无菌的PBS调节浓度至2.0mg/ml，最终产品体积为355ml，终产品琼脂凝胶电泳图见图6。
实施例二质粒DNA纯化生产各步骤回收率如下表3所示。
| 表3 | DNA浓度（ug/ml） | 体积（L） | 回收率（%） | 总回收率（%） |
| 裂解浓缩液 | 280 | 6 | / | / |
| 辛酸钠处理后裂解浓缩液 | 258 | 5.7 | 87.5 | 87.5 |
| 阴离子交换层析收集液 | 355 | 3.1 | 74.8 | 65.5 |
| 疏水层析收集液 | 235 | 4.1 | 87.6 | 57.4 |
| 除盐浓缩收集液 | 2300 | 0.325 | 77.6 | 44.5 |
| 过滤除菌液 | 2000 | 0.375 | 94.9 | 42.2 |
对比例1 传统三步层析法纯化S蛋白质粒DNA
本对比例示出了一种含新冠S蛋白质粒DNA的纯化方法，具体包含以下步骤：
（1’）2000g含有新冠S蛋白质粒DNA的大肠杆菌湿菌体，按分子克隆指南所述方法进行裂解及中和的混合液；
（2’）采用管式离心机初步澄清后，继续用5.0μm及0.5μm的滤芯组合过滤，并用纯化水冲洗滤芯，得到碱裂解过滤澄清液57L；
（3’）使用孔径为300KD的超滤膜包对碱裂解过滤澄清液进行浓缩，再使用含有10mmol/L的三羟基氨基甲烷，1mmol/L的乙二胺四乙酸二钠，pH8.0的缓冲液进行置换洗滤，浓缩至原体积的1/10，体积为5.5L，质粒浓度为305μg/ml，得超滤浓缩液；
（4’）在上述超滤浓缩液中加入264g/L的硫酸铵固体边加边搅拌，混匀后，常温放置30分钟后，离心收取上清并用0.5μm滤器过滤，最终收取体积6.5L，质粒DNA 的浓度为235μg/ml，得澄清的超滤浓缩液；
（5’）分子筛层析：将澄清的超滤浓缩液过预平衡好的Sepharose 6FF分子筛层析柱，平衡分子筛层析缓冲液硫酸铵浓度为2.1mol/L，乙二胺四乙酸二钠浓度为10mmol/L，三羟基氨基甲烷浓度为100mmol/L，pH值为7.5，并以此作为洗脱液进行洗脱；收集质粒洗脱峰，洗脱峰体积11L，质粒浓度为105μg/ml，得分子筛层析收集液；
（6’）亲和层析：将分子筛层析收集液过预平衡好的Plasmidselect Xtra亲和层析柱，平衡疏水层析缓冲液硫酸铵浓度为2.0mol/L，乙二胺四乙酸二钠浓度为10mmol/L，三羟基氨基甲烷浓度为100mmol/L，pH值为7.5；用浓度为0.3mol/L氯化钠，1.7mol/L硫酸铵，10mmol/L的乙二胺四乙酸二钠，100mmol/L的三羟基氨基甲烷，pH值为7.5的洗脱液进行洗脱，洗脱体积2.1L，质粒浓度为428μg/ml，得亲和层析收集液；
（7’）离子交换层析：将亲和层析收集液用2倍体积的无菌注射用水稀释后，过预平衡好的SURCE30Q离子交换层析柱，平衡离子交换层析缓冲液氯化钠浓度为0.4mol/L，乙二胺四乙酸二钠浓度为10mmol/L，三羟基氨基甲烷浓度为100mmol/L，pH值为7.5；用浓度为1.0mol/L氯化钠，10mmol/L的乙二胺四乙酸二钠，100mmol/L的三羟基氨基甲烷，pH值为7.5的洗脱液进行洗脱，洗脱体积1.5L，质粒浓度为426μg/ml，得离子交换层析收集液；
（8’）超滤除盐浓缩：使用中空纤维超滤柱（截留分子量：750kD）对离子交换层析收集液进行超滤洗滤；洗滤液为10mmol/L的PBS缓冲液，洗滤5倍，浓缩后质粒浓度为2.1mg/ml，体积240ml，得超滤洗滤浓缩液；
（9’）过滤除菌：将超滤洗滤浓缩液使用孔径为0.22μm的滤芯过滤除菌，再用无菌的PBS调节浓度至2.0mg/ml，最终产品体积为242ml。
对比例1传统三步层析法纯化S蛋白质粒DNA各步骤回收率如下表4所示。
| 表4 | DNA浓度（ug/ml） | 体积（L） | 回收率（%） | 总回收率（%） |
| 裂解浓缩液 | 305 | 5.5 | / | / |
| 硫酸铵沉淀 | 235 | 6.5 | 91.1 | 91.1 |
| 分子筛层析 | 105 | 11 | 75.6 | 68.9 |
| 亲和层析 | 428 | 2.1 | 77.8 | 53.6 |
| 离子交换层析 | 426 | 1.5 | 71.1 | 38.1 |
| 除盐浓缩收集液 | 2100 | 0.240 | 78.9 | 30.1 |
| 过滤除菌液 | 2000 | 0.242 | 96.0 | 28.9 |
根据表3、4可知，本发明在低温条件下，将辛酸钠应用于质粒DNA产品的纯化，相比传统采用硫酸铵沉淀纯化方法，不仅操作简便易放大，减少了操作步骤，同时提高了纯化质粒的总回收率（相比传统的总回收率提高了1.46倍），并符合药用标准；而且大大减少了硫酸铵的使用，降低了对操作人员和环境的影响。本发明纯化方法纯化效果好而且纯化过程大大减少了硫酸铵试剂的使用，重复性强，操作简单，可满足工业产业化纯化生产要求。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种质粒DNA的产业化纯化方法，其特征在于，其包括以下步骤：在质粒DNA超滤浓缩液中加入辛酸钠，混匀后，常温放置一段时间，接着低温静置一定时间，然后澄清处理；然后依次进行离子交换层析、疏水层析、超滤除盐浓缩和过滤除菌，完成纯化。
2.根据权利要求1所述的质粒DNA的产业化纯化方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
（1）在质粒DNA超滤浓缩液中加入辛酸钠，混匀后，常温放置一段时间，接着低温静置一定时间，然后进行澄清处理，得到澄清的超滤浓缩液；
（2）离子交换层析：在步骤（1）获得的澄清后的超滤浓缩液中加入氯化钠，过阴离子交换柱，洗脱收集洗脱峰，得阴离子交换层析收集液；
（3）疏水层析：在步骤（2）获得的阴离子交换层析收集液中加入硫酸铵后，过疏水层析柱，收集流穿峰，得疏水层析收集液；
（4）超滤除盐浓缩：将步骤（3）获得的疏水层析收集液进行浓缩洗虑，得超滤洗虑浓缩液；
（5）过滤除菌：将步骤（4）获得的超滤洗虑浓缩液进行除菌过滤，并进行相应的稀释配制，使质粒DNA浓度符合药用标准。
3.根据权利要求1或2所述的质粒DNA的产业化纯化方法，其特征在于，所述辛酸钠终浓度为0.2~0.5mol/L。
4.根据权利要求1或2所述的质粒DNA的产业化纯化方法，其特征在于，所述低温静置的低温为2~8℃。
5.根据权利要求4所述的质粒DNA的产业化纯化方法，其特征在于，所述低温静置一定时间为30~60min。
6.根据权利要求2所述的质粒DNA的产业化纯化方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述氯化钠终浓度为0.2~0.5mol/L。
7.根据权利要求6所述的质粒DNA的产业化纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换柱中，平衡缓冲液的三羟基氨基甲烷浓度为50~100mmol/L，乙二胺四乙酸二钠浓度为1-10mmol/L，pH值为7.0~8.0。
8.根据权利要求2所述的质粒DNA的产业化纯化方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述硫酸铵终浓度为2.0mol/L。
9.根据权利要求8所述的质粒DNA的产业化纯化方法，其特征在于，所述疏水层析柱中，平衡缓冲液的三羟基氨基甲烷浓度为50~100mmol/L，乙二胺四乙酸二钠浓度为1~10mmol/L，pH值为7.0~8.0。
10.一种质粒DNA，其特征在于，其经过如权利要求1至9任一所述的产业化纯化方法纯化获得。
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