CN108864278B - 一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法 - Google Patents

一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛋白质纯化领域，具体涉及一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法。本发明制备分子生物级牛血清白蛋白的方法包括吸附剂分散液制备、吸附剂纯化牛血清白蛋白样品、肝素‑琼脂糖层析柱处理牛血清白蛋白样品、超滤浓缩以及透析处理等步骤。本发明的方法采用硅藻土与Heparin‑sepharose层析柱的结合对牛血清白蛋白样品进行纯化，能够去除牛血清白蛋白样品中的核酸酶，得到分子生物级的牛血清白蛋白；整个纯化过程都在低温环境下进行，最大限度的保持了牛血清白蛋白的活性；并且不涉及DEPC处理，不会对环境造成污染；可以可完全去除牛血清白蛋白中微量的核酸酶，省时省力且回收效率高，便于放大规模。

Description

一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法
技术领域
本发明属于蛋白质纯化领域，具体涉及一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法。
背景技术
核酸酶是一种能催化核苷酸链(DNA和RNA)中磷酸二酯键水解的酶，作用于磷酸二酯键的P-O位置，广泛存在于动植物体内及空气中。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。只能作用于RNA的称为核糖核酸酶(RNase)，只能作用于DNA的称为脱氧核糖核酸酶(DNase)，有些核酸酶既能作用于RNA也能作用于DNA，因此统称为核酸酶(nuclease)。根据核酸酶作用位置的不同，可将核酸酶分为核酸外切酶(exonuclease)和核酸内切酶。
由于核酸酶具有很强的降解核酸(DNA及RNA)的能力，因此在以核酸为模板的检测中，由于存在核酸酶污染很容易出现假阴性结果。另外，核酸酶的耐热性较好，尤其是RNase酶，即使经过高温处理也仍可能有残留的活性。通常PCR检测过程中，对所用水、液体试剂等的灭活主要采用DEPC(剧毒)水浸泡灭活处理，并且之后必须进行高温高压降解DEPC处理。牛血清白蛋白(BSA)是一种常用的PCR扩增增强剂和稳定剂，它能够起到稳定扩增酶、降低PCR抑制物的作用，减少扩增酶蛋白对容器的吸附等作用。由于BSA生物来源的属性，必然会残留一定量的核酸酶；为了避免其蛋白变性，又不能采用剧烈条件对核酸酶进行灭活处理。因此需要一种更有效的去除BSA中核酸酶的方法，以提高BSA在核酸检测，如PCR检测中的效果。
硅藻土具有密度小、比表面积大、多孔、吸附性强、耐酸、耐碱、熔点高等特点，主要性质如下：(1)硅藻土表面有大量不同种类的羟基，硅藻土中的羟基与其吸附性能直接相关，羟基越多，则吸附性能越好。硅藻土中的羟基在热处理条件下可以发生转化，改变硅藻土的吸附性能。此外，这些羟基具有活性，能与其他物质发生反应，改变硅藻土的吸附特性；(2)硅藻土表面的电荷一般为负电荷，使得硅藻土颗粒表现出一定的负电性，在大多数pH值范围内硅藻土表面都带负电，能与其他一些带正电荷的蛋白质结合，进而实现对蛋白质的纯化作用。
由于其廉价、吸附性强、化学性质稳定等特性，硅藻土已经被广泛应用许多领域。淳俊等人利用硅藻土能有效吸附RNA酶这一特性，开发了一种广泛适用的RNA提取方法。结果表明采用硅藻土-苯酚提取方法提取RNA的得率是异硫氰酸胍法的3倍多，而且使用范围较广。但是没有对提取的RNA样品中残留的核酸酶进行测试。翟玲等人报道了一种去除牛血清白蛋白蛋白中的RNA酶的方法，采用高岭土对牛血清白蛋白溶液进行吸附，通过电泳法进行检测，结果表明，37℃条件下未经高岭土处理的BSA在1个小时内没有表现出RNA酶活性，但2小时后表现出明显的RNA酶的活性，而经过高岭土处理的BSA在2小时内几乎不水解RNA，但该检验方法为电泳法，灵敏度相对较低，微量残留的核酸酶检测不到。
肝素(Heparin)是一种含硫酸脂的酸性多糖，能和抗凝血因子Ⅲ、凝血酶、类凝血酶、人凝血因子、DNA结合，进而实现对这些物质的纯化。核酸酶是一类能和DNA或RNA相互结合的蛋白，因而可以用肝素对核酸酶进行纯化或去除。匡春香等人利用Heparin-separinCL-6B结合DEAE-Sephades A-25对BSA进行RNA核酸酶的去除，采用λ-HindⅢDNA片段，pBR322DNA，16S，23S rRNA为底物，加入不同浓度经过纯化的BSA样品于37℃条件下反应4h。结果发现电泳图谱与空白相比没有明显变化，作者认为已经分子生物学级要求，但电泳法本身灵敏度不高，有微量的核酸酶残留也检测不出来。另外电泳法是一个开放的体系，容易对环境造成核酸污染。本发明采用荧光定量PCR方法来检测核酸酶的残留，灵敏度要高于电泳法，而且是不开盖体系，不会造成核酸污染，即使微量的核酸酶残留也能在CT值上体现出来。
目前有单独使用硅藻土(高岭土)或肝素结合DEAE去除核酸酶的报道，用电泳检测方法未检测到有明显的变化，但本发明采用荧光定量PCR方法检测核酸酶残留量时发现单独采用硅藻土或肝素对牛血清白蛋白处理后仍有核酸酶残留，造成实验的CT值推后，检测灵敏度下降，定量不准确。为了解决单独硅藻土或肝素去除BSA中的核酸酶不完全这一难题，开发了硅藻土结合肝素来进行核酸酶去除的方法，该方法成本低，操作简单、快速，适合于工业化生产。另外，分子生物学级别的BSA价格非常昂贵，应用面广，因此本发明产生的经济效益极为显著。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法。本发明的方法结合硅藻土和肝素两种方法对牛血清白蛋白进行精细纯化，能够制备分子生物级的牛血清白蛋白。另外，本发明的整个方法过程温和，无需高温、高压及DEPC浸泡，最大限度的保持了牛血清白蛋白活性，同时也避免了对环境的污染。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)吸附剂用悬浮液重悬并洗涤3次后，在悬浮液中分散均匀，得到吸附剂分散液，在4℃条件下储存备用；
(2)将牛血清白蛋白样品溶解在悬浮液中形成样品分散液，然后加入吸附剂分散液，搅拌后分离并收集上清液；
(3)将上清液与吸附剂分散液混合，搅拌后分离并收集上清液，重复两次；将收集的上清液用膜过滤后，得到牛血清白蛋白纯化液1；
(4)用肝素-琼脂糖(Heparin-Sepharose)层析柱对步骤(3)得到的牛血清白蛋白纯化液1进行纯化，收集穿透峰，得到牛血清白蛋白纯化液2；
(5)采用分子截留量为10KD的超滤浓缩管对牛血清白蛋白纯化液2进行超滤浓缩，得到超滤牛血清白蛋白样品3；
(6)将超滤牛血清白蛋白样品3采用分子截留量为14000Da的透析袋4℃条件下搅拌透析2-3h后，更换透析液透析过夜，即得分子生物级牛血清白蛋白。
优选地，所述吸附剂、悬浮液在使用前经过灭菌处理。
优选地，所述吸附剂是具有多孔结构的吸附性材料。
进一步优选地，所述吸附剂为硅藻土或高岭土。
优选地，所述悬浮液是Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲溶液中的一种或多种，浓度为10mM-100mM，pH为5-9。
进一步优选地，所述悬浮液的浓度为40-60mM，pH为7.5-8.5。
进一步优选地，所述悬浮液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为50mM，pH为7.8.
优选地，步骤(1)中吸附剂与悬浮液的比例为1:1-1:20w/v。
优选地，步骤(2)中牛血清白蛋白样品与悬浮液的比例为1:1-1:10w/v；样品分散液与吸附剂分散液的体积比1:1-1:10。
优选地，步骤(3)中每次使用的吸附剂分散液的体积与步骤(2)中使用的吸附剂分散液的体积相同。
优选地，所述搅拌在4℃进行30min，所述分离是在10000rpm离心10min。
优选地，肝素-琼脂糖(Heparin-Sepharose)层析柱使用前用平衡液进行平衡，所述平衡液为Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲溶液中的一种或多种，浓度为10mM-100mM，pH为5-9。
进一步优选地，所述平衡液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为10mM-50mM，pH为7-9。
进一步优选地，所述平衡液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为20mM，pH为8。
优选地，透析使用的透析液为Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲溶液中的一种或多种，浓度为10mM-100mM，pH为5-9。
进一步优选地，透析液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为10mM-50mM，pH为7-9。
进一步优选地，透析液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为10mM，pH为8。
优选地，超滤牛血清白蛋白样品3与透析液的体积比为1:10-1:20。
本发明的有益效果：
(1)本发明的方法采用硅藻土与Heparin-sepharose层析柱的结合对牛血清白蛋白样品进行纯化，能够去除牛血清白蛋白样品中的核酸酶，得到分子生物级的牛血清白蛋白；
(2)本发明的方法的整个纯化过程都在低温环境下进行，最大限度的保持了牛血清白蛋白的活性；并且不涉及DEPC处理，不会对环境造成污染；
(3)本发明的方法仅需一步吸附、一步柱层析即可完全去除牛血清白蛋白中微量的核酸酶，省时省力且回收效率高，便于放大规模；
(4)与未经处理的牛血清白蛋白相比，在核酸检测体系中使用本发明的方法制备的牛血清白蛋白时，检测灵敏度明显提高，对于临床中的病原核酸检验具有重要意义。
附图说明
图1是DNA样品检测中不同牛血清白蛋白样品扩增Ct值变化的图；
图2是RNA样品检测中不同牛血清白蛋白样品扩增Ct值变化的图；
其中×表示未经过处理的BSA样品；▲表示单独硅藻土纯化的BSA样品；■表示单独Heparin-Sepharose层析柱纯化的BSA样品；●表示硅藻土结合Heparin-Sepharos层析柱纯化的BSA样品。
具体实施方式
本发明的方法采用硅藻土与Heparin-Sepharose层析柱的结合来去除牛血清白蛋白中微量的核酸酶，本领域的技术人员可以参考本发明的内容对方法参数进行适当地修改，而这些修改也应被视为包括在本发明内。
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商的建议条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市面购到的常规产品。
实施例1单独使用硅藻土纯化牛血清白蛋白
用硅藻土纯化牛血清白蛋白(去除牛血清白蛋白中的核酸酶)时，使用的悬浮液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为50mM，pH为7.8；使用的透析液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为10mM，pH为8.0；硅藻土以及悬浮液使用前在121℃条件下灭菌30min。具体的纯化步骤为：
(1)将6g硅藻土用60mL悬浮液(硅藻土与悬浮液的比例为1:10w/v)混合，置于100℃沸水浴中5min，室温条件下搅拌5min，5000rpm离心10min，丢弃上清液；重复上述洗涤步骤3次后，将洗涤后的硅藻土在60mL悬浮液中分散均匀，得到吸附剂分散液，在4℃条件下储存备用；
(2)将2.5g牛血清白蛋白在12.5mL悬浮液中(牛血清白蛋白与悬浮液的比例为1:5w/v)溶解分散均匀，加入18.75mL吸附剂分散液，在4℃搅拌30min后，在该温度下10000rpm离心10min，收集上清；
(3)在上清液中加入18.75mL吸附剂分散液(牛血清白蛋白悬浮液与吸附剂分散液的比例为1:1.5v/v)，在4℃搅拌30min，在该温度10000rpm离心10min，收集上清液；再重复一次；
(4)收集的上清用0.45μm膜过滤后，即得牛血清白蛋白纯化液；
(5)采用分子截留量为10KD的超滤浓缩管2500rpm离心20min，对蛋白浓度进行超滤浓缩，得到超滤牛血清白蛋白样品；
(6)将超滤牛血清白蛋白样品采用分子截留量为14000Da的透析袋4℃条件下搅拌透析2h后，更换透析液透析过夜，超滤牛血清白蛋白样品与透析液的体积比为1:15；
(7)透析后的样品测定蛋白浓度后，稀释至10mg/ml，分装成1mL/支，保存于-20℃。
实施例2单独使用Heparin-Sepharose层析柱纯化牛血清白蛋白
用Heparin-Sepharose层析柱纯化牛血清白蛋白(去除牛血清白蛋白中的核酸酶)时，使用的层析柱平衡液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为20mM，pH为8.0；使用的透析液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为10mM，pH为8.0；平衡液使用前在121℃条件下灭菌30min。具体的纯化步骤为：
(1)将2.5g牛血清白蛋白在12.5mL平衡液中分散均匀，用0.45μm膜过滤后，作为上样样品；
(2)用平衡液平衡Heparin-Sepharose层析柱5倍CV，流速为180mL/h后，对上样样品进行纯化，收集穿透峰，上样完成后用平衡液洗脱至基线平稳；
(3)采用分子截留量为10KD的超滤浓缩管2500rpm离心20min，对收集的穿透峰进行超滤浓缩，得到超滤牛血清白蛋白样品；
(4)将超滤牛血清白蛋白样品采用分子截留量为14000Da的透析袋4℃条件下搅拌透析2h后，更换透析液透析过夜，超滤牛血清白蛋白样品2与透析液的体积比为1:15；
(5)透析后的样品测定蛋白浓度后，稀释至10mg/ml，分装成1mL/支，保存于-20℃。
实施例3使用硅藻土与Heparin-Sepharose层析柱的结合纯化牛血清白蛋白
用硅藻土与Heparin-Sepharose层析柱的结合纯化牛血清白蛋白(去除牛血清白蛋白中的核酸酶)时，使用的悬浮液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为50mM，pH为7.8；使用的层析柱平衡液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为20mM，pH为8.0；使用的透析液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为10mM，pH为8.0；硅藻土、悬浮液以及平衡液使用前在121℃条件下灭菌30min。具体的纯化步骤为：
(1)将6g硅藻土用60mL悬浮液(硅藻土与悬浮液的比例为1:10w/v)混合，置于100℃沸水浴中5min，室温条件下搅拌5min，5000rpm离心10min，丢弃上清液；重复上述洗涤步骤3次后，将洗涤后的硅藻土在60mL悬浮液中分散均匀，得到吸附剂分散液，在4℃条件下储存备用；
(2)将2.5g牛血清白蛋白在12.5mL悬浮液中(牛血清白蛋白与悬浮液的比例为1:5w/v)溶解分散均匀，加入18.75mL吸附剂分散液(牛血清白蛋白悬浮液与吸附剂分散液的比例为1:1.5v/v)，在4℃搅拌30min后，在该温度10000rpm离心10min，收集上清；
(3)在上清液中加入18.75mL吸附剂分散液，在4℃搅拌30min，在该温度10000rpm离心10min，收集上清液；再重复一次；
(4)收集的上清用0.45μm膜过滤后，即得牛血清白蛋白纯化液，作为Heparin-Sepharose层析柱的上样样品；
(5)用平衡液平衡Heparin-Sepharose层析柱5倍CV，流速为180ml/h，对上样样品进行纯化，收集穿透峰，上样完成后用平衡液洗脱至基线平稳；
(6)采用分子截留量为10KD的超滤浓缩管2500rpm离心20min，对收集的穿透峰进行超滤浓缩，得到超滤牛血清白蛋白样品；
(7)将超滤牛血清白蛋白样品采用分子截留量为14000Da的透析袋4℃条件下搅拌透析2h后，更换透析液透析过夜，超滤牛血清白蛋白样品与透析液的体积比为1:15；
(8)透析后的样品测定蛋白浓度后，稀释至10mg/ml，分装成1mL/支，保存于-20℃。
实施例4检测实施例1-3纯化的牛血清白蛋白去除核酸酶的效果
检测实施例1-3中纯化的牛血清白蛋白去除核酸酶的效果，具体过程如下：
(1)DNA体系中的模板、引物及探针
DNA模板的制备：采用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取试剂盒提取人血液中基因组DNA，用作反应模板，应用下述引物探针扩增β-激动蛋白(β-actin)基因，每个反应孔中DNA模板的量为0.05ng/T。
正向引物：5’TTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG 3’
反向引物：5’AAACTGGAACGGTGAAGGTGA 3’
探针：5’-Cy5-CTTGCGCAGAAAACAAGATGAGATTGGC-BHQ3-3’
(2)试剂
10×PCR缓冲液包含100mM Tris-HCl、500mM KCl，pH为8.3。MgCl2、KCl购自广州化学试剂厂；三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自广州威佳生物科技有限公司；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、脱氧尿嘧啶(dUTP)购自上海申能博彩生物科技有限公司；50X Superstartplus-UNG Robustart Taq(5U/μL)、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)(1U/μL)，为珠海宝锐生物科技有限公司生产；引物及探针由上海生物工程(上海)股份有限公司合成。
(3)体系配方表
按照下表先将模板和未处理以及按照实施例1-3处理后的BSA(10mg/mL)进行混匀，25℃条件下放置1小时，让BSA样品和模板进行作用，反应结束后按照下表进行其他组分的添加，配置完成并混匀后立即上机，具体反应程序见以下反应条件。
Figure BDA0001745280890000071
(4)反应条件
荧光定量PCR仪：SLAN96P。
50℃处理2min，95℃预变性5min；95℃变性10s、55℃退火40s，共50个循环。
(5)实验结果
反应结束后，将SLAN96P中Ct值导出，进行统计分析。
表1 DNA检测不同BSA样品扩增的平均Ct值
Figure BDA0001745280890000072
Figure BDA0001745280890000081
由图1以及表1可以看出，4种BSA样品添加反应体系在荧光值上基本一致。未处理的BSA、实施例1纯化的BSA和实施例2纯化的BSA样品在DNA检测中Ct值基本一致，没有显著差异；而本发明的方法纯化的BSA样品的反应体系Ct值为31.97，比其他BSA样品提前了1.6个Ct值。结果表明，未处理的BSA样品中有核酸酶，单独用硅藻土或Heparin-Sepharose层析柱纯化BSA样品均不能完全去除残留的核酸酶，而本发明硅藻土结合Heparin-Sepharos层析柱的纯化方法能够有效的去除BSA样品中残留的核酸酶，检测的灵敏度提高了2倍。
实施例5检测实施例1-3纯化的牛血清白蛋白去除核酸酶的效果
检测实施例1-3中纯化的牛血清白蛋白去除核酸酶的效果，具体过程如下：
(1)RNA体系中模板、引物及探针
RNA模板的制备：采用天根生化科技(北京)有限公司RNA提取试剂盒从人血液中提取总RNA，用作反应模板，应用下述引物探针扩增GAPDH基因，每个反应孔中RNA模板的量为5ng。
正向引物：5’GTGAACCATGAGAAGTATGACAAC 3’
反向引物：5’CATGAGTCCTTCCACGATACC 3’
探针：5’-HEX-CCTCAAGATCATCAGCAATGCCTCCTG-BHQ1-3’
(2)试剂
氯化镁(MgCl2)、氯化钾(KCl)购自广州化学试剂厂；三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自广州威佳生物科技有限公司；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、脱氧尿嘧啶(dUTP)购自上海申能博彩生物科技有限公司；5×反转录预混液(5×Neoscript RT Premix含反转录酶、热启动酶、dNTP、PCR buffer等)为珠海宝锐生物科技有限公司生产；引物及探针由上海生物工程(上海)股份有限公司合成。
(3)体系配方组成
按照下表先将RNA模板和4种不同方式处理的BSA样品进行混匀，25℃条件下放置1小时，让BSA样品和模板进行作用，反应结束后按照下表进行其余组分的添加，配置完成并混匀后立即上机，具体反应程序以下反应条件。
Figure BDA0001745280890000082
Figure BDA0001745280890000091
(4)反应条件
荧光定量PCR仪：SLAN96P。
50℃逆转录15min，95℃预变性1min；95℃变性15s、56℃退火45s，共50个循环。
(5)实验结果
反应结束后，将SLAN96P中Ct值导出，进行统计分析。
表2 RNA体系中不同BSA样品扩增的平均Ct值
Figure BDA0001745280890000092
由图2以及表2可以看出，未处理的BSA样品的荧光值最低，而实施例1纯化的BSA、实施例2纯化的BSA以及实施例3纯化的BSA的荧光值基本一致，约为未处理的BSA样品的1.76倍。实施例1纯化的BSA样品比未处理的BSA样品提前7.18个Ct值；实施例1纯化的BSA样品和实施例2纯化的BSA样品的Ct基本相当，仅相差0.35；而本发明的方法纯化的BSA样品Ct值比未处理的BSA样品提前8.51个Ct值，比实施例1和实施例2纯化的BSA样品的Ct值提前约1。结果表明，在RNA体系检测中，未处理的BSA样品中存在大量残留的核酸酶，相对于本发明而言，25℃处理1小时后CT值推后了8.5个Ct值；实施例1和实施例2去除核酸酶的能力基本相当，而本发明的方法去除核酸酶的效果明显实施例1和实施例2的方法，Ct值提前了1，即相当于RNA检测中对RNA模板的检测灵敏度提高了一倍。

Claims (9)

1.一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)吸附剂用缓冲液重悬并洗涤3次后，在缓冲液中分散均匀，得到吸附剂分散液，在4℃条件下储存备用；其中，所述吸附剂是具有多孔结构的吸附性材料，所述具有多孔结构的吸附性材料为硅藻土或高岭土；
(2)将牛血清白蛋白样品溶解在缓冲液中形成样品分散液，然后加入吸附剂分散液，搅拌后分离并收集上清液；
(3)将上清液与吸附剂分散液混合，搅拌后分离并收集上清液，重复两次；将收集的上清液用膜过滤后，得到牛血清白蛋白纯化液1；
(4)用肝素-琼脂糖(Heparin-Sepharose)层析柱对步骤(3)得到的牛血清白蛋白纯化液1进行纯化，收集穿透峰，得到牛血清白蛋白纯化液2；
(5)采用分子截留量为10KD的超滤浓缩管对牛血清白蛋白纯化液2进行超滤浓缩，得到超滤牛血清白蛋白样品3；
(6)将超滤牛血清白蛋白样品3采用分子截留量为14000Da的透析袋4℃条件下搅拌透析2-3h后，更换透析液透析过夜，即得分子生物级牛血清白蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备分子生物级牛血清白蛋白的方法，其特征在于，所述缓冲液是Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲溶液中的一种或多种，浓度为10mM-100mM，pH为5-9。
3.根据权利要求2所述的制备分子生物级牛血清白蛋白的方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度为40-60mM，pH为7.5-8.5。
4.根据权利要求3所述的制备分子生物级牛血清白蛋白的方法，其特征在于，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为50mM，pH为7.8。
5.根据权利要求1所述的制备分子生物级牛血清白蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中吸附剂与缓冲液的比例为1:1-1:20w/v。
6.根据权利要求1所述的制备分子生物级牛血清白蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中牛血清白蛋白样品与缓冲液的比例为1:1-1:10w/v；样品分散液与吸附剂分散液的体积比为1:1-1:10。
7.根据权利要求1所述的制备分子生物级牛血清白蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的搅拌在4℃进行30min，所述分离是在10000rpm离心10min。
8.根据权利要求1所述的制备分子生物级牛血清白蛋白的方法，其特征在于，肝素-琼脂糖(Heparin-Sepharose)层析柱使用前用平衡液进行平衡，所述平衡液为Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲溶液中的一种或多种，浓度为10mM-100mM，pH为5-9。
9.根据权利要求1所述的制备分子生物级牛血清白蛋白的方法，其特征在于，透析使用的透析液为Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲溶液中的一种或多种，浓度为10mM-100mM，pH为5-9。
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