CN102952187A - 一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法 - Google Patents
一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102952187A CN102952187A CN201210502736XA CN201210502736A CN102952187A CN 102952187 A CN102952187 A CN 102952187A CN 201210502736X A CN201210502736X A CN 201210502736XA CN 201210502736 A CN201210502736 A CN 201210502736A CN 102952187 A CN102952187 A CN 102952187A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bovine serum
- preparation
- serum albumin
- concentration
- bsa
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法,包括如下步骤:A)分离血浆;B)制备血清;C)加热提取;D)置换溶液和浓缩;E)DEAE柱进一步纯化;F)BSA剂型处理。本发明用料少,可节约投入;工艺流程短,省时省力;操作简单,重复性好,适合大批量生产;目标产品得率高、纯度高、质量好,本方法制得的成品牛血清白蛋白经过质量检验,产品质量完全符合现行行业质量标准,使用效果良好,可满足生化试剂与生物制药行业对牛血清白蛋白的质量要求;成本低,经济效益显著。
Description
技术领域
本发明涉及一种从牛血清中提取白蛋白的方法,尤其涉及一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法。
背景技术
牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)是牛血清中的一种球蛋白,包含583个氨基酸残基,分子量为66.43kDa,等电点为4.7,含氮量为16%,含糖量为0.08%,含脂量只有0.2%;白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合,BSA是生物学诸多学科及医、药学各领域广泛应用的生化试剂,例如在western blot中作为封闭试剂,血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、pH缓冲作用、载体作用和营养作用;在动物细胞无血清培养中,添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。
BSA的制备方法较多,但多数尚处于实验阶段,目前市场上的BSA主要采用以下三种方法制得:(1)盐析法,用硫酸铵分级沉淀后,经辛酸处理精制而得;(2)有机溶剂沉淀法,以E.J.Cohn氏法最常用,最早用于人血液制品的生产,利用乙醇的低介电常数性质以及蛋白质在一定温度、pH、离子强度及浓度条件下在不同浓度乙醇中溶解度不同分离血浆蛋白质,可以生产出多种血浆蛋白;(3)热激法,取牛血用枸橼酸钠抗凝离心后得到血浆,加热,加入辛酸钠,调pH值后加乙醇,再经过滤、脱盐、浓缩、冻干后得牛血清白蛋白。
盐析法为最传统的生产方法,此法原理较为简单,但是硫酸铵对设备有一定的腐蚀性,整个工艺比较耗时,且硫酸铵用量很多,所得产品纯度只有80%~90%,收率一般为0.8~1.0%,以上导致此法生产效率低,成本偏高;利用冷乙醇沉淀法也有一些不足:乙醇是一种非特异性沉淀剂,尽管BSA生产效率显著,但产品纯度不是很高,作为有机溶剂的乙醇还可能使蛋白质发生聚集或变性,为了避免蛋白质变性,必须在-20℃的低温环境中进行,设备与厂房的投入很大,乙醇易燃,给生产带来安全隐患,单程需7日,能源消耗巨大,费时费力,生产不易实现自动化,有机溶剂沉淀法所得BSA纯度在90%~95%,收率在10%左右,相对而言成本比较高,从而使其产品因在市场中售价偏高而降低了竞争力;单纯使用热激法,虽然用料少且省时,但是收率仅有1.8~2.0%,且纯度也不高,仅能达到90%。
因此,目前BSA的制备方法存在费时费力、收率低、纯度不高、生产效率低、成本高等缺陷。
发明内容
为解决现有技术中存在的缺陷,本发明提供一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法,它用料少,省时省力,收率高,用本制备方法可较大幅度地降低成本。
本发明的技术方案是:本发明提供一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法,包括如下步骤:A)分离血浆:取新鲜牛血,加入血量体积的10%的抗凝剂,轻轻搅拌使抗凝剂分散均匀,4℃,1500rpm离心,分离收集血浆;B)制备血清:室温下,取所述血浆,边搅拌边加入无水氯化钙粉末,待所述无水氯化钙粉末完全溶解后静置0.8~1.2h,将凝结成果冻状的血浆块打碎,5000rpm离心,上层澄清液体即为牛血清,下层乳黄色凝块为纤维蛋白,收集所述牛血清;C)加热提取:取所述牛血清用pH5.2~7.0 PBS缓冲液稀释2~10倍后放入带夹层的反应釜中,加入辛酸钠并搅拌使之完全溶解,再加入所述牛血清体积的5%~20%的乙醇,用1当量浓度的HCl调pH值至4.0~6.2,油浴加热,使反应釜中牛血清的温度保持在55~75℃,0.8~1.2h后取出反应液,压滤机压滤,收集滤液,弃掉滤渣;D)置换溶液和浓缩:将所述滤液用20000分子量以下的超滤装置过滤并将缓冲体系置换为pH8.0~8.5 Tris-HCl,同时进行浓缩;E)DEAE柱进一步纯化:装柱后用pH8.0~8.5 Tris-HCl平衡柱子,将超滤浓缩后的BSA溶液泵入层析柱中,并继续用pH8.0~8.5 Tris-HCl平衡,待接入纯化系统中的核酸蛋白检测仪吸光值有所上升时,收集穿透组分,待穿透峰回落至基线后用含0.15M NaCl的pH8.0~8.5 Tris-HCl溶液洗脱,待核酸蛋白检测仪吸光值有所上升时,收集洗脱组分并脱盐浓缩,得到脱盐浓缩后的洗脱组分;F)BSA剂型处理:取所述脱盐浓缩后的洗脱组分,加入防腐剂、络合剂,得到高纯BSA溶液,或直接进行冷冻干燥,得到BSA冻干粉。
作为本发明的进一步改进是:步骤A)中所述抗凝剂采用浓度为3%~5%的柠檬酸三钠溶液。
作为本发明的进一步改进是:步骤B)中所述加入无水氯化钙粉末的量为3~10g/L血浆。
作为本发明的进一步改进是:步骤C)中所述加入辛酸钠的量为1~10mmol/L血清。
作为本发明的进一步改进是:步骤C)中所述乙醇的浓度为95%。
作为本发明的进一步改进是:步骤A)和步骤B)在集中屠宰场分散操作,步骤C)、D)、E)、F)在洁净厂房集中操作,实现低成本生产与高质量的产品产出,以满足生物制药等行业对牛血清白蛋白严格的质量要求。
本发明所用的柠檬酸三钠为抗凝剂,辛酸钠为牛血清白蛋白的保护剂,使牛血清白蛋白在温度55℃以上不变性。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:用料少,可节约投入;工艺流程短,省时省力;操作简单,重复性好,适合大批量生产;目标产品得率高、纯度高、质量好,本方法制得的成品牛血清白蛋白经过质量检验,产品质量完全符合现行行业质量标准,使用效果良好,可满足生化试剂与生物制药行业对牛血清白蛋白的质量要求;成本低,经济效益显著。
附图说明
图1是本发明工艺流程图。
图2是本发明一步沉淀法制备的BSA与其他生产厂家提供的同类别BSA纯度对比(12% SDS-PAGE)示意图,其中a~d 泳道:为某市售国外品牌的BSA (组分五,白蛋白含量98%),浓度依次为7、6、5、4mg/ml;e 泳道为牛血清×10倍稀释;f、g 泳道为本法一次沉淀制得的BSA;h~l 为国内5家具备代表性的企业生产的BSA产品。
图3是本发明层析处理后的BSA与某进口品牌BSA纯度对比(12% SDS-PAGE)示意图,其中A~F 泳道为某市售国外品牌的BSA (组分五,白蛋白含量98%),A:4mg/ml,B:2mg/ml,C:1mg/ml,D:0.8mg/ml,E:0.6mg/ml,F:0.4mg/ml;G为牛血清×15倍稀释;H、J为DEAE层析处理后的BSA样品;I:滤渣;K:废液。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例一 高纯度牛血清白蛋白的制备。
高纯度牛血清白蛋白的制备,包括如下步骤:
A)分离血浆:取新鲜牛血,经严格的检疫,确保无感染疾病,加入血量体积的10%的抗凝剂,即浓度为3%~5%的柠檬酸三钠溶液,轻轻搅拌使抗凝剂分散均匀,4℃,1500rpm离心,分离收集血浆;
B)制备血清:室温下,取所述血浆,边搅拌边加入无水氯化钙粉末,加入无水氯化钙粉末的量为3~10g/L血浆,待所述无水氯化钙粉末完全溶解后静置0.8~1.2h,至容器内血浆完全凝结成果冻状,将凝结成果冻状的血浆块打碎,5000rpm离心,上层澄清液体即为牛血清,下层乳黄色凝块为纤维蛋白,收集所述牛血清;
C)加热提取:取所述牛血清用pH5.2~7.0 PBS缓冲液稀释2~10倍后放入带夹层的反应釜中,按1~10mmol/L血清加入辛酸钠,并搅拌使辛酸钠完全溶解,再加入所述牛血清体积的5%~20%的乙醇,用1当量浓度的HCl调pH值至4.0~6.2,油浴加热,使反应釜中牛血清的温度保持在55~75℃,0.8~1.2h后取出反应液,压滤机压滤,收集滤液,弃掉滤渣;
D)置换溶液和浓缩:将所述滤液用20000分子量以下的超滤装置过滤并将缓冲体系置换为pH8.0~8.5 Tris-HCl,同时进行浓缩;
E)DEAE柱进一步纯化:用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡层析柱,再用纯水淋洗干净,装入DEAE填料并用纯水冲洗压实;装柱后用5倍以上柱体积的pH8.0~8.5 Tris-HCl平衡柱子,将超滤浓缩后的BSA溶液泵入层析柱中,并继续用pH8.0~8.5 Tris-HCl平衡,待接入纯化系统中的核酸蛋白检测仪吸光值有所上升时,收集穿透组分,待穿透峰回落至基线后用含0.15M NaCl的pH8.0~8.5 Tris-HCl溶液洗脱,待核酸蛋白检测仪吸光值有所上升时,收集洗脱组分并脱盐浓缩,得到脱盐浓缩后的洗脱组分;用0.5mol/L的NaOH溶液清洗层析柱后可以重复使用;
F)BSA剂型处理:取所述脱盐浓缩后的洗脱组分,加入防腐剂、络合剂,得到高纯BSA溶液,或直接进行冷冻干燥,得到BSA冻干粉。
利用本发明制备的产品包装为密封瓶装或塑料袋装,保存温度小于等于20℃,本发明所用的柠檬酸三钠为抗凝剂,市售,辛酸钠为牛血清白蛋白的保护剂,使之在温度55℃以上不变性,市售,盐酸及乙醇为市售;对本发明制备的牛血清白蛋白进行检验,其质量检测结果见表一,从表一中可以看出,本发明的质量完全符合行业质量标准;对于本发明的产品,纯度用电泳法测定,如图2和图3所示,从图中可以看出,利用本发明制备的牛血清白蛋白杂质含量少、纯度较高。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
A)分离血浆:取新鲜牛血,加入血量体积的10%的抗凝剂,轻轻搅拌使抗凝剂分散均匀,4℃,1500rpm离心,分离收集血浆;
B)制备血清:室温下,取所述血浆,边搅拌边加入无水氯化钙粉末,待所述无水氯化钙粉末完全溶解后静置0.8~1.2h,将凝结成果冻状的血浆块打碎,5000 rpm离心,上层澄清液体即为牛血清,下层乳黄色凝块为纤维蛋白,收集所述牛血清;
C)加热提取:取所述牛血清用pH5.2~7.0 PBS缓冲液稀释2~10倍后放入带夹层的反应釜中,加入辛酸钠并搅拌使之完全溶解,再加入所述牛血清体积的5%~20%的乙醇,用1当量浓度的HCl调pH值至4.0~6.2,油浴加热,使反应釜中牛血清的温度保持在55~75℃,0.8~1.2h后取出反应液,压滤机压滤,收集滤液,弃掉滤渣;
D)置换溶液和浓缩:将所述滤液用20000分子量以下的超滤装置过滤并将缓冲体系置换为pH8.0~8.5 Tris-HCl,同时进行浓缩;
E)DEAE柱进一步纯化:装柱后用pH8.0~8.5 Tris-HCl平衡柱子,将超滤浓缩后的BSA溶液泵入层析柱中,并继续用pH8.0~8.5 Tris-HCl平衡,待接入纯化系统中的核酸蛋白检测仪吸光值有所上升时,收集穿透组分,待穿透峰回落至基线后用含0.15M NaCl的pH8.0~8.5 Tris-HCl溶液洗脱,待核酸蛋白检测仪吸光值有所上升时,收集洗脱组分并脱盐浓缩,得到脱盐浓缩后的洗脱组分;
F)BSA剂型处理:取所述脱盐浓缩后的洗脱组分,加入防腐剂、络合剂,得到高纯BSA溶液,或直接进行冷冻干燥,得到BSA冻干粉。
2.根据权利要求1所述的高纯度牛血清白蛋白的制备方法,其特征在于:步骤A)中所述抗凝剂采用浓度为3%~5%的柠檬酸三钠溶液。
3.根据权利要求1所述的高纯度牛血清白蛋白的制备方法,其特征在于:步骤B)中所述加入无水氯化钙粉末的量为3~10g/L血浆。
4.根据权利要求1所述的高纯度牛血清白蛋白的制备方法,其特征在于:步骤C)中所述加入辛酸钠的量为1~10mmol/L血清。
5.根据权利要求1所述的高纯度牛血清白蛋白的制备方法,其特征在于:步骤C)中所述乙醇的浓度为95%。
6.根据权利要求1所述的高纯度牛血清白蛋白的制备方法,其特征在于:步骤A)和步骤B)在集中屠宰场分散操作,步骤C)、D)、E)、F)在洁净厂房集中操作。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210502736.XA CN102952187B (zh) | 2012-11-30 | 2012-11-30 | 一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210502736.XA CN102952187B (zh) | 2012-11-30 | 2012-11-30 | 一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102952187A true CN102952187A (zh) | 2013-03-06 |
CN102952187B CN102952187B (zh) | 2014-04-09 |
Family
ID=47761620
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210502736.XA Active CN102952187B (zh) | 2012-11-30 | 2012-11-30 | 一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102952187B (zh) |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105085666A (zh) * | 2015-09-15 | 2015-11-25 | 江苏锦宇环境工程有限公司 | 一种牛血清白蛋白的制备方法 |
CN105384791A (zh) * | 2015-12-09 | 2016-03-09 | 青海北极牦牛生物科技有限公司 | 一种高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺 |
CN106065029A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-11-02 | 成都远睿生物技术有限公司 | 一种牛血清白蛋白提取方法和牛血清白蛋白 |
CN106749626A (zh) * | 2017-01-24 | 2017-05-31 | 西藏康威科技发展有限公司 | 一种从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法及利用牛血的方法 |
CN107365376A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-11-21 | 天津市正江现代生物技术有限公司 | 一种鹿血清蛋白的提取方法 |
CN107383185A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-11-24 | 天津市正江现代生物技术有限公司 | 一种高纯度牛血清白蛋白的提取方法 |
CN108864278A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-11-23 | 珠海宝锐生物科技有限公司 | 一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法 |
CN109810185A (zh) * | 2019-04-08 | 2019-05-28 | 北京蛋白质组研究中心 | 一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法 |
CN110229229A (zh) * | 2019-07-10 | 2019-09-13 | 甘肃养泰和生物科技有限公司 | 一种从牛血浆中提取纯化细胞培养级牛血清白蛋白的生产方法及其应用 |
CN112083158A (zh) * | 2020-08-29 | 2020-12-15 | 赵峻岭 | 一种封闭液用牛血清的制备方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1843376A (zh) * | 2006-05-15 | 2006-10-11 | 锦州奥鸿药业有限责任公司 | 一种提取纯化小牛血清去蛋白提取物的方法 |
-
2012
- 2012-11-30 CN CN201210502736.XA patent/CN102952187B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1843376A (zh) * | 2006-05-15 | 2006-10-11 | 锦州奥鸿药业有限责任公司 | 一种提取纯化小牛血清去蛋白提取物的方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
HIROYUKI YOSHIDA ET AL: "Fabrication of hard dextran DEAE:Adsorption equilibria of BSA", 《ADSORPTION》, 31 December 1999 (1999-12-31) * |
孙涛等: "聚焦电层析分离牛血清白蛋白和牛血红蛋白", 《药物生物技术》, no. 2, 31 December 2009 (2009-12-31) * |
路秀玲等: "扩张床吸附直接从牛血中快速分离牛血清白蛋白", 《中国生化药物杂志》, 31 December 2005 (2005-12-31) * |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105085666A (zh) * | 2015-09-15 | 2015-11-25 | 江苏锦宇环境工程有限公司 | 一种牛血清白蛋白的制备方法 |
CN105384791A (zh) * | 2015-12-09 | 2016-03-09 | 青海北极牦牛生物科技有限公司 | 一种高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺 |
CN106065029A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-11-02 | 成都远睿生物技术有限公司 | 一种牛血清白蛋白提取方法和牛血清白蛋白 |
CN106749626A (zh) * | 2017-01-24 | 2017-05-31 | 西藏康威科技发展有限公司 | 一种从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法及利用牛血的方法 |
CN106749626B (zh) * | 2017-01-24 | 2020-05-19 | 西藏森威医疗科技有限公司 | 一种从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法及利用牛血的方法 |
CN107365376A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-11-21 | 天津市正江现代生物技术有限公司 | 一种鹿血清蛋白的提取方法 |
CN107383185A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-11-24 | 天津市正江现代生物技术有限公司 | 一种高纯度牛血清白蛋白的提取方法 |
CN108864278A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-11-23 | 珠海宝锐生物科技有限公司 | 一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法 |
CN108864278B (zh) * | 2018-07-27 | 2021-02-19 | 珠海宝锐生物科技有限公司 | 一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法 |
CN109810185A (zh) * | 2019-04-08 | 2019-05-28 | 北京蛋白质组研究中心 | 一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法 |
CN110229229A (zh) * | 2019-07-10 | 2019-09-13 | 甘肃养泰和生物科技有限公司 | 一种从牛血浆中提取纯化细胞培养级牛血清白蛋白的生产方法及其应用 |
CN112083158A (zh) * | 2020-08-29 | 2020-12-15 | 赵峻岭 | 一种封闭液用牛血清的制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102952187B (zh) | 2014-04-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102952187B (zh) | 一种高纯度牛血清白蛋白的制备方法 | |
CN105017412B (zh) | 一种从牛血清中分离高纯度牛血清白蛋白的方法 | |
CN101979532B (zh) | 一种综合利用猪血的方法 | |
Tan et al. | Three phase partitioning for simultaneous purification of aloe polysaccharide and protein using a single-step extraction | |
Oelmeier et al. | Alternative separation steps for monoclonal antibody purification: Combination of centrifugal partitioning chromatography and precipitation | |
CN103882083B (zh) | 一种抗氧化胶原肽的制备方法 | |
US20130260437A1 (en) | Method of co-extracting multiple proteins from chicken egg white | |
CN106478810B (zh) | 一种同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法 | |
CN104610430B (zh) | 利用灵芝蛋白制备的抗氧化多肽及其制备方法 | |
CN107840883A (zh) | 牛乳酪蛋白3种主要组分同时分离的方法 | |
CN104356227B (zh) | 血清脂类、脂蛋白及载脂蛋白高效浓缩提取方法 | |
CN104450639B (zh) | 一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的方法 | |
CN102702341B (zh) | 基于cho细胞表达系统的重组人神经生长因子纯化方法 | |
CN104387493B (zh) | 一种采用逆流色谱技术一步纯化大蒜多糖的方法 | |
CN102206273A (zh) | 一种从猪血中提取免疫球蛋白g的方法 | |
CN104152518A (zh) | 一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法 | |
CN105801689A (zh) | 一种共制备卵白蛋白与卵铁传递蛋白的方法 | |
CN103833840A (zh) | 一种从人血浆中提取高密度脂蛋白及分离纯化载脂蛋白apoA-I的方法 | |
CN105384791B (zh) | 一种高纯度牦牛血清白蛋白的生产工艺 | |
CN107488652A (zh) | 一种利用双水相体系萃取木瓜蛋白酶的方法 | |
CN104450656A (zh) | 兔血中凝血酶的纯化制备方法 | |
CN104404094A (zh) | 基于蛤利用酶转化法提取牛磺酸的方法 | |
CN108355618B (zh) | 牛来源透明质酸酶亲和介质及其吸附方法 | |
CN103103170B (zh) | 牛或羊玻璃酸酶的生产方法 | |
CN102464713A (zh) | 一种卵泡刺激素的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |