CN110229229A - 一种从牛血浆中提取纯化细胞培养级牛血清白蛋白的生产方法及其应用 - Google Patents

一种从牛血浆中提取纯化细胞培养级牛血清白蛋白的生产方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种从牛血浆中提取纯化细胞培养级牛血清白蛋白的生产方法，属于生物化学技术领域。本发明所述方法以牛血浆为原料，依次包括热变性、一次超滤、上SP Sepharose FF柱、二次超滤、上DEAE Sepharose FF柱、三次超滤和冻干的步骤。本发明经热变性和多次超滤、柱层析，提取纯化得到细胞培养级牛血清白蛋白，牛血清白蛋白的纯度(质量百分比)≥98％；且无蛋白酶、无IgG、脂肪酸含量(质量百分比)≤0.02％、内毒素含量≤1.0EU/mg。另外，本发明在提取纯化牛血清白蛋白过程中未使用硫酸铵，对环境友好。

Description

一种从牛血浆中提取纯化细胞培养级牛血清白蛋白的生产方 法及其应用
技术领域
本发明涉生物化学技术领域，具体涉及一种从牛血浆中提取纯化细胞培养级牛血清白蛋白的生产方法及其应用。
背景技术
牛血清白蛋白(BSA)是生物学、医学和药学等领域广泛应用的生化试剂。常用的提取方法有低温乙醇法、利凡诺法、硫酸铵盐析法、热提取法等。
《牛血清白蛋白纯化工艺的改进》(徐云远等，兰州大学生物系，甘肃科学学报，1991.1(总第6期))文献中，采用硫酸铵盐析、上清酸沉淀、加辛酸钠热变性、再次硫酸铵盐析、上清再次酸沉淀、除盐、冻干，得到产品。同种方法反复使用，而且产品纯度只有90％。《直接加热处理法生产牛血清白蛋白的工艺研究》(田荣华等，绵阳生物工程研究中心，四川师范大学学报，2000.123)文献中，血浆稀释后，加入适当的稳定剂和蛋白沉淀剂，在pH5.2～5.4之间，温度65～75℃之间，保温15～60分钟后过滤等，制得产品。该文献中提及产品纯度不低于95％，但其仅是小规模试验，在规模化生产试验中，仅一步热处理工艺过于简单，纯度很难达到95％。
市面上普遍需要纯度98％以上，无蛋白酶，无IgG、极低脂肪酸和内毒素的细胞培养级的牛血清白蛋白。国内尚无厂家生产这种高规格的产品，只能依赖进口。但血液制品的进口限制很多，因此给用户带来困扰。
发明内容
有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种从牛血浆中提取纯化细胞培养级牛血清白蛋白的生产方法及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种从牛血浆中提取纯化细胞培养级牛血清白蛋白的生产方法，所述方法以牛血浆为原料，依次包括热变性、一次超滤、上SP Sepharose FF柱、二次超滤、上DEAE Sepharose FF柱、三次超滤和冻干的步骤。
优选的，所述细胞培养级牛血清白蛋白的纯度(质量百分比)≥98％；所述细胞培养级牛血清白蛋白中无蛋白酶、无IgG、脂肪酸含量(质量百分比)≤0.02％、内毒素含量≤1.0EU/mg。
优选的，所述热变性为：将所述牛血浆与水混合，得到热变性混合液；将所述热变性混合液加热、调节pH，保温处理后压滤；所述牛血浆与水混合的体积比为1：(0.6～1.0)；所述加热后的热变性混合液的温度为60～65℃；所述调节pH后的热变性混合液的pH值为5.0～5.6；所述保温处理的时间为1.5～3h；所述压滤后收集压滤液，冷却。
优选的，本发明向所述热变性混合液中加入辛酸钠；所述辛酸钠的质量与所述牛血浆的体积比为(0.4～0.8)kg：100L。
优选的，所述一次超滤的截留分子量≤20kD；所述一次超滤后换液为柠檬酸-柠檬酸钠Buffer；所述柠檬酸-柠檬酸钠Buffer的pH值为5.0～5.4；所述柠檬酸-柠檬酸钠Buffer的浓度为15～25mmol/L。
优选的，所述上SP Sepharose FF柱后，收集流穿峰。
优选的，所述二次超滤的截留分子量≤20kD；所述二次超滤后换液为PBS Buffer；所述PBS Buffer的pH值为6.3～6.7；所述PBS Buffer的浓度为9～11mmol/L。
优选的，所述上DEAE Sepharose FF柱后，用PBS Buffer洗脱；所述PBS Buffer的pH值为6.3～6.7；所述PBS Buffer的浓度为9～11mmol/L；收集洗脱液。
优选的，所述三次超滤的截留分子量≤20kD；所述三次超滤后换液为水循环超滤洗涤。
本发明还提供了上述方法生产得到的牛血清白蛋白在细胞培养或生产诊断试剂、生化试剂中的应用。
有益效果：本发明提供了一种从牛血浆中提取纯化细胞培养级牛血清白蛋白的生产方法，所述方法以牛血浆为原料，依次包括热变性、一次超滤、上SP Sepharose FF柱、二次超滤、上DEAE Sepharose FF柱、三次超滤和冻干的步骤。本发明经热变性和多次超滤、柱层析，提取纯化得到细胞培养级牛血清白蛋白，牛血清白蛋白的纯度(质量百分比)≥98％；且无蛋白酶、无IgG、脂肪酸含量(质量百分比)≤0.02％、内毒素含量≤1.0EU/mg。另外，本发明在提取纯化牛血清白蛋白过程中未使用硫酸铵，对环境友好。
具体实施方式
本发明提供了一种从牛血浆中提取纯化细胞培养级牛血清白蛋白的生产方法，所述方法以牛血浆为原料，依次包括热变性、一次超滤、上SP Sepharose FF柱、二次超滤、上DEAE Sepharose FF柱、三次超滤和冻干的步骤。
本发明以牛血浆为原料，制备细胞培养级牛血清白蛋白。本发明对所述牛血浆的制备方法不作特别限定，本领域常规方法均可。
本发明所述热变性优选为：将所述牛血浆与水混合，得到热变性混合液；将所述热变性混合液加热、调节pH，保温处理后压滤。在本发明中，所述水优选为二级反渗透水。所述牛血浆与水混合的体积比优选为1：(0.6～1.0)，更优选为1：(0.7～0.9)，更优选为1：0.8；所述加热后的热变性混合液的温度优选为60～65℃，更优选为62～63℃；所述调节pH后的热变性混合液的pH值优选为5.0～5.6，更优选为5.2～5.4，更优选为5.3；所述保温处理的时间优选为1.5～3h，更优选为2～2.5h；本发明优选趁热压滤，所述压滤后收集压滤液，冷却。本发明所述热变性操作能去除血浆中的大部分杂蛋白，白蛋白纯度能达到90％左右。
本发明优选向所述热变性混合液中加入辛酸钠；所述辛酸钠的质量与所述牛血浆的体积比优选为(0.4～0.8)kg：100L，更优选为0.6kg：100L。本发明在热变性时加入少量的辛酸钠保护剂，辛酸钠与白蛋白结合后，提高了白蛋白的耐热性，使白蛋白在加热时不易变性沉淀，而免疫球蛋白等杂蛋白变性沉淀下来，从而去除了大部分杂蛋白。
本发明所述一次超滤的截留分子量优选≤20kD；所述一次超滤后优选换液为柠檬酸-柠檬酸钠Buffer；所述柠檬酸-柠檬酸钠Buffer的pH值优选为5.0～5.4，更优选为5.2；所述柠檬酸-柠檬酸钠Buffer的浓度优选为15～25mmol/L，更优选为20mmol/L。
本发明所述上SP Sepharose FF柱能去除残留的蛋白酶和IgG。所述上SPSepharose FF柱后，收集流穿峰。然后进行二次超滤，所述二次超滤的截留分子量优选≤20kD；所述二次超滤后优选换液为PBS Buffer；所述PBS Buffer的pH值优选为6.3～6.7，更优选为6.5；所述PBS Buffer的浓度优选为9～11mmol/L，更优选为10mmol/L。
本发明所述上DEAE Sepharose FF柱能去除内毒素。所述上DEAE Sepharose FF柱后，优选用PBS Buffer洗脱；所述PBS Buffer的pH值优选为6.3～6.7，更优选为6.5；所述PBS Buffer的浓度优选为9～11mmol/L，更优选为10mmol/L。
本发明洗脱后，收集洗脱液。然后进行三次超滤。所述三次超滤的截留分子量优选≤20kD；所述三次超滤后优选换液为水，循环进行超滤洗涤操作。在本发明中，所述水优选为二级反渗透水。
本发明对所述一次超滤、二次超滤、三次超滤的超滤用装置不作特别限定，本领域常规操作用装置如中空纤维超滤器等均可。
本发明还提供了上述方法生产得到的牛血清白蛋白在细胞培养或生产诊断试剂、生化试剂中的应用。本发明所述方法生产得到的牛血清白蛋白纯度(质量百分比)≥98％；且无蛋白酶、无IgG、脂肪酸含量(质量百分比)≤0.02％、内毒素含量≤1.0EU/mg，适于应用到细胞培养或诊断试剂、生化试剂的生产。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1：
在GMP车间规模化生产：
(1)热变性：牛血浆加入0.6～1.0倍血浆体积的二级反渗透水稀释，边加热边搅拌，同时加入血浆体积0.4～0.8％重量的辛酸钠作为保护剂，辛酸钠与白蛋白结合后，提高了白蛋白的耐热性，使白蛋白在加热时不易变性沉淀，而免疫球蛋白等杂蛋白变性沉淀下来，从而去除了大部分杂蛋白；加热至60～65℃后，调节pH至5.0～5.6之间，保温1.5～3小时。趁热压滤，收集压滤液，冷却后泵入截留分子量20kD的中空纤维超滤器中，进行超滤浓缩并换液为pH 5.2的20mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠Buffer，为下步上柱准备了白蛋白浓缩液作为上样液。
(2)上SP Sepharose FF柱：将步骤(1)换液后的白蛋白浓缩液，泵入已平衡的SPSepharose FF柱中，白蛋白直接流穿出，而残留的杂蛋白吸附在柱中，用1mol/L的NaCl洗柱再生；收集流穿峰，泵入截留分子量20kD的中空纤维超滤器中，进行超滤浓缩并换液为pH6.5的10mmol/L的PBS Buffer，为下步上柱准备了白蛋白浓缩液作为上样液。
(3)上DEAE Sepharose FF柱：将步骤(2)换液后的白蛋白浓缩液，泵入已平衡的DEAE Sepharose FF柱中，白蛋白和内毒素都吸附在柱上，用含0.2mol/L的NaCl的pH 6.5的10mmol/L的PBS Buffer洗脱，白蛋白洗脱下来而内毒素仍然吸附在柱上，再用0.5mol/L的NaOH水解、洗出内毒素而再生柱；收集洗脱液，泵入截留分子量20kD的中空纤维超滤器中，进行超滤浓缩并加二级反渗透水循环超滤，以洗去NaCl、缓冲液和小分子杂质等，收集浓缩液后冷冻干燥，制得细胞培养级牛血清白蛋白。产品纯度≥98％，无蛋白酶，无IgG，脂肪酸含量≤0.02％，内毒素≤1.0EU/mg。
实施例2
牦牛在屠宰时，预先在接血池中加入0.6％的柠檬酸钠抗凝剂(用少量二级反渗透水溶解后倒入池中)，当血液流入池中时不断搅拌；经105型管式离心机分离，制备牦牛血浆500L。
牦牛血浆加入400L二级反渗透水(电导率≤5.0μS/cm)稀释，边加热边搅拌，同时加入3公斤辛酸钠；加热至63℃后，调节pH至5.3，保温2小时。趁热压滤，收集压滤液，冷却后泵入截留分子量20kD的中空纤维超滤器中，进行超滤浓缩并换液为pH 5.2的20mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠Buffer。
将上步换液后的白蛋白浓缩液，泵入已平衡的SP Sepharose FF柱中(柱径630mm，柱高450mm，Millipore公司生产)，白蛋白直接流穿出，收集流穿峰，泵入截留分子量20kD的中空纤维超滤器中，进行超滤浓缩并换液为pH 6.5的10mmol/L的PBS Buffer；层析柱用1mol/L的NaCl洗去吸附的杂蛋白而再生，再用pH 5.2的20mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠Buffer平衡，待下一批次样液上柱。
将上步换液后的白蛋白浓缩液，泵入已平衡的DEAE Sepharose FF柱中(柱径630mm，柱高450mm，Millipore公司生产)，白蛋白和内毒素都吸附在柱上，用含0.2mol/L的NaCl的pH 6.5的10mmol/L的PBS Buffer洗脱，白蛋白洗脱下来而内毒素仍然吸附在柱上；收集洗脱液，泵入截留分子量20kD的中空纤维超滤器中，进行超滤浓缩并加二级反渗透水循环超滤，收集浓缩液后冷冻干燥，制得细胞培养级牛血清白蛋白；层析柱用0.5mol/L的NaOH水解、洗出内毒素而再生，再用pH 6.5的10mmol/L的PBS Buffer平衡，待下一批次样液上柱。
经热变性、两次柱层析后，产品纯度达98.7％，无蛋白酶，无IgG、脂肪酸含量0.016％，内毒素0.8EU/mg。
实施例3
牦牛在屠宰时，预先在接血池中加入0.5％的柠檬酸钠抗凝剂(用少量二级反渗透水溶解后倒入池中)，当血液流入池中时不断搅拌；经105型管式离心机分离，制备牦牛血浆600L。
牦牛血浆加入400L二级反渗透水(电导率≤5.0μS/cm)稀释，边加热边搅拌，同时加入4.8公斤辛酸钠；加热至65℃后，调节pH至5.5，保温1.5小时。趁热压滤，收集压滤液，冷却后泵入截留分子量20kD的中空纤维超滤器中，进行超滤浓缩并换液为pH 5.2的20mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠Buffer。
将上步换液后的白蛋白浓缩液，泵入已平衡的SP Sepharose FF柱中(柱径630mm，柱高450mm，Millipore公司生产)，白蛋白直接流穿出，收集流穿峰，泵入截留分子量20kD的中空纤维超滤器中，进行超滤浓缩并换液为pH 6.5的10mmol/L的PBS Buffer；层析柱用1mol/L的NaCl洗去吸附的杂蛋白而再生，再用pH 5.2的20mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠Buffer平衡，待下一批次样液上柱。
将上步换液后的白蛋白浓缩液，泵入已平衡的DEAE Sepharose FF柱中(柱径630mm，柱高450mm，Millipore公司生产)，白蛋白和内毒素都吸附在柱上，用含0.2mol/L的NaCl的pH 6.5的10mmol/L的PBS Buffer洗脱，白蛋白洗脱下来而内毒素仍然吸附在柱上；收集洗脱液，泵入截留分子量20kD的中空纤维超滤器中，进行超滤浓缩并加二级反渗透水循环超滤，收集浓缩液后冷冻干燥，制得细胞培养级牛血清白蛋白；层析柱用0.5mol/L的NaOH水解、洗出内毒素而再生，再用pH 6.5的10mmol/L的PBS Buffer平衡，待下一批次样液上柱。
经热变性、两次柱层析后，产品纯度达98.3％，无蛋白酶，无IgG、脂肪酸含量0.018％，内毒素0.9EU/mg。
实施例4
黄牛在屠宰时，预先在接血池中加入0.5％的柠檬酸钠抗凝剂(用少量二级反渗透水溶解后倒入池中)，当血液流入池中时不断搅拌；经105型管式离心机分离，制备黄牛血浆600L。
黄牛血浆加入400L二级反渗透水(电导率≤5.0μS/cm)稀释，边加热边搅拌，同时加入2.4公斤辛酸钠；加热至60℃后，调节pH至5.0，保温3小时。趁热压滤，收集压滤液，冷却后泵入截留分子量20kD的中空纤维超滤器中，进行超滤浓缩并换液为pH 5.2的20mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠Buffer。
将上步换液后的白蛋白浓缩液，泵入已平衡的SP Sepharose FF柱中(柱径630mm，柱高450mm，Millipore公司生产)，白蛋白直接流穿出，收集流穿峰，泵入截留分子量20kD的中空纤维超滤器中，进行超滤浓缩并换液为pH 6.5的10mmol/L的PBS Buffer；层析柱用1mol/L的NaCl洗去吸附的杂蛋白而再生，再用pH 5.2的20mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠Buffer平衡，待下一批次样液上柱。
将上步换液后的白蛋白浓缩液，泵入已平衡的DEAE Sepharose FF柱中(柱径630mm，柱高450mm，Millipore公司生产)，白蛋白和内毒素都吸附在柱上，用含0.2mol/L的NaCl的pH 6.5的10mmol/L的PBS Buffer洗脱，白蛋白洗脱下来而内毒素仍然吸附在柱上；收集洗脱液，泵入截留分子量20kD的中空纤维超滤器中，进行超滤浓缩并加二级反渗透水循环超滤，收集浓缩液后冷冻干燥，制得细胞培养级牛血清白蛋白；层析柱用0.5mol/L的NaOH水解、洗出内毒素而再生，再用pH 6.5的10mmol/L的PBS Buffer平衡，待下一批次样液上柱。
经热变性、两次柱层析后，产品纯度达98.0％，无蛋白酶，无IgG、脂肪酸含量0.02％，内毒素1.0EU/mg。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种从牛血浆中提取纯化细胞培养级牛血清白蛋白的生产方法，其特征在于，所述方法以牛血浆为原料，依次包括热变性、一次超滤、上SP Sepharose FF柱、二次超滤、上DEAE Sepharose FF柱、三次超滤和冻干的步骤。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述细胞培养级牛血清白蛋白的纯度≥98％；所述细胞培养级牛血清白蛋白中无蛋白酶、无IgG、脂肪酸含量≤0.02％、内毒素含量≤1.0EU/mg。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述热变性为：将所述牛血浆与水混合，得到热变性混合液；将所述热变性混合液加热、调节pH，保温处理后压滤；所述牛血浆与水混合的体积比为1：(0.6～1.0)；所述加热后的热变性混合液的温度为60～65℃；所述调节pH后的热变性混合液的pH值为5.0～5.6；所述保温处理的时间为1.5～3h；所述压滤后收集压滤液，冷却。
4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，向所述热变性混合液中加入辛酸钠；所述辛酸钠的质量与所述牛血浆的体积比为(0.4～0.8)kg：100L。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述一次超滤的截留分子量≤20kD；所述一次超滤后换液为柠檬酸-柠檬酸钠Buffer；所述柠檬酸-柠檬酸钠Buffer的pH值为5.0～5.4；所述柠檬酸-柠檬酸钠Buffer的浓度为15～25mmol/L。
6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述上SP Sepharose FF柱后，收集流穿峰。
7.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述二次超滤的截留分子量≤20kD；所述二次超滤后换液为PBS Buffer；所述PBS Buffer的pH值为6.3～6.7；所述PBS Buffer的浓度为9～11mmol/L。
8.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述上DEAE Sepharose FF柱后，用PBS Buffer洗脱；所述PBS Buffer的pH值为6.3～6.7；所述PBS Buffer的浓度为9～11mmol/L；收集洗脱液。
9.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述三次超滤的截留分子量≤20kD；所述三次超滤后换液为水循环超滤洗涤。
10.权利要求1～9任意一项所述方法生产得到的牛血清白蛋白在细胞培养或生产诊断试剂、生化试剂中的应用。
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