CN111087443A - 一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法 - Google Patents
一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111087443A CN111087443A CN201811236669.5A CN201811236669A CN111087443A CN 111087443 A CN111087443 A CN 111087443A CN 201811236669 A CN201811236669 A CN 201811236669A CN 111087443 A CN111087443 A CN 111087443A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- elution
- buffer solution
- urine
- hpo
- buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 title claims abstract description 98
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 97
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims abstract description 22
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 71
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 61
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 43
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 38
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 32
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 32
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 30
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 27
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 20
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 19
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 14
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 14
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 claims description 9
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 8
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 7
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 claims description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 102000003966 Alpha-1-microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 101800001761 Alpha-1-microglobulin Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012404 Orosomucoid Human genes 0.000 description 2
- 108010061952 Orosomucoid Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 2
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 2
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 2
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 102000003888 major urinary proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000280 major urinary proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003895 organic fertilizer Substances 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
Abstract
本发明提供一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法，所述方法利用特定吸附剂对尿液中多种蛋白质的同时亲和捕获与从吸附剂上的分阶段特定洗脱，包括以下步骤：1)收集尿液，进行透析、离心和过滤；2)制备Cibacron Blue F3‑GA‑琼脂糖凝胶亲和吸附剂，装柱并平衡；3)将尿液上样，静置；4)分阶段洗脱，收集各个阶段的洗脱级分。本发明的方法能够从同一批尿液中平行地一次提取出不少于八种高价值的尿蛋白，显著提高了尿蛋白的分离提取效率，使尿液作为特定生物资源得到充分利用。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白提取技术，更具体而言，本发明涉及一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法。
背景技术
一个健康成人每天排出体外的尿液平均为1.5升，因此城市每天(24小时)排出体外的尿液量是非常巨大的数字，而人类的尿液里含有多达1500余种蛋白质，其中很多蛋白质有相当高的科研、医疗和经济价值。因此，如果能从人尿液中分离提取并纯化尿蛋白，经济价值将相当可观；并且，处理后的尿液残渣还可以作为农业有机肥料使用，变废为宝，同时还解决了尿液产生的环境问题。
现在从人尿液中分离提取的尿蛋白一般仅限于四种：尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制剂乌司他丁、白蛋白和β2-微球蛋白，另有少数企业能够从孕妇的尿液中分离提取出人绒毛膜促性腺激素(简称hCG)，但是限于原料不易获取，所以生产成本较高。目前已知的从尿液中分离提取尿蛋白的生产工艺都只能从一批尿液中同时提取出最多两种蛋白质，一般仅能够从同一批尿液中分离提取出一种尿蛋白；并且，这些生产工艺往往粗制和精制合一，纯化一种尿蛋白只能从头做到底，没有选择的余地，不能根据市场的要求有效、灵活地调整生产的具体产品的类型和产量。
因此，本领域仍需要能够从尿液中同时提取多种尿蛋白的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种从尿液中提取多种蛋白质的方法，特别是该方法能够从同一批次尿液中吸附和洗脱出多种尿蛋白，从而使尿液作为特定生物资源得到充分利用；同时，考虑到获取的尿蛋白的多样性和专一性之间的关系，该方法还能够通过限制吸附的尿蛋白的数量，使得洗脱液中所包含的不同种类的尿蛋白数量适当，容易用分子筛层析或离子交换层析加以分离为单一种类的尿蛋白，为最终的精制提供很有价值的基础。
为了解决上述技术问题，本发明的发明人提供一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法，该方法主要利用特定吸附剂对尿液中多种蛋白质的同时亲和捕获与从吸附剂上的分阶段特定洗脱。具体而言，本发明的方法包括以下步骤：
1)收集尿液，进行透析、离心和过滤；
2)制备Cibacron Blue F3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂，装柱并平衡；
3)将尿液在亲和层析柱上样，上样后在室温下静置；
4)分阶段洗脱，收集各个阶段的洗脱级分。
根据本发明的方法，步骤1)中，所述尿液为哺乳动物尿液，优选为人的尿液；根据本发明的具体实施方式，从可建立有特殊的收集装置的公共厕所收集人排出体外的尿液，对所述尿液进行过滤，所述过滤采用10nm≤孔径≤15nm的纳滤膜进行，或者所述过滤先采用20nm≤孔径的超滤膜进行，然后再采用10nm≤孔径≤15nm的纳滤膜进行。
步骤1)中，所述透析可以是自由扩散透析或搅拌透析，例如参见余瑞元等人，《生物化学实验原理与方法》，北京大学出版社，2005，第二版。
根据本发明的方法，优选地，所述透析包括以1-2倍体积的缓冲溶液对尿液透析过夜或透析6-8hr，其中所述缓冲溶液为50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、20mMNaH2PO4/Na2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)；
优选地，所述透析先在水中透析过夜，然后在所述缓冲溶液中透析过夜。
接下来，需要对经透析的尿液进行离心和过滤处理。根据本发明的方法，步骤1)中，所述离心包括：将透析液在10,000g-12,000g的重力下离心40min-60min；优选地，所述过滤包括取离心得到的上清液，经0.22μm滤器过滤。
根据本发明的方法，需要准备亲和层析介质。本发明的方法采用Cibacron BlueF3-GA作为亲和配体，琼脂糖凝胶(例如Sepharose 4B)作为载体，二者偶联得到亲和吸附剂进行装柱。因此，步骤2)中，所述Cibacron Blue F3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂通过偶联Cibacron Blue F3-GA和琼脂糖凝胶例如Sepharose 4B制备得到；
优选地，所述制备Cibacron Blue F3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂包括以下步骤：
A.水洗得到湿琼脂糖凝胶4B，并在室温下分散在体积为干胶体积至少十倍的水中，混匀；
B.将Cibacron Blue F3-GA在室温下溶解于至少十倍体积的水中，混匀；
C.在温和搅拌下，使Cibacron Blue F3-GA与湿琼脂糖凝胶以1:100的质量比充分混合；
D.加入20％氯化钠溶液，室温下放置30min，再加入15％碳酸钠溶液，室温下偶联1h，得到亲和吸附剂；
E.用10-30℃、优选20-25℃的水、6M尿素和1％碳酸钠溶液依次洗涤亲和吸附剂，直至洗涤液无色。
备选地，也可以采用Cibacron Blue F3-GA与CNBr活化琼脂糖凝胶4B偶联制备亲和吸附剂。
采用本领域常规方法将得到的亲和吸附剂装柱。优选地，步骤2)中，所述装柱得到柱体积为10-25ml、优选10ml的亲和层析柱。
在上样前，需要进行亲和层析柱的平衡操作。根据本发明的方法，所述平衡中，以20mM NaH2PO4/Na2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)作为平衡缓冲溶液，以1-3ml/min的流速冲洗亲和层析柱；
进一步优选地，所述平衡中采用至少3倍柱体积的平衡缓冲溶液。
根据本发明的方法，亲和层析柱连接上检测器，选择280nm的检测波长，在亲和柱平衡完成后(观察电导和pH的数值变化趋势)，进行该柱的上样。其中，步骤3)中，所述上样包括将经步骤1)得到的尿液以1-3ml/min的流速流过步骤2)中制备的亲和层析柱；优选地，所述尿液的体积为亲和层析柱中的亲和层析介质的体积的2-6倍、优选2.5-3倍。
上样后，静置一段时间而不是立刻洗脱能够提高吸附效率。优选地，所述静置包括在室温下静置30min-1hr。
根据本发明的方法，采用分阶段洗脱来获得尿液中的多种蛋白质。其中，步骤4)中，所述分阶段洗脱包括采用磷酸钾缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液的第一阶段洗脱、采用包含NaCl的磷酸钾缓冲溶液、磷酸钠缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液的第二阶段洗脱和采用包含NaSCN的磷酸钾缓冲溶液、磷酸钠缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液的第三阶段洗脱；
优选地，所述第一阶段洗脱包括：
以50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)作为洗脱缓冲溶液，以1-3ml/min的流速冲洗亲和层析柱；
优选地，将50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)作为洗脱缓冲溶液；
优选地，所述第一阶段洗脱中采用5-15倍柱体积的洗脱缓冲溶液。
优选地，所述步骤1)的透析中使用的缓冲溶液和/或所述步骤2)的平衡中使用的缓冲溶液与第一阶段洗脱中采用的洗脱缓冲溶液相同。
这一阶段的洗脱能够监测到一个巨大的洗脱峰+流穿峰，这个峰的洗脱级分含有多种尿蛋白，自检测器在280nm下检测到吸收峰的出现开始收集洗脱峰对应的洗脱级分，直到吸收值重新回到初始值。
优选地，所述第二阶段洗脱为包含NaCl的磷酸钾缓冲溶液、磷酸钠缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液洗脱，包括：
以0-1.0M NaCl+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或0-1.0M NaCl+20mM NaH2PO4/Na2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或0-1.0M NaCl+10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)作为洗脱缓冲溶液，以1-3ml/min的流速冲洗亲和层析柱。
优选地，所述第二阶段洗脱中采用5-10倍柱体积的洗脱缓冲溶液(具体的洗脱体积可以观察层析系统的监视器显示的mAU曲线显示的洗脱峰的出现和结束而确定具体的洗脱体积)；优选地，所述第二阶段洗脱为NaCl的连续线性浓度的梯度洗脱，洗脱过程中，NaCl在洗脱缓冲溶液中的浓度从0M逐渐增加至1.0M。
其中NaCl的连续线性浓度通过层析系统的梯度混合器形成。例如将50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)作为A液，1.0M NaCl+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)作为B液，通过层析系统的梯度混合器形成NaCl浓度范围为0-1.0M的连续线性梯度。
更优选地，以0M NaCl+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)作为初始的洗脱缓冲溶液，洗脱3-5个柱体积，期间将NaCl在洗脱缓冲溶液中的浓度逐渐从0M增加至1.0M，然后NaCl达到恒定浓度时再洗脱3-5个柱体积。
第二个洗脱阶段的洗脱自检测器在280nm下检测到吸收峰的出现开始收集洗脱峰对应的洗脱级分，可分别收集，直到吸收值重新回到初始值。
优选地，所述第三阶段洗脱为包含NaSCN的磷酸钾缓冲溶液、磷酸钠缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液洗脱，包括：
以0.5-1.0M NaSCN+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、0.5-1.0MNaSCN+20mM NaH2PO4/Na2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或0.5-1.0M NaSCN+10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)作为洗脱缓冲溶液，以1-3ml/min的流速冲洗亲和层析柱；
优选地，0.5M NaSCN+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)作为洗脱缓冲溶液；
优选地，所述第三阶段洗脱中采用5-15倍柱体积的洗脱缓冲溶液(具体的洗脱体积可以观察层析系统的监视器显示的mAU曲线显示的洗脱峰的出现和结束而确定具体的洗脱体积)。
这一阶段的洗脱自检测器在280nm下检测到吸收峰的出现开始收集洗脱峰对应的洗脱级分，直到吸收值重新回到初始值。
根据本发明的方法，步骤4)中，所述三个阶段的洗脱流速是相同的；
优选地，步骤4)中，所述收集各个阶段的洗脱级分包括根据检测到的280nm下的吸收峰来收集对应的洗脱产物；
优选地，所述方法中，通过检测在280nm下的吸光度来监测所述平衡、上样和/或分阶段洗脱。
对于获得的洗脱级分，可以用比浊法、ELISA等方法检测有关尿蛋白的种类和浓度。收集到尿蛋白粗品可以进行液氮冷却条件下冻干或者浓缩。
与现有技术相比，本发明提供了一种新型的从尿液中提取多种蛋白质的方法，已经证明，该方法能够从同一批尿液中平行地一次提取出不少于八种高价值的尿蛋白：α1-微球蛋白(Alpha-1-microglobulin)、转铁蛋白(Transferrin)、β2-微球蛋白(Beta-2-microglobulin)、IgA、IgG、IgM、α1-抗胰蛋白酶(Alpha-1-Antitrypsin)、α1-酸性糖蛋白(Orosomucoid或Alpha-1-acid glycoprotein)，大大提高了尿液蛋白质的提取效率。
并且，本发明的方法在一次性分离提取出多种高价值尿蛋白的同时，还实现了极高的富集效率。本领域已知，健康人的尿液中蛋白质的总浓度为13.3mg/L-53.3mg/L(24小时尿液)，本发明的方法可以一次性从尿液中吸附得到近20mg/L的总蛋白，显著提高了尿蛋白的分离提取效率。
此外，本发明的方法提取的尿蛋白除了蛋白质分子的固有性质之外，最大限度地保留了尿蛋白的活性，为尿蛋白的精制以及下游应用提供了丰富的、高质量的、多样化的生产原料。并且在本发明的方法的操作过程中，在保证生产有效性的同时，还充分考虑到生产者操作时的安全性——该方法完全避免使用强酸强碱和带有腐蚀性的试剂，最大限度地避免试剂对于人员健康的可能损伤和对于环境的可能污染。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1本发明的方法的优化
(一)透析溶液、平衡缓冲溶液与洗脱流动相
含目标蛋白的液体样品在上样、结合以及洗脱过程中不可避免地需要用到缓冲溶液或流动相。层析柱的平衡缓冲溶液、上样缓冲溶液(在本发明的方法中即对尿液进行透析处理使的透析液)以及洗脱时的流动相可以相同，也可以不同。经过优化，本发明的方法优选使用相同的平衡缓冲溶液、上样缓冲溶液与洗脱流动相。因为这样层析开始时不会引起层析环境变化，导致对特异性蛋白质吸附的不良影响。
平衡缓冲溶液、上样缓冲溶液、洗脱流动相可以选择：
50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)；
20mM NaH2PO4/Na2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)；或
10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)。
经过多次测试(测定结果直接用亲和层析柱的洗脱峰读出各个洗脱峰的mAU值进行选择)，最后确定50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)作为上样缓冲溶液、平衡缓冲溶液、洗脱流动相效果最好。10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)不被优选的原因是，正常人的尿液的pH约为6.0，10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)偏碱性可能影响尿蛋白的稳定性。
(二)洗脱流动相的进一步优化：
对应于平衡缓冲溶液、上样缓冲溶液、洗脱流动相优选为50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)，三种洗脱溶液相应改变为：
(1)50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)；
(2)线性梯度洗脱缓冲溶液：
A液：50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)
B液：1.0M NaCl溶液+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)
梯度洗脱时，NaCl的浓度从0M至1.0M形成线性梯度。
(3)恒定梯度洗脱缓冲溶液：
0.5-1M NaSCN+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)：
用0.5M NaSCN+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、0.6M NaSCN+50mMKH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、0.7M NaSCN+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、0.8M NaSCN+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、0.9M NaSCN+50mMKH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)和1.0M NaSCN+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)，即分梯度加大NaSCN的摩尔浓度，发现在对应的第三个洗脱峰的mAU值变化不大。
在以上优化过程中，所有试剂和已经透析过夜处理后的健康人的离体尿液在上层析柱之前，均需要进行过滤和超声脱气处理。
(三)其他条件：
流速：一般为1-3ml/min，在此范围内变更流速，从各个洗脱峰的mAU值没有明显变化；
温度：均在室温下进行；
上样后静置：在室温下静置0.5hr至1.0hr，再进行洗脱，显著增加蛋白吸附效果；
冷冻干燥：我们实验的几种尿蛋白均可进行冷冻干燥或加入甘油液相保存，市场上同种蛋白质产品均为冷冻保存或加入甘油液相保存——其产品说明有效期至少2年。
实施例2多种尿蛋白的提取方法
(一)处理尿液
将健康人的离体尿液200ml放入半透膜中，装入自由扩散透析装置浸泡入纯净水透析过夜，再放入50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)透析过夜。然后，取透析过夜后的健康人的离体尿液200ml在10,000g-12,000g的重力下离心40min-60min，去除掉尿液中的沉淀物。取离心后的上清液，然后用0.22μm过滤盘，装在针筒上进行过滤。
(二)准备亲和层析柱
1.制备亲和吸附剂
用水洗琼脂糖凝胶4B(Sepharose 4B)，并将20g湿重琼脂糖凝胶4B散于50ml水中，将200mg Cibacron Blue F3-GA溶于20ml水中，然后用摇床震荡温和搅拌得到琼脂糖凝胶4B分散液和Cibacron Blue F3-GA溶液约1小时。混合琼脂糖凝胶4B分散液和CibacronBlue F3-GA溶液。
向上述混合物中先加入10ml 20％(200g/l)氯化钠溶液，室温下放置30min，再加入20ml 15％(15g/l)碳酸钠溶液，在室温下偶联1小时。之后用温水、6mol/L尿素和1％(10g/l)碳酸钠溶液依次洗涤亲和吸附剂，直至洗涤液无色。
将得到的亲和吸附剂储存于含0.02％叠氮化钠的0.01％碳酸钠溶液中。
上述操作在通风橱中操作，以免CNBr引起中毒。
2.装柱
按照本领域常规方法进行亲和吸附剂的装柱，得到10ml的亲和层析柱。
3.平衡
亲和层析柱连接上检测器，选择280nm的检测波长，同时观察电导和pH的数值变化趋势。
铁架台固定好亲和层析柱，将其进样端用导管连接上蠕动泵，出样端用导管连接上废液缸，蠕动泵的进样端用导管连接上流动相(平衡缓冲溶液)，即50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)，以1-3ml/min的流速、至少3倍的柱体积冲洗该亲和层析柱，直到紫外检测器的UV线回复到基线。
(三)上样
在亲和柱平衡完成后(观察电导和pH的数值变化趋势)，进行该柱的上样。
将亲和层析柱接上进液管和出液管，用蠕动泵提供动力，进液管连接上文经透析、离心和过滤处理的尿液样品，上样的尿液样品为50-60ml，上样时的流速为1-3ml/min。上样后将亲和层析柱在室温下静置30min。
(四)洗脱
以下各阶段洗脱时的流速均为1-3ml/min。
1.第一阶段洗脱：
用50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)作为本阶段的洗脱液，洗脱5-15个柱体积。这一阶段的洗脱能够监测到一个巨大的洗脱峰+流穿峰，这个峰的洗脱级分含有多种尿蛋白，自检测器在280nm下检测到吸收峰的出现开始收集洗脱峰对应的洗脱级分，直到吸收值重新回到初始值。
得到约15ml的洗脱级分(洗脱峰1)。
2.第二阶段洗脱：
以0-1M NaCl+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)作为洗脱缓冲溶液，其中以0M NaCl+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)作为初始的洗脱缓冲溶液，洗脱3-5个柱体积，期间将NaCl在洗脱缓冲溶液中的浓度逐渐从0M增加至1.0M，然后再洗脱3-5个柱体积。
收集洗脱出的级分时，根据在280nm下检测到的洗脱峰进行分别收集，实验完毕后根据顺序给不同的级分编号，直到吸收值重新回到初始值。
得到约10ml的洗脱级分(洗脱峰2)。
3.第三阶段洗脱：
以0.5M NaSCN+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)作为洗脱缓冲溶液，洗脱5-15个柱体积。
收集洗脱出的级分时，根据在280nm下检测到吸收峰的出现开始收集洗脱峰对应的洗脱级分，直到吸收值重新回到初始值。
得到约150ml的洗脱级分(洗脱峰3)。
(五)检测
对洗脱峰1和3分别检测总蛋白质的浓度和有关蛋白质的各自的浓度，检测结果见下表1。
表1.主要尿蛋白的种类和浓度(中日友好医院检验科，比浊法)
健康的成年人的尿中的超过1500种尿蛋白的总浓度是13.3-53.3mg/L(蔡淦等，上海辞书出版社，2001，83；孙兆林、查燕、黄山主编，肾脏标记物临床与检验，人民军医出版社，2014，7)。在获得的两个洗脱峰中，总蛋白浓度与各种尿蛋白浓度证明了本发明的方法的明显富集效果。
重复本发明的方法，将获得的洗脱峰再次进行蛋白检测，结果与表1相同。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (10)
1.一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
1)收集尿液，进行透析、离心和过滤；
2)制备Cibacron Blue F3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂，装柱并平衡；
3)将尿液在亲和层析柱上样，上样后在室温下静置；
4)分阶段洗脱，收集各个阶段的洗脱组分。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述尿液为哺乳动物尿液，优选为人的尿液；优选地，所述尿液为从公共厕所收集的人排出体外的尿液，对所述尿液进行过滤，所述过滤采用10nm≤孔径≤15nm的纳滤膜进行，或者所述过滤先采用20nm≤孔径的超滤膜进行，然后再采用10nm≤孔径≤15nm的纳滤膜进行；
优选地，所述透析为自由扩散透析或搅拌透析，包括以1-2倍体积的缓冲溶液对尿液透析过夜或透析6-8hr，其中所述缓冲溶液为50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、20mM NaH2PO4/Na2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)；
优选地，所述透析先在水中透析过夜，然后在所述缓冲溶液中透析过夜。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述离心包括：将透析液在10,000g-12,000g的重力下离心40min-60min；
优选地，所述过滤包括取离心得到的上清液，经0.22μm滤器过滤。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述CibacronBlue F3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂通过偶联Cibacron Blue F3-GA和琼脂糖凝胶例如Sepharose 4B制备得到；
优选地，所述制备Cibacron Blue F3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂包括以下步骤：
A.水洗得到湿琼脂糖凝胶，并在室温下分散在体积为干胶体积至少十倍的水中，混匀；
B.将Cibacron Blue F3-GA在室温下溶解于至少十倍体积的水中，混匀；
C.在温和搅拌下，使Cibacron Blue F3-GA与湿琼脂糖凝胶以1:100的质量比充分混合；
D.加入20％氯化钠溶液，室温下放置30min，再加入15％碳酸钠溶液，室温下偶联1h，得到亲和吸附剂；
E.用10-30℃、优选20-25℃的水、6M尿素和1％碳酸钠溶液依次洗涤亲和吸附剂，直至洗涤液无色。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述装柱得到柱体积为10-25ml、优选10ml的亲和层析柱；
优选地，所述平衡中，以20mM NaH2PO4/Na2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)作为平衡缓冲溶液，以1-3ml/min的流速冲洗亲和层析柱；
优选地，所述平衡中采用至少3倍柱体积的平衡缓冲溶液。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述上样包括将经步骤1)得到的尿液以1-3ml/min的流速流过步骤2)中制备的亲和层析柱；
优选地，所述尿液的体积为亲和层析柱中的亲和层析介质的体积的2-6倍、优选2.5-3倍；
优选地，所述静置包括在室温下静置30min-1hr。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述分阶段洗脱包括采用磷酸钾缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液的第一阶段洗脱、采用包含NaCl的磷酸钾缓冲溶液、磷酸钠缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液的第二阶段洗脱、和采用包含NaSCN的磷酸钾缓冲溶液、磷酸钠缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液的第三阶段洗脱；
优选地，所述第一阶段洗脱包括：
以50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)作为洗脱缓冲溶液，以1-3ml/min的流速冲洗亲和层析柱；
优选地，将50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)作为洗脱缓冲溶液；
优选地，所述第一阶段洗脱中采用5-15倍柱体积的洗脱缓冲溶液；
优选地，所述步骤1)的透析中使用的缓冲溶液和/或所述步骤2)的平衡中使用的缓冲溶液与第一阶段洗脱中采用的洗脱缓冲溶液相同。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述第二阶段洗脱包括：
以0-1.0M NaCl+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或0-1.0M NaCl+20mMNaH2PO4/Na2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或0-1.0M NaCl+10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)作为洗脱缓冲溶液，以1-3ml/min的流速冲洗亲和层析柱；
优选地，将0-1.0M NaCl+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)作为洗脱缓冲溶液；
优选地，所述第二阶段洗脱中采用5-10倍柱体积的洗脱缓冲溶液；
优选地，所述第二阶段洗脱为NaCl的连续线性浓度的梯度洗脱，洗脱过程中，NaCl在洗脱缓冲溶液中的浓度从0M逐渐增加至1.0M；
更优选地，以0M NaCl+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)作为初始的洗脱缓冲溶液，洗脱3-5个柱体积，期间将NaCl在洗脱缓冲溶液中的浓度逐渐从0M增加至1.0M，然后NaCl达到恒定浓度时再洗脱3-5个柱体积。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述第三阶段洗脱包括：
以0.5-1.0M NaSCN+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、0.5-1.0M NaSCN+20mM NaH2PO4/Na2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或0.5-1.0M NaSCN+10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)作为洗脱缓冲溶液，以1-3ml/min的流速冲洗亲和层析柱；
优选地，0.5M NaSCN+50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)作为洗脱缓冲溶液；
优选地，所述第三阶段洗脱中采用5-15倍柱体积的洗脱缓冲溶液。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述三个阶段的洗脱流速是相同的；
优选地，步骤4)中，所述收集各个阶段的洗脱级分包括根据检测到的280nm下的吸收峰来收集对应的洗脱产物；
优选地，所述方法中，通过检测在280nm下的吸光度来监测所述平衡、上样和/或分阶段洗脱。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811236669.5A CN111087443A (zh) | 2018-10-23 | 2018-10-23 | 一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811236669.5A CN111087443A (zh) | 2018-10-23 | 2018-10-23 | 一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111087443A true CN111087443A (zh) | 2020-05-01 |
Family
ID=70391819
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811236669.5A Pending CN111087443A (zh) | 2018-10-23 | 2018-10-23 | 一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111087443A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111748545A (zh) * | 2020-07-09 | 2020-10-09 | 江苏尤里卡生物科技有限公司 | 一种用琼脂糖凝胶4b吸附尿液中尿激酶的方法 |
| CN112778411A (zh) * | 2021-02-26 | 2021-05-11 | 通用生物系统（安徽）有限公司 | 一种天然β2-微球蛋白的提取方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4285077A (en) * | 1978-04-28 | 1981-08-25 | Braxton Earl Jacob | Apparatus for extracting proteins from urine |
| CN101863974A (zh) * | 2009-07-13 | 2010-10-20 | 广东天普生化医药股份有限公司 | 一种直接富集尿蛋白的方法 |
| CN106699876A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-05-24 | 广东天普生化医药股份有限公司 | 一种从人尿中大规模收集尿蛋白的方法 |
| CN106866812A (zh) * | 2017-02-27 | 2017-06-20 | 日照岚山生化制品有限公司 | 一种从妇女尿液中提取多种尿蛋白的方法 |
-
2018
- 2018-10-23 CN CN201811236669.5A patent/CN111087443A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4285077A (en) * | 1978-04-28 | 1981-08-25 | Braxton Earl Jacob | Apparatus for extracting proteins from urine |
| CN101863974A (zh) * | 2009-07-13 | 2010-10-20 | 广东天普生化医药股份有限公司 | 一种直接富集尿蛋白的方法 |
| CN106699876A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-05-24 | 广东天普生化医药股份有限公司 | 一种从人尿中大规模收集尿蛋白的方法 |
| CN106866812A (zh) * | 2017-02-27 | 2017-06-20 | 日照岚山生化制品有限公司 | 一种从妇女尿液中提取多种尿蛋白的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 樊春祥;张建中;: "尿蛋白质组分析及其在病原生物学领域的应用", 中国病原生物学杂志, no. 03 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111748545A (zh) * | 2020-07-09 | 2020-10-09 | 江苏尤里卡生物科技有限公司 | 一种用琼脂糖凝胶4b吸附尿液中尿激酶的方法 |
| CN112778411A (zh) * | 2021-02-26 | 2021-05-11 | 通用生物系统（安徽）有限公司 | 一种天然β2-微球蛋白的提取方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105153297B (zh) | 一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2-巨球蛋白的方法 | |
| US7488422B2 (en) | Method and apparatus for separating a target molecule from a liquid mixture | |
| CN103998456B (zh) | 用于蛋白质的混合式色谱纯化的固相 | |
| CN104672328B (zh) | 一种人抗凝血酶ⅲ的生产方法 | |
| EP1729867A1 (en) | A method for chromatographic purification | |
| JPH11506603A (ja) | 新規因子ｉｘ精製法 | |
| JP2008542710A (ja) | クロマトグラフィーマトリックスの再生 | |
| US8956535B2 (en) | Single pass method and apparatus for separating a target molecule from a liquid mixture | |
| Ribeiro et al. | Effect of IDA and TREN chelating agents and buffer systems on the purification of human IgG with immobilized nickel affinity membranes | |
| CN111087443A (zh) | 一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法 | |
| CN104725506A (zh) | 一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法 | |
| Pires et al. | Selective protein purification via tangential flow filtration–Exploiting protein-protein complexes to enable size-based separations | |
| Legallais et al. | Strategies for the depyrogenation of contaminated immunoglobulin G solutions by histidine-immobilized hollow fiber membrane | |
| Coffinier et al. | Separation of IgG from human plasma using thiophilic hollow fiber membranes | |
| CN103230784A (zh) | 复合晶胶连续床介质、制备与分离IgG和白蛋白的应用 | |
| CN219308758U (zh) | 一种微流控蛋白纯化芯以及检测系统和双纯化单元芯片 | |
| CN110229229A (zh) | 一种从牛血浆中提取纯化细胞培养级牛血清白蛋白的生产方法及其应用 | |
| CN108059673B (zh) | 一种人血清中分离免疫球蛋白IgG的方法 | |
| CN115651081A (zh) | 一种破伤风抗毒素的纯化方法、层析填料及破伤风抗毒素 | |
| CN105738628A (zh) | 一种纯化羊抗人血浆载脂蛋白a-i多克隆抗体的方法 | |
| CN101073666B (zh) | 一种制备胰激肽原酶原料药的方法 | |
| CN115925890A (zh) | 一种抗新冠病毒中和抗体纯化方法 | |
| He et al. | Purification of lysozyme by multistage affinity filtration | |
| US20140186388A1 (en) | Method for Producing Protein-Carbohydrate Vaccines Reduced in Free Carbohydrate | |
| CN114602237B (zh) | 一种从人血浆或人血浆衍生原料中去除内毒素的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200501 |